CN112798792A - 一种检测cho细胞宿主蛋白残留的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学分析技术领域，尤其涉及一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒。本发明试剂盒利用CHO宿主细胞蛋白作为标准品和抗原制备抗体，具有特异性高、灵敏度高、检测效率高的特点，可同时检测多个样品，定量限达到5ppm，使用设备简单，操作方便，检测成本低。

Description

一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学分析技术领域，尤其涉及一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒及检测方法。
背景技术
CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞，该细胞表达的蛋白最接近于天然蛋白分子、产物胞外分泌但很少分泌自身内源蛋白，对目标蛋白分离纯化工作十分有利，是目前在单抗和重组蛋白类生物制品中被广泛使用的工程细胞，CHO细胞表达系统具有表达遗传背景清楚、表达系统完善稳定、蛋白表达水平较高等优势。
CHO分泌的内源蛋白很少但是仍然会有少量蛋白残留在生物制品的半成品和成品中。CHO细胞中残留的宿主蛋白(HCP)作为人类自身系统的外源蛋白，残留在成品中的CHOHCP可能会引起免疫应答，甚至给病人带来病理反应。同时残留HCP也有可能会降低蛋白药物效果。因此生物医药企业在质控环节必须对生产的半成品或成品的HCP进行定量测定。
目前，用于HCP测定的方法主要是ELISA法，ELISA方法作为一种经典的方法，因其高灵敏度和特异性被广泛应用。药典2020版规定药物中宿主细胞蛋白质残留量用酶联免疫吸附法测定，应不高于蛋白质总量的0.01％。商品化ELISA试剂盒在制备时消除不同CHO细胞系引起的HCP的差异，从而适用于一系列重组CHO细胞系。但是商业化试剂盒价格昂贵，标准品储量有限，会在一定时间内更换标准品与特异性抗血清批号，这些原因也极大地限制了该方法的应用。有研究表明：(1)不同检测试剂盒之间结果存在较大偏差；(2)同一检测试剂和替换标准品后测得结果有较大差异；(3)标准品的组成成分和比例存在较大差异。因为对于不同的基因工程产品，其分子量大小、等电点不同，生产工艺中所采用的纯化方法不同，以致在产品中残留的CHO细胞蛋白的成分和比例有较大差异，所以只有根据不同的生产工艺、制备工艺特异的CHO细胞蛋白标准品和特异性抗血清，建立相应的检测方法，才能真实的反应供试品的CHO细胞蛋白残留量。
另外，虽然已有专利报道过CHO专属性检测试剂盒的检测方法，但是其抗原依然是CHO细胞不同亚型的混合物，特异性明显降低。而且并未体现专属性抗体的覆盖率。
相比于单克隆抗体，利用多克隆抗体可以提高检测的灵敏度，但普遍存在特异性较差的问题。因此，提供一种免疫效果好的免疫方式来提高多抗的特异性具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒及检测方法，该试剂盒具有特异性高、灵敏度高、检测效率高，可同时检测多个样品，定量限达到5ppm，使用设备简单，操作方便，检测成本低。另外，本发明采用特定免疫方式获得的CHODG44捕获抗体和CHODG44报告抗体可特异性识别CHO宿主蛋白，具有安全性高、特异性好的优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒，包括：包被有CHODG44捕获抗体的酶标板、生物素标记的CHODG44报告抗体和酶标记的链霉亲和素；
所述CHODG44捕获抗体、CHODG44报告抗体均由CHO宿主细胞蛋白作为免疫原免疫兔子制得，所述CHODG44捕获抗体、CHODG44报告抗体识别CHO宿主细胞蛋白不同的抗原表位。
一些实施方案中，制备所述CHODG44捕获抗体和CHODG44报告抗体时，免疫的兔子的数量为12只，每只兔子注射3～10次免疫原，每次注射0.1-10mg。一些具体实施例中，每只兔子注射10次免疫原，每次注射2.5mg。
给予注射免疫原时，第一次注射时免疫原混合Freund完全佐剂，在之后的注射中，免疫原混合Freund不完全佐剂。具体地，第一次注射时，每1ml蛋白(含0.1-10mgCHO宿主细胞蛋白)混合1ml Freund完全佐剂，之后每次注射时，每1ml蛋白混合1ml Freund不完全佐剂，采用多点注射，共免疫10次。
本发明中，以CHO宿主细胞蛋白作为免疫原免疫兔子制得的CHODG44抗体为多克隆抗体，选择一部分多克隆抗体作为捕获抗体包被酶标板，用于捕获待测样本中的抗原。选择另外一部分作为报告抗体，用于检测和定量CHO宿主细胞蛋白。其中，捕获抗体和报告抗体识别CHO宿主细胞蛋白不同的抗原表位。
本发明试剂盒基于双抗体夹心法和生物素-亲和素信号放大系统构建，加入待测样本后，待测样本被酶标板上的CHODG44捕获抗体捕获，然后加入生物素化的报告抗体IgG，形成CHODG44捕获抗体-CHO细胞宿主蛋白-生物素化的CHODG44报告抗体的双抗夹心复合物。该双抗体夹心复合物中的生物素化报告抗体IgG再与辣根过氧化物酶标记的亲和素结合，形成CHODG44捕获抗体-CHO细胞宿主蛋白-生物素化的CHODG44报告抗体-辣根过氧化物酶标记的亲和素复合物，抗原信号放大，加入底物，显色，450nm波长下测定吸光值。吸光值与CHO细胞宿主蛋白的含量成正比。
本发明中，所述酶标记的链霉亲和素为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
本发明提供的试剂盒还包括显色液、封闭液和终止液。
其中：
所述显色液为TMB。
所述终止液为硫酸溶液，一些具体实施例中，硫酸溶液的浓度为1mol/L。
所述封闭液为含BSA的PBST缓冲液，一些具体实施例中，封闭液为含0.01g/ml BSA的PBST缓冲液，其配制过程为：1g BSA加入到100mL的PBST缓冲液中，0.22μm滤膜过滤。
本发明试剂盒还包括标准品，所述标准品为CHODG44宿主细胞蛋白。
本发明还提供一种检测生物医药制品中CHO细胞宿主蛋白残留的方法，利用本发明试剂盒检测CHO细胞宿主蛋白残留，包括以下步骤：
步骤1：用CHODG44捕获抗体包被酶标板；
步骤2：向步骤1制得的酶标板中加入待测样本和标准品溶液，孵育，洗涤；
步骤3：向步骤2洗涤后的酶标板中加入生物素标记的报告抗体，孵育，洗涤；
步骤4：向步骤3洗涤后的酶标板中加入酶标记的链霉亲和素，孵育，洗涤；
步骤5：向步骤4洗涤后的酶标板中加入显色液显色，孵育，加入终止液终止反应，于450nm波长下测定吸收度值。
一些实施方案中，CHODG44捕获抗体浓度为5μg/mL～10μg/mL；
生物素化标记的报告抗体的浓度为1.25μg/mL～10μg/mL；
辣根过氧化物酶的工作浓度为0.01μg/mL～2μg/mL。
显色液显色反应的温度20℃～30℃，反应时间为5min～20min。
一些具体实施例中，CHODG44捕获抗体浓度为5μg/mL，生物素化标记的报告抗体的浓度为2.5μg/mL。
本发明试剂盒利用CHO宿主细胞蛋白作为标准品和抗原制备抗体，具有特异性高、灵敏度高、检测效率高的特点，可同时检测多个样品，定量限达到5ppm，使用设备简单，操作方便，检测成本低。
附图说明
图1示MAbSelect亲和柱的IgG洗脱图；
图2示蛋白从酸性(PH3.0)到中性(PH7.0)中CHO宿主蛋白荧光染色经分析胶图；
图3示酸性(PH3.0)到中性(PH7.0)宿主蛋白抗CHO宿主蛋白抗体二维免疫印迹覆盖率；
图4示中性(PH7.0)到碱性(PH10.0)宿主蛋白抗CHO宿主蛋白抗体二维免疫印迹覆盖率；
图5示CHO宿主细胞蛋白夹心ELISA第一次条件优化的标准曲线图；
图6示CHO宿主细胞蛋白夹心ELISA第二次条件优化的标准曲线图；
图7示CHO宿主细胞蛋白夹心ELISA最终标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 CHODG44抗原、抗体的制备
1.1 CHO宿主细胞蛋白免疫原的制备
1.1.1模拟实际生产工艺培养细胞：复苏构建的CHODG44冻存细胞，使用HM003培养基摇瓶培养，传代至450mL以及细胞活率在90％以上结束，转移至5升罐继续培养。
1.1.2收集细胞：3,000x g，30min离心收集包含CHO-HCP抗原的上清液，并使用0.2微米的无菌薄膜进行无菌化过滤。
1.1.3蛋白浓缩：对过滤好的上清液进行浓缩，先使用新的8KD浓缩包进行浓缩，然后使用Millipore的TFF蛋白浓缩系统进一步浓缩，并使用PBS进行透析，最终产品为PBS溶解的蛋白溶液。
1.1.4蛋白检测：利用Human IgG ELISA方法检测，免疫原中只含有极低量的IgG残留(ArrayBridge human IgG ELISA，10ppm)。BCA定量检测(检测三个浓度，每个浓度3个平行，取标准曲线中间的读数用来定量)，HCP的蛋白浓度测定值为3.28mg/ml，储存于-20℃备用。
1.2兔抗CHO宿主细胞抗体的制备
1.2.1 CHO宿主细胞蛋白免疫12只兔子(新西兰大白兔，雄性，免疫前体重达到2-3KG)。另外，多只兔子可以提供更多的抗体类型，因为不同的兔子个体产生的抗体种类上会略有不同。
1.2.2剂量：每只兔子每次注射0.1-10mg的免疫原。第一次注射时免疫原混合Freund完全佐剂，在之后的注射中，免疫原混合Freund不完全佐剂。采用多个部位肌注免疫法(三个注射点在后背，其他三个注射点在腹部)。
1.2.3免疫进程：经3-10次免疫，目的是增大抗体的产量和提高抗体的质量。
经研究发现，每只兔子每次注射2.5mg的CHO宿主细胞蛋白，第一次注射时，每1ml蛋白混合1ml Freund完全佐剂，之后每次注射时，每1ml蛋白混合1ml Freund不完全佐剂，采用多点注射，共免疫10次，该免疫方式的效果最优，优先以该方法获得的免疫血清作为捕获抗体的来源。
实施例2 CHO宿主细胞蛋白的二维电泳和二维免疫印迹分析与抗体的覆盖率
2.1纯化抗体；
2.1.1按照实施例1的方法免疫兔子，从12只兔子得到的总免疫血清中取60ml，经过0.45μm滤膜过滤后通过GE Life Sciences的亲和柱进行纯化。IgG用50mM,pH 2.8的甘氨酸溶液洗脱。洗脱结果见图1。
2.1.2IgG洗脱后，样品立刻放入4LPBS中4℃搅拌透析过夜，立刻透析的原因是尽可能快的去除酸性溶液以减少酸诱导的IgG变性，直到缓冲液没有变化。
2.1.3通过Nano-Drop法测定蛋白浓度为4.7mg/ml，总共510mg的IgG被纯化。透析好的IgG储存于4℃备用。分出部分IgG(252mg)用PBS调节浓度至4mg/ml分装，1ml/支，作为捕获抗体储存于-20℃备用。
2.2报告抗体的生物素化标记
使用Thermo公司的生物素标记试剂盒(Cat.No.PI-21335)将部分已纯化的IgG255mg(实施例1中免疫兔子获得的抗体)进行生物素标记。生物素标签步骤采用说明书的推荐。生物素与IgG的摩尔比为20：1。
2.3基于二维凝胶电泳的总蛋白检测和免疫印迹覆盖率分析；
CHO宿主细胞总蛋白的检测是采用18cm的IPG胶，通过Bio-Rad的等电聚焦电泳进行的。目的是为尽可能多的检测CHO宿主细胞蛋白。同时，胶的选取也要能够满足二维凝胶电泳所需要的分析率和可重复性。
2.4免疫印迹分析
直接使用从12只免疫的兔子中获得的血清进行免疫印迹的分析。报告抗体为：IRDye 800 CW羊抗兔抗体(Li-Cor,www.licor.com.IRDye 800 CW羊抗兔IgG；目录号：925-32211)，最终信号通过Li-CorOdyssey远红外系统检测。二维免疫印迹图像和二维总蛋白染色图像通过PDQuest程序分析(Bio-Rad,USA)，分析条件设置为同样的参数。
2.5 CHO宿主细胞蛋白抗体覆盖率的免疫印迹分析
二维免疫印迹实验覆盖率分析过程如下：
2.5.1 10-20％的SDS-Tris-甘氨酸凝胶；
2.5.2荧光染色；
2.5.3 1000μg样品上样于18cmIPG胶进行等电聚焦电泳；
2.5.4用从12只兔子得到的抗CHO宿主细胞蛋白血清结合；
2.5.5一抗来源：1:500稀释的抗血清；
2.5.6蛋白成像：Bio-Rad ChemiDoc系统；
2.5.7免疫印迹成像：Li-Cor Odyssey系统；
2.5.8二维覆盖率分析：Bio-RadPDQuest。所用参数：灵敏度：8.00；型号范围：11；最小峰值：4043。结果如图2。
2.6宿主细胞蛋白覆盖率二维免疫印记分析结果
2.6.1总体蛋白经荧光染色检测有348个点(包括被免疫印迹检测未被荧光染色检测到的7个增加的点。这个现象的发生是由于1)一些蛋白的糖基化导致蛋白质不能很好的染色。2)免疫印迹从一抗，二抗和二抗的荧光标记三个层次使得信号得到了放大，由此导致了免疫印迹检测更灵敏，所以总体蛋白的一些点在蛋白染色中不能被检测而在免疫印迹中却可以被检测到。结果如图3，图4。
2.6.2总体蛋白被抗CHO宿主细胞蛋白抗体识别有251个点。
2.6.3专属性抗CHO宿主细胞蛋白抗体覆盖率为251/348＝72％(Bio-Rad报道Cygnus抗体的覆盖率为47％)。双向凝胶电泳总体蛋白染色和抗CHO宿主细胞蛋白覆盖率二维免疫印迹统计总结：基于总体宿主细胞蛋白和抗体辨识的蛋白点分析，抗CHO宿主细胞蛋白抗体的覆盖率达到CHO宿主细胞蛋白的72％。
实施例3专属CHO宿主细胞蛋白ELISA检测方法开发及验证
基于兔抗CHO宿主细胞蛋白抗体的一种灵敏的CHO宿主细胞蛋白ELISA的开发。使用从12只兔子的抗血清库中纯化出的IgG(即CHODG44捕获抗体)作为包板抗体，从样品库中(实施例1中免疫兔子获得的抗体)生物素化的IgG作为报告抗体用于检测和定量从CHO获得的宿主细胞蛋白。夹心ELISA的原理是由于多种宿主细胞蛋白每一种都可以产生多种抗体，如果一个抗原表位被捕获抗体占用，那么其他的抗原表位就可以被用来作为报告抗体的结合位点。
3.1方法说明：
3.1.1仪器
1)酶标仪
2)洗板机
3)微孔板恒温振荡器
4)移液器
3.1.2溶液准备
1)1×PBS缓冲液：取100mL的10×PBS缓冲液加入900mL的超纯水，混匀后用0.22μm滤膜过滤。2-8℃保存，有效期6个月。
2)PBST缓冲液(Washbuffer)：取1mLTween 20到1L 1×PBS缓冲液中混匀，并用0.22μm滤膜过滤。2-8℃保存，有效期7天。
3)封闭液/样品稀释液(Blockingbuffer/Diluentbuffer)：取1g BSA到100mL的PBST缓冲液中混匀，并用0.22μm滤膜过滤。2-8℃保存，有效期1个月。
4)终止液(Stop solution)：取浓硫酸2mL加入34.8mL超纯水制成1mol/L H2SO4。室温保存，有效期6个月。
5)捕获抗体：用1×PBS缓冲液将4mg/mL的捕获抗体稀释成1.25～20μg/mL的工作浓度(现配现用)。
6)报告抗体：用封闭液/样品稀释液将3mg/mL的报告抗体稀释成0.5μg/mL～20μg/mL的工作浓度(现配现用)。
7)链霉亲和素-HRP：用封闭液/样品稀释液将其稀释成0.01μg/mL～3μg/mL的工作浓度(现配现用)。
8)标准品制备：取24.3μL的40μg/mL的标准品加入1176μL的样品稀释液配制成浓度为810ng/mL的标准品，然后3倍梯度稀释8个浓度：810ng/mL、270ng/mL、90ng/mL、30ng/mL、10ng/mL、3.33ng/mL、1.11ng/mL、0ng/mL。
表1标准品溶液稀释
Figure BDA0002868672790000081
Figure BDA0002868672790000091
3.1.3操作步骤
洗板方式：采用手动洗板或洗板机洗板。
1)捕获抗体包被
取稀释好的的捕获抗体包被液加入酶标板各孔，每孔100μL；封口后，置于2-8℃条件下孵育16～92h。
2)洗板
取酶标板用300μL/孔PBST洗板4次，将板在滤纸上拍干。
3)封闭
在每个孔中加入250μL封闭液，封口后，在常温条件下200rpm振摇孵育90～180分钟。
4)洗板
孵育完成后，每孔加300μLPBST洗板4次。将板在滤纸上拍干。
5)加样
标准品孔中加入810ng/mL、270ng/mL、90ng/mL、30ng/mL、10ng/mL、3.33ng/mL、1.11ng/mL、0ng/mL标准品溶液各100μL，每个浓度设置3复孔；
样品孔加入稀释后样品各100μL，每个设置3复孔。封口后，在常温条件下200rpm振摇孵育90±5分钟。
6)洗板
孵育完成后，每孔加300μLPBST洗板6次，将板在滤纸上拍干。
7)加报告抗体
每孔中加入100μL用样品稀释液稀释的报告抗体工作液，封口后，在常温条件下200rpm振摇孵育45±2分钟。
8)洗板
孵育完成后，每孔加300μLPBST缓冲液洗板6次，将板在滤纸上拍干。
9)加链霉亲和素-HRP
每孔中加入100μL用样品稀释液稀释的链霉亲和素-HRP，封口后，在常温条件下200rpm振摇孵育30±2分钟。
10)洗板
孵育完成后，每孔加300μLPBST缓冲液洗板6次，将板在滤纸上拍干。
11)显色
每个工作孔中分别加100μL的TMB显色液，封口，室温避光孵育5～20分钟，工作孔出现蓝色。
12)终止
每孔分别加100μL的终止液，轻敲微孔板混匀，酶反应终止，原来显蓝色的孔将会变成黄色。在450nm波长测吸光值，并根据标准曲线将样品的吸光值代入方程，求得待测样品中宿主细胞蛋白的含量。
按下式计算CHO宿主细胞蛋白残留量：
样品CHO宿主细胞蛋白残留量％＝待测样品测定均值×10-6÷待测样品稀释后的蛋白浓度×100％。
3.1.4根据以上方法对捕获抗体浓度和报告抗体浓度及二抗浓度进行优化。
3.2方法优化
3.2.1取5μg/mL捕获抗体(coating IgG)包被酶标板，加入样品，再分别与10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL的报告抗体相结合，最后加链霉亲和素-HRP和TMB显色，结果如图5。
3.2.2取10μg/mL捕获抗体(coating IgG)包被酶标板，加入样品，再分别与10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL的报告抗体相结合，最后加链霉亲和素-HRP和TMB显色，结果如图6。
3.2.3结果显示捕获抗体的最优浓度为5μg/mL～10μg/mL；报告抗体的最优浓度范围为1.25μg/mL～10μg/mL；链霉亲和素-HRP的使用浓度范围为0.01μg/mL～2μg/mL。其中5μg/mL捕获抗体(coating IgG)包被酶标板，报告抗体浓度为2.5μg/mL时的标曲如图7。
3.3方法验证
3.3.1取抗体注射液制剂缓冲液、抗体原液(40μg/mL)、CHO宿主细胞蛋白标准品(40μg/mL)各取24.3μL加入1176μL的封闭液配制成浓度为810ng/mL的溶液，然后3倍梯度稀释8个浓度：810ng/mL、270ng/mL、90ng/mL、30ng/mL、10ng/mL、3.33ng/mL、1.11ng/mL、0ng/mL，每个浓度设三个复孔，然后依据检验方法进行检测，做曲线拟合。
3.3.2取抗体注射液制剂缓冲液、抗体注射液制剂缓冲液加标20ng/mL、抗体原液(4mg/mL)、抗体原液(4mg/mL)加标100ng/mL，亲和层析收集液(0.005mg/mL)、亲和层析收集液(0.005mg/mL)加标100ng/mL，阴离子层析收集液(2mg/mL)、阴离子层析收集液(2mg/mL)加标100ng/mL，超滤收集液(2mg/mL)、超滤收集液(2mg/mL)加标100ng/mL，每个样品做3复孔，依据检验方法检测，计算回收率和RSD值。
3.3.3结果分析
表2
Figure BDA0002868672790000111
实验结果表明，在不同的成分存在的条件下本发明试剂盒均能准确检测出CHO宿主蛋白残留量。
3.4准确度/重复性/中间精密度/定量限
3.4.1制备抗体原液(4mg/mL)溶液一份、抗体原液(4mg/mL)加标20ng/mL溶液6份，每份溶液做3个复孔，然后依据检验方法进行检测，由3名检测人员每人做两次实验，分别计算测定结果的回收率及三名检测人员之间的回收率的RSD值。
3.4.2结果分析：
标准曲线相关系数R2≥0.990，每名实验人员重复两次，每次6个平行样，每个原液加标20ng/mL样品的回收率均应为70％～130％之间，样品三复孔的CV％≤25％；每名实验人员不同重复及不同实验人员之间的加标回收率的RSD≤25％。
3名实验人员6次实验结果统计，结果见表3。
表3
Figure BDA0002868672790000121
Figure BDA0002868672790000131
3.4.3验证结果
相关系数R2均≥0.990，每个样品加标20ng/mL的加标回收率均在70％～130％之间；各样品三复孔之间的CV％均小于25％；每名实验人员6个平行样的回收率的RSD值小于25％；相同实验人员两次实验之间的回收率的RSD值小于25％；3名实验人员6次实验结果的回收率的RSD值小于25％；结果证明该方法的准确性、重复性、中间精密度均很高。该夹心ELISA方法检测限值可达到3.3ng/mL，检测抗体原液(4mg/mL)加标20ng/mL溶液回收率符合规定，证明该试剂盒的定量限为5ppm。
3.5线性与范围
3.5.1制备抗体原液(4mg/mL)加标5个不同浓度(600ng/mL、300ng/mL、150ng/mL、75ng/mL、20ng/mL)的样品溶液，每份溶液做3个复孔，然后依据检验方法进行检测。检测HCP含量的测定结果与样品中加标浓度呈正比关系的程度。
3.5.2根据验证实验中的线性、准确度、精密度(重复性、中间精密度)，确定范围。
标准曲线上各点的浓度测定值，确认该方法的验证范围(20ng/mL～600ng/mL)。
3.5.3可接受标准：标准曲线相关系数R2≥0.990，回归方程曲线相关系数应R2≥0.980，CV％≤25％。本方法能够准确检测的范围为20ng/mL～600ng/mL。
3.5.4结果分析：相关系数R2为0.999，原液加标600ng/mL溶液的加标回收率为119％；原液加标300ng/mL溶液的加标回收率为116％；原液加标150ng/mL溶液的加标回收率为104％；原液加标75ng/mL溶液的加标回收率为98％；、原液加标20ng/mL溶液的加标回收率为94％；加标回收率均在70％～130％之间；每个样品三复孔的CV％均小于25％。线性回归方程的曲线为Y＝1.212X-16.649，R2为0.999；确定本方法能够准确检测的范围为20ng/mL～600ng/mL。
3.6耐用性
3.6.1实验目的：通过改变实验过程中包被时间、显色时间，来测定此改变对试验结果的影响。通过对样品进行反复冻融3次然后检测，确定样品的冻融稳定性。
3.6.2实验方法：
改变显色时间：制备抗体原液(4mg/mL)溶液1份，抗体原液(4mg/mL)加标100ng/mL溶液3份，每份溶液做3个复孔，按实验方法进行检测。在实验过程中加入显色液后，反应时间分别为10min和14min。然后计算抗体原液的加标回收率及偏差。
反复冻融稳定性：将抗体原液置于-80℃过夜，放于2～8℃冰箱复溶，反复冻融3次，分别将冻融1次、冻融2次和冻融3次的抗体原液用样品稀释液稀释至终浓度4mg/mL的溶液，再制备样品加标100ng/mL的溶液3份，每份溶液做3个复孔，按实验方法进行检测。然后分别计算冻融1次、冻融2次和冻融3次的抗体原液的加标回收率及偏差。
延长包被时间：制备抗体原液(4mg/mL)溶液1份、抗体原液(4mg/mL)加标100ng/mL溶液3份，每份溶液做3个复孔，在实验过程中向包被板每孔中加入100μL用PBS稀释至5μg/mL的捕获抗体,置于2～8℃冰箱，分别孵育48h和72h，然后按试验方法进行检测，然后计算供试品的加标回收率及偏差。
回收率＝(加标样品测定均值－空白样品测定均值)/样品中理论加标浓度×100％
偏差＝|改变条件样品回收率平均值－正常条件样品回收率平均值|/正常条件样品回收率平均值×100％
3.6.3可接受标准
标准品剂量反应曲线的R2≥0.990，回收率应为70％～130％，CV％≤25％；回收率的偏差应≤20％。
3.6.4结果分析：
每次实验标准品曲线相关系数R2均大于0.990；各样品三复孔之间的CV％均小于25％；改变条件样品回收率与正常条件下样品回收率之间的偏差为12.0％、5.4％、9.8％、6.5％、2.2％、3.3％、9.8％均小于20％。见表4。
表4
Figure BDA0002868672790000151
3.6.5结果讨论
结果显示，该方法在包被16-92h，显色10-14分钟，对结果无显著影响。样品经过3次冻融对结果无显著影响。
实施例4与商品化试剂盒比较优势
4.1实验方法
取单抗亲和层析收集液、低PH孵育收集液、阴离子层析收集液分别取3批样品，按照本发明及Cygnus公司CHO宿主蛋白残留量检测试剂盒方法分别对这3批样品进行检测，比对检测结果。
4.2结果分析
对于同一样本，本发明试剂盒检测的蛋白残留量检测值明显高于试Cygnus试剂盒。Cygnus试剂盒的检测下限为0.0008％，而专属性方法检测4mg/mL样品中加标20ng的宿主细胞蛋白，经过符合ICH验证的ELISA方法定量限达到5ppm，明显优于试剂盒方法。
表5
Figure BDA0002868672790000161
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒，其特征在于，包括：包被有CHODG44捕获抗体的酶标板、生物素标记的CHODG44报告抗体和酶标记的链霉亲和素；
所述CHODG44捕获抗体和CHODG44报告抗体识别均由CHO宿主细胞蛋白作为免疫原免疫兔子制得，两种抗体识别CHO宿主细胞蛋白不同的抗原表位。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫的兔子的数量为12只，每只兔子注射3～10次免疫原，每次注射0.1-10mg。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述注射为：第一次注射时免疫原混合Freund完全佐剂，在之后的注射中，免疫原混合Freund不完全佐剂。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CHODG44捕获抗体和CHODG44报告抗体为多克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的链霉亲和素为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括显色液和终止液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸溶液。
9.根据权利要求1～8任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准品，所述标准品为CHODG44宿主细胞蛋白。
10.一种检测生物医药制品中CHO细胞宿主蛋白残留的方法，其特征在于，利用权利要求1～9任一项所述的试剂盒检测CHO细胞宿主蛋白残留，包括以下步骤：
步骤1：用CHODG44捕获抗体包被酶标板；
步骤2：向步骤1制得的酶标板中加入待测样本和标准品溶液，孵育，洗涤；
步骤3：向步骤2洗涤后的酶标板中加入生物素标记的CHODG44报告抗体，孵育，洗涤；
步骤4：向步骤3洗涤后的酶标板中加入酶标记的链霉亲和素，孵育，洗涤；
步骤5：向步骤4洗涤后的酶标板中加入显色液显色，孵育，加入终止液终止反应，于450nm波长下测定吸收度值。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117192107A (zh) * 2023-09-11 2023-12-08 福建基诺厚普生物科技有限公司 一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105021824A (zh) * 2015-07-06 2015-11-04 上海优者生物科技有限公司 用于定量检测生物医药制品中残留cho宿主细胞蛋白的elisa试剂盒及其使用方法
CN105823891A (zh) * 2016-04-20 2016-08-03 北京科兴中维生物技术有限公司 一种定量检测人二倍体细胞残留蛋白的试剂盒
CN105884886A (zh) * 2015-01-26 2016-08-24 武汉大学 检测重组蛋白提取物中残留杂蛋白的特异性抗体及检测试剂
CN106802349A (zh) * 2016-12-30 2017-06-06 广东华南联合疫苗开发院有限公司 Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法
CN111272993A (zh) * 2020-03-11 2020-06-12 赛秦(上海)生物技术有限公司 一种用于生物制品残留物检测试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105884886A (zh) * 2015-01-26 2016-08-24 武汉大学 检测重组蛋白提取物中残留杂蛋白的特异性抗体及检测试剂
CN105021824A (zh) * 2015-07-06 2015-11-04 上海优者生物科技有限公司 用于定量检测生物医药制品中残留cho宿主细胞蛋白的elisa试剂盒及其使用方法
CN105823891A (zh) * 2016-04-20 2016-08-03 北京科兴中维生物技术有限公司 一种定量检测人二倍体细胞残留蛋白的试剂盒
CN106802349A (zh) * 2016-12-30 2017-06-06 广东华南联合疫苗开发院有限公司 Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法
CN111272993A (zh) * 2020-03-11 2020-06-12 赛秦(上海)生物技术有限公司 一种用于生物制品残留物检测试剂盒

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117192107A (zh) * 2023-09-11 2023-12-08 福建基诺厚普生物科技有限公司 一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒

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