CN117683075A - 一种湖羊小分子肽分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种湖羊小分子肽分离纯化方法。该方法包括以下步骤：1)羊胎盘的预处理与匀浆；2)冻融离心；3)过滤脱色脱腥；4)冷冻干燥；5)纯化。采用本发明的技术方法分离纯化的湖羊小分子肽，微孔膜去除了部分未水解的蛋白质、酶、有机胶体等杂质和悬浮物质，对提取液的澄清、脱腥都有着明显效果，并且利用反渗透法提取的小分子肽浸出率高、含量也高，能有效保证其有效成分的提取与活性物质的稳定。
Description
技术领域
本发明涉及小分子肽提取技术领域，特别涉及一种湖羊小分子肽分离纯化方法。
背景技术
动物源性免疫活性物质对人体具有免疫调节功能，发挥功能作用的主要成分可能是其富含的小分子肽，如胎盘免疫调节因子、胸腺肽、神经肽等。研究表明，它们具有促进T细胞E受体恢复、促进淋巴细胞增殖、提高血清补体水平等免疫调节作用。常规的分离纯化蛋白质或肽的方法有透析法、超滤法、柱层析法等，但是大多数所提取最终成分不单一，有效成分含量较低。
羊胎盘在化妆品中的应用越来越广泛，如广州欢乐海洋生物技术公司运用羊胎盘提取物研制的营养性膏霜，具有较好的护肤效果。然而，羊胎盘在食品工业中的开发应用相对较少，尚未形成工业化生产，有待进一步开发研究。胎盘肽又称为胎盘免疫调节肽、胎盘转移因子、胎盘免疫调节因子是目前研究的比较深入的胎盘提取物。由于提取所采取的工艺不同，成分和稳定性也有差异。胎盘免疫调节肽属小分子量核苷酸及肽类物质的混合物，分子量小于5000Da，含多种氨基酸。刘月新等(1985)首次报道从健康分娩产妇胎盘中提取一种小分子活性物质，经过初步理化性质和生物活性研究证明其主要成分为肽类物质，也称为胎盘肽。胎盘肽为无色或微黄透明液体、具有可透析性、可超滤性、蛋白质反应阴性、无抗原性、冻干品为白色疏松粉末、易溶于水。经过组份分析得知，含游离氨基酸17种，水解氨基酸16种，一定量的小分子肽，少量的核糖、脱氧核糖及核酸，其中包括7种人体必需氨基酸。不耐热，经热处理可破坏其活性。胎盘肽冻干制品性质较稳定，0～4℃可保持生物活性1年。黄洁、王钊等也研究发现羊胎盘的营养结构与人胎盘具有很高的相似性。羊胎盘提取水溶性物质后的残余物进行营养价值分析：其蛋白质功效比(PER值)为1.27，干基总蛋白含量为97.67％，其中氨基酸含量依次为：谷氨酸(10.24％)、甘氨酸(9.51％)、天门冬氨酸(6.56％)、精氨酸(5.65％)、亮氨酸(5.46％)、脯氨酸(5.41％)。氨基酸组成合理，其第一限制性氨基酸为异亮氨酸和缬氨酸，两者的氨基酸评分均为0.71。
目前，羊胎盘在食品中的应用研究还比较少，主要针对活性物质的提取方面。现有技术采取的一系列简单的方法研制羊胎盘全粉，保存了羊胎盘中大量的天然生理活性物质或采用一系列工艺对羊胎盘中的活化羊胎索进行提取。虽然目前研制出的羊胎盘粉能够有效保留其中大量的生物活性，但由于分子量较大，活性肽及氨基酸含量少等因素，人体并不能对其进行有效的吸收利用。
羊胎盘开来源广泛，生物活性物质丰富，营养价值极高。因此对胎盘活性物质的进一步研究，明确其组成成分，改进目前加工技术，充分利用其有效成分，提高活性物质的稳定性，使产品有利于质量控制与工业化生产具有很大的研究意义。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的是提供一种湖羊小分子肽分离纯化方法，通过该方法分离纯化的湖羊小分子肽，微孔膜去除了部分未水解的蛋白质、酶、有机胶体等杂质和悬浮物质，对提取液的澄清、脱腥都有着明显效果。并且利用反渗透法提取的小分子肽浸出率高、含量也高，能有效保证其有效成分的提取与活性物质的稳定。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种湖羊小分子肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1.预处理匀浆：羊胎盘经室温解冻，去除血液用水冲洗，剔除血管与筋膜，将其剪碎成约0.5～1.0cm小块，加入去离子水，组织捣碎机得到胎盘浆液；
S2.冻融离心：将S1所述的胎盘浆液，置于-20℃与10-15℃下反复冻融3次，然后经过将冻融后的胎盘浆液经4500-6000r/min下离心15-30min，取上层清液为羊胎盘多肽提取液；
S3.过滤脱色脱腥：吸取S2中所述的羊胎盘多肽提取液，置于RO反渗透机器中，收集滤液；
S4.冷冻干燥：将S3所得到的滤液经过-20--30℃冷冻干燥得到胎盘多肽冻干粉；
S5.纯化：将S4所得到的胎盘多肽冻干粉经过2ml的甲醇与水的混合溶剂复溶后，将其进行Flash色谱柱纯化得到纯净小分子肽。
优选的，在步骤S1中，按照为原料质量的1:1比例加入去离子水。
优选的，在步骤S2中，离心与离心后得到的羊胎盘多肽提取液均处于4℃下操作与储存。
优选的，在步骤S3中，在4℃的环境温度下进行RO反渗透操作。
优选的，在步骤S5中，甲醇与水的混合比例为4:1。
优选的，在步骤S5中，Flash色谱柱条件为流动相，甲醇(A相)：水(B相)；梯度，0-10min，B％为90％-100％，10-20min，B％:100％-100％，20-30min，B％为100％-10％，30-40min，B％为10％-10％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
采用本发明的技术方法分离纯化的湖羊小分子肽，微孔膜去除了部分未水解的蛋白质、酶、有机胶体等杂质和悬浮物质，对提取液的澄清、脱腥都有着明显效果，并且利用反渗透法提取的小分子肽浸出率高、含量也高，能有效保证其有效成分的提取与活性物质的稳定。
附图说明
图1为本发明的湖羊小分子肽分离纯化工艺流程图；
图2为本发明提取的湖羊小分子肽样品例、实施例1与对比例1的透光率柱状图；
图3为本发明提取的湖羊小分子肽样品例、实施例1与对比例1的多肽提取液蛋白质含量柱状图；
图4为本发明提取的湖羊小分子肽实施例1提取液在测波为254nm与214nm下的HPLC色谱图；
图5为本发明提取的湖羊小分子肽对比例1提取液在测波为254nm与214nm下的HPLC色谱图；
图6为本发明提取的湖羊小分子肽对比例2复溶液在测波为254nm与214nm下的HPLC色谱图；
图7为本发明提取的湖羊小分子肽实施例1复溶液在测波为254nm与214nm下的HPLC色谱图；
图8为本发明提取的湖羊小分子肽对比例3复溶液在测波为254nm与214nm下的HPLC色谱图；
图9为本发明一种湖羊小分子肽分离纯化工艺实施例1产物的质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-9，本发明提供了：
本发明实施例所用的检测仪器与设备型号如下表：
表1
样品例：
羊胎盘经室温解冻，去除血液用水冲洗，剔除血管与筋膜，将其剪碎成约0.5～1.0cm小块，1：1加去离子水，组织捣碎机得到胎盘浆液。-20℃下反复冻融3次，6000r/min离心30min，上层清液即为羊胎盘多肽提取样液，4℃保存备用。
实施例：
实施例1
S101.预处理匀浆：羊胎盘经室温解冻，去除血液用水冲洗，剔除血管与筋膜，将其剪碎成约0.5cm小块，按照原料1:1的质量比加入去离子水，组织捣碎机得到胎盘浆液；
S102.冻融离心：将S101所述的胎盘浆液，置于-20℃与4℃下反复冻融3次，然后经过将冻融后的胎盘浆液经6000r/min环境温度为4℃下离心30min，取上层清液为羊胎盘多肽提取液；
S103.过滤脱色脱腥：吸取S102中所述的羊胎盘多肽提取液，置于RO反渗透机器中，在环境温度为4℃下，收集滤液；
S104.冷冻干燥：将S103所得到的滤液经过-20℃冷冻干燥得到胎盘多肽冻干粉；
S105.纯化：将S104所得到的胎盘多肽冻干粉经过按照2ml的4:1的甲醇与水混合溶剂复溶后，将其进行Flash色谱柱纯化得到纯净小分子肽。
实施例2
S201.预处理匀浆：羊胎盘经室温解冻，去除血液用水冲洗，剔除血管与筋膜，将其剪碎成约1.0cm小块，按照原料1:1的质量比加入去离子水，组织捣碎机得到胎盘浆液；
S202.冻融离心：将S201所述的胎盘浆液，置于-20℃与0℃下反复冻融3次，然后经过将冻融后的胎盘浆液经4500r/min环境温度为4℃下离心15min，取上层清液为羊胎盘多肽提取液；
S203.过滤脱色脱腥：吸取S202中所述的羊胎盘多肽提取液，置于RO反渗透机器中，在环境温度为4℃下，收集滤液；
S204.冷冻干燥：将S203所得到的滤液经过-30℃冷冻干燥得到胎盘多肽冻干粉；
S205.纯化：将S204所得到的胎盘多肽冻干粉经过按照2ml的4:1的甲醇与水混合溶剂复溶后，将其进行Flash色谱柱纯化得到纯净小分子肽。
实施例3
S301.预处理匀浆：羊胎盘经室温解冻，去除血液用水冲洗，剔除血管与筋膜，将其剪碎成约1.0cm小块，按照原料1:1的质量比加入去离子水，组织捣碎机得到胎盘浆液；
S302.冻融离心：将S301所述的胎盘浆液，置于-20℃与2℃下反复冻融3次，然后经过将冻融后的胎盘浆液经5500r/min环境温度为4℃下离心20min，取上层清液为羊胎盘多肽提取液；
S303.过滤脱色脱腥：吸取S302中所述的羊胎盘多肽提取液，置于RO反渗透机器中，在环境温度为4℃下，收集滤液；
S304.冷冻干燥：将S303所得到的滤液经过-25℃冷冻干燥得到胎盘多肽冻干粉；
S305.纯化：将S304所得到的胎盘多肽冻干粉经过按照2ml的4:1甲醇与水混合溶剂复溶后，将其进行Flash色谱柱纯化得到纯净小分子肽。
上述述实施例中RO反渗透操作具体为：
将羊胎盘多肽提取液置于RO反渗透机器内，通过压力泵增加提取液压力以通过反渗透RO半透膜使得水分子与多肽通过，拦截大多数水中的溶质与杂质；再添加少许弱碱性物质于提取后的多肽提取液中已调节溶液的PH值，得到羊胎盘多肽滤液。
对比例
对比例1
对比例1与实施例1存在以下区别，区别仅在于：对比例1中将实施例1中所述过滤脱色脱腥步骤进行替换，从而取消了“利用RO反渗透膜过滤”这个步骤，替换成“利用透析袋脱色脱腥”，具体为：吸取S102中所述的羊胎盘多肽提取液于1KDa透析袋中；将透析袋置于去离子水中，4℃下透析一周，收集滤液。其他组分、用量及其制备过程均与实施例1相同。
对比例2
对比例2与实施例1存在以下区别，区别仅在于：对比例2中将实施例1中所述纯化步骤进行替换，从而取消了“利用4:1的甲醇与水混合溶剂复溶后通过Flash色谱柱纯化得到小分子肽”，替换成“利用2ml的甲醇复溶后通过Flash色谱柱纯化得到小分子肽”，其他组分、用量及其制备过程均与实施例1相同。
对比例3
对比例3与实施例1存在以下区别，区别仅在于：对比例3中将实施例1中所述纯化步骤进行替换，从而取消了“利用2ml的4:1的甲醇与水混合溶剂复溶后通过Flash色谱柱纯化得到小分子肽”，替换成“利用2ml的1：4的甲醇与水混合溶剂复溶后通过Flash色谱柱纯化得到小分子肽”，其他组分、用量及其制备过程均与实施例1相同。
对上述实施例与对比例所制备提取的湖羊小分子肽进行相关理化性质检测：
针对实施例1-3与对比例1-3进行透光率、多肽提取液蛋白质含量与HPLC的检测，结果如下：
由图2可知，通过反渗透与透析袋处理后，与提取液的样品例相比，实施例1与对比例1的透光率都有明显的增强，幅度分别为23.6％、97.7％，随着孔径的减小，增大的幅度更明显。目视检查发现，提取液由混浊变得澄清；颜色从暗黄变成亮黄到亮淡黄；未经处理的提取液腥味较重，实施例1腥味减弱，对比例1腥味已较弱。说明微孔膜去除了部分未水解的蛋白质、酶、有机胶体等杂质和悬浮物质，对提取液的澄清、脱腥都有明显效果，且孔径愈小效果愈明显。
从图3可知，样品例、实施例1与对比例1三种提取液的蛋白质含量依次减少，与提取样液相比，提取液1和提取液1分别减少了25.7％、54.7％，提取液2的蛋白质含量迅速降低，说明依靠半透膜进行弥散和渗透的透析提取要比利用高压力RO反渗透法截留大分子物质愈多，对蛋白质含量影响愈大。
湖羊胎盘提取液分别经反渗透和透析处理后的HPLC分析结果如图4与图5所示，可以看出经RO反渗透膜过滤后的提取液中能够获得较高的蛋白质含量，相比透析方法表现更好。
而实施例1与对比例2、3处理后的HPLC分析结果如图6、图7与图8所示，可以得到湖羊多肽冻干粉在不同的溶液中的溶解度不同，当其在较难溶的溶剂中，物质在色谱中较难洗脱，导致分离度差，而进行HPLC时色谱图又可能会受到溶剂效应的影响，当稀释剂溶剂强度大于流动相时会造成色谱峰变形的现象。
对比三组复溶液的色谱图可以发现，对比例2其稀释液为甲醇，而进行洗脱的流动相为90％甲醇、10％水，此时溶解样品的溶剂强度大于该样品出峰时流动相强度，样品溶剂可以看成流动相的一部分，一部分样品溶解于溶剂中会被迅速洗脱出色谱柱，而一部分样品溶解于流动相，被流动相洗脱出，这样会造成色谱峰的展宽与分叉。而对比例3在水:甲醇＝4:1的条件下稀释，其分离度相较实施例1分离度较差，故本实验使用甲醇:水＝4:1作为复溶溶剂。
综上所述，本发明依靠半透膜进行弥散和渗透的透析提取要比利用高压力RO反渗透法截留大分子物质愈多，对蛋白质含量影响愈大，微孔膜去除了部分未水解的蛋白质、酶、有机胶体等杂质和悬浮物质，对提取液的澄清、脱腥都有明显效果，且孔径愈小效果愈明显。故本发明采用的技术方法分离纯化的湖羊小分子肽，微孔膜去除了部分未水解的蛋白质、酶、有机胶体等杂质和悬浮物质，对提取液的澄清、脱腥都有着明显效果。并且利用反渗透法提取的小分子肽浸出率高、含量也高，能有效保证其有效成分的提取与活性物质的稳定。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的技术人员而言，可容易的实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (6)
1.一种湖羊小分子肽分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.预处理匀浆：羊胎盘经室温解冻，去除血液用水冲洗，剔除血管与筋膜，将其剪碎成约0.5～1.0cm小块，加入去离子水，组织捣碎机得到胎盘浆液；
S2.冻融离心：将S1所述的胎盘浆液，置于-20℃与0-4℃下反复冻融3次，然后经过将冻融后的胎盘浆液经4500-6000r/min下离心15-30min，取上层清液为羊胎盘多肽提取液；
S3.过滤脱色脱腥：吸取S2中所述的羊胎盘多肽提取液，置于RO反渗透机器中，收集滤液；
S4.冷冻干燥：将S3所得到的滤液经过-20--30℃冷冻干燥得到胎盘多肽冻干粉；
S5.纯化：将S4所得到的胎盘多肽冻干粉经过2ml的甲醇与水的混合溶剂复溶后，将其进行Flash色谱柱纯化得到纯净小分子肽。
2.根据权利要求1所述的一种湖羊小分子肽分离纯化方法，其特征在于，在步骤S1中，所述加入去离子水的比例为原料质量的1:1。
3.根据权利要求1所述的一种湖羊小分子肽分离纯化方法，其特征在于，在步骤S2中，离心与离心后得到的羊胎盘多肽提取液均处于4℃下操作与储存。
4.根据权利要求1所述的一种湖羊小分子肽分离纯化方法，其特征在于，在步骤S3中，所述操作在4℃的环境温度下进行RO反渗透。
5.根据权利要求1所述的一种湖羊小分子肽分离纯化方法，其特征在于，在步骤S5中，所述甲醇与水的混合比例为4:1。
6.根据权利要求1所述的一种湖羊小分子肽分离纯化方法，其特征在于，在步骤S5中，所述Flash色谱柱条件为流动相，具体结构为：甲醇(A相)：水(B相)；梯度，0-10min，B％为90％-100％；10-20min，B％:100％-100％；20-30min，B％为100％-10％；30-40min，B％为10％。
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