CN109970863A - 一种具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽及其用途，属于生化药学技术领域。所述双功能多肽是降糖多肽与免疫调节多肽的融合多肽，所述降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性连接肽。本发明的降糖及免疫调节双功能多肽，既具有GLP‑1类似物的功能，促进胰岛β细胞的增殖，降低1型糖尿病病人的血糖并降低糖化血红蛋白，降低2型糖尿病病人的血糖、抑制进食并降低糖化血红蛋白，同时又具有1型糖尿病自身抗原免疫调节肽功能，调节免疫，抑制病理性的免疫攻击。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽及其用途，属于生化药学技术领域。
背景技术
据发明人所知，1型糖尿病(T1DM)是一种由于胰腺β细胞遭受自身免疫攻击被破坏而导致胰岛素绝对缺乏的疾病。目前，1型糖尿病的研究主要分为前期诊断和预防阶段，以及中后期的治疗阶段。其中，诊断和预防主要针对1型糖尿病的发病机理而研究相应的诊断方法和预防措施。1型糖尿病的发病机制涉及T细胞介导的自身免疫攻击以及在易感个体中B淋巴细胞产生针对β细胞的抗体反应，因此患者在出现临床症状前的较长一段时间内，体内就有针对胰岛β细胞的自身免疫反应存在，这就为疾病的诊断和预防提供了基础。目前研究者已经发现，在出现高血糖临床症状之前，自身免疫抗原可在数月或数年之前就可以被检测到。针对这些抗原，目前已经研制了多种疫苗，其靶点主要集中在自身免疫性T细胞；这些疫苗能够诱导保护性免疫耐受，改善病理性的自身免疫；免疫耐受通过抑制效应T细胞，并激活调节性T细胞(Treg细胞)，起到改善病理性自身免疫的效果，延缓糖尿病发展。
已经确诊为高血糖的1型糖尿病患者主要以治疗为主，胰岛素仍然是临床治疗的主要药物，加强的胰岛素治疗也是目前临床上控制1型糖尿病的主要的治疗手段，而胰岛移植、干细胞移植等方法也逐渐出现，但是都处于研究阶段，离应用还存在一定的距离。因此靶向T1DM其他缺陷的治疗也成为一种良好的治疗方式，特别是T1DM患者常见的治疗副作用，如体重增加，胰岛素剂量的增加，注射次数的增加和低血糖等。由于缺乏新的治疗方式，导致T1DM患者要不断地努力控制血糖。胰高血糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)已被认为是T1DM患者胰岛素的伴随疗法，因为它们能够保持或减轻体重、降低低血糖风险以及降低胰高血糖素水平等。GLP-1RA能够保护β细胞，因此GLP-1RA可以通过停止自身免疫破坏或增加β细胞再生来增加T1DM患者的β细胞量。在诊断时，大多数1型糖尿病患者仍然具有分泌胰岛素的能力，相当于非糖尿病个体的20-30％，因此，存在保持和增加β细胞量的机会，这可以通过GLP-1RA的治疗来实现，这也将改善低血糖的风险，因为功能性β细胞的参与更有利于胰高血糖素的反应。
发明人分别于2016.12.20、2016.09.06申请了申请号为CN201611222521.7、CN20161080519.7,名称为《降糖调脂肽——Progly肽的设计及其用途》、《P8降糖肽的设计及其用途》的中国发明专利申请，其中涉及的Progly肽、P8肽均为GLP-1类似物，能够促进胰岛β细胞的增殖，有效降低1型糖尿病小鼠的空腹血糖，改善体重等，可以作为1型糖尿病的辅助治疗药物。
热休克蛋白60(Hsp60)是一种主要的自身抗原，在1型糖尿病患者体内已经检测到高水平的抗Hsp60抗体，抗体的滴度与疾病严重程度正相关。其中Hsp60上437位～460位的一段特异性多肽P277肽，其序列为VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED，是一种抗原决定簇，能特异地与效应T细胞反应。P277肽与Hsp60一样具有引起血管内皮损伤的副作用，P227肽免疫的C57BL/6小鼠，能够引起严重的血管内皮损伤，在高脂饲养新西兰大白兔模型上，P277肽免疫诱发了严重动脉粥样硬化，并且发现大量P277抗体聚集在动脉硬化斑块周围，说明P277肽不仅存在调节免疫反应的T表位，还存在致动脉粥样硬化的B表位。
发明人于2016.10.28申请了申请号为CN201610949156.3、申请公布号为CN106518987A、名称为《新型糖尿病免疫调节肽-VP肽的设计及其用途》的中国发明专利申请，其中，通过表位扫描技术，精确扫描到P277肽的B表位，在最大程度保证T表位完整性和B表位空间结构的前提下，通过氨基酸突变来改造B表位，得到VP肽，能够保持免疫调节作用的同时，消除血管内皮损伤的副作用。
目前1型糖尿病尚无有效的根治方法。其临床治疗的最大瓶颈就是无法实现促进胰岛β细胞增殖的同时，消除自身反应性T细胞对β细胞造成的免疫攻击。在上述已有成果的基础上，发明人将具有降糖作用的Progly肽与具有免疫调节作用的VP肽，通过一个柔性接头G融合在一起，获得了一条具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽:Progly-VP。该多肽在促进胰岛β细胞增殖的同时，改善新生胰岛的炎症微环境，消除了自身反应性T细胞对新生β细胞的免疫攻击，显著提高了1型糖尿病的预防和治疗的效果。后续研究表明，具有降糖作用的P8肽与具有免疫调节作用的VP肽，在没有柔性接头的条件下直接融合在一起，获得融合多肽P8-VP。该多肽也具有降糖及免疫调节的双重作用。该多肽在促进胰岛β细胞增殖的同时，可以改善新生胰岛的炎症微环境，消除自身反应性T细胞对新生β细胞的免疫攻击，显著提高了1型糖尿病的预防和治疗的效果。最后，我们把此种设计思路进一步扩展，发现降糖多肽与免疫调节肽通过柔性连接肽，或没有柔性连接肽连接，得到的融合多肽均具有降糖及免疫调节的双重作用。此类融合多肽在促进胰岛β细胞增殖的同时，可以改善新生胰岛的炎症微环境，消除自身反应性T细胞对新生β细胞的免疫攻击，最终显著提高1型糖尿病的预防和治疗的效果，如后续获得的Progly-P20，P8-P20，Progly-P9，P8-P9。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：实现促进胰岛β细胞增殖的同时，改善新生胰岛的炎症微环境，消除自身反应性T细胞对β细胞造成的免疫攻击，获得具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽，提高了1型糖尿病的预防和治疗的效果。
本发明的主要研究过程如下：首先筛选并设计GLP-1的类似物。发明人利用计算机模拟分析，设计能够与GLP-1受体结合的多肽。然后利用构建好的GLP-1受体稳转细胞株作为筛选平台，先后发现Progly肽及P8肽具有GLP-1受体激活作用，并可以在体内外促进胰岛β细胞的增殖。接下来利用免疫细胞体外筛选体系筛选具有抗炎作用的免疫调节多肽。我们在1型糖尿病自身抗原HSP60,GAD65及胰岛素自身抗原中先后发现了VP肽、P20肽及P9肽等一系列具有抗炎作用的免疫调节多肽。最后将具有降糖作用的Progly肽或P8肽与具有免疫调节作用的VP肽、P20肽及P9肽，通过一个柔性接头G或没有柔性接头融合在一起，获得了具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽Progly-VP、Progly-P20、Progly-P9,P8-VP、P8-P20,P8-P9。该类多肽在促进胰岛β细胞增殖的同时，可以改善新生胰岛的炎症微环境，消除自身反应性T细胞对新生β细胞的免疫攻击，显著提高1型糖尿病的预防和治疗的效果。
后续研究表明，降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性，只有当降糖肽位于氨基端，而免疫调节肽位于羧基端时，获得的融合肽才具有降糖及免疫调节的双功能，反之相关作用丧失。以Progly、VP链接为例，只有当以Progly-VP此种方式相连时具有药效，而当以VP-Progly此种方式链接时，药效丧失。
P8肽与VP相连的情形与Progly\VP相连的情形一致，仍具有方向性。即只有当以P8-VP此种方式相连时具有药效，而当以VP-P8此种方式链接时，药效丧失。
而且该降糖及免疫调节双功能的发挥，依赖于此两种肽的融合，如果是等分子混合，仍然无法获得降糖及免疫调节的双功能作用。
所述降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽，或链接几个柔性多肽，并不影响降糖及免疫调节双功能的发挥。以Progly-VP相连及P8-VP相连为例。
本发明所采用的技术方案是：
一种具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽，是降糖多肽与免疫调节多肽的融合多肽，所述降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性连接肽。
进一步地，其中所述降糖多肽为GLP-1类似物，所述免疫调节肽为1型糖尿病自身抗原中的免疫调节多肽。
其中，所述GLP-1类似物包括但不限于下述之一：
Progly肽：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGP(SEQ ID NO.1)
P8肽：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSSGAPPPS(SEQ ID NO.2)。
所述1型糖尿病自身抗原中的免疫调节多肽包括源于1型糖尿病自身抗原HSP60的免疫调节肽、源于1型糖尿病自身抗原GAD65的免疫调节肽或源于胰岛素自身抗原的免疫调节肽。
更具体地，
(1)所述源于1型糖尿病自身抗原HSP60的免疫调节肽包括但不限于下述之一：
VP肽：VLGGGCRCIPALDSLTPANED(SEQ ID NO.3)；
P361肽：KGDKAHIEKRIQEITEQLDI(SEQ ID NO.4)；
P76肽：DGVTVAKSIDLKDKYKNIGA(SEQ ID NO.5)
(2)所述源于1型糖尿病自身抗原GAD65的免疫调节肽包括但不限于下述之一：
P20肽：EYVTLKKMREIIGWPGGSGD(SEQ ID NO.6)；
P524肽：SRLSKVAPVIKARMM(SEQ ID NO.7)；
P290肽：AALGIGTDSVILIKCDE(SEQ ID NO.8)；
P247肽：NMYAMMIARFKMFPEVKEKG(SEQ ID NO.9)；
P260肽：PEVKEKGMAALPRLIAFTSE(SEQ ID NO.10)；
P509肽：IPPSLRTLEDNEERMSRLSK(SEQ ID NO.11)；
P524肽：SRLSKVAPVIKARMMEYGTT(SEQ ID NO.12)；
(3)所述源于胰岛素自身抗原的免疫调节肽包括但不限于下述之一：
P9肽：SHLVEALALVAGERG(SEQ ID NO.13)；
P13肽：EALYLVCGERG(SEQ ID NO.14)
P621肽：HGDTTFEYQD(SEQ ID NO.15)
本发明中，所述的连接肽优选G或多聚G；但不限于此。
本发明还公开了上述降糖及免疫调节双功能多肽用于制备治疗或预防1型糖尿病药物或药物组合物的用途。
公开了上述降糖及免疫调节双功能多肽用于制备治疗或预防2型糖尿病药物或药物组合物的用途。
公开了上述降糖及免疫调节双功能多肽用于制备治疗或预防肥胖药物或药物组合物的用途。
本发明的上述用途中，所述药物组合物包括药物载体和/或药物活性物质。
本发明的降糖及免疫调节双功能多肽，既具有GLP-1类似物的功能，促进胰岛β细胞的增殖，降低1型糖尿病病人的血糖并降低糖化血红蛋白，降低2型糖尿病病人的血糖、抑制进食并降低糖化血红蛋白，同时又具有1型糖尿病自身抗原免疫调节肽功能，调节免疫，抑制病理性的免疫攻击。
附图说明
图1为本发明实施例1的降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性的实验结果示意图。图中，Progly-VP组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图2为本发明实施例1的降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合的实验结果示意图。图中，Progly-VP组与对照组相比时，**表示P<0.01，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图3为本发明实施例1的降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能发挥的实验结果示意图。图中，Progly-VP融合各组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。图4为本发明实施例1的Progly肽实验结果示意图。图中，Progly组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；GLP-1组与对照组相比时，^^^表示P<0.001；Progly组与GLP-1组相比时，$表示P<0.05，$$表示P<0.01，$$$表示P<0.001；GTT指糖耐量实验；AUC指曲线下面积。
图5为本发明实施例1的Progly-VP肽实验结果示意图。图中，Progly-VP组与对照组相比时，***表示P<0.001；GLP-1组与对照组相比时，^^^表示P<0.001；GTT指糖耐量实验；AUC指曲线下面积。
图6为本发明实施例1的累计进食影响结果示意图。
图7为本发明实施例1的血糖影响结果示意图。
图8为本发明实施例1的甘油三酯和游离脂肪酸影响结果示意图。
图9为本发明实施例1的NOD小鼠发病率和死亡率影响结果示意图。
图10为本发明实施例1的NOD小鼠空腹血糖影响结果示意图。
图11为本发明实施例1的NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎影响结果示意图。
图12为本发明实施例1的NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2影响结果示意图。
图13为本发明实施例2的降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性的实验结果示意图。图中，P8-VP组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图14为本发明实施例2的降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合的实验结果示意图。图中，P8-VP组与对照组相比时，**表示P<0.01，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图15为本发明实施例2的降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能发挥的实验结果示意图。图中，P8-VP融合各组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图16为本发明实施例2的P8肽实验结果示意图。图中，P8组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；GLP-1组与对照组相比时，^^^表示P<0.001；P8组与GLP-1组相比时，$表示P<0.05，$$表示P<0.01，$$$表示P<0.001；GTT指糖耐量实验；AUC指曲线下面积。
图17为本发明实施例2的P8-VP肽实验结果示意图。图中，P8-VP组与对照组相比时，***表示P<0.001；GLP-1组与对照组相比时，^^^表示P<0.001；GTT指糖耐量实验；AUC指曲线下面积。
图18为本发明实施例2的累计进食影响结果示意图。
图19为本发明实施例2的血糖影响结果示意图。
图20为本发明实施例2的甘油三酯和游离脂肪酸影响结果示意图。
图21为本发明实施例2的NOD小鼠发病率和死亡率影响结果示意图。
图22为本发明实施例2的NOD小鼠空腹血糖影响结果示意图。
图23为本发明实施例2的NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎影响结果示意图。
图24为本发明实施例2的NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2影响结果示意图。
图25为本发明实施例3的降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性的实验结果示意图。图中，Progly-P20组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图26为本发明实施例3的降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合的实验结果示意图。图中，Progly-P20组与对照组相比时，**表示P<0.01，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图27为本发明实施例3的降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能发挥的实验结果示意图。图中，Progly-P20融合各组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图28为本发明实施例3的Progly-P20肽实验结果示意图。图中，Progly-P20组与对照组相比时，***表示P<0.001；GLP-1组与对照组相比时，^^^表示P<0.001；GTT指糖耐量实验；AUC指曲线下面积。
图29为本发明实施例3的累计进食影响结果示意图。
图30为本发明实施例3的血糖影响结果示意图。
图31为本发明实施例3的甘油三酯和游离脂肪酸影响结果示意图。
图32为本发明实施例3的NOD小鼠发病率和死亡率影响结果示意图。
图33为本发明实施例3的NOD小鼠空腹血糖影响结果示意图。
图34为本发明实施例3的NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎影响结果示意图。
图35为本发明实施例3的NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2影响结果示意图。
图36为本发明实施例4的降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性的实验结果示意图。图中，P8-P20组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图37为本发明实施例4的降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合的实验结果示意图。图中，P8-P20组与对照组相比时，**表示P<0.01，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图38为本发明实施例4的降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能发挥的实验结果示意图。图中，P8-P20融合各组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图39为本发明实施例4的P8-P20肽实验结果示意图。图中，P8-P20组与对照组相比时，***表示P<0.001；GLP-1组与对照组相比时，^^^表示P<0.001；GTT指糖耐量实验；AUC指曲线下面积。
图40为本发明实施例4的累计进食影响结果示意图。
图41为本发明实施例4的血糖影响结果示意图。
图42为本发明实施例4的甘油三酯和游离脂肪酸影响结果示意图。
图43为本发明实施例4的NOD小鼠发病率和死亡率影响结果示意图。
图44为本发明实施例4的NOD小鼠空腹血糖影响结果示意图。
图45为本发明实施例4的NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎影响结果示意图。
图46为本发明实施例4的NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2影响结果示意图。
图47为本发明实施例5的降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性的实验结果示意图。图中，Progly-P9组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图48为本发明实施例5的降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合的实验结果示意图。图中，Progly-P9组与对照组相比时，**表示P<0.01，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图49为本发明实施例5的降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能发挥的实验结果示意图。图中，Progly-P9融合各组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图50为本发明实施例5的Progly-P9肽实验结果示意图。图中，Progly-P9组与对照组相比时，***表示P<0.001；GLP-1组与对照组相比时，^^^表示P<0.001；GTT指糖耐量实验；AUC指曲线下面积。
图51为本发明实施例5的累计进食影响结果示意图。
图52为本发明实施例5的血糖影响结果示意图。
图53为本发明实施例5的甘油三酯和游离脂肪酸影响结果示意图。
图54为本发明实施例5的NOD小鼠发病率和死亡率影响结果示意图。
图55为本发明实施例5的NOD小鼠空腹血糖影响结果示意图。
图56为本发明实施例5的NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎影响结果示意图。
图57为本发明实施例5的NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2影响结果示意图。
图58为本发明实施例6的降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性的实验结果示意图。图中，P8-P9组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图59为本发明实施例6的降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合的实验结果示意图。图中，P8-P9组与对照组相比时，**表示P<0.01，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图60为本发明实施例6的降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能发挥的实验结果示意图。图中，P8-P9融合各组与对照组相比时，*表示P<0.05，***表示P<0.001；AUC指曲线下面积。
图61为本发明实施例6的P8-P9肽实验结果示意图。图中，P8-P9组与对照组相比时，***表示P<0.001；GLP-1组与对照组相比时，^^^表示P<0.001；GTT指糖耐量实验；AUC指曲线下面积。
图62为本发明实施例6的累计进食影响结果示意图。
图63为本发明实施例6的血糖影响结果示意图。
图64为本发明实施例6的甘油三酯和游离脂肪酸影响结果示意图。
图65为本发明实施例6的NOD小鼠发病率和死亡率影响结果示意图。
图66为本发明实施例6的NOD小鼠空腹血糖影响结果示意图。
图67为本发明实施例6的NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎影响结果示意图。
图68为本发明实施例6的NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2影响结果示意图。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1:本发明多肽Progly-VP与Progly肽、VP肽的药效比较
(1)降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为3组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、Progly-VP组、VP-Progly组进行糖耐量实验。结果如图1A所示，与对照组相比，Progly-VP组能够显著降低血糖值。图1B显示Progly-VP组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当以VP-Progly此种方式链接时，药效降低，说明降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性。
(2)降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、Progly-VP组、Progly组、VP组及Progly与VP混合组进行糖耐量实验。结果如图2A所示，与对照组相比，Progly-VP组能够显著降低血糖值。图2B显示Progly-VP组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当Progly与VP等分子混合而非融合时，药效降低，说明降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合。
(3)降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、Progly-VP组、Progly-G-VP组、Progly-GG-VP组及Progly-GGG-VP组进行糖耐量实验。结果如图3A所示，与对照组相比，Progly-VP组、Progly-G-VP组、Progly-GG-VP组及Progly-GGG-VP组都能够显著降低血糖值，各组之间没有统计学差异。图3B显示Progly-VP组、Progly-G-VP组、Progly-GG-VP组及Progly-GGG-VP组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而各组之间没有统计学差异，说明降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥。
(4)Progly肽对正常小鼠的急性和持续降糖效果
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、Progly组(1nmol/kg)、Progly组(30nmol/kg)、Progly组(100nmol/kg)、GLP-1组(30nmol/kg)进行糖耐量实验。
结果如图4A所示，与对照组相比，GLP-1、Progly均能够显著降低血糖值，曲线下面积与对照组相比，明显降低，说明Progly能够与GLP-1一样具有糖依赖性的促胰岛素的分泌作用。同时Progly(1、30、100nmol/kg)能够剂量依赖性地降低血糖，最小起效浓度为1nmol/kg。
评估Progly的在体内的代谢水平，分别在皮下给予GLP-1(30nmol/kg)、Progly(30nmol/kg)，然后分别在给药后的0.5h、1h、2h、4h给予葡萄糖(1.5g/kg)，在给糖之后的15min检测血糖，结果如图4B所示，Progly在给药2h后，与对照组相比仍然具有显著性差异(p<0.05)，说明Progly能够持续降糖达到2h之久。而GLP-1降糖效果仅仅持续0.5h。
(5)本发明多肽Progly-VP的药效持续时间
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、Progly-VP组(0.1nmol/kg)、Progly-VP组(1nmol/kg)、Progly-VP组(30nmol/kg)、Progly-VP组(100nmol/kg)、GLP-1组(30nmol/kg)进行糖耐量实验。Progly-VP即本发明降糖及免疫调节双功能多肽。
结果如图5A所示，与对照组相比，GLP-1、Progly-VP均能够显著降低血糖值，曲线下面积与对照组相比，明显降低，说明Progly-VP与GLP-1一样具有糖依赖性的促胰岛素分泌作用。同时Progly-VP(0.1、1、30、100nmol/kg)能够剂量依赖性的降低血糖，最小起效浓度为0.1nmol/kg。
评估Progly-VP在体内的代谢水平，分别在皮下给予GLP-1(30nmol/kg)、Progly-VP(30nmol/kg)，然后分别在给药后的0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h给予葡萄糖(1.5g/kg)，在给糖之后的15min检测血糖，结果如图5B所示，Progly-VP在给药10h后，与对照组相比仍然具有显著性差异(p<0.001)，说明Progly-VP的药效持续时间达到10h之久。
(6)STZ糖尿病模型小鼠造模及分组
80只6周龄的雄性C57小鼠(购自扬州大学实比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2012-0004)，适应性饲养1周。实验前空腹12小时，按50mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液(pH＝5.2的柠檬酸缓冲液)，连续注射5天，注射后1周、2周分别检测空腹血糖，血糖值均超过11.0mmol/L，为造模成功。
将成模小鼠随机分成4组，每组12只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、Progly组(阳性对照组)、VP组(阳性对照组)、Progly-VP组(实验组)。给药剂量为30nmol/kg，每天2次，溶剂为生理盐水，皮下注射0.1ml，固定时间点给药，AM 9：00—10:00，PM 8:00—9:00。阴性对照组，皮下注射0.1ml生理盐水。
(7)对STZ糖尿病模型小鼠累计进食的影响
从给药开始，每组分别记录初始添食量，隔2～3天检测剩食量，并继续添加新的鼠粮，并记录，依次类推，到4周给药结束，记录小鼠的总进食量，并绘制累计进食曲线，结果如图6所示，Progly-VP组同Progly阳性对照组具有相同的抑制进食效果，明显少于溶剂组和VP组。
(8)对STZ糖尿病模型小鼠血糖的影响
给药前小鼠空腹8小时，AM8:00开始禁食，PM4:00尾静脉检测空腹血糖，检测用血糖检测仪(欧姆龙血糖仪HEA-231型)，作为给药0周血糖。之后分别在给药1、2、3、4周，检测空腹血糖，禁食时间和检测时间同0周方法。
结果如图7所示，连续给药2周后，Progly-VP组与阴性对照组相比，血糖明显降低(p<0.01，与对照组比较)，到第4周，平均血糖值只有9.3mmol/L(p<0.01，与对照组比较)，几乎接近正常值，与阳性对照组Progly相似。说明Progly-VP处理能够发挥GLP-1RA的作用，很好地降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖。
(9)对STZ糖尿病模型小鼠甘油三酯和游离脂肪酸的影响
给药4周后，眼眶取血，静置收集血清，试剂盒分别检测甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平，结果如图8所示。
结果显示，在血清甘油三酯水平方面，Progly和Progly-VP组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.001，存在极明显差异；在血清游离脂肪酸水平方面，Progly和Progly-VP组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.01，存在显著性差异。
结果说明，Progly和Progly-VP处理后能够明显降低STZ糖尿病模型小鼠的甘油三酯和游离脂肪酸水平。
(10)对NOD小鼠发病率和死亡率的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组Progly组、VP组、Progly-VP组)，期间间隔2周检测血糖，血糖值连续两次≥11mmol/L认为发病。
结果显示，对照组小鼠从15周开始发病，到39周时，发病率为66％，而实验组Progly组、VP组、Progly-VP组分别在17周、21周、17周发病，说明VP组能够延缓发病时间。等观察期结束，实验组Progly组、VP组、Progly-VP组的发病率分别为33％、40％、15％，说明在后期，VP组抑制发病的作用开始减少，与对照组比较，实验组Progly-VP组的发病率显著降低，p<0.05，实验组Progly组、VP组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图9A)。
39周观察期结束，分别记录小鼠死亡日期，并作图，结果显示，对照组小鼠，21周开始死亡，到39周时，死亡7只，死亡率为58％，而实验组Progly组、VP组、Progly-VP组的死亡率分别为33％、30％、15％，与对照组比较，实验组Progly-VP组的死亡率率显著降低，p<0.05，实验组Progly组、VP组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图9B)。
结果说明本发明多肽Progly-VP能够显著降低NOD小鼠的发病率与死亡率。
(11)对NOD小鼠空腹血糖的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组Progly组、VP组、Progly-VP组)，期间间隔2周检测血糖。定期测定每组每只小鼠的血糖经过24周的治疗，继续观察10周。
Progly-VP组未发生糖尿病，然而，空白对照组、Progly或VP组都相继有糖尿病的发生(图10A)。这些数据表明，Progly-VP能够预防糖尿病的再次发生。另外，Progly-VP组血糖值从29周开始维持在较低水平(停止给药)，第39周，Progly-VP组血糖值明显低于对照组和VP组(排除糖尿病小鼠)(p<0.05)(图10B)。
(12)对NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎的影响
作为(10)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取小鼠胰腺，称胰腺重量，并分析各组之间的差异。
结果显示，Progly-VP能够显著增加胰腺重量，与对照组相比，p<0.05，其他组均有升高，但是差异性不显著(图11A)。将胰腺进行HE染色，分析小鼠胰腺炎的程度，结果如图所示，对照组全部伴随胰腺炎的发生，而实验组Progly、VP、Progly-VP组分别有1只、1只、3只无胰腺炎(图11B)。结果说明，Progly-VP肽能够抑制胰腺炎的发生。
(13)对NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2的影响
作为(10)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取脾脏，经过抗体染色，流式分析Th1和Th2的比例，以及Th2/Th1的比值。
结果显示，实验组VP组、Progly-VP组能够显著增加Th2的比例，与对照组比较，p<0.05，Progly组有轻微升高，但是差异不显著(图12A和C)；实验组Progly组、Progly-VP组、VP组对Th1无影响，各组之间无显著性差异(图12A和B)；实验组VP组、Progly-VP组的Treg/Th17的比值显著升高，p<0.05，Progly组有轻微升高，但是差异不显著(图12A和D)。结果说明，Progly-VP肽能通过提高Th2的比例，以及Th2/Th1的比值来调节小鼠体内免疫平衡。
综合来看，本发明Progly-VP肽能够有效地发挥糖依赖性促胰岛素分泌作用(IPTGG)；降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖，抑制STZ糖尿病模型小鼠的进食；降低NOD小鼠的发病率和死亡率，增加胰腺重量，抑制胰腺炎；调节小鼠体内免疫平衡。
实施例2：本发明多肽P8-VP与P8肽、VP肽的药效比较
(1)降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为3组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、P8-VP组、VP-P8组进行糖耐量实验。结果如图13A所示，与对照组相比，P8-VP组能够显著降低血糖值。图13B显示P8-VP组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当以VP-P8此种方式链接时，药效降低，说明降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性。
(2)降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、P8-VP组、P8组、VP组及P8与VP混合组进行糖耐量实验。结果如图14A所示，与对照组相比，P8-VP组能够显著降低血糖值。图14B显示P8-VP组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当P8与VP等分子混合而非融合时，药效降低，说明降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合。
(3)降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、P8-VP组、P8-G-VP组、P8-GG-VP组及P8-GGG-VP组进行糖耐量实验。结果如图15A所示，与对照组相比，P8-VP组、P8-G-VP组、P8-GG-VP组及P8-GGG-VP组都能够显著降低血糖值，各组之间没有统计学差异。图15B显示P8-VP组、P8-G-VP组、P8-GG-VP组及P8-GGG-VP组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而各组之间没有统计学差异，说明降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥。
(4)P8肽对正常小鼠的急性和持续降糖效果
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、P8组(1nmol/kg)、P8组(30nmol/kg)、P8组(100nmol/kg)、GLP-1组(30nmol/kg)进行糖耐量实验。
结果如图16A所示，与对照组相比，GLP-1、P8均能够显著降低血糖值，曲线下面积与对照组相比，明显降低，说明P8能够与GLP-1一样具有糖依赖性的促胰岛素的分泌作用。同时P8(1、30、100nmol/kg)能够剂量依赖性地降低血糖，最小起效浓度为1nmol/kg。
评估P8的在体内的代谢水平，分别在皮下给予GLP-1(30nmol/kg)、P8(30nmol/kg)，然后分别在给药后的0.5h、1h、2h、4h给予葡萄糖(1.5g/kg)，在给糖之后的15min检测血糖，结果如图16B所示，P8在给药2h后，与对照组相比仍然具有显著性差异(p<0.05)，说明P8能够持续降糖达到2h之久。而GLP-1降糖效果仅仅持续0.5h。
(5)本发明多肽P8-VP肽的药效持续时间
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、P8-VP组(0.1nmol/kg)、P8-VP组(1nmol/kg)、P8-VP组(30nmol/kg)、P8-VP组(100nmol/kg)、GLP-1组(30nmol/kg)进行糖耐量实验。P8-VP即本发明降糖及免疫调节双功能多肽。
结果如图17A所示，与对照组相比，GLP-1、P8-VP均能够显著降低血糖值，曲线下面积与对照组相比，明显降低，说明P8-VP与GLP-1一样具有糖依赖性的促胰岛素分泌作用。同时P8-VP(0.1、1、30、100nmol/kg)能够剂量依赖性的降低血糖，最小起效浓度为0.1nmol/kg。
评估P8-VP在体内的代谢水平，分别在皮下给予GLP-1(30nmol/kg)、P8-VP(30nmol/kg)，然后分别在给药后的0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h给予葡萄糖(1.5g/kg)，在给糖之后的15min检测血糖，结果如图17B所示，P8-VP在给药10h后，与对照组相比仍然具有显著性差异(p<0.001)，说明P8-VP的药效持续时间达到10h之久。
(6)STZ糖尿病模型小鼠造模及分组
80只6周龄的雄性C57小鼠(购自扬州大学实比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2012-0004)，适应性饲养1周。实验前空腹12小时，按50mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液(pH＝5.2的柠檬酸缓冲液)，连续注射5天，注射后1周、2周分别检测空腹血糖，血糖值均超过11.0mmol/L，为造模成功。
将成模小鼠随机分成4组，每组12只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、P8组(阳性对照组)、VP组(阳性对照组)、P8-VP组(实验组)。给药剂量为30nmol/kg，每天2次，溶剂为生理盐水，皮下注射0.1ml，固定时间点给药，AM 9：00—10:00，PM 8:00—9:00。阴性对照组，皮下注射0.1ml生理盐水。
(7)对STZ糖尿病模型小鼠累计进食的影响
从给药开始，每组分别记录初始添食量，隔2～3天检测剩食量，并继续添加新的鼠粮，并记录，依次类推，到4周给药结束，记录小鼠的总进食量，并绘制累计进食曲线，结果如图18所示，P8-VP组同P8阳性对照组具有相同的抑制进食效果，明显少于溶剂组和VP组。
(8)对STZ糖尿病模型小鼠血糖的影响
给药前小鼠空腹8小时，AM8:00开始禁食，PM4:00尾静脉检测空腹血糖，检测用血糖检测仪(欧姆龙血糖仪HEA-231型)，作为给药0周血糖。之后分别在给药1、2、3、4周，检测空腹血糖，禁食时间和检测时间同0周方法。
结果如图19所示，连续给药2周后，P8-VP组与阴性对照组相比，血糖明显降低(p<0.01，与对照组比较)，到第4周，平均血糖值只有9.3mmol/L(p<0.01，与对照组比较)，几乎接近正常值，与阳性对照组P8相似。说明P8-VP处理能够发挥GLP-1RA的作用，很好地降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖。
(9)对STZ糖尿病模型小鼠甘油三酯和游离脂肪酸的影响
给药4周后，眼眶取血，静置收集血清，试剂盒分别检测甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平，结果如图20所示。
结果显示，在血清甘油三酯水平方面，P8和P8-VP组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.001，存在极明显差异；在血清游离脂肪酸水平方面，P8和P8-VP组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.01，存在显著性差异。
结果说明，P8和P8-VP处理后能够明显降低STZ糖尿病模型小鼠的甘油三酯和游离脂肪酸水平。
(10)对NOD小鼠发病率和死亡率的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组P8组、VP组、P8-VP组)，期间间隔2周检测血糖，血糖值连续两次≥11mmol/L认为发病。
结果显示，对照组小鼠从15周开始发病，到39周时，发病率为67％，而实验组P8组、VP组、P8-VP组分别在17周、21周、17周发病，说明VP组能够延缓发病时间。等观察期结束，实验组P8组、VP组、P8-VP组的发病率分别为39％、37％、17％，说明在后期，VP组抑制发病的作用开始减少，与对照组比较，实验组P8-VP组的发病率显著降低，p<0.05，实验组P8组、VP组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图21A)。
39周观察期结束，分别记录小鼠死亡日期，并作图，结果显示，对照组小鼠，21周开始死亡，到39周时，死亡7只，死亡率为58％，而实验组P8组、VP组、P8-VP组的死亡率分别为30％、30％、13％，与对照组比较，实验组P8-VP组的死亡率率显著降低，p<0.05，实验组P8组、VP组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图21B)。
结果说明本发明多肽P8-VP能够显著降低NOD小鼠的发病率与死亡率。
(11)对NOD小鼠空腹血糖的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组P8组、VP组、P8-VP组)，期间间隔2周检测血糖。定期测定每组每只小鼠的血糖经过24周的治疗，继续观察10周。
P8-VP组未发生糖尿病，然而，空白对照组、P8或VP组都相继有糖尿病的发生(图22A)。这些数据表明，P8-VP能够预防糖尿病的再次发生。另外，P8-VP组血糖值从29周开始维持在较低水平(停止给药)，第39周，P8-VP组血糖值明显低于对照组和VP组(排除糖尿病小鼠)(p<0.05)(图22B)。
(12)对NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎的影响
作为(10)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取小鼠胰腺，称胰腺重量，并分析各组之间的差异。
结果显示，P8-VP能够显著增加胰腺重量，与对照组相比，p<0.05，其他组均有升高，但是差异性不显著(图23A)。将胰腺进行HE染色，分析小鼠胰腺炎的程度，结果如图所示，对照组全部伴随胰腺炎的发生，而实验组P8、VP、P8-VP组分别有1只、1只、3只无胰腺炎(图23B)。结果说明，P8-VP肽能够抑制胰腺炎的发生。
(13)对NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2的影响
作为(10)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取脾脏，经过抗体染色，流式分析Th1和Th2的比例，以及Th2/Th1的比值。
结果显示，实验组VP组、P8-VP组能够显著增加Th2的比例，与对照组比较，p<0.05，P8组有轻微升高，但是差异不显著(图24A)；实验组P8组、P8-VP组、VP组对Th1无影响，各组之间无显著性差异(图24B)；实验组VP组、P8-VP组的Treg/Th17的比值显著升高，p<0.05，P8组有轻微升高，但是差异不显著(图24C)。结果说明，P8-VP肽能通过提高Th2的比例，以及Th2/Th1的比值来调节小鼠体内免疫平衡。
综合来看，本发明P8-VP肽能够有效地发挥糖依赖性促胰岛素分泌作用(IPTGG)；降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖，抑制STZ糖尿病模型小鼠的进食；降低NOD小鼠的发病率和死亡率，增加胰腺重量，抑制胰腺炎；调节小鼠体内免疫平衡。
附图说明
实施例3：本发明多肽Progly-P20与Progly肽、P20肽的药效比较
(1)降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为3组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、Progly-P20组、P20-Progly组进行糖耐量实验。结果如图25A所示，与对照组相比，Progly-P20组能够显著降低血糖值。图25B显示Progly-P20组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当以P20-Progly此种方式链接时，药效降低，说明降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性。
(2)降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、Progly-P20组、Progly组、P20组及Progly与P20混合组进行糖耐量实验。结果如图26A所示，与对照组相比，Progly-P20组能够显著降低血糖值。图26B显示Progly-P20组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当Progly与P20等分子混合而非融合时，药效降低，说明降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合。
(3)降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、Progly-P20组、Progly-G-P20组、Progly-GG-P20组及Progly-GGG-P20组进行糖耐量实验。结果如图27A所示，与对照组相比，Progly-P20组、Progly-G-P20组、Progly-GG-P20组及Progly-GGG-P20组都能够显著降低血糖值，各组之间没有统计学差异。图27B显示Progly-P20组、Progly-G-P20组、Progly-GG-P20组及Progly-GGG-P20组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而各组之间没有统计学差异，说明降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥。
(4)本发明多肽Progly-P20的药效持续时间
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、Progly-P20组(0.1nmol/kg)、Progly-P20组(1nmol/kg)、Progly-P20组(30nmol/kg)、Progly-P20组(100nmol/kg)、GLP-1组(30nmol/kg)进行糖耐量实验。Progly-P20即本发明降糖及免疫调节双功能多肽。
结果如图28A所示，与对照组相比，GLP-1、Progly-P20均能够显著降低血糖值，曲线下面积与对照组相比，明显降低，说明Progly-P20与GLP-1一样具有糖依赖性的促胰岛素分泌作用。同时Progly-P20(0.1、1、30、100nmol/kg)能够剂量依赖性的降低血糖，最小起效浓度为0.1nmol/kg。
评估Progly-P20在体内的代谢水平，分别在皮下给予GLP-1(30nmol/kg)、Progly-P20(30nmol/kg)，然后分别在给药后的0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h给予葡萄糖(1.5g/kg)，在给糖之后的15min检测血糖，结果如图28B所示，Progly-P20在给药10h后，与对照组相比仍然具有显著性差异(p<0.001)，说明Progly-P20的药效持续时间达到10h之久。
(5)STZ糖尿病模型小鼠造模，及分组
80只6周龄的雄性C57小鼠(购自扬州大学实比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2012-0004)，适应性饲养1周。实验前空腹12小时，按50mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液(pH＝5.2的柠檬酸缓冲液)，连续注射5天，注射后1周、2周分别检测空腹血糖，血糖值均超过11.0mmol/L，为造模成功。
将成模小鼠随机分成4组，每组12只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、Progly组(阳性对照组)、P20组(阳性对照组)、Progly-P20组(实验组)。给药剂量为30nmol/kg，每天2次，溶剂为生理盐水，皮下注射0.1ml，固定时间点给药，AM 9：00—10:00，PM 8:00—9:00。阴性对照组，皮下注射0.1ml生理盐水。
(6)对STZ糖尿病模型小鼠累计进食的影响
从给药开始，每组分别记录初始添食量，隔2～3天检测剩食量，并继续添加新的鼠粮，并记录，依次类推，到4周给药结束，记录小鼠的总进食量，并绘制累计进食曲线，结果如图29所示，Progly-P20组同Progly阳性对照组具有相同的抑制进食效果，明显少于溶剂组和P20组。
(7)对STZ糖尿病模型小鼠血糖的影响
给药前小鼠空腹8小时，AM8:00开始禁食，PM4:00尾静脉检测空腹血糖，检测用血糖检测仪(欧姆龙血糖仪HEA-231型)，作为给药0周血糖。之后分别在给药1、2、3、4周，检测空腹血糖，禁食时间和检测时间同0周方法。
结果如图30所示，连续给药2周后，Progly-P20组与阴性对照组相比，血糖明显降低(p<0.01，与对照组比较)，到第4周，平均血糖值只有9.3mmol/L(p<0.01，与对照组比较)，几乎接近正常值，与阳性对照组Progly相似。说明Progly-P20处理能够发挥GLP-1RA的作用，很好地降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖。
(8)对STZ糖尿病模型小鼠甘油三酯和游离脂肪酸的影响
给药4周后，眼眶取血，静置收集血清，试剂盒分别检测甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平，结果如图31所示。
结果显示，在血清甘油三酯水平方面，Progly和Progly-P20组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.001，存在极明显差异；在血清游离脂肪酸水平方面，Progly和Progly-P20组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.01，存在显著性差异。
结果说明，Progly和Progly-P20处理后能够明显降低STZ糖尿病模型小鼠的甘油三酯和游离脂肪酸水平。
(9)对NOD小鼠发病率和死亡率的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组Progly组、P20组、Progly-P20组)，期间间隔2周检测血糖，血糖值连续两次≥11mmol/L认为发病。
结果显示，对照组小鼠从15周开始发病，到39周时，发病率为66％，而实验组Progly组、P20组、Progly-P20组分别在17周、21周、17周发病，说明P20组能够延缓发病时间。等观察期结束，实验组Progly组、P20组、Progly-P20组的发病率分别为35％、19％、17％，说明在后期，P20组抑制发病的作用开始减少，与对照组比较，实验组Progly-P20组的发病率显著降低，p<0.05，实验组Progly组、P20组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图32A)。
39周观察期结束，分别记录小鼠死亡日期，并作图，结果显示，对照组小鼠，21周开始死亡，到39周时，死亡7只，死亡率为70％，而实验组Progly组、P20组、Progly-P20组的死亡率分别为42％、38％、18％，与对照组比较，实验组Progly-P20组的死亡率率显著降低，p<0.05，实验组Progly组、P20组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图32B)。
结果说明本发明多肽Progly-P20能够显著降低NOD小鼠的发病率与死亡率。
(10)对NOD小鼠空腹血糖的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组Progly组、P20组、Progly-P20组)，期间间隔2周检测血糖。定期测定每组每只小鼠的血糖经过24周的治疗，继续观察10周。
Progly-VP组未发生糖尿病，然而，空白对照组、Progly或VP组都相继有糖尿病的发生(图33A)。这些数据表明，Progly-P20能够预防糖尿病的再次发生。另外，Progly-P20组血糖值从29周开始维持在较低水平(停止给药)，第39周，Progly-P20组血糖值明显低于对照组和P20组(排除糖尿病小鼠)(p<0.05)(图33B)。
(11)对NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎的影响
作为(9)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取小鼠胰腺，称胰腺重量，并分析各组之间的差异。
结果显示，Progly-P20能够显著增加胰腺重量，与对照组相比，p<0.05，其他组均有升高，但是差异性不显著(图34A)。将胰腺进行HE染色，分析小鼠胰腺炎的程度，结果如图所示，对照组全部伴随胰腺炎的发生，而实验组Progly、P20、Progly-P20组分别有1只、1只、3只无胰腺炎(图34B)。结果说明，Progly-P20肽能够抑制胰腺炎的发生。
(12)对NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2的影响
作为(9)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取脾脏，经过抗体染色，流式分析Th1和Th2的比例，以及Th2/Th1的比值。
结果显示，实验组P20组、Progly-P20组能够显著增加Th2的比例，与对照组比较，p<0.05，Progly组有轻微升高，但是差异不显著(图35A)；实验组Progly组、Progly-P20组、P20组对Th1无影响，各组之间无显著性差异(图35B)；实验组P20组、Progly-P20组的Treg/Th17的比值显著升高，p<0.05，Progly组有轻微升高，但是差异不显著(图35C)。结果说明，Progly-P20肽能通过提高Th2的比例，以及Th2/Th1的比值来调节小鼠体内免疫平衡。
综合来看，本发明Progly-P20肽能够有效地发挥糖依赖性促胰岛素分泌作用(IPTGG)；降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖，抑制STZ糖尿病模型小鼠的进食；降低NOD小鼠的发病率和死亡率，增加胰腺重量，抑制胰腺炎；调节小鼠体内免疫平衡。
实施例4：本发明多肽P8-P20与P8肽、P20肽的药效比较
(1)降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为3组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、P8-P20组、P20-P8组进行糖耐量实验。结果如图36A所示，与对照组相比，P8-P20组能够显著降低血糖值。图36B显示P8-P20组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当以P20-P8此种方式链接时，药效降低，说明降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性。
(2)降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、P8-P20组、P8组、P20组及P8与P20混合组进行糖耐量实验。结果如图37A所示，与对照组相比，P8-P20组能够显著降低血糖值。图37B显示P8-P20组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当P8与P20等分子混合而非融合时，药效降低，说明降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合。
(3)降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、P8-P20组、P8-G-P20组、P8-GG-P20组及P8-GGG-P20组进行糖耐量实验。结果如图38A所示，与对照组相比，P8-P20组、P8-G-P20组、P8-GG-P20组及P8-GGG-P20组都能够显著降低血糖值，各组之间没有统计学差异。图38B显示P8-P20组、P8-G-P20组、P8-GG-P20组及P8-GGG-P20组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而各组之间没有统计学差异，说明降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥。
(4)本发明P8-P20多肽的药效持续时间
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、P8-P20组(0.1nmol/kg)、P8-P20组(1nmol/kg)、P8-P20组(30nmol/kg)、P8-P20组(100nmol/kg)、GLP-1组(30nmol/kg)进行糖耐量实验。P8-P20即本发明降糖及免疫调节双功能多肽。
结果如图39A所示，与对照组相比，GLP-1、P8-P20均能够显著降低血糖值，曲线下面积与对照组相比，明显降低，说明P8-P20与GLP-1一样具有糖依赖性的促胰岛素分泌作用。同时P8-P20(0.1、1、30、100nmol/kg)能够剂量依赖性的降低血糖，最小起效浓度为0.1nmol/kg。
评估P8-P20在体内的代谢水平，分别在皮下给予GLP-1(30nmol/kg)、P8-P20(30nmol/kg)，然后分别在给药后的0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h给予葡萄糖(1.5g/kg)，在给糖之后的15min检测血糖，结果如图39B所示，P8-P20在给药10h后，与对照组相比仍然具有显著性差异(p<0.001)，说明P8-P20的药效持续时间达到10h之久。
(5)STZ糖尿病模型小鼠造模及分组
80只6周龄的雄性C57小鼠(购自扬州大学实比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2012-0004)，适应性饲养1周。实验前空腹12小时，按50mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液(pH＝5.2的柠檬酸缓冲液)，连续注射5天，注射后1周、2周分别检测空腹血糖，血糖值均超过11.0mmol/L，为造模成功。
将成模小鼠随机分成4组，每组12只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、P8组(阳性对照组)、P20组(阳性对照组)、P8-P20组(实验组)。给药剂量为30nmol/kg，每天2次，溶剂为生理盐水，皮下注射0.1ml，固定时间点给药，AM 9：00—10:00，PM 8:00—9:00。阴性对照组，皮下注射0.1ml生理盐水。
(6)对STZ糖尿病模型小鼠累计进食的影响
从给药开始，每组分别记录初始添食量，隔2～3天检测剩食量，并继续添加新的鼠粮，并记录，依次类推，到4周给药结束，记录小鼠的总进食量，并绘制累计进食曲线，结果如图40所示，P8-P20组同P8阳性对照组具有相同的抑制进食效果，明显少于溶剂组和P20组。
(7)对STZ糖尿病模型小鼠血糖的影响
给药前小鼠空腹8小时，AM8:00开始禁食，PM4:00尾静脉检测空腹血糖，检测用血糖检测仪(欧姆龙血糖仪HEA-231型)，作为给药0周血糖。之后分别在给药1、2、3、4周，检测空腹血糖，禁食时间和检测时间同0周方法。
结果如图41所示，连续给药2周后，P8-P20组与阴性对照组相比，血糖明显降低(p<0.01，与对照组比较)，到第4周，平均血糖值只有9.3mmol/L(p<0.01，与对照组比较)，几乎接近正常值，与阳性对照组P8相似。说明P8-P20处理能够发挥GLP-1RA的作用，很好地降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖。
(8)对STZ糖尿病模型小鼠甘油三酯和游离脂肪酸的影响
给药4周后，眼眶取血，静置收集血清，试剂盒分别检测甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平，结果如图42所示。
结果显示，在血清甘油三酯水平方面，P8和P8-P20组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.001，存在极明显差异；在血清游离脂肪酸水平方面，P8和P8-P20组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.01，存在显著性差异。
结果说明，P8和P8-P20处理后能够明显降低STZ糖尿病模型小鼠的甘油三酯和游离脂肪酸水平。
(9)对NOD小鼠发病率和死亡率的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组P8组、P20组、P8-P20组)，期间间隔2周检测血糖，血糖值连续两次≥11mmol/L认为发病。
结果显示，对照组小鼠从15周开始发病，到39周时，发病率为68％，而实验组P8组、P20组、P8-P20组分别在17周、21周、17周发病，说明P20组能够延缓发病时间。等观察期结束，实验组P8组、20P组、P8-P20组的发病率分别为37％、40％、13％，说明在后期，P20组抑制发病的作用开始减少，与对照组比较，实验组P8-P20组的发病率显著降低，p<0.05，实验组P8组、P20组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图43A)。
39周观察期结束，分别记录小鼠死亡日期，并作图，结果显示，对照组小鼠，21周开始死亡，到39周时，死亡7只，死亡率为58％，而实验组P8组、P20组、P8-P20组的死亡率分别为35％、38％、15％，与对照组比较，实验组P8-P20组的死亡率率显著降低，p<0.05，实验组P8组、P20组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图43B)。
结果说明本发明多肽P8-P20能够显著降低NOD小鼠的发病率与死亡率。
(10)对NOD小鼠空腹血糖的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组P8组、P20组、P8-P20组)，期间间隔2周检测血糖。定期测定每组每只小鼠的血糖经过24周的治疗，继续观察10周。
P8-P20组未发生糖尿病，然而，空白对照组、P8或P20组都相继有糖尿病的发生(图44A)。这些数据表明，P8-P20能够预防糖尿病的再次发生。另外，P8-P20组血糖值从29周开始维持在较低水平(停止给药)，第39周，P8-P20组血糖值明显低于对照组和P20组(排除糖尿病小鼠)(p<0.05)(图44B)。
(11)对NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎的影响
作为(9)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取小鼠胰腺，称胰腺重量，并分析各组之间的差异。
结果显示，P8-P20能够显著增加胰腺重量，与对照组相比，p<0.05，其他组均有升高，但是差异性不显著(图45A)。将胰腺进行HE染色，分析小鼠胰腺炎的程度，结果如图所示，对照组全部伴随胰腺炎的发生，而实验组P8、P20、P8-P20组分别有1只、1只、3只无胰腺炎(图45B)。结果说明，Progly-P20肽能够抑制胰腺炎的发生。
(12)对NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2的影响
作为(9)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取脾脏，经过抗体染色，流式分析Th1和Th2的比例，以及Th2/Th1的比值。
结果显示，实验组P20组、P8-P20组能够显著增加Th2的比例，与对照组比较，p<0.05，P8组有轻微升高，但是差异不显著(图46A)；实验组P8组、P8-P20组、P20组对Th1无影响，各组之间无显著性差异(图46B)；实验组P20组、P8-P20组的Treg/Th17的比值显著升高，p<0.05，P8组有轻微升高，但是差异不显著(图46C)。结果说明，P8-P20肽能通过提高Th2的比例，以及Th2/Th1的比值来调节小鼠体内免疫平衡。
综合来看，本发明P8-P20肽能够有效地发挥糖依赖性促胰岛素分泌作用(IPTGG)；降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖，抑制STZ糖尿病模型小鼠的进食；降低NOD小鼠的发病率和死亡率，增加胰腺重量，抑制胰腺炎；调节小鼠体内免疫平衡。
实施例5：本发明多肽Progly-P9与Progly肽、P9肽的药效比较
(1)降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为3组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、Progly-P9组、P9-Progly组进行糖耐量实验。结果如图47A所示，与对照组相比，Progly-P9组能够显著降低血糖值。图47B显示Progly-P9组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当以P9-Progly此种方式链接时，药效降低，说明降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性。
(2)降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、Progly-P9组、Progly组、P9组及Progly与P9混合组进行糖耐量实验。结果如图48A所示，与对照组相比，Progly-P9组能够显著降低血糖值。图48B显示Progly-P9组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当Progly与P9等分子混合而非融合时，药效降低，说明降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合。
(3)降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、Progly-P9组、Progly-G-P9组、Progly-GG-P9组及Progly-GGG-P9组进行糖耐量实验。结果如图49A所示，与对照组相比，Progly-P9组、Progly-G-P9组、Progly-GG-P9组及Progly-GGG-P9组都能够显著降低血糖值，各组之间没有统计学差异。图49B显示Progly-P9组、Progly-G-P9组、Progly-GG-P9组及Progly-GGG-P9组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而各组之间没有统计学差异，说明降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥。
(4)本发明多肽Progly-P9的药效持续时间
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、Progly-P9组(0.1nmol/kg)、Progly-P9组(1nmol/kg)、Progly-P9组(30nmol/kg)、Progly-P9组(100nmol/kg)、GLP-1组(30nmol/kg)进行糖耐量实验。Progly-P9即本发明降糖及免疫调节双功能多肽。
结果如图50A所示，与对照组相比，GLP-1、Progly-P9均能够显著降低血糖值，曲线下面积与对照组相比，明显降低，说明Progly-P9与GLP-1一样具有糖依赖性的促胰岛素分泌作用。同时Progly-P9(0.1、1、30、100nmol/kg)能够剂量依赖性的降低血糖，最小起效浓度为0.1nmol/kg。
评估Progly-P9在体内的代谢水平，分别在皮下给予GLP-1(30nmol/kg)、Progly-P9(30nmol/kg)，然后分别在给药后的0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h给予葡萄糖(1.5g/kg)，在给糖之后的15min检测血糖，结果如图50B所示，Progly-P9在给药10h后，与对照组相比仍然具有显著性差异(p<0.001)，说明Progly-P9的药效持续时间达到10h之久。
(5)STZ糖尿病模型小鼠造模及分组
80只6周龄的雄性c57小鼠(购自扬州大学实比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2012-0004)，适应性饲养1周。实验前空腹12小时，按50mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液(pH＝5.2的柠檬酸缓冲液)，连续注射5天，注射后1周、2周分别检测空腹血糖，血糖值均超过11.0mmol/L，为造模成功。
将成模小鼠随机分成4组，每组12只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、Progly组(阳性对照组)、P9组(阳性对照组)、Progly-P9组(实验组)。给药剂量为30nmol/kg，每天2次，溶剂为生理盐水，皮下注射0.1ml，固定时间点给药，AM 9：00—10:00，PM 8:00—9:00。阴性对照组，皮下注射0.1ml生理盐水。
(6)对STZ糖尿病模型小鼠累计进食的影响
从给药开始，每组分别记录初始添食量，隔2～3天检测剩食量，并继续添加新的鼠粮，并记录，依次类推，到4周给药结束，记录小鼠的总进食量，并绘制累计进食曲线，结果如图51所示，Progly-P9组同Progly阳性对照组具有相同的抑制进食效果，明显少于溶剂组和P9组。
(7)对STZ糖尿病模型小鼠血糖的影响
给药前小鼠空腹8小时，AM8:00开始禁食，PM4:00尾静脉检测空腹血糖，检测用血糖检测仪(欧姆龙血糖仪HEA-231型)，作为给药0周血糖。之后分别在给药1、2、3、4周，检测空腹血糖，禁食时间和检测时间同0周方法。
结果如图52所示，连续给药2周后，Progly-P9组与阴性对照组相比，血糖明显降低(p<0.01，与对照组比较)，到第4周，平均血糖值只有9.3mmol/L(p<0.01，与对照组比较)，几乎接近正常值，与阳性对照组Progly相似。说明Progly-P9处理能够发挥GLP-1RA的作用，很好地降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖。
(8)对STZ糖尿病模型小鼠甘油三酯和游离脂肪酸的影响
给药4周后，眼眶取血，静置收集血清，试剂盒分别检测甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平，结果如图53所示。
结果显示，在血清甘油三酯水平方面，Progly和Progly-P9组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.001，存在极明显差异；在血清游离脂肪酸水平方面，Progly和Progly-P9组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.01，存在显著性差异。
结果说明，Progly和Progly-P9处理后能够明显降低STZ糖尿病模型小鼠的甘油三酯和游离脂肪酸水平。
(9)对NOD小鼠发病率和死亡率的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组Progly组、P9组、Progly-P9组)，期间间隔2周检测血糖，血糖值连续两次≥11mmol/L认为发病。
结果显示，对照组小鼠从15周开始发病，到39周时，发病率为66％，而实验组Progly组、P9组、Progly-P9组分别在17周、21周、17周发病，说明P9组能够延缓发病时间。等观察期结束，实验组Progly组、P9组、Progly-P20组的发病率分别为35％、18％、13％，说明在后期，P9组抑制发病的作用开始减少，与对照组比较，实验组Progly-P9组的发病率显著降低，p<0.05，实验组Progly组、P9组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图54A)。
39周观察期结束，分别记录小鼠死亡日期，并作图，结果显示，对照组小鼠，21周开始死亡，到39周时，死亡7只，死亡率为68％，而实验组Progly组、P9组、Progly-P9组的死亡率分别为33％、38％、16％，与对照组比较，实验组Progly-P9组的死亡率率显著降低，p<0.05，实验组Progly组、P9组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图54B)。
结果说明本发明多肽Progly-P9能够显著降低NOD小鼠的发病率与死亡率。
(10)对NOD小鼠空腹血糖的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组Progly组、P9组、Progly-P9组)，期间间隔2周检测血糖。定期测定每组每只小鼠的血糖经过24周的治疗，继续观察10周。
Progly-P9组未发生糖尿病，然而，空白对照组、Progly或P9组都相继有糖尿病的发生(图55A)。这些数据表明，Progly-P9能够预防糖尿病的再次发生。另外，Progly-P9组血糖值从29周开始维持在较低水平(停止给药)，第39周，Progly-P9组血糖值明显低于对照组和P9组(排除糖尿病小鼠)(p<0.05)(图55B)。
(11)对NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎的影响
作为(9)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取小鼠胰腺，称胰腺重量，并分析各组之间的差异。
结果显示，Progly-P9能够显著增加胰腺重量，与对照组相比，p<0.05，其他组均有升高，但是差异性不显著(图56A)。将胰腺进行HE染色，分析小鼠胰腺炎的程度，结果如图所示，对照组全部伴随胰腺炎的发生，而实验组Progly、P9、Progly-P9组分别有1只、1只、3只无胰腺炎(图56B)。结果说明，Progly-P9肽能够抑制胰腺炎的发生。
(12)对NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2的影响
作为(9)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取脾脏，经过抗体染色，流式分析Th1和Th2的比例，以及Th2/Th1的比值。
结果显示，实验组P9组、Progly-P9组能够显著增加Th2的比例，与对照组比较，p<0.05，Progly组有轻微升高，但是差异不显著(图57A)；实验组Progly组、Progly-P9组、P9组对Th1无影响，各组之间无显著性差异(图57B)；实验组P9组、Progly-P9组的Treg/Th17的比值显著升高，p<0.05，Progly组有轻微升高，但是差异不显著(图57C)。结果说明，Progly-P9肽能通过提高Th2的比例，以及Th2/Th1的比值来调节小鼠体内免疫平衡。
综合来看，本发明Progly-P9肽能够有效地发挥糖依赖性促胰岛素分泌作用(IPTGG)；降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖，抑制STZ糖尿病模型小鼠的进食；降低NOD小鼠的发病率和死亡率，增加胰腺重量，抑制胰腺炎；调节小鼠体内免疫平衡。
实施例6：本发明多肽P8-P9与P8肽、P9肽的药效比较
(1)降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为3组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、P8-P9组、P9-P8组进行糖耐量实验。结果如图58A所示，与对照组相比，P8-P9组能够显著降低血糖值。图58B显示P8-P9组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当以P9-P8此种方式链接时，药效降低，说明降糖肽与免疫调节肽融合时具有方向性。
(2)降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、P8-P9组、P8组、P9组及P8与P9混合组进行糖耐量实验。结果如图59A所示，与对照组相比，P8-P9组能够显著降低血糖值。图59B显示P8-P9组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而当P8与P9等分子混合而非融合时，药效降低，说明降糖及免疫调节双功能的发挥依赖于此两种肽的融合。
(3)降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照Vehicle组)、P8-P9组、P8-G-P9组、P8-GG-P9组及P8-GGG-P9组进行糖耐量实验。结果如图60A所示，与对照组相比，P8-P9组、P8-G-P9组、P8-GG-P9组及P8-GGG-P9组都能够显著降低血糖值，各组之间没有统计学差异。图60B显示P8-P9组、P8-G-P9组、P8-GG-P9组及P8-GGG-P9组曲线下面积与对照组相比，也明显降低，而各组之间没有统计学差异，说明降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性多肽不影响双功能的发挥。
(4)本发明P8-P9多肽的药效持续时间
8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、P8-P9组(0.1nmol/kg)、P8-P9组(1nmol/kg)、P8-P9组(30nmol/kg)、P8-P9组(100nmol/kg)、GLP-1组(30nmol/kg)进行糖耐量实验。P8-P9即本发明降糖及免疫调节双功能多肽。
结果如图61A所示，与对照组相比，GLP-1、P8-P9均能够显著降低血糖值，曲线下面积与对照组相比，明显降低，说明P8-P9与GLP-1一样具有糖依赖性的促胰岛素分泌作用。同时P8-P9(0.1、1、30、100nmol/kg)能够剂量依赖性的降低血糖，最小起效浓度为0.1nmol/kg。
评估P8-P9在体内的代谢水平，分别在皮下给予GLP-1(30nmol/kg)、P8-P9(30nmol/kg)，然后分别在给药后的0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h给予葡萄糖(1.5g/kg)，在给糖之后的15min检测血糖，结果如图61B所示，P8-P9在给药10h后，与对照组相比仍然具有显著性差异(p<0.001)，说明P8-P9的药效持续时间达到10h之久。
(5)STZ糖尿病模型小鼠造模及分组
80只6周龄的雄性c57小鼠(购自扬州大学实比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2012-0004)，适应性饲养1周。实验前空腹12小时，按50mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液(pH＝5.2的柠檬酸缓冲液)，连续注射5天，注射后1周、2周分别检测空腹血糖，血糖值均超过11.0mmol/L，为造模成功。
将成模小鼠随机分成4组，每组12只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、P8组(阳性对照组)、P9组(阳性对照组)、P8-P9组(实验组)。给药剂量为30nmol/kg，每天2次，溶剂为生理盐水，皮下注射0.1ml，固定时间点给药，AM 9：00—10:00，PM 8:00—9:00。阴性对照组，皮下注射0.1ml生理盐水。
(6)对STZ糖尿病模型小鼠累计进食的影响
从给药开始，每组分别记录初始添食量，隔2～3天检测剩食量，并继续添加新的鼠粮，并记录，依次类推，到4周给药结束，记录小鼠的总进食量，并绘制累计进食曲线，结果如图62所示，P8-P9组同P8阳性对照组具有相同的抑制进食效果，明显少于溶剂组和P9组。
(7)对STZ糖尿病模型小鼠血糖的影响
给药前小鼠空腹8小时，AM8:00开始禁食，PM4:00尾静脉检测空腹血糖，检测用血糖检测仪(欧姆龙血糖仪HEA-231型)，作为给药0周血糖。之后分别在给药1、2、3、4周，检测空腹血糖，禁食时间和检测时间同0周方法。
结果如图63所示，连续给药2周后，P8-P9组与阴性对照组相比，血糖明显降低(p<0.01，与对照组比较)，到第4周，平均血糖值只有9.3mmol/L(p<0.01，与对照组比较)，几乎接近正常值，与阳性对照组P8相似。说明P8-P9处理能够发挥GLP-1RA的作用，很好地降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖。
(8)对STZ糖尿病模型小鼠甘油三酯和游离脂肪酸的影响
给药4周后，眼眶取血，静置收集血清，试剂盒分别检测甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平，结果如图64所示。
结果显示，在血清甘油三酯水平方面，P8和P8-P9组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.001，存在极明显差异；在血清游离脂肪酸水平方面，P8和P8-P9组明显降低血中的甘油三酯含量，与模型组比较，p≤0.01，存在显著性差异。
结果说明，P8和P8-P9处理后能够明显降低STZ糖尿病模型小鼠的甘油三酯和游离脂肪酸水平。
(9)对NOD小鼠发病率和死亡率的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组P8组、P9组、P8-P9组)，期间间隔2周检测血糖，血糖值连续两次≥11mmol/L认为发病。
结果显示，对照组小鼠从15周开始发病，到39周时，发病率为58％，而实验组P8组、P9组、P8-P9组分别在17周、21周、17周发病，说明P20组能够延缓发病时间。等观察期结束，实验组P8组、P9组、P8-P9组的发病率分别为27％、35％、14％，说明在后期，P9组抑制发病的作用开始减少，与对照组比较，实验组P8-P9组的发病率显著降低，p<0.05，实验组P8组、P9组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图65A)。
39周观察期结束，分别记录小鼠死亡日期，并作图，结果显示，对照组小鼠，21周开始死亡，到39周时，死亡7只，死亡率为70％，而实验组P8组、P9组、P8-P9组的死亡率分别为32％、40％、18％，与对照组比较，实验组P8-P20组的死亡率率显著降低，p<0.05，实验组P8组、P9组虽然降低发病率，但是无显著性差异(图65B)。
结果说明本发明多肽P8-P9能够显著降低NOD小鼠的发病率与死亡率。
(10)对NOD小鼠空腹血糖的影响
采用NOD小鼠，从第5周开始，检测空腹血糖(空腹6h)，并给药(分对照组和实验组P8组、P9组、P8-P9组)，期间间隔2周检测血糖。定期测定每组每只小鼠的血糖经过24周的治疗，继续观察10周。
P8-P9组未发生糖尿病，然而，空白对照组、P8或P9组都相继有糖尿病的发生(图66A)。这些数据表明，P8-P9能够预防糖尿病的再次发生。另外，P8-P9组血糖值从29周开始维持在较低水平(停止给药)，第39周，P8-P9组血糖值明显低于对照组和P9组(排除糖尿病小鼠)(p<0.05)(图66B)。
(11)对NOD小鼠胰腺重量和胰腺炎的影响
作为(9)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取小鼠胰腺，称胰腺重量，并分析各组之间的差异。
结果显示，P8-P9能够显著增加胰腺重量，与对照组相比，p<0.05，其他组均有升高，但是差异性不显著(图67A)。将胰腺进行HE染色，分析小鼠胰腺炎的程度，结果如图所示，对照组全部伴随胰腺炎的发生，而实验组P8、P9、P8-P9组分别有1只、1只、3只无胰腺炎(图67B)。结果说明，Progly-P9肽能够抑制胰腺炎的发生。
(12)对NOD小鼠免疫调节因子Th1/Th2的影响
作为(9)的延续，39周观察期结束后，处死小鼠，取脾脏，经过抗体染色，流式分析Th1和Th2的比例，以及Th2/Th1的比值。
结果显示，实验组P9组、P8-P9组能够显著增加Th2的比例，与对照组比较，p<0.05，P8组有轻微升高，但是差异不显著(图68A)；实验组P8组、P8-P9组、P9组对Th1无影响，各组之间无显著性差异(图68B)；实验组P9组、P8-P9组的Treg/Th17的比值显著升高，p<0.05，P8组有轻微升高，但是差异不显著(图68C)。结果说明，P8-P9肽能通过提高Th2的比例，以及Th2/Th1的比值来调节小鼠体内免疫平衡。
综合来看，本发明P8-P9肽能够有效地发挥糖依赖性促胰岛素分泌作用(IPTGG)；降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖，抑制STZ糖尿病模型小鼠的进食；降低NOD小鼠的发病率和死亡率，增加胰腺重量，抑制胰腺炎；调节小鼠体内免疫平衡。
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<110> 南京零一生物科技有限公司
<120> 一种具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽及其用途
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Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser
20 25 30
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Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys Asp
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His Gly Asp Thr Thr Phe Glu Tyr Gln Asp
1 5 10
Claims (10)
1.一种具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽，其特征在于，是降糖多肽与免疫调节多肽的融合多肽，所述降糖肽与免疫调节肽之间具有或不具有柔性连接肽。
2.如权利要求1所述的具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽，其特征在于，
其中，所述降糖多肽为GLP-1类似物，所述免疫调节肽为1型糖尿病自身抗原中的免疫调节多肽。
3.如权利要求2所述的具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽，其特征在于，所述GLP-1类似物为下述之一：
Progly肽：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGP
P8肽：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSSGAPPPS。
4.如权利要求2所述的具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽，其特征在于，所述1型糖尿病自身抗原中的免疫调节多肽是源于1型糖尿病自身抗原HSP60的免疫调节肽、源于1型糖尿病自身抗原GAD65的免疫调节肽或源于胰岛素自身抗原的免疫调节肽。
5.如权利要求4所述的具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽，其特征在于，
所述源于1型糖尿病自身抗原HSP60的免疫调节肽是下述之一：
VP肽：VLGGGCRCIPALDSLTPANED；
P361肽：KGDKAHIEKRIQEITEQLDI；
P76肽：DGVTVAKSIDLKDKYKNIGA
所述源于1型糖尿病自身抗原GAD65的免疫调节肽是下述之一：
P20肽：EYVTLKKMREIIGWPGGSGD；
P524肽：SRLSKVAPVIKARMM；
P290肽：AALGIGTDSVILIKCDE；
P247肽：NMYAMMIARFKMFPEVKEKG；
P260肽：PEVKEKGMAALPRLIAFTSE；
P509肽：IPPSLRTLEDNEERMSRLSK；
P524肽：SRLSKVAPVIKARMMEYGTT；
所述源于胰岛素自身抗原的免疫调节肽是下述之一：
P9肽：SHLVEALALVAGERG；
P13肽：EALYLVCGERG
P621肽：HGDTTFEYQD
6.如权利要求1所述的具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽，其特征在于，所述的连接肽为G或多聚G。
7.权利要求1-6所述的具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽用于制备治疗或预防1型糖尿病药物或药物组合物的用途。
8.权利要求1-6所述的具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽用于制备治疗或预防2型糖尿病药物或药物组合物的用途。
9.权利要求1-6所述的具有降糖及免疫调节作用的双功能多肽用于制备治疗或预防肥胖药物或药物组合物的用途。
10.根据权利要求7或8或9所述的用途，其特征是，所述药物组合物包括药物载体和/或药物活性物质。
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