CN112708582A - 一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，包含以下步骤：S1、将双歧杆菌经过活化、发酵培养，得到双歧杆菌液；S2、将复合维生素B、氯化钠、硫酸镁、脱脂乳粉、磷酸氢二钾、氯化铁、蛋白胨、酵母粉、水苏糖、葡萄糖、十二水合磷酸氢二钠、去离子水加入到发酵罐中，发酵，得到一次发酵液；S3、将双歧杆菌液接种于发酵液中，发酵，得到二次发酵液；S4、将二次发酵液加入到无水乙醇中，超声处理，离心，过滤，滤液即为二裂酵母发酵产物滤液。所述的二裂酵母发酵产物滤液具有良好的美白功效、清除自由基性能，同时还具有减少皮肤色斑数量、提亮肤色、减轻皱纹数量和程度、提高平滑度的作用，在化妆品中具有广泛的应用前景。

Description

一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法。
背景技术
二裂酵母是人体肠道菌群之一，肠道黏附性强，定植于肠道的能力强，并具有激活巨噬细胞、刺激免疫因子释放、维持肠道菌群平衡、抗肿瘤、促进微量元素吸收、控制内毒素的产生等重要的生理保健功能，因此二裂酵母的应用价值极高。
二裂酵母发酵产物滤液是双歧杆菌发酵后处理得到的发酵产物滤液，提取得到的二裂酵母发酵产物滤液虽然清除自由基功效，但是清除自由基能力不足，因此，如何制备出具有良好的清除自由基白作用的二裂酵母发酵产物滤液成为了亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，所述的二裂酵母发酵产物滤液具有良好的美白功效以及清除自由基性能。
一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，包含以下步骤：
S1、将双歧杆菌接种到培养基上，25~35℃下进行活化培养1~3d，得到活化的双歧杆菌，将活化的双歧杆菌接种到液体培养基中，28~35℃下发酵培养2~4d，得到双歧杆菌液；
S2、按照重量份配比称取：0.01~0.015份复合维生素B、0.01~0.04份氯化钠、0.03~0.06份硫酸镁、0.1~0.2份脱脂乳粉、0.15~0.3份磷酸氢二钾、0.15~0.3份氯化铁、0.2~0.4份蛋白胨、0.2~0.5份酵母粉、0.2~0.5份水苏糖、0.4~0.7份葡萄糖、0.5~0.8份十二水合磷酸氢二钠、94~98份去离子水加入到发酵罐中，28~40℃下发酵18~30h，得到一次发酵液；
S3、将双歧杆液接种于发酵液中，接种量为5~15wt%，在25~32℃下发酵30~50h，得到二次发酵液；
S4、将二次发酵液加入到无水乙醇中，超声处理，离心，过滤，经过巴氏杀菌，滤液即为二裂酵母发酵产物滤液。
作为一种优选方案，所述培养基按重量百分比包括：0.1~0.3%磷酸氢二钾，0.2~0.6%L-谷氨酸钠，0.2~0.8％氯化钠，0.4~1%木醋液，0.5~1.2%秸秆粉，1~2％葡萄糖，1~3％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
作为一种优选方案，所述液体培养基按重量百分比包括：0.1~0.3%磷酸氢二钾，0.2~0.6%L-谷氨酸钠，0.2~0.8％氯化钠，0.4~1%木醋液， 0.5~1.2%秸秆粉，1~2％葡萄糖，1~3％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
作为一种优选方案，所述S2具体：按照重量份配比称取：0.012份复合维生素B、0.02份氯化钠、0.05份硫酸镁、0.16份脱脂乳粉、0.25份磷酸氢二钾、0.28份氯化铁、0.28份蛋白胨、0.3份酵母粉、0.4份水苏糖、0.6份葡萄糖、0.64份十二水合磷酸氢二钠、96.7份去离子水加入到发酵罐中，32℃下发酵24h，得到一次发酵液。
作为一种优选方案，所述双歧杆菌为乳双歧杆菌BB-12。
作为一种优选方案，所述二次发酵液、无水乙醇重量比为1：2~6。
作为一种优选方案，所述超声处理功率为400~700W，超声处理时间为25~45min。
作为一种优选方案，将二裂酵母发酵产物滤液加入到去离子水中，上大孔吸附树脂，洗脱速度为1~2BV/h，去离子水洗 1~2BV，40~60wt％乙醇溶液洗1.5~2.5BV，收集乙醇洗液，干燥，即得纯化的二裂酵母发酵产物滤液。
作为一种优选方案，所述大孔吸附树脂为HPD-600。
作为一种优选方案，所述二裂酵母发酵产物滤液、去离子水重量比为（2~6）：1。
本发明解决其技术问题采用以下技术方案：
本发明的有益效果：（1）本发明所述的二裂酵母发酵产物滤液具有良好的美白功效、清除自由基性能，同时还具有减少皮肤色斑数量、提亮肤色、减轻皱纹数量和程度、提高平滑度的作用，在化妆品中具有广泛的应用前景；（2）所述的二裂酵母发酵产物滤液由益生菌双歧杆菌经发酵培养后所得发酵产物滤液，富含双歧杆菌分泌产物维生素 多肽 多糖氨基酸等活性物质，且经过发酵以及纯化，保留了具有美白、清除自由基的功效物质。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，包含以下步骤：
S1、将双歧杆菌接种到培养基上，28℃下进行活化培养2d，得到活化的双歧杆菌，将活化的双歧杆菌接种到液体培养基中，30℃下发酵培养3d，得到双歧杆菌液；
S2、按照重量份配比称取：0.012份复合维生素B、0.02份氯化钠、0.05份硫酸镁、0.16份脱脂乳粉、0.25份磷酸氢二钾、0.28份氯化铁、0.28份蛋白胨、0.3份酵母粉、0.4份水苏糖、0.6份葡萄糖、0.64份十二水合磷酸氢二钠、96.7份去离子水加入到发酵罐中，32℃下发酵24h，得到一次发酵液；
S3、将双歧杆液接种于发酵液中，接种量为8wt%，在30℃下发酵40h，得到二次发酵液；
S4、将二次发酵液加入到无水乙醇中，500W超声处理30min，离心，过滤，经过巴氏杀菌，滤液即为二裂酵母发酵产物滤液；所述二次发酵液、无水乙醇重量比为1：4。
所述培养基按重量百分比包括：0.2%磷酸氢二钾，0.5%L-谷氨酸钠，0.6％氯化钠，0.8%木醋液，1%秸秆粉，1.5％葡萄糖，2％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
所述液体培养基按重量百分比包括：0.2%磷酸氢二钾，0.5%L-谷氨酸钠，0.6％氯化钠，0.8%木醋液，1%秸秆粉，1.5％葡萄糖，2％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
所述双歧杆菌为乳双歧杆菌BB-12。
实施例2
一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，包含以下步骤：
S1、将双歧杆菌接种到培养基上，28℃下进行活化培养2d，得到活化的双歧杆菌，将活化的双歧杆菌接种到液体培养基中，30℃下发酵培养3d，得到双歧杆菌液；
S2、按照重量份配比称取：0.01份复合维生素B、0.01份氯化钠、0.03份硫酸镁、0.1份脱脂乳粉、0.15份磷酸氢二钾、0.15份氯化铁、0.2份蛋白胨、0.2份酵母粉、0.2份水苏糖、0.4份葡萄糖、0.5份十二水合磷酸氢二钠、94份去离子水加入到发酵罐中，32℃下发酵24h，得到一次发酵液；
S3、将双歧杆液接种于发酵液中，接种量为8wt%，在30℃下发酵40h，得到二次发酵液；
S4、将二次发酵液加入到无水乙醇中，500W超声处理30min，离心，过滤，经过巴氏杀菌，滤液即为二裂酵母发酵产物滤液；所述二次发酵液、无水乙醇重量比为1：4。
所述培养基按重量百分比包括：0.2%磷酸氢二钾，0.5%L-谷氨酸钠，0.6％氯化钠，0.8%木醋液，1%秸秆粉，1.5％葡萄糖，2％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
所述液体培养基按重量百分比包括：0.2%磷酸氢二钾，0.5%L-谷氨酸钠，0.6％氯化钠，0.8%木醋液，1%秸秆粉，1.5％葡萄糖，2％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
所述双歧杆菌为乳双歧杆菌BB-12。
实施例3
一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，包含以下步骤：
S1、将双歧杆菌接种到培养基上，28℃下进行活化培养2d，得到活化的双歧杆菌，将活化的双歧杆菌接种到液体培养基中，30℃下发酵培养3d，得到双歧杆菌液；
S2、按照重量份配比称取：0.015份复合维生素B、0.04份氯化钠、0.06份硫酸镁、0.2份脱脂乳粉、0.3份磷酸氢二钾、0.3份氯化铁、0.4份蛋白胨、0.5份酵母粉、0.5份水苏糖、0.7份葡萄糖、0.8份十二水合磷酸氢二钠、98份去离子水加入到发酵罐中， 32℃下发酵24h，得到一次发酵液；
S3、将双歧杆液接种于发酵液中，接种量为8wt%，在30℃下发酵40h，得到二次发酵液；
S4、将二次发酵液加入到无水乙醇中，500W超声处理30min，离心，过滤，经过巴氏杀菌，滤液即为二裂酵母发酵产物滤液；所述二次发酵液、无水乙醇重量比为1：4。
所述培养基按重量百分比包括：0.2%磷酸氢二钾，0.5%L-谷氨酸钠，0.6％氯化钠，0.8%木醋液，1%秸秆粉，1.5％葡萄糖，2％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
所述液体培养基按重量百分比包括：0.2%磷酸氢二钾，0.5%L-谷氨酸钠，0.6％氯化钠，0.8%木醋液，1%秸秆粉，1.5％葡萄糖，2％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
所述双歧杆菌为乳双歧杆菌BB-12。
实施例4
一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，包含以下步骤：
S1、将双歧杆菌接种到培养基上，28℃下进行活化培养2d，得到活化的双歧杆菌，将活化的双歧杆菌接种到液体培养基中，30℃下发酵培养3d，得到双歧杆菌液；
S2、按照重量份配比称取：0.012份复合维生素B、0.02份氯化钠、0.05份硫酸镁、0.16份脱脂乳粉、0.25份磷酸氢二钾、0.28份氯化铁、0.28份蛋白胨、0.3份酵母粉、0.4份水苏糖、0.6份葡萄糖、0.64份十二水合磷酸氢二钠、96.7份去离子水加入到发酵罐中，32℃下发酵24h，得到一次发酵液；
S3、将双歧杆液接种于发酵液中，接种量为8wt%，在30℃下发酵40h，得到二次发酵液；
S4、将二次发酵液加入到无水乙醇中，500W超声处理30min，离心，过滤，经过巴氏杀菌，滤液即为二裂酵母发酵产物滤液；所述二次发酵液、无水乙醇重量比为1：4；
S5、将二裂酵母发酵产物滤液加入到去离子水中，上大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，去离子水洗 1.5BV，50wt％乙醇溶液洗2BV，收集乙醇洗液，干燥，即得纯化的二裂酵母发酵产物滤液。
所述大孔吸附树脂为HPD-600。
所述二裂酵母发酵产物滤液、去离子水重量比为5：1。
所述培养基按重量百分比包括：0.2%磷酸氢二钾，0.5%L-谷氨酸钠，0.6％氯化钠，0.8%木醋液，1%秸秆粉，1.5％葡萄糖，2％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
所述液体培养基按重量百分比包括：0.2%磷酸氢二钾，0.5%L-谷氨酸钠，0.6％氯化钠，0.8%木醋液，1%秸秆粉，1.5％葡萄糖，2％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
所述双歧杆菌为乳双歧杆菌BB-12。
对比例1
对比例1与实施例4不同之处在于，对比例4所述的二次发酵液采用水提取，其他都相同。
一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，包含以下步骤：
S1、将双歧杆菌接种到培养基上，28℃下进行活化培养2d，得到活化的双歧杆菌，将活化的双歧杆菌接种到液体培养基中，30℃下发酵培养3d，得到双歧杆菌液；
S2、按照重量份配比称取：0.012份复合维生素B、0.02份氯化钠、0.05份硫酸镁、0.16份脱脂乳粉、0.25份磷酸氢二钾、0.28份氯化铁、0.28份蛋白胨、0.3份酵母粉、0.4份水苏糖、0.6份葡萄糖、0.64份十二水合磷酸氢二钠、96.7份去离子水加入到发酵罐中，32℃下发酵24h，得到一次发酵液；
S3、将双歧杆液接种于发酵液中，接种量为8wt%，在30℃下发酵40h，得到二次发酵液；
S4、将二次发酵液加入到去离子水中，500W超声处理30min，离心，过滤，经过巴氏杀菌，滤液即为二裂酵母发酵产物滤液；所述二次发酵液、去离子水重量比为1：4；
S5、将二裂酵母发酵产物滤液加入到去离子水中，上大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，去离子水洗 1.5BV，50wt％乙醇溶液洗2BV，收集乙醇洗液，干燥，即得纯化的二裂酵母发酵产物滤液。
所述大孔吸附树脂为HPD-600。
所述二裂酵母发酵产物滤液、去离子水重量比为5：1。
所述培养基按重量百分比包括：0.2%磷酸氢二钾，0.5%L-谷氨酸钠，0.6％氯化钠，0.8%木醋液，1%秸秆粉，1.5％葡萄糖，2％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
所述液体培养基按重量百分比包括：0.2%磷酸氢二钾，0.5%L-谷氨酸钠，0.6％氯化钠，0.8%木醋液，1%秸秆粉，1.5％葡萄糖，2％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
所述双歧杆菌为乳双歧杆菌BB-12。
为了进一步证明本发明的效果，提供了以下测试方法：
1. 美白实验：选择同一代对数生长期的B16细胞，用常规胰酶处理后，吹打成单细胞悬液，然后定量接种于96孔板。24小时后，弃去上清液，实验组分别加入含有测试药液的培养液（测试物分别为实施例1~3、对比例1~2所制备得到的二裂酵母发酵产物滤液、实施例4纯化的二裂酵母发酵产物滤液），然后在37℃，5％的CO2饱和湿性条件下培养，对照孔加RPMI1640培养液，培育三天后弃去上清液，用常规胰酶消化处理后，计数细胞密度，离心得到细胞沉淀，然后用PBS冲洗两次，离心弃去上清液，加入 10％的DMSO的1N的NaOH液，80℃水浴50分钟，接着用酶标仪测定450nm处的吸光值。黑色素生成的抑制率(%)＝ (对照组的吸光度-试验组的吸光度/对照组的吸光度) × 100%，具体结果见表1。
2. 清除自由基实验：本实验应用ABTS测定自由基清除率。配制浓度为7mmol/L的ABTS和2 .45mmol/L的过硫酸钾混合溶液，室温避光静置12h，用水稀释，使其在734nm下的吸光值为0 .7±0 .02(记为A0)，在ABTS工作液试管中加入实施例1~3、对比例1~2所制备得到的二裂酵母发酵产物滤液、实施例4纯化的二裂酵母发酵产物滤液的样品1mL，ABTS工作液1.5mL。以上各组室温避光放置1h，在734nm下测定其吸光值(记为A)，清除率(％)＝(A0-A)/A0×100％，具体结果见表1。
表1 测试结果
Figure 828930DEST_PATH_IMAGE001
从表1中可看出，本发明所制备得到的二裂酵母发酵产物滤液具有良好的美白功效以及清除自由基性能。
对比实施例1~3可知，不同的原料配比的加入能够影响制备得到的二裂酵母发酵产物滤液美白功效以及清除自由基性能。
对比实施例1、4可知，采取无水乙醇提取、大孔吸附树脂纯化能够提高美白效果以及清除自由基性能。
对比实施例1与对比例1可知，采取醇提相比于水提更加能够提高美白效果以及清除自由基性能。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.一种二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1、将双歧杆菌接种到培养基上，25~35℃下进行活化培养1~3d，得到活化的双歧杆菌，将活化的双歧杆菌接种到液体培养基中，28~35℃下发酵培养2~4d，得到双歧杆菌液；
S2、按照重量份配比称取：0.01~0.015份复合维生素B、0.01~0.04份氯化钠、0.03~0.06份硫酸镁、0.1~0.2份脱脂乳粉、0.15~0.3份磷酸氢二钾、0.15~0.3份氯化铁、0.2~0.4份蛋白胨、0.2~0.5份酵母粉、0.2~0.5份水苏糖、0.4~0.7份葡萄糖、0.5~0.8份十二水合磷酸氢二钠、94~98份去离子水加入到发酵罐中，28~40℃下发酵18~30h，得到一次发酵液；
S3、将双歧杆液接种于发酵液中，接种量为5~15wt%，在25~32℃下发酵30~50h，得到二次发酵液；
S4、将二次发酵液加入到无水乙醇中，超声处理，离心，过滤，经过巴氏杀菌，滤液即为二裂酵母发酵产物滤液。
2.根据权利要求1所述的二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述培养基按重量百分比包括：0.1~0.3%磷酸氢二钾，0.2~0.6%L-谷氨酸钠，0.2~0.8％氯化钠，0.4~1%木醋液，0.5~1.2%秸秆粉，1~2％葡萄糖，1~3％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
3.根据权利要求1所述的二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述液体培养基按重量百分比包括：0.1~0.3%磷酸氢二钾，0.2~0.6%L-谷氨酸钠，0.2~0.8％氯化钠，0.4~1%木醋液， 0.5~1.2%秸秆粉，1~2％葡萄糖，1~3％甘蔗糖蜜，余量纯净水。
4.根据权利要求1所述的二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述S2具体：按照重量份配比称取：0.012份复合维生素B、0.02份氯化钠、0.05份硫酸镁、0.16份脱脂乳粉、0.25份磷酸氢二钾、0.28份氯化铁、0.28份蛋白胨、0.3份酵母粉、0.4份水苏糖、0.6份葡萄糖、0.64份十二水合磷酸氢二钠、96.7份去离子水加入到发酵罐中，32℃下发酵24h，得到一次发酵液。
5.根据权利要求1所述的二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述双歧杆菌为乳双歧杆菌BB-12。
6.根据权利要求1所述的二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述二次发酵液、无水乙醇重量比为1：2~6。
7.根据权利要求1所述的二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述超声处理功率为400~700W，超声处理时间为25~45min。
8.根据权利要求1所述的二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，将二裂酵母发酵产物滤液加入到去离子水中，上大孔吸附树脂，洗脱速度为1~2BV/h，去离子水洗 1~2BV，40~60wt％乙醇溶液洗1.5~2.5BV，收集乙醇洗液，干燥，即得纯化的二裂酵母发酵产物滤液。
9.根据权利要求8所述的二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为HPD-600。
10.根据权利要去8所述的二裂酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述二裂酵母发酵产物滤液、去离子水重量比为（2~6）：1。
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