CN110483488A - 一种异戊烯基化黄酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及异戊烯基化黄酮类化合物及其制备方法和应用，可有效解决异戊烯基化黄酮类化合物的制备和制备保肝活性药物的问题，所述的异戊烯基化黄酮类化合物是从小叶莲中提取的桃儿七酮V(sinoflavonoid V，Ⅰ)、桃儿七酮W(sinoflavonoid W，Ⅱ)、桃儿七酮X(sinoflavonoid X，Ⅲ)、桃儿七酮Y(sinoflavonoid Y，Ⅳ)、桃儿七酮Z(sinoflavonoid Z，Ⅴ)、桃儿七酮NA(sinoflavonoid NA，Ⅵ)，本发明原料丰富，制备方法易操作，可用于制备肝保护药物，具有实际的临床意义，经济和社会效益显著。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是具有肝保护活性的一种异戊烯基化黄酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
肝脏将人体内多种内源性或者外源性毒性物质通过氧化、还原、水解等多种途径将其转化成无毒或者低毒的物质，是重要的代谢器官。肝脏易受病毒、药物、毒物及免疫病理因素的影响，如长期生活在有毒的环境中或过量饮酒都会诱发各类肝脏疾病，进而导致肝损伤的发生。肝损伤是形成肝炎、肝硬化和肝癌疾病的直接原因，临床发病率逐年升高，它已经成为严重危害全球人类健康的主要疾病之一。目前发病的重要原因普遍被认为是机体免疫应答和氧化应激反应，但对肝脏损伤的确切发病机制尚不明确，对于肝损伤尚无有效的治疗措施。
传统中药在我国已有几千年的应用历史，是研究保肝药物的重要资源。小叶莲是小檗科桃儿七属植物桃儿七Sinopodophyllum hexandrum的干燥成熟果实。鬼臼是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见。不入汤。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、月经不调、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气管炎等症。鬼臼分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。小叶莲作为传统藏药始载于《月王药诊》，具有悠久的药用历史。化学成分研究表明主要含有木脂素类化合物和黄酮类化合物，其中异戊烯基化黄酮类化合物是小叶莲中代表性的活性成分，具有重要而广泛的生物活性如抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗骨质疏松、预防老年痴呆、抗糖尿病、心脑血管保护、雌激素样等。但涉及具有保肝活性的异戊烯基化黄酮类化合物及其生物活性，迄今为止未见有专利或文献报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种异戊烯基化黄酮类化合物及其制备方法和应用，可有效解决异戊烯基化黄酮类化合物的制备和制备保肝活性药物的问题。
本发明解决的技术方案是，一种异戊烯基化黄酮类化合物，是从小叶莲中提取的桃儿七酮V(sinoflavonoid V，Ⅰ)、桃儿七酮W(sinoflavonoid W，Ⅱ)、桃儿七酮X(sinoflavonoid X，Ⅲ)、桃儿七酮Y(sinoflavonoid Y，Ⅳ)、桃儿七酮Z(sinoflavonoid Z，Ⅴ)、桃儿七酮NA(sinoflavonoid NA，Ⅵ)，分子结构式分别为：
一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法是：
以小叶莲药材6-9kg为原料，用2–5倍原料重量、体积浓度为75％–95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90–95℃，每次提取时间为1.5–2小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2–3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2–3.2L，时间为1.5–2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、 0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用9.1–13L洗脱液，流速为10–15mL/min，每350–500mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份 133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份 189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度400–600mL，每40–60mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6 个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度40–70mL，每4–7mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为50–70mL/h，每8–12mL 为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每10–15mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度150–200mL，每15–20mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为30–50mL/h，每3–5mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热 3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
本发明制备的具有肝保护活性的新型异戊烯基化黄酮类化合物桃儿七酮V(sinoflavonoid V，I)、桃儿七酮W(sinoflavonoid W，Ⅱ)、桃儿七酮X(sinoflavonoid X，Ⅲ)、桃儿七酮Y(sinoflavonoid Y，Ⅳ)、桃儿七酮Z(sinoflavonoid Z，V)、桃儿七酮 NA(sinoflavonoid NA，Ⅵ)，本发明原料丰富，制备方法易操作，可用于制备肝保护药物，具有实际的临床意义，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明化合物Ⅰ的核磁共振氢谱图。
图2为本发明化合物Ⅰ的核磁共振碳谱图。
图3为本发明化合物Ⅰ的HMBC谱图。
图4为本发明化合物Ⅰ的HSQC谱图。
图5为本发明化合物Ⅱ的核磁共振氢谱图。
图6为本发明化合物Ⅱ的核磁共振碳谱图。
图7为本发明化合物Ⅱ的HMBC谱图。
图8为本发明化合物Ⅱ的HSQC谱图。
图9为本发明化合物Ⅲ的核磁共振氢谱图。
图10为本发明化合物Ⅲ的核磁共振碳谱图。
图11为本发明化合物Ⅲ的HMBC谱图。
图12为本发明化合物Ⅲ的HSQC谱图。
图13为本发明化合物Ⅳ的核磁共振氢谱图。
图14为本发明化合物Ⅳ的核磁共振碳谱图。
图15为本发明化合物Ⅳ的HMBC谱图。
图16为本发明化合物Ⅳ的HSQC谱图。
图17为本发明化合物V的核磁共振氢谱图。
图18为本发明化合物V的核磁共振碳谱图。
图19为本发明化合物V的HMBC谱图。
图20为本发明化合物V的HSQC谱图。
图21为本发明化合物Ⅵ的核磁共振氢谱图。
图22为本发明化合物Ⅵ的核磁共振碳谱图。
图23为本发明化合物Ⅵ的HMBC谱图。
图24为本发明化合物Ⅵ的HSQC谱图。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施时可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法是：以小叶莲药材7.5kg为原料，用4 倍原料重量、体积浓度为85％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间为 1.8小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.6L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2.6L，时间为1.8小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用11L洗脱液，流速为13mL/min，每430mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度500mL，每50mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份 Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、 100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度55mL，每4–7mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为60mL/h，每10mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3 的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每13mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度180mL，每18mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为40mL/h，每4mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、 Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-PackODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
实施例2
本发明一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法是：以小叶莲药材9kg为原料，用2倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为1.5 小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次3.2L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、 100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流速为15mL/min，每500mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度400mL，每40mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、 100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度45mL，每5mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为70mL/h，每12mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3 的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热 3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每11mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度200mL，每20mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为50mL/h，每5mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、 Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
实施例3
本发明一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法是：
以小叶莲药材6kg为原料，用5倍原料重量、体积浓度为75％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用9.5L洗脱液，流速为10mL/min，每350mL为一流份，收集260 个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚- 丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、 70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度400mL，每40mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3 的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度40mL，每4mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为50mL/h，每8mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3 的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热 3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每14mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度150mL，每15mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为30mL/h，每3mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、 Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
实施例4
本发明一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法是：以小叶莲药材8kg为原料，用3倍原料重量、体积浓度为80％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为93℃，每次提取时间为1.6 小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2.8L，时间为1.6小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、 100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用11.8L 洗脱液，流速为13mL/min，每450mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷- 甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度550mL，每55mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度60mL，每6mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为65mL/h，每9mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3 的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热 3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每12mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度180mL，每18mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为45mL/h，每4mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、 Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
实施例5
本发明一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法是：以小叶莲药材7kg为原料，用3倍原料重量、体积浓度为85％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2 小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.4L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2.4L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、 100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10.5L 洗脱液，流速为12mL/min，每400mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度500mL，每50mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、 100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度60mL，每6mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为65mL/h，每11mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3 的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热 3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每14mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度160mL，每16mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为45mL/h，每4.5mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3 的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热 3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为 YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
本发明方法稳定可靠，易操作，实施例1-5所得产物经UV、IR、核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定，分别为具有肝保护活性的新型异戊烯基化黄酮类化合物桃儿七酮V(sinoflavonoid V，I)、桃儿七酮W(sinoflavonoid W，Ⅱ)、桃儿七酮X(sinoflavonoid X，Ⅲ)、桃儿七酮Y(sinoflavonoid Y，Ⅳ)、桃儿七酮Z(sinoflavonoid Z，V)、桃儿七酮NA(sinoflavonoid NA，Ⅵ)，有关资料如下：
一、化合物的鉴定
化合物Ⅰ，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 409.1282[M﹢H]+(calcd for C23H21O7,409.1287，确定分子式为C23H20O7。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3330cm-1)，缔合羰基(1650cm-1)，苯环(1610 cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(269，359nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6) 显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.31(1H,s)、6.90(1H,d,J＝8.4Hz)、7.59(1H,d,J＝8.4 Hz)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个五取代和1,2,3,4-四取代苯环结构单元。由1个亚甲基质子信号δ3.30(2H,d,J＝6.8Hz)，2个与季碳相连的甲基质子信号δ1.49(3H,s)、1.56(3H,s)，1个烯氢质子δ5.06(1H,t,J＝6.8)，提示结构中存在1个异戊烯基。一个二取代呋喃环上的两个烯氢质子δ7.05(1H,d,J＝2.1)、8.09(1H,d,J＝2.1)。一个与烯碳相连的甲氧基氢信号δ3.65(3H,s)。1个与4位羰基缔合的5位酚羟基质子信号δ 12.70(1H,s)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有23个碳原子，除了1组异戊烯基碳信号δ21.1、122.4、131.0、17.6、25.3，一个二取代呋喃环δ107.3、146.6，一个甲氧基氢信号δ 60.6之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ178.1，两个与氧相连的烯碳信号δ156.6、 137.7，以上碳谱数据进一步表明化合物Ⅰ为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ3.30(2H,d,J＝6.8Hz,H-1″)与δ161.6(C-7)、106.0(C-8)、153.9(C-9)的远程相关，表明异戊烯基连接在黄酮母核的C-8位。由烯氢质子信号δ7.05(1H,d,J＝2.1,H-1″′)与δ113.4(C-1′)、128.1(C-2′)、143.1(C-3′)的HMBC远程相关、8.09(1H,d,J＝2.1,H-2″′)与143.1 (C-3′)的HMBC远程相关，表明呋喃环与黄酮母核的C-2′和C-3′位骈和。甲氧基氢信号δ3.65 (3H,s)与137.7(C-3)的远程相关，表明甲氧基与C-3相连。将化合物Ⅰ的1H NMR、13C NMR 信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见Table 1)。因此化合物Ⅰ的结构为 2′,3′-furano-5,3′,4′-trihydroxy-3-methoxyflavone，命名为桃儿七酮V(sinoflavonoid V)。
Table 1.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments for I.
化合物Ⅱ，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 427.1390[M﹢H]+(calcd for C23H23O8,427.1393)，确定分子式为C23H22O8。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3350cm-1)，缔合羰基(1651cm-1)，苯环(1610 cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(264，350nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6) 显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.29(1H,s)，6.79(1H,d,J＝8.4Hz)、7.09(1H,d,J＝8.4 Hz)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个五取代和1,2,3,4-四取代苯环结构单元。由1个亚甲基质子信号δ3.30(2H,d,J＝6.8Hz)，2个与季碳相连的甲基质子信号δ1.58(3H,s)、1.60(3H,s)，1个烯氢质子δ5.05(1H,t,J＝6.8)，提示结构中存在1个异戊烯基。一个亚甲基氢质子δ3.44(1H,dd,J＝17.1,6.8)、2.95(1H,dd,J＝17.1,2.4)，二连氧氢质子6.03(1H,br.s)，提示结构中存在一个2-羟基-二氢呋喃环。一个与烯碳相连的甲氧基氢信号δ3.64(3H,s)。1个与4位羰基缔合的5位酚羟基质子信号δ12.65(1H,s)。13CNMR(125 MHz,DMSO-d6)显示含有23个碳原子，除了1组2-羟基二氢呋喃基δ38.2、101.0，一组异戊烯基δ21.1、122.4、131.3、17.7、25.4，一个甲氧基δ60.2之外，还给出12个芳香碳信号，1 个羰基碳信号δ178.1，两个连氧烯碳信号δ156.0、138.0，以上碳谱数据进一步表明化合物Ⅱ为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ3.30(2H,d,J＝6.8Hz,H-1″) 与δ161.6(C-7)、105.9(C-8)、153.9(C-9)的远程相关，表明异戊烯基连接黄酮母核的C-8位。由亚甲基质子信号δ3.44(1H,dd,J＝17.1,6.8,H-1″′)、2.95(1H,dd,J＝17.1,2.4,H-1″′)与δ 117.8(C-1′)、127.0(C-2′)、145.4(C-3′)的远程相关，二连氧次甲基质子信号δ6.03(1H,br.s, H-2″′)和145.4(C-3′)的远程相关，表明呋喃环与黄酮母核的C-2′和C-3′位骈和。甲氧基氢信号δ3.64(3H,s)与138.0(C-3)的远程相关，表明甲氧基与C-3相连。将化合物Ⅱ的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见Table 2)。因此化合物Ⅱ的结构为 8-(3-methyl-2-butenyl)-2′,3′-(2-hydroxydihydrofurano)-5,7,4′-tetrihydroxy-3-methoxyflavone，命名为桃儿七酮W(sinoflavonoid W)。
Table 2.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments for Ⅱ.
化合物Ⅲ，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 491.1683[M﹢Na]+(calcd for C26H28O8Na,491.1682)，确定分子式为 C26H28O8。IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3368cm-1)，缔合羰基(1655cm-1)，苯环 (1597cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(264，350nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.17(1H,s)，6.77(2H,s)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个五取代和1,2,3,4-四取代苯环结构单元。由1个亚甲基质子信号δ2.79(1H,dd,J＝16.5,5.2Hz)、2.47(1H,dd,J＝16.5,7.1Hz)，1个连氧次甲基氢信号δ3.67(1H,dd,J＝7.1,5.2Hz)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.20(3H,s)、1.27(3H,s)，提示结构中存在1个3-羟基-2,2-二甲基-二氢吡喃环。由1个亚甲基质子信号δ3.23(2H,d,J＝ 6.9Hz)，两个与季碳相连的的甲基质子信号δ1.27(3H,s)、1.44(3H,s)，一个烯氢质子δ4.99 (1H,t,J＝6.9)，提示结构中存在1个异戊烯基。1个与烯碳相连的甲氧基氢信号δ3.57(3H,s)。三个酚羟基信号δ12.45(1H,s)、9.90(1H,s)、8.57(1H,s)，其中δ12.45(1H,s)为与4位羰基缔合的5位酚羟基氢信号。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有26个碳原子，除了1组 3-羟基-2,2-二甲基-二氢吡喃基δ24.9、66.8、78.9、20.8、25.1，一组异戊烯基δ25.7、122.9、 130.2、17.2、25.2，一个甲氧基δ59.8之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ178.2，两个连氧烯碳信号δ158.7、139.1，以上碳谱数据进一步表明化合物Ⅲ为异戊烯基化黄酮醇衍生物。由亚甲基质子信号δ2.79(1H,dd,J＝16.5,5.2Hz,H-1″)、2.47(1H,dd,J＝16.5,7.1Hz, H-1″)与δ158.7(C-7)、99.0(C-8)、154.1(C-9)的HMBC远程相关，表明3-羟基-2,2-二甲基- 二氢吡喃环与黄酮母核的C-7和C-8骈和。由亚甲基质子信号δ3.23(2H,d,J＝6.9Hz,H-1″′) 与δ121.2(C-1′)、127.7(C-2′)、143.3(C-3′)的远程相关，表明异戊烯基连接在2′位。甲氧基氢信号δ3.57(3H,s)与139.1(C-3)的远程相关，表明甲氧基与C-3相连。将化合物Ⅲ的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见Table 3)。因此化合物Ⅲ的结构为 7,8-(2,2-dimethyldihydropyrano)-2′-(3-methyl-2-butenyl)-5,3′,4′-trihydroxy-3-methoxyflavone，命名为桃儿七酮X(sinoflavonoid X)。
Table 3.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments for Ⅲ.
化合物Ⅳ，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 491.1669[M﹢Na]+(calcd for C26H28O8Na,491.1682)，确定分子式为 C26H28O8。IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3340cm-1)，缔合羰基(1651cm-1)，苯环 (1584cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(264，350nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.30(1H,s)，6.75(1H,d,J＝8.2Hz)、6.87(1H,d, J＝8.2Hz)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个五取代和1,2,3,4- 四取代苯环结构单元。由1个亚甲基质子信号δ2.75(1H,dd,J＝17.0,5.4Hz)、2.55(1H,dd,J ＝17.0,8.2Hz)，1个连氧次甲基氢信号δ3.60(1H,dd,J＝8.2,5.4Hz)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.17(3H,s)、1.32(3H,s)，提示结构中存在1个3-羟基-2,2-二甲基-二氢吡喃环。由1 个亚甲基质子信号δ3.23(2H,d,J＝6.9Hz)，两个与季碳相连的的甲基质子信号δ1.48(3H,s)、 1.54(3H,s)，一个烯氢质子δ5.05(1H,t,J＝6.9)，提示结构中存在1个异戊烯基。1个与烯碳相连的甲氧基氢信号δ3.57(3H,s)。3个酚羟基信号δ12.57(1H,s)、10.81(1H,s)、9.24(1H,s)，其中δ12.57(1H,s)为与4位羰基缔合的5位酚羟基氢信号。13CNMR(125MHz,DMSO-d6) 显示含有26个碳原子，除了1组3-羟基-2,2-二甲基-二氢吡喃基δ29.5、67.8、76.8、19.8、25.3，一组异戊烯基δ21.0、122.0、130.9、17.4、25.5，一个甲氧基δ60.2之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ178.2，两个连氧烯碳信号δ158.2、138.7，以上碳谱数据进一步表明化合物Ⅳ为异戊烯基化黄酮醇衍生物。由亚甲基质子信号δ3.23(2H,d,J＝6.9Hz,H-1″)与δ161.5(C-7)、105.9(C-8)、154.1(C-9)的HMBC远程相关，表明异戊烯基连接在8位。由亚甲基质子信号δ2.75(1H,dd,J＝17.0,5.4Hz,H-1″′)、2.55(1H,dd,J＝17.0,8.2Hz,H-1″′)与δ 120.5(C-1′)、120.6(C-2′)、141.0(C-3′)的远程相关，表明3-羟基-2,2-二甲基-二氢吡喃环与黄酮母核的C-2′和C-3′位骈和。甲氧基氢信号δ3.57(3H,s)与138.7(C-3)的远程相关，表明甲氧基与C-3相连。将化合物Ⅳ的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见 Table 4)。因此化合物Ⅳ的结构为 8-(3-methyl-2-butenyl)-2′,3′-(2,2-dimethyldihydropyrano)-5,7,4′-trihydroxy-3-methoxyflavone，命名为桃儿七酮Y(sinoflavonoid Y)。
Table 4.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments for Ⅳ.
化合物V，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 465.1544[M–H]–(calcd for C26H25O8,465.1549)，确定分子式为C26H26O8。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3403cm-1)，缔合羰基(1654cm-1)，苯环(1578cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(263，332nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.30(1H,s)，6.90(1H,d,J＝8.4Hz)、7.55(1H,d,J＝8.4Hz)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个五取代和1,2,3,4-四取代苯环结构单元。由末端双键δ5.77(1H,s),5.28(1H,s)，1个甲基氢信号δ2.10(3H,s)，表明异丙烯基的存在。1个烯氢质子δ7.01(1H,s)，2个烯碳δ104.2,156.5，表明四氢呋喃环的存在。由 2个亚甲基质子信号δ2.67(2H,m)、1.47(2H,m)，两个季碳上的甲基质子信号δ0.98(6H,s)，提示结构中存在1个3-羟基-3-甲基丁基。1个与烯碳相连的甲氧基氢信号δ3.65(3H,s)。δ12.67 (1H,s)为与4位羰基缔合的5位酚羟基氢信号。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有26个碳原子，除了1组3-羟基-3-甲基丁基δ17.5、47.8、68.7、28.8(×2)，一组异丙烯基δ132.5、 114.1、18.9，1个二取代呋喃环δ104.2、156.5，一个甲氧基δ60.1之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ178.9，两个连氧烯碳信号δ156.7、137.7，以上碳谱数据进一步表明化合物V为异戊烯基化黄酮醇衍生物。由亚甲基质子信号δ2.67(2H,m,H-1″)与δ161.7(C-7)、 107.2(C-8)、154.1(C-9)的HMBC远程相关，表明3-羟基-3-甲基丁基连接在8位。由烯氢质子信号信号δ7.01(1H,s,H-1″′)与δ113.5(C-1′)、129.4(C-2′)、142.7(C-3′)的远程相关，表明呋喃环与黄酮母核的C-2′和C-3′位骈和。由末端双键δ5.77(1H,s),5.28(1H,s)与156.5(C-2″′) 的HMBC远程相关，表明异丙烯连接在C-2″′位。甲氧基氢信号δ3.65(3H,s)与137.7(C-3) 的HMBC远程相关，表明甲氧基与C-3相连。将化合物V的1H NMR、13CNMR信号通过 HSQC、HMBC谱进行归属(见Table 5)。因此化合物V的结构为 3′-(2-isopropenylfurano)-5,7,4′-trihydroxy-3-methoxyflavone，命名为桃儿七酮Z(sinoflavonoid Z)。
Table 5.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments for V.
化合物Ⅵ，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 369.1336[M+H]+(calcd for C21H21O6,369.1338)，确定分子式为C21H20O6。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3421cm-1)，缔合羰基(1647cm-1)，苯环(1603cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(268，355nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.18(1H,s)、6.43(1H,s)，7.80(1H,d,J＝2.0Hz)、6.87(1H,d,J ＝8.5Hz)、7.78(1H,d,J＝8.5,2.0Hz)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个1,3,4,5-四取代和1,3,4-三取代苯环结构单元。由2个亚甲基质子信号δ2.83(2H,d,J ＝6.5Hz)、1.82(2H,d,J＝6.5Hz)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.32(6H,s)，提示结构中存在2,2-二甲基-二氢吡喃环。1个与烯碳相连的甲氧基氢信号δ3.78(3H,s)。δ12.65(1H,s)为与 4位羰基缔合的5位酚羟基质子信号。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有21个碳原子，除了1组2,2-二甲基二氢吡喃环δ22.2、32.5、75.8、27.0(×2)，一个甲氧基δ60.1之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ178.3，两个连氧烯碳信号δ156.6、138.2，以上碳谱数据进一步表明化合物Ⅵ为异戊烯基化黄酮醇衍生物。由亚甲基质子信号δ2.83(2H,d,J＝6.5 Hz,H-1″)与δ130.2(C-2′)、121.5(C-3′)、156.8(C-4′)的远程相关，表明2,2-二甲基二氢吡喃环与黄酮母核的C-3′和C-4′位骈和。甲氧基氢信号δ3.78(3H,s)与138.2(C-3)的HMBC远程相关，表明甲氧基与C-3相连。将化合物Ⅵ的1H NMR、13CNMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见Table 6)。因此化合物Ⅵ的结构为 3′,4′-(2,2-dimethyldihydropyrano)-5,7-dihydroxy-3-methoxyflavone，命名为桃儿七酮NA(sinoflavonoid NA)。
Table 6.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments for Ⅵ.
二、肝保护作用有关实验资料如下：
1.实验材料
人肝癌细胞株(HepG2)由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2.细胞培养及实验分组
HepG2细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。取对数生长期的HepG2细胞随机分成：空白对照组、模型组、正常对照组、给药组。
3.MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含4000个)，置37℃、5％CO2温箱中培养24小时。每组均设6个平行孔。空白组只加培养基，无细胞；给药组加入50μM的测试化合物的稀释液；模型组加入异烟肼/利福平(0.1+0.2)mg/mL的溶液。置37℃、5％CO2温箱中继续培养24小时，弃培养液，每孔加50μL(1mg/mL)MTT溶液(培养基配置)。37℃孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490nm条件下测定光密度值(OD)，计算细胞存活率。重复测试3次，取平均值为最终结果。
4.实验结果
与正常对照组比较，模型组的细胞存活率明显降低，具有显著性差异(P<0.01)；与模型组相比，经桃儿七酮V(sinoflavonoid V，I)、桃儿七酮W(sinoflavonoid W，Ⅱ)、桃儿七酮X (sinoflavonoid X，Ⅲ)、桃儿七酮Y(sinoflavonoid Y，Ⅳ)、桃儿七酮Z(sinoflavonoid Z，V)、桃儿七酮NA(sinoflavonoid NA，Ⅵ)的保护后细胞存活率由55.8％分别增加到57.9％、60.5％、 62.9％、59.3％、58.2％、57.0％，各组均差异显著(P<0.01)，具体见Table 7。
Table 7.MTT法测定各组细胞存活率情况
| 组别 | n | 细胞存活率 |
| 模型组 | 6 | 55.8％ |
| 桃儿七酮V(I) | 6 | 57.9％ |
| 桃儿七酮W(Ⅱ) | 6 | 60.5％ |
| 桃儿七酮X(Ⅲ) | 6 | 62.9％ |
| 桃儿七酮Y(Ⅳ) | 6 | 59.3％ |
| 桃儿七酮Z(V) | 6 | 58.2％ |
| 桃儿七酮NA(Ⅵ) | 6 | 57.0％ |
通过多次反复实验，异戊烯基化黄酮类化合物由于黄酮母核及其所连异戊烯基化基团的位置、数目、种类的不同，其对利福平/异烟肼所致肝细胞损伤的保护作用存在很大的差异，由上述实验表明，本发明制备出的新型异戊烯基化黄酮类化合物桃儿七酮V(sinoflavonoid V)、桃儿七酮W(sinoflavonoid W)、桃儿七酮X(sinoflavonoid X)、桃儿七酮Y(sinoflavonoid Y)、桃儿七酮Z(sinoflavonoid Z)、桃儿七酮NA(sinoflavonoidNA)，对利福平/异烟肼所致肝细胞损伤具有保护作用，具有制备临床上肝保护药物的应用，实现在制备肝保护药物中的应用，是肝保护药物上的一大创新，经济和社会效益显著。
Claims (8)
1.一种异戊烯基化黄酮类化合物，其特征在于，该异戊烯基化黄酮类化合物是从小叶莲中提取的桃儿七酮V(sinoflavonoid V，Ⅰ)、桃儿七酮W(sinoflavonoid W，Ⅱ)、桃儿七酮X(sinoflavonoid X，Ⅲ)、桃儿七酮Y(sinoflavonoid Y，Ⅳ)、桃儿七酮Z(sinoflavonoidZ，Ⅴ)、桃儿七酮NA(sinoflavonoid NA，Ⅵ)，分子结构式分别为：
2.权利要求1所述的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，以小叶莲药材6-9kg为原料，用2–5倍原料重量、体积浓度为75％–95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90–95℃，每次提取时间为1.5–2小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2–3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2–3.2L，时间为1.5–2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用9.1–13L洗脱液，流速为10–15mL/min，每350–500mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度400–600mL，每40–60mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度40–70mL，每4–7mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为50–70mL/h，每8–12mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每10–15mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度150–200mL，每15–20mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为30–50mL/h，每3–5mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
3.根据权利要求2所述的所述的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，以小叶莲药材7.5kg为原料，用4倍原料重量、体积浓度为85％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间为1.8小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.6L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2.6L，时间为1.8小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用11L洗脱液，流速为13mL/min，每430mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度500mL，每50mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度55mL，每4–7mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为60mL/h，每10mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每13mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度180mL，每18mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为40mL/h，每4mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
4.根据权利要求2所述的所述的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，以小叶莲药材9kg为原料，用2倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为1.5小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次3.2L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流速为15mL/min，每500mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度400mL，每40mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度45mL，每5mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为70mL/h，每12mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每11mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度200mL，每20mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为50mL/h，每5mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
5.根据权利要求2所述的所述的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，以小叶莲药材6kg为原料，用5倍原料重量、体积浓度为75％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用9.5L洗脱液，流速为10mL/min，每350mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度400mL，每40mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度40mL，每4mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为50mL/h，每8mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每14mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度150mL，每15mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为30mL/h，每3mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
6.根据权利要求2所述的所述的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，以小叶莲药材8kg为原料，用3倍原料重量、体积浓度为80％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为93℃，每次提取时间为1.6小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2.8L，时间为1.6小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用11.8L洗脱液，流速为13mL/min，每450mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度550mL，每55mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度60mL，每6mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为65mL/h，每9mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每12mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度180mL，每18mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为45mL/h，每4mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
7.根据权利要求2所述的所述的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，以小叶莲药材7kg为原料，用3倍原料重量、体积浓度为85％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，合并三次提取液，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.4L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2.4L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10.5L洗脱液，流速为12mL/min，每400mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组分Fr.7经开放ODS柱色谱，依次以体积比60:40、70:30、80:20、90:10的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，每一梯度500mL，每50mL为一流份，共收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比2:3的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–7、流份8–14、流份16–25、流份26–32、流份33–36、流份37–40，得到6个亚组份Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4、Fr.7-5、Fr.7-6；亚组份Fr.7-4经硅胶柱色谱，体积比100:10、100:30、100:50石油醚–丙酮混合溶剂洗脱，每一梯度60mL，每6mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅵ的流份得到化合物Ⅵ；
将组分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为65mL/h，每11mL为一流份、收集43个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份4–7、流份8–13、流份9–26、流份27–33、流份34–43，得到5个亚组份Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3、Fr.8-4、Fr.8-5；亚组份Fr.8-4经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为72:28的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅳ；
将组分Fr.9经硅胶柱色谱，以体积比100:30的石油醚-丙酮溶液洗脱，每14mL为一流份，收集含有化合物Ⅴ的流份即得到化合物Ⅴ；
将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液梯度洗脱，每一梯度160mL，每16mL为一流份，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰得到化合物Ⅰ；
将组分Fr.14经Sephadex LH-20柱色谱，经甲醇洗脱，流速为45mL/h，每4.5mL为一流份、收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比2:3的石油醚-乙酸乙酯作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–11、流份12–17、流份18–25，得到3个亚组份Fr.14-1、Fr.14-2、Fr.14-3；亚组份Fr.14-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为75:25的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为16min的色谱峰得到化合物Ⅲ，收集保留时间为25min的色谱峰得到化合物Ⅱ。
8.权利要求1所述的异戊烯基化黄酮类化合物桃儿七酮V(sinoflavonoid V，Ⅰ)、桃儿七酮W(sinoflavonoid W，Ⅱ)、桃儿七酮X(sinoflavonoid X，Ⅲ)、桃儿七酮Y(sinoflavonoid Y，Ⅳ)、桃儿七酮Z(sinoflavonoid Z，Ⅴ)、桃儿七酮NA(sinoflavonoidNA，Ⅵ)在制备肝保护药物中的应用。
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