CN103719534B - 一种对大豆分离蛋白进行酶水解的方法 - Google Patents

Abstract

一种对大豆分离蛋白进行酶水解的方法，属于大豆蛋白加工领域。本发明按照以下步骤改性大豆分离蛋白：（1）大豆分离蛋白热处理；（2）大豆分离蛋白进行有限酶水解；（3）有限酶水解后的大豆分离蛋白加热钝化蛋白酶；（4）喷雾干燥，制得产品酶解大豆蛋白干粉。本发明通过酶制剂的筛选，控制酶解条件，采用天野蛋白酶PC10F和/或SDNY10酶解得到的酶解大豆蛋白干粉粘度和凝胶强度较弱，苦味较小，而其它功能性质良好。

Description

一种对大豆分离蛋白进行酶水解的方法

技术领域

本发明涉及一种筛选酶制剂控制酶解条件水解大豆蛋白，控制生产低粘度、弱凝胶性、且苦味小的植物蛋白的方法，属于大豆蛋白加工领域。

背景技术

食品工业的飞速发展迫切需要具有各种专门功能性的大豆分离蛋白作为食品的原料成分或添加基料，蛋白质改性技术是实现该目标的重要手段。蛋白质改性是人为地对蛋白质结构进行修饰，从而改善产品的相容性和功能性。目前蛋白质改性技术主要有物理改性、化学改性、酶法改性和基因工程改性。蛋白质的理化性质，取决于它的氨基酸组成、分子大小及形态结构等，所以，一切能改变蛋白质氨基酸组成、分子大小和形态结构的因素必将影响其功能特性。研究提高大豆分离蛋白的功能性，就要从大豆分离蛋白的组成和结构入手，再进一步探索加工工艺对产品功能性的影响。酶法改性通常是蛋白酶的有限水解。酶法改性的程度取决于所用的酶、处理的时间以及人们所需要的功能性质。蛋白经酶解后，其功能性质的变化十分显著，并且同化学改性相比，酶法改性还具有以下几个方面优点：(1)酶解过程十分温和，很少或没有不受欢迎的副反应或副产品；(2)最终水解产物经平衡后，含盐极少且最终产品的功能性质可通过选择特定的酶和反应因素加以控制；(3)蛋白水解产物可直接为消化不良者提供营养。

大豆蛋白制品越来越广泛地用于食品加工的各个领域，这与其营养丰富且在食品加工、储藏和消费过程中体现出的良好的功能性质有很大关系。大豆蛋白质经过蛋白酶处理后，溶解性、粘度、乳化力、起泡力、抗氧化性等功能特性均有所改善。大豆分离蛋白对于所应用食品体系的黏度和凝胶性有显著影响。高分子的蛋白溶液有很大的黏性，酶改性可以显著降低大豆分离蛋白的黏度，酶解同时会导致凝胶性的降低甚至达到无凝胶性的程度。低黏度的大豆分离蛋白可作为乳化剂应用于浓汤、高蛋白饮料、酸化饮料、婴儿食品、成人保健品、高蛋白的点心中。然而，酶水解的蛋白质产物有苦味，水解物的口感对其应用以及产品的可接受性影响重大。

酶水解的各种蛋白质经常表现苦味的原因是形成了苦味肽．大部分苦味肽的苦味是其中的疏水性氨基酸引起的。在完整的球蛋白分子中．大部分疏水性侧链藏在内部，它们不接触味蕾，感觉不到苦味。当蛋白质水解时，肽链含有的疏水性氨基酸充分暴露出来，接触味蕾产生苦味。随水解进程的继续，越来越多的疏水性氨基酸侧链暴露出来使苦味增加。按照Ney提出的Q规则理论，认为可以从蛋白质的一级结构上判断其水解物苦味生成的倾向，如果蛋白质本身的疏水性较强的话，那么它们的水解物中疏水性多肽出现的机会就较多，则水解物较苦。蛋白质的疏水性强弱可以根据它们Q值（平均疏水度）的大小加以判断。高Q值的蛋白质如酪蛋白、大豆蛋白和玉米醇溶蛋白就极易产生苦味，而像肉类蛋白和胶原蛋白的Q值较低，就不易产生苦味。此外，大豆制品的苦涩味和收敛性也与大豆异黄酮有关，游离的苷元型较之结合的糖苷具有更强的不愉快的风味。异黄酮在大豆中多以糖苷型存在，糖苷经酸水解或β-葡萄糖苷酶催化分解能转化为游离型的苷元。而苦味的有无及大小限制了大豆蛋白酶解物的应用范围。所以，在运用酶水解大豆分离蛋白提高功能性质的同时，控制苦味的产生引起广泛关注。

本发明以脱脂豆粕为原料，通过碱溶酸沉制备大豆分离蛋白。大豆分离蛋白本身无苦味等不良风味，但是粘度高，溶解性、分散性等功能性较差。通过选择合适的酶，在合适的条件下进行酶水解，达到合适的水解度，最终实现了在不产生明显苦味情况下蛋白质功能性质的明显改善。

发明内容

本发明的目的是提供一种对大豆分离蛋白进行酶水解的方法，通过酶制剂的筛选和酶解条件的控制得到低粘度、弱凝胶性、苦味值小的大豆分离蛋白。

本发明的技术方案：一种对大豆分离蛋白进行酶水解的方法，按照以下步骤改性大豆分离蛋白：

（1）大豆分离蛋白热处理：取大豆分离蛋白加入去离子水中，配制成质量浓度5%~15%的溶液；将此溶液倒入酶解反应器中，在50~85℃处理10~30min；

（2）大豆分离蛋白进行有限酶水解：用0.5 mol/L NaOH溶液将步骤（1）所得蛋白溶液调pH 6.5~8.5，待pH稳定15min后，按照E:S=0.01%~0.1%酶底比加入天野PC10F蛋白酶或天野SDNY10蛋白酶之一种(若底物为10g则加入酶制剂1~10mg)，或天野PC10F蛋白酶和天野SDNY10蛋白酶按照质量比5:1~1:5的混合酶后酶解（若底物为10g，如加入混合酶制剂总共6mg ，则天野PC10F蛋白酶为5~1mg，天野SDNY10蛋白酶为1~5mg），将单一酶或混合酶加入蛋白溶液中并开始酶解计时，维持pH保持恒定，反应5~30min；

（3）有限酶水解后的大豆分离蛋白加热钝化蛋白酶：迅速将有限酶水解后的蛋白溶液在高于酶失活的温度下加热15~60min后冷却至室温；

（4）喷雾干燥：将钝化后的蛋白溶液喷雾干燥，控制进风温度为110~130℃，出风温度为80~90℃，得酶解大豆蛋白干粉。

所述的对大豆分离蛋白进行酶水解的方法，所得产物酶解大豆蛋白干粉的水悬浮液具有如下物理特征：

（1）室温下，固形物含量为10%悬浮液的100s^-1剪切速率下粘度不大于10mPa·s；

（2）12%固形物含量悬浮液在95℃加热30min，并冷却至室温后，凝胶强度不大于3g；

（3）室温下，固形物含量为3%悬浮液的离心沉淀率不大于3%；

（4）室温下，配制成固形物含量为5%悬浮液的分散时间不大于40s。

所得产物酶解大豆蛋白干粉具有如下成分特征：

（1）苷元型异黄酮与总异黄酮之比不大于25%；

（2）在70%乙醇中可溶性氮与总氮之比不大于23%；

（3）70%乙醇可溶性氮在C18柱上的峰面积加权平均保留时间不大于56min。

所得产物酶解大豆蛋白干粉具有如下风味特征：

（1）以3%固形物含量分散于去离子水中所得悬浮液的苦味值不大于2；

（2）以3%固形物含量分散于5%蔗糖溶液中所得悬浮液的苦味值不大于1；

（3）以3%固形物含量分散于牛奶中所得悬浮液的苦味值不大于1。

分析方法：

1、氮含量的测定：半微量凯氏定氮法 (GB 5009.5—1985)。

2、粘度的测定：将得到的酶解大豆蛋白干粉溶于去离子水中，配制成10%浓度的溶液，于磁力搅拌器上搅拌30min后，用MCR301旋转流变仪测定粘度变化。测定参数：测试类型Stead State Flow，夹具60mm 2⁰椎板，样品间隙1mm，温度25℃，剪切速率从0.1s^-1~250s^-1。

3、凝胶强度的测定：将得到的酶解大豆蛋白干粉溶于去离子水中，于烧杯中配制成12%浓度的溶液。将此烧杯置于90℃的水浴中加热保温30 min，然后用冰浴冷却至室温，在4℃的冰箱中保存24 h，从冰箱中取出陈化30 min即可测定。用TA-XT2i质构仪测定凝胶强度，选用直径为12 mm的圆柱状平头冲头。设定前进速度：2mm/s,，冲压速度：1 mm/s；后撤速度：2 mm/s，冲压深度：10 mm，则形变为40％；每个样品重复测定3次取平均值得到凝胶质构参数。记录探头下压过程中感应的最大应力为凝胶强度。

4、离心沉淀率的测定：将得到的酶解大豆蛋白干粉溶于去离子水中，配制成3%浓度的溶液10mL，搅拌均匀后，4000r/min离心15min。离心沉淀率=（沉淀重量/离心样品重量）×100%。

5、分散时间的测定：取2g蛋白粉，加入38mL去离子水中，记录从搅拌开始到粉块全部散去所需的时间，重复3次取平均值。

6、异黄酮的提取与测定：准确称取酶解大豆分离蛋白粉1g，加入4mL 0.1M HCl 和20mL 乙腈，室温下搅拌2h，滤纸过滤后，取滤液真空旋转蒸干，用 80% 甲醇定容至 10mL，通过孔径0.45μm的醋酸纤维素膜，上清液以A液[乙腈（含0.05%三氟乙酸）]和B液[水（含0.05%三氟乙酸）]为流动相，色谱柱C18 梯度洗脱。对照标准样品测定异黄酮的含量，即通过保留时间找到对应的某种异黄酮标样，由标样峰面积、浓度和样品峰面积求出样品中该种异黄酮的浓度。采用的梯度和流速如下：

7、70%乙醇提取苦味肽的RP-HPLC测定：酶解蛋白干粉于去离子水中配制5%浓度的溶液，加入无水乙醇使乙醇浓度达到70%后，静置10min，4000r/min离心15min，取上清液，真空旋转蒸发掉乙醇后，加少量水溶解。冷冻干燥得粗苦味肽。配制8mg/mL的苦味肽溶液，通过孔径0.45μm的醋酸纤维素膜，上清液以C液[乙腈（含0.085%三氟乙酸）]和D液[水（含0.1%三氟乙酸）]为流动相，色谱柱C18 梯度洗脱。得到苦味肽谱图。

峰面积加权平均保留时间=∑（）

采用的流动相梯度和流速如下：

8、苦味的评定方法：感官评定小组由五人组成，评定员用蒸馏水漱口之后，取待评定液2-3mL置于口中，10秒钟后吐出，漱口后取与之味道相近之标准液品尝，如确认两味道相近，即可将待评定液的苦味值定为该标准液的苦味值，否则需取其它标准液再尝，直至确定待评定液的苦味值。取五人评定的平均值，以奎宁为基准物质。经评定当标准液浓度c为(3×10^-6mol/L)时，刚好无苦味，定c值为下限，32c为上限。此时若再增加奎宁浓度，苦味基本上不再增加。在 c～32c之间，奎宁浓度成倍增加，苦味值也相应增加。据此设定评分标准见表1。

表1 苦味值的评分标准

本发明的有益效果：本发明通过酶制剂的筛选，控制酶解条件，得到采用天野蛋白酶PC10F和/或SDNY10 酶解得到的酶解大豆蛋白干粉粘度和凝胶强度较弱，苦味较小，而其它功能性质良好。

附图说明

图1：70%乙醇提取的以PC10F酶酶解产物的粗苦味肽的RP-HPLC谱图。

图2：70%乙醇提取的以SDNY10酶酶解产物的粗苦味肽的RP-HPLC谱图。

图3：70%乙醇提取的以中性蛋白酶酶解产物的粗苦味肽的RP-HPLC谱图。

图4：70%乙醇提取的以PC10F蛋白酶和SDNY10质量比1:1酶解产物的粗苦味肽的RP-HPLC谱图。

具体实施方式

实施例1采用天野PC10F酶解

取15g的大豆分离蛋白加入285g去离子水中，于磁力搅拌器上搅拌1h，配制成5%浓度的溶液。将此溶液倒入酶解反应器中。连接60℃恒温循环水浴锅，将酶解反应器置于磁力搅拌器上，搅拌30min，用0.5 mol/L NaOH溶液将蛋白溶液调到pH 7.5，待pH稳定15min后，称取E:S=0.08%的天野PC10F蛋白酶11.321mg，加入蛋白溶液中并开始计时。维持pH保持恒定，反应30min后，迅速将蛋白溶液倒入500mL烧杯中，覆盖保鲜膜，将烧杯放入沸水浴中加热20min。取出后迅速冷却至室温。喷雾干燥时进风温度为125℃，出风温度为85℃得酶解蛋白粉。半微量凯氏定氮法测得原料和酶解后蛋白的含量为94.34%和94.16%。配制10%的溶液在100s^-1剪切速率下测定其粘度为5.65mPa·s。配制12%的溶液测定其凝胶强度为1.19g。3%悬浮液的离心沉淀率为1.19%。分散时间为17s。苷元型异黄酮与总异黄酮比例为24.20%。70%乙醇可溶氮占总氮的18.24%。70%乙醇可溶性氮在C18柱上的峰面积加权平均保留时间为51.22min。3%固形物含量分散于去离子水中所得悬浮液的苦味为1。分散于5%蔗糖溶液中苦味值为0。分散于牛奶中苦味值为0。

实施例2采用天野SDNY10酶解

取15g的大豆分离蛋白加入172.5g去离子水中，于磁力搅拌器上搅拌1h，配制成8%浓度的溶液。将此溶液倒入酶解反应器中。连接70℃恒温循环水浴锅，将酶解反应器置于磁力搅拌器上，搅拌30min，用0.5 mol/L NaOH溶液将蛋白溶液调到pH 7.0，待pH稳定15min后，称取E:S=0.1%的天野SDNY10蛋白酶14.151mg，加入蛋白溶液中并开始计时。维持pH保持恒定，反应15min后，迅速将蛋白溶液倒入500mL烧杯中，覆盖保鲜膜，将烧杯放入沸水浴中加热20min。取出后迅速冷却至室温。喷雾干燥时进风温度为125℃，出风温度为85℃得酶解蛋白粉。半微量凯氏定氮法测得原料和酶解后蛋白的含量为94.34%和94.09%。配制10%的溶液在100s^-1剪切速率下测定其粘度为8.31mPa·s。配制12%的溶液测定其凝胶强度为2.56g。3%悬浮液的离心沉淀率为2.44%。分散时间为24s。苷元型异黄酮与总异黄酮比例为24.34%。70%乙醇可溶氮占总氮的18.53%。70%乙醇可溶性氮在C18柱上的峰面积加权平均保留时间为53.78min。3%固形物含量分散于去离子水中所得悬浮液的苦味为2。分散于5%蔗糖溶液中苦味值为0。分散于牛奶中苦味值为0。

实施例3采用天野SDNY10和 PC10F混合酶解

取15g的大豆分离蛋白加入285g去离子水中，于磁力搅拌器上搅拌1h，配制成5%浓度的溶液。将此溶液倒入酶解反应器中。连接65℃恒温循环水浴锅，将酶解反应器置于磁力搅拌器上，搅拌30min，用0.5M NaOH溶液将蛋白溶液调到pH 7.5，待pH稳定15min后，按照总酶底比E:S=0.06%分别称取天野SDNY10蛋白酶2.83mg和天野蛋白酶PC10F 5.66mg，混合后加入蛋白溶液中并开始计时。维持pH保持恒定，反应30min后，迅速将蛋白溶液倒入500mL烧杯中，覆盖保鲜膜，将烧杯放入沸水浴中加热20min。取出后迅速冷却至室温。喷雾干燥时进风温度为125℃，出风温度为85℃得酶解蛋白粉。半微量凯氏定氮法测得原料和酶解后蛋白的含量为94.34%和94.23%。配制10%的溶液在100s^-1剪切速率下测定其粘度为6.98mPa·s。配制12%的溶液测定其凝胶强度为1.86g。3%悬浮液的离心沉淀率为2.04%。分散时间为21s。苷元型异黄酮与总异黄酮比例为24.47%。70%乙醇可溶氮占总氮的19.55%。70%乙醇可溶性氮在C18柱上的峰面积加权平均保留时间为53.25min。3%固形物含量分散于去离子水中所得悬浮液的苦味为2。分散于5%蔗糖溶液中苦味值为0。分散于牛奶中苦味值为0。

对照例：采用中性蛋白酶酶解

取15g的大豆分离蛋白加入135g去离子水中，于磁力搅拌器上搅拌1h，配制成10%浓度的溶液。将此溶液倒入酶解反应器中。连接50℃恒温循环水浴锅，将酶解反应器置于磁力搅拌器上，搅拌10min，用0.5M NaOH溶液将蛋白溶液调到pH 7.0，待pH稳定15min后，称取E:S=0.08%的中性蛋白酶11.321mg，加入蛋白溶液中并开始计时。维持pH保持恒定，反应20min后，迅速将蛋白溶液倒入500mL烧杯中，覆盖保鲜膜，将烧杯放入沸水浴中加热30min。取出后迅速冷却至室温。喷雾干燥时进风温度为120℃，出风温度为80℃得酶解大豆蛋白干粉。半微量凯氏定氮法测得原料和酶解后蛋白的含量为94.34%和93.97%。配制10%的溶液在100s^-1剪切速率下测定其粘度为10.3mPa·s。配制12%的溶液测定其凝胶强度为4.33g。3%悬浮液的离心沉淀率为3.25%。分散时间为61s。苷元型异黄酮与总异黄酮比例为26.73%。70%乙醇可溶氮占总氮的25.83%。70%乙醇可溶性氮在C18柱上的峰面积加权平均保留时间为60.26min。3%固形物含量分散于去离子水中所得悬浮液的苦味值为3。分散于5%蔗糖溶液中苦味值为1。分散于牛奶中苦味值为1。

表2：酶解蛋白中提取的异黄酮含量

含量	总异黄酮mg	苷元型异黄酮mg	苷元型异黄酮/总异黄酮(%)
				PC10F	1.178	0.285	24.20
SDNY10	1.183	0.288	24.34
				混合酶解	1.181	0.289	24.47
中性蛋白酶	1.174	0.314	26.73

从总体上看出采用天野蛋白酶PC10F和/或SDNY10 酶解，比采用中性蛋白酶酶解所得产品的功能特性更优。

Claims (3)

1.一种对大豆分离蛋白进行酶水解的方法，其特征在于按照以下步骤改性大豆分离蛋白：

（1）大豆分离蛋白热处理：取大豆分离蛋白加入去离子水中，配制成质量浓度5%~15%的溶液；将此溶液倒入酶解反应器中，在50~85℃处理10~30min；

（2）大豆分离蛋白进行有限酶水解：用0.5mol/L NaOH溶液将步骤（1）所得蛋白溶液调pH 6.5~8.5，待pH稳定15min后，按照E:S=0.01%~0.1%酶底比加入天野PC10F蛋白酶或天野SD-NY10蛋白酶之一种，或加入天野PC10F蛋白酶和天野SD-NY10蛋白酶按照质量比5:1~1:5的混合酶，将单一酶或混合酶加入蛋白溶液中并开始酶解计时，维持pH保持恒定，反应5~30min；

（3）有限酶水解后的大豆分离蛋白加热钝化蛋白酶：迅速将有限酶水解后的蛋白溶液在高于酶失活的温度下加热15~60min后冷却至室温；

（4）喷雾干燥：将钝化后的蛋白溶液喷雾干燥，控制进风温度为110~130℃，出风温度为80~90℃，得酶解大豆蛋白干粉。

2.根据权利要求1所述的对大豆分离蛋白进行酶水解的方法，其特征在于所得产物酶解大豆蛋白干粉的水悬浮液具有如下物理特征：

（1）室温下，固形物含量为10%悬浮液在100s^-1剪切速率下的粘度不大于10mPa·s；

（2）12%固形物含量悬浮液在95℃加热30min，并冷却至室温后，凝胶强度不大于3g；

（3）室温下，固形物含量为3%悬浮液的离心沉淀率不大于3%；

（4）室温下，配制成固形物含量为5%悬浮液的分散时间不大于40s。

3.根据权利要求1所述的对大豆分离蛋白进行酶水解的方法，其特征在于所得产物酶解大豆蛋白干粉具有如下成分特征：

（1）苷元型异黄酮与总异黄酮之比不大于25%；

（2）在70%乙醇中可溶性氮与总氮之比不大于23%；

（3）70%乙醇可溶性氮在C18柱上的峰面积加权平均保留时间不大于56min。