CN117551168A - 一种海参ace抑制肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种海参ACE抑制肽，其氨基酸序列为：HDWWKER。上述海参ACE抑制肽的制备方法，包括以下步骤：S1.制备小分子肽冻干粉，S2.制备低聚肽冻干粉，S3.序列鉴定，S4.虚拟筛选，S5.多肽合成。本发明还公开了上述海参ACE抑制肽在制备辅助降血压药物中的应用。本发明以海参花为原料，获得海参ACE抑制肽的氨基酸序列，且制备的海参ACE抑制肽具有良好ACE抑制活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种海参ACE抑制肽及其制备方法和应用。
背景技术
血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽是经过蛋白水解后形成的小分子多肽，它具有显著的降血压作用，更有效的是它与其它普通降压药物比较发现，ACE抑制肽无毒副作用，并且对正常的血压无影响。ACE在血压调节中起重要作用，经碳端两个氨基酸(His-Leu)的切除，能够把原本无活性的血管紧张素Ⅰ转变为具有活性的血管紧张素Ⅱ，引起血管收缩，使血压上升；ACE还会使具有血管舒张功能的舒缓激肤失活，同样又引起血压上升的情形，ACE抑制肽能够阻断ACE引起的两种生化反应过程，起到降血压的作用。
海参具有较高的营养价值和经济价值，海参大部分采用干制的方式进行出售，海参在干制前一般会将其内脏剔除。在繁殖期捕捞来的海参母体，其腹腔内的存在籽卵(海参花)，以往加工时，海参花通常会连同其它内脏一起被丢弃。
然而，海参花中也含有丰富的营养物质，甚至高于海参皮，海参花还被赐予海参花美名。在人们意识到海参花的价值后，当下的做法通常也是将取出的海参花进行干制处理，再将得到的海参花干进行单独售卖。但是，海参花干制过程中容易破坏小分子物质，导致其营养物质大量流失，而且海参花干的保质期较短。因此对海参花进行深加工以提高其利用价值具有重大意义，目前，也没有以海参花为原料制备ACE抑制肽的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海参ACE抑制肽及其制备方法和应用，其以海参花为原料，获得海参ACE抑制肽的氨基酸序列，且制备的海参ACE抑制肽具有良好ACE抑制活性。
为达到上述目的，本发明公开了一种海参ACE抑制肽，其氨基酸序列为：HDWWKER。
优选地，其IC50为0.584±0.028mmol/L。
上述海参ACE抑制肽的制备方法，其包括以下步骤：
S1.制备小分子肽冻干粉
选取海参花作为原料，利用碱性蛋白酶酶解海参花，酶解结束后灭酶和离心处理，得到酶解液；酶解液经粗滤和超滤处理后，收集得到小于3kDa分子量的小分子多肽组分，冻干后即得小分子肽冻干粉；
S2.制备低聚肽冻干粉
利用中压蛋白纯化仪对小分子肽冻干粉进行固定化酶凝胶靶向亲和吸附，之后进行洗脱和脱盐处理，得到靶向亲和洗脱液；对靶向亲和洗脱液进行PR-HPLC分析，并对靶向亲和洗脱液的各组分进行分离，真空冷冻干燥处理后，对靶向亲和洗脱液的各组分进行ACE抑制率测定，ACE抑制率最高的组分即为低聚肽冻干粉；
S3.序列鉴定
采用LC-MS/MS对低聚肽冻干粉进行质谱测定，质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得多条不重复多肽序列；
S4.虚拟筛选
通过软件将多肽序列与ACE蛋白进行分子对接，筛选得到与ACE蛋白结合能力强的多肽序列；
S5.多肽合成
将筛选得到的多肽序列进行固相合成，筛选活性高的多肽序列，即得到海参ACE抑制肽。
优选地，步骤S1中，先将海参花与超纯水振荡均匀，底物浓度为3～5％，调节pH为8.0～10，然后在50～60℃温度下，加入碱性蛋白酶进行酶解，碱性蛋白酶的添加量为2000～3000U/g，酶解3～7h；酶解结束后，于95～100℃的水浴锅中进行钝化灭酶15～25min，自然冷却后，于4～6℃、4000～6000r/min条件下离心10～20min，取上清液，即得酶解液；酶解液采用200nm陶瓷膜进行粗滤，再采用相对分子质量为3kDa的超滤膜进行超滤。
优选地，步骤S1中，海参花酶解时，底物浓度为3.5％，pH调整为9，酶解温度为65℃，碱性蛋白酶的添加量为3.5U/mg，酶解时间为5h。
优选地，步骤S2中，获取靶向亲和洗脱液的具体操作方法为：
S21：将溴化氰活化琼脂糖4B填料与其3倍体积的pH8.0的Tris-HCl缓冲液进行混匀处理后轻柔振荡2h过滤；过滤液采用pH4.0的0.1M醋酸盐缓冲液和pH 8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液交替清洗并重复操作3～5次，得ACE固定化凝胶填料；其中，醋酸盐缓冲液中含0.5M的NaCl，Tris-HCl缓冲液中含0.5M的NaCl；
S22：将ACE固定化凝胶填料悬浮于其3倍体积的硼酸盐缓冲液，装填入5mL中压层析柱中，即得固定化酶凝胶靶向亲和吸附柱；
S23：将固定化酶凝胶靶向亲和吸附柱安装在中压蛋白纯化仪，用摩尔浓度为0.1mol/L、pH8.0的硼酸盐缓冲液进行平衡过液，平衡流速0.6mL/min，紫外检测波长为220nm；
S24：将小分子肽配制成1mg/mL浓度作为上样液，进行靶向亲和吸附；
S25：以pH8.3的0.1mol/L硼酸盐缓冲液为洗脱流动相进行洗脱，洗脱流速0.6mL/min，收集洗脱峰组分并将多次洗脱峰组分合并，使用100Da透析膜进行脱盐处理后即得靶向亲和洗脱液；其中，硼酸盐缓冲液中包含1mol/L的NaCl。
优选地，步骤S2中，PR-HPLC分析具体为：色谱条件：C18，检测器：DAD二极管阵列检测器,流动相：A相：含0.1％ TFA的水，B相：含0.1％ TFA的乙腈，流动相梯度：5～30％B相，流速1ml/min，梯度时间30min，流速：0.5mL·min-1，检测波长：228nm。
优选地，步骤S3具体为：采用Q-Exactive质谱仪对低聚肽冻干粉进行分析，用C18除盐柱进行除盐，将样品经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析上样3μL样品，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，质谱参数设置如下：质量/电荷(m/z)＝100～1500；一级MS分析的操作条件如下：分辨率＝70000；AGC target＝3e6；最大IT＝50ms；扫描电荷＝1～6；二级MS/MS的操作条件：分辨率＝17500；topN＝20；隔离窗口＝2m/z；AGCtarget＝1e5；最大IT＝60ms；NCE/Stepped NCE＝28kV，动态排除时间＝30s；质谱原始文件由Peaks Studio进行分析。
优选地，步骤S4具体为：以晶体结构为1O8A的ACE作为受体，运用对接软件UCSFDOCK 6.9对ACE分子加氢、加电荷和除水、质子化预处理，保留Zn2+，剔除远离的Cl-，进行能量最小化Amber ff12SB处理，将步骤S3获得的多肽序列以Discovery Studio 2019Client绘制小分子作为配体，最后确定ACE的活性口袋，在口袋范围10，盒子边缘6的条件下虚拟筛选；将虚拟筛选的结果通过Grid Score得分进行排名，挑选出前20条分数较高的多肽序列。
另外，本发明还公开了上述海参ACE抑制肽在制备辅助降血压药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明以海参花为原料，获得海参ACE抑制肽的氨基酸序列，制备的海参ACE抑制肽具有良好的ACE抑制活性。
2、海参ACE抑制肽HDWWKER与ACE蛋白口袋对接，与9个氨基酸残基Gln281、Hid383、Hie353、Ala354、Ala356、Asp358、Lys511、Tyr520、Tyr523之间形成氢键，提供静电力贡献；与残基Hie410和Tyr360形成π-π堆积作用；与Asp358、Glu376、Asp415、Asp453和Lys511形成盐桥作用；同样与Phe512、Hie410、Pro407、Tyr523、Phe457、Val380、Val351疏水间作用力，Val380形成2种疏水间作用；并与金属离子Zn701发生配位作用。氢键、盐桥、疏水间作用、π-π堆积作用及金属配位作用是HDWWKER与ACE发生结合的主导作用力，使其在ACE的活性部位空腔中更为稳定的结合。
3、通过本发明方法制备得到的海参ACE抑制肽HDWWKER与ACE酶的相互作用强，活性高，可以应用于辅助降血压药物中。
附图说明
图1为本发明海参花小分子肽的靶向亲和吸附图。
图2为本发明海参花小分子肽的洗脱峰局部图。
图3为本发明超滤前的酶解液的高效液相色谱图。
图4为本发明超滤后的酶解液的高效液相色谱图。
图5为本发明靶向亲和洗脱液的高效液相色谱图。
图6为本发明靶向亲和洗脱液各组分的ACE抑制活性比较图。
图7为本发明不同浓度的多肽HDWWKER的ACE抑制率比较图。
图8为本发明多肽HDWWKER与ACE的分子对接复合模式图。
图9为本发明图9中A部的放大示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明公开了一种海参ACE抑制肽，其氨基酸序列为：HDWWKER，如序列表SEQ IDNO：1所示。海参ACE抑制肽的IC50为0.584±0.028mmol/L。
上述海参ACE抑制肽的制备方法，其包括以下步骤：
S1.制备小分子肽冻干粉
选取海参花作为原料，将新鲜海参花进行清洗处理掉大颗粒杂质，进行真空冷冻干燥后，按照底物浓度3.5％添加超纯水振荡混匀，恒温水浴预热，采用蛋白酶解法对海参花进行水解，调节pH后加入相应蛋白酶。本发明采用碱性蛋白酶酶解海参花，碱性蛋白酶的添加量为2500U/mg。酶解条件设定为：pH9，温度60℃，酶解5h。
酶解结束后，立即于95～100℃的水浴锅中进行钝化灭酶15～25min，自然冷却后，于4～6℃、4000～6000r/min条件下离心10～20min，取上清液，即得酶解液。此时对酶解液进行ACE抑制率分析，酶解液的ACE抑制率为80.646±0.515％。
酶解液采用200nm陶瓷膜进行粗滤，再采用相对分子质量为3kDa的超滤膜进行超滤，分离获得小于3kDa的小分子多肽组分，其与酶解液及超滤截留液相比，小于3kDa的小分子多肽组分表现出最高ACE抑制活性，IC50值为0.303±0.027mg/mL。小于3kDa的小分子多肽组分冻干后即得小分子肽冻干粉。
S2.制备低聚肽冻干粉
利用中压蛋白纯化仪对小分子肽冻干粉进行固定化酶凝胶靶向亲和吸附，之后进行洗脱和脱盐处理，得到靶向亲和洗脱液。获取靶向亲和洗脱液的具体操作方法为：
S21：将溴化氰活化琼脂糖4B填料(Seplite 4B)与其3倍体积的pH8.0的Tris-HCl缓冲液进行混匀处理后轻柔振荡2h过滤。过滤液采用pH4.0的0.1M醋酸盐缓冲液(含0.5M的NaCl)和pH 8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液(含0.5M的NaCl)交替清洗并重复操作3～5次，得ACE固定化凝胶填料。
S22：将ACE固定化凝胶填料悬浮于其3倍体积的硼酸盐缓冲液，装填入5mL中压层析柱中，即得固定化酶凝胶靶向亲和吸附柱。
S23：将固定化酶凝胶靶向亲和吸附柱安装在中压蛋白纯化仪，用摩尔浓度为0.1mol/L、pH8.0的硼酸盐缓冲液进行平衡过液，平衡流速0.6mL/min，紫外检测波长为220nm。
S24：将小分子肽配制成1mg/mL浓度作为上样液，进行靶向亲和吸附。
S25：以pH8.3的0.1mol/L硼酸盐缓冲液(含1mol/L的NaCl)为洗脱流动相进行洗脱，洗脱流速0.6mL/min，收集洗脱峰组分并将多次洗脱峰组分合并，使用100Da透析膜进行脱盐处理后即得靶向亲和洗脱液。
固定化酶凝胶靶向亲和吸附柱对海参花小分子肽的靶向亲和吸附如图1所示。小分子肽在时间为15min后基线趋于平稳，表示小分子肽已全部过柱并具有ACE抑制活性的低聚肽与亲和吸附柱结合并吸附牢固。随后更换流动洗脱相洗脱，随洗脱液浓度上升吸附的活性肽在64.47min被逐渐洗脱并在78.97min被完全洗脱，洗脱峰面积为68.59mL*mAU，占蛋白总面积的2.48％，如图2所示。
对靶向亲和洗脱液进行PR-HPLC分析，具体地，色谱条件：C18，检测器：DAD二极管阵列检测器,流动相：A相：水(含0.1％ TFA)，B相：乙腈(含0.1％ TFA)，流动相梯度：5～30％ B相，流速1ml/min，梯度时间30min，流速：0.5mL·min-1，检测波长：228nm随后对靶向亲和洗脱液的各组分进行分离，真空冷冻干燥处理后，对靶向亲和洗脱液的各组分进行ACE抑制率测定，ACE抑制率最高的组分即为低聚肽冻干粉。
将超滤前后的酶解液及靶向亲和洗脱液的高效液相色谱进行比对，如图3所示，超滤前的酶解液中多肽组成复杂，其中除包含具有ACE抑制活性的多肽外，还包含大量杂肽，难以直接利用。经过初步分离的超滤组分酶解液虽去除了部分杂肽纯化出具有更高ACE抑制活性小分子肽，但杂肽含量仍较高，如图4所示。而经过靶向亲和纯化后的洗脱液组成相对简单，主要含有3个组分，表明酶解液中无法与亲和位点相结合的杂肽在洗脱过程中基本被除去，同时纯化出能与亲和位点相结合具有ACE抑制活性的低聚肽，如图5所示。分别测定靶向亲和纯化的各组分在浓度为1mg/mL时ACE抑制率，三个组分的ACE抑制率之间均有显著差异，其中峰2组分表现出最高的ACE抑制活性，ACE抑制率为59.228±2.089％，如图6所示。
S3.序列鉴定
采用LC-MS/MS对低聚肽冻干粉(靶向亲和洗脱峰2组分)进行质谱测定，质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得多条不重复多肽序列。具体地，采用Q-Exactive质谱仪对靶向亲和洗脱峰2组分进行分析，用C18除盐柱进行除盐，将样品经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析上样3μL样品，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，质谱参数设置如下：质量/电荷(m/z)＝100～1500；一级MS分析的操作条件如下：分辨率＝70000；AGC target＝3e6；最大IT＝50ms；扫描电荷＝1～6；二级MS/MS的操作条件：分辨率＝17500；topN＝20；隔离窗口＝2m/z；AGC target＝1e5；最大IT＝60ms；NCE/Stepped NCE＝28kV，动态排除时间＝30s。
质谱原始文件由Peaks Studio的的peptides模块进行序列分析。质谱检测多肽原理是将LC-MS检测到的多肽分子量和数据库中分子量非常接近多肽进行比较，并进一步筛选碎片离子的相关性获得准确的氨基酸序列组成。为提高肽序列的准确性和可信度，将-10lgP作为可信度指标，值越大表明匹配结果越好，值越大表明该蛋白包含的可信肽段越多，因此将-10lgP的值设置为＞25.0，多肽所含氨基酸数量即肽链长度length＜20。将所选多肽通过BIOPEP数据库(https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/)及AHTPDB数据库(http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpdb/)，去除已被发现报道的具有ACE抑制活性的多肽。利用PeptideRanker的在线系统对所筛选序列进行生物活性预测(http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/peptideranker.php)，其中生物活性评分(PR)不小于0.5的肽认定为具有潜在高生物活性，最终获得180条序列，如表1所示。
表1LC-MS鉴定GLP序列
S4.虚拟筛选
通过软件将多肽序列与ACE蛋白进行分子对接，筛选得到与ACE蛋白结合能力强的多肽序列。具体地，以晶体结构为1O8A的ACE作为受体，其3D结构可从RCSB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org)下载人血管紧张素转化酶(天然)的晶体结构(PDB ID：1O8A)。
运用对接软件UCSF DOCK 6.9对ACE分子加氢、加电荷和除水、质子化预处理，保留Zn2+，剔除远离的Cl-，进行能量最小化Amber ff12SB处理，将步骤S3获得的多肽序列以Discovery Studio 2019Client绘制小分子作为配体，最后确定ACE的活性口袋，在口袋范围10，盒子边缘6的条件下虚拟筛选。将虚拟筛选的结果通过Grid Score得分进行排名，挑选出前20条分数较高的多肽序列。
S5.多肽合成
将筛选得到的多肽序列(20条)进行固相合成，经RP-HPLC和LC/MS鉴定纯度及分子量，纯度为＞98％。分别测定浓度为1mg/mL的20条多肽ACE抑制活性并观察多肽水溶性及晶体状态，测定多肽在不同浓度ACE抑制率计算IC50值验证活性，20条多肽的对接分值即抑制率参见表2。从表2可知，ACE抑制肽ADDFYYQ、DDQYHIF、HDWWKER、SDDFFNR、THDWWKER这5个多肽均为白色粉末状物质并具有较好的ACE抑制活性。其中，不同浓度的ACE抑制肽HDWWKER的ACE抑制率参见图7，ACE抑制肽HDWWKER的IC50＝0.584±0.028mmol/L。
表2虚拟筛选出的20条多肽的对接分值及抑制率
对ACE抑制肽HDWWKER的构效关系进行研究，具体地，使用AutoDock将ACE-C端结构域与ACE抑制肽进行分子对接，ACE抑制肽配体进行柔性设置，其他参数默认，Vina程序进行分子对接，分析ACE抑制肽HDWWKER与ACE的构效关系。结果参见图8和图9，多肽HDWWKER与ACE蛋白口袋对接，与9个氨基酸残基Gln281、Hid383、Hie353、Ala354、Ala356、Asp358、Lys511、Tyr520、Tyr523之间形成氢键，提供静电力贡献(Grid_es＝-11.7976kcal/mol)；与残基Hie410和Tyr360形成π-π堆积作用；与Asp358、Glu376、Asp415、Asp453和Lys511形成盐桥作用；同样与Phe512、Hie410、Pro407、Tyr523、Phe457、Val380、Val351疏水间作用力，Val380形成2种疏水间作用(Grid_vdw＝-127.8212kcal/mol)；并与金属离子Zn701发生配位作用。氢键、盐桥、疏水间作用、π-π堆积作用及金属配位作用是HDWWKER与ACE发生结合的主导作用力，使其在ACE的活性部位空腔中更为稳定的结合。
基于上述研究，本发明还公开了海参ACE抑制肽HDWWKER在制备辅助降血压药物中的应用。通过本发明方法制备得到的海参ACE抑制肽HDWWKER与ACE酶的相互作用强，活性高，可以应用于辅助降血压药物中。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种海参ACE抑制肽，其特征在于，其氨基酸序列为：HDWWKER。
2.如权利要求1所述的海参ACE抑制肽，其特征在于：其IC50为0.584±0.028mmol/L。
3.如权利要求1所述的海参ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备小分子肽冻干粉
选取海参花作为原料，利用碱性蛋白酶酶解海参花，酶解结束后灭酶和离心处理，得到酶解液；酶解液经粗滤和超滤处理后，收集得到小于3kDa分子量的小分子多肽组分，冻干后即得小分子肽冻干粉；
S2.制备低聚肽冻干粉
利用中压蛋白纯化仪对小分子肽冻干粉进行固定化酶凝胶靶向亲和吸附，之后进行洗脱和脱盐处理，得到靶向亲和洗脱液；对靶向亲和洗脱液进行PR-HPLC分析，并对靶向亲和洗脱液的各组分进行分离，真空冷冻干燥处理后，对靶向亲和洗脱液的各组分进行ACE抑制率测定，ACE抑制率最高的组分即为低聚肽冻干粉；
S3.序列鉴定
采用LC-MS/MS对低聚肽冻干粉进行质谱测定，质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得多条不重复多肽序列；
S4.虚拟筛选
通过软件将多肽序列与ACE蛋白进行分子对接，筛选得到与ACE蛋白结合能力强的多肽序列；
S5.多肽合成
将筛选得到的多肽序列进行固相合成，筛选活性高的多肽序列，即得到海参ACE抑制肽。
4.如权利要求3所述的海参ACE抑制肽的制备方法，其特征在于：步骤S1中，先将海参花与超纯水振荡均匀，底物浓度为3～5％，调节pH为8.0～10，然后在50～60℃温度下，加入碱性蛋白酶进行酶解，碱性蛋白酶的添加量为2000～3000U/g，酶解3～7h；酶解结束后，于95～100℃的水浴锅中进行钝化灭酶15～25min，自然冷却后，于4～6℃、4000～6000r/min条件下离心10～20min，取上清液，即得酶解液；酶解液采用200nm陶瓷膜进行粗滤，再采用相对分子质量为3kDa的超滤膜进行超滤。
5.如权利要求4所述的海参ACE抑制肽的制备方法，其特征在于：步骤S1中，海参花酶解时，底物浓度为3.5％，pH调整为9，酶解温度为65℃，碱性蛋白酶的添加量为3.5U/mg，酶解时间为5h。
6.如权利要求3所述的海参ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，获取靶向亲和洗脱液的具体操作方法为：
S21：将溴化氰活化琼脂糖4B填料与其3倍体积的pH8.0的Tris-HCl缓冲液进行混匀处理后轻柔振荡2h过滤；过滤液采用pH4.0的0.1M醋酸盐缓冲液和pH 8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液交替清洗并重复操作3～5次，得ACE固定化凝胶填料；其中，醋酸盐缓冲液中含0.5M的NaCl，Tris-HCl缓冲液中含0.5M的NaCl；
S22：将ACE固定化凝胶填料悬浮于其3倍体积的硼酸盐缓冲液，装填入5mL中压层析柱中，即得固定化酶凝胶靶向亲和吸附柱；
S23：将固定化酶凝胶靶向亲和吸附柱安装在中压蛋白纯化仪，用摩尔浓度为0.1mol/L、pH8.0的硼酸盐缓冲液进行平衡过液，平衡流速0.6mL/min，紫外检测波长为220nm；
S24：将小分子肽配制成1mg/mL浓度作为上样液，进行靶向亲和吸附；
S25：以pH8.3的0.1mol/L硼酸盐缓冲液为洗脱流动相进行洗脱，洗脱流速0.6mL/min，收集洗脱峰组分并将多次洗脱峰组分合并，使用100Da透析膜进行脱盐处理后即得靶向亲和洗脱液；其中，硼酸盐缓冲液中包含1mol/L的NaCl。
7.如权利要求3所述的海参ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，PR-HPLC分析具体为：色谱条件：C18，检测器：DAD二极管阵列检测器,流动相：A相：含0.1％TFA的水，B相：含0.1％TFA的乙腈，流动相梯度：5～30％B相，流速1ml/min，梯度时间30min，流速：0.5mL·min-1，检测波长：228nm。
8.如权利要求3所述的海参ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤S3具体为：采用Q-Exactive质谱仪对低聚肽冻干粉进行分析，用C18除盐柱进行除盐，将样品经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析上样3μL样品，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，质谱参数设置如下：质量/电荷(m/z)＝100～1500；一级MS分析的操作条件如下：分辨率＝70000；AGC target＝3e6；最大IT＝50ms；扫描电荷＝1～6；二级MS/MS的操作条件：分辨率＝17500；topN＝20；隔离窗口＝2m/z；AGC target＝1e5；最大IT＝60ms；NCE/SteppedNCE＝28kV，动态排除时间＝30s；质谱原始文件由Peaks Studio进行分析。
9.如权利要求3所述的海参ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤S4具体为：以晶体结构为1O8A的ACE作为受体，运用对接软件UCSF DOCK 6.9对ACE分子加氢、加电荷和除水、质子化预处理，保留Zn2+，剔除远离的Cl-，进行能量最小化Amber ff12SB处理，将步骤S3获得的多肽序列以Discovery Studio 2019Client绘制小分子作为配体，最后确定ACE的活性口袋，在口袋范围10，盒子边缘6的条件下虚拟筛选；将虚拟筛选的结果通过Grid Score得分进行排名，挑选出前20条分数较高的多肽序列。
10.如权利要求1所述的海参ACE抑制肽在制备辅助降血压药物中的应用。
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