CN110041388A - 一种黄酮类化合物或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物及其提取方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有式Ⅰ结构的黄酮类化合物及其从油茶饼中的提取方法和在制备抑制黑色素生成药物及产品中的用途。本发明提供的黄酮化合物结构、药效稳定，含量与纯度高。

Description

一种黄酮类化合物或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物及 其提取方法和用途
技术领域
本发明涉及天然植物提取技术领域，特别涉及一种黄酮类化合物或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物及其从油茶饼中的提取方法和在制备抑制黑色素生成药物及产品中的用途。
背景技术
油茶(Camellia oleifera Abel.)是山茶科(Theaceae)油茶属(Camellia Linn)常绿小乔木,主要分布在中国、日本、东南亚地区，遍布我国18个省区，其中湖南、江西、广西、浙江等省为主要产区。因其种子可榨油(茶油)，故得名油茶。茶油为世界四大木本植物油之一，茶油中不饱和脂肪酸的含量远高于豆油、菜油和花生油，其含量可达90％以上，维生素E含量也比橄榄油高出一倍，长期食用可降低血清胆固醇，有预防和治疗心血管疾病的作用。由于茶油的多种保健功能，油茶的种植面积逐年上升，但油茶种子榨油后所得的残渣(油茶饼)作为主要的农业副产物，如得不到妥善的处理，将造成环境的污染和资源的浪费。为实现农业副产物的再利用，实现环境友好，众多研究者对油茶饼的化学成分及药理活性进行了研究，发现其中主要含有皂苷、黄酮、生物碱、黄酮及鞣质等化学成分，药理学研究表明其具有抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化、抗突变及神经保护等药理活性。
另外，多种研究表明黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，这些化合物用于防治心脑血管疾病，能降低血管的脆性，改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，防治老年高血压、脑溢血、冠心病、心绞痛,扩张冠状血管，增加冠脉流量。许多成分具有止咳、祛痰、平喘及抗菌的活性，同时具有护肝、解肝毒、抗真菌、治疗急、慢性肝炎、肝硬化及抗自由基和抗氧化作用。除此之外，黄酮类化合物还具有与植物雌激素相同的作用。在畜牧业动物生产上，黄酮类化合物的应用能显著提高动物生产性能，提高动物机体抗病力，改善动物机体免疫机能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种黄酮类化合物或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物及其从油茶饼中的提取方法和在制备抑制黑色素生成药物及产品中的用途，该提取方法具有原料成本低、提取率高、所得黄酮类化合物纯度高的优点。
本发明的第一目的在于提供一种一种黄酮类化合物或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物。
本发明的第二目的在于提供一种油茶饼中提取黄酮类化合物的方法，所述方法快速有效、纯度很高。
本发明的第三目的在于提供黄酮类化合物或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物在制备抑制黑色素生成药物及产品中的用途。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种具有式Ⅰ结构的黄酮类化合物，具体结构式为：
其中，R1独立选自-OH、H，R2独立的选自或者H。
本发明还提供了一种油茶饼中提取权利要求1所述黄酮类化合物的方法，包括以下步骤：
(1)取脱脂后的油茶饼，粉碎后70％EtOH回流提取，合并提取液，减压浓缩，得到油茶饼浸膏；
(2)浸膏加水混悬，置于分液漏斗中，先用乙酸乙酯萃取，再用正丁醇萃取，回收溶剂后，分别得到乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇萃取物；
(3)取乙酸乙酯部位浸膏，通过硅胶柱色谱法，采用EtOAc-CH3OH系统梯度洗脱，得到5个流分E1、E2、E3、E4、E5；E2经反复硅胶柱色谱分离得到黄酮化合物3；
E4经反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、HPLC等方法分离得到黄酮类化合物2；
(4)取正丁醇部位浸膏，通过大孔吸附树脂柱色谱，采用H2O-EtOH系统梯度洗脱，得到5个流分B1、B2、B3、B4、B5。B3经反相硅胶柱色谱、HPLC分离得到黄酮类化合物1，
进一步地，所述步骤(1)中油茶饼与70％EtOH质量体积比为1:10g/ml，70％EtOH回流提取次数为3次，每次提取时间为3小时。
进一步地，所述步骤(2)中乙酸乙酯、正丁醇的体积均与水混悬液相同。
进一步地，所述步骤(3)中EtOAc-CH3OH系统梯度洗脱浓度比分别为30:1、20:1、10:1、5:1、1:1。
进一步地，所述步骤(4)中H2O-EtOH系统梯度洗脱浓度比分别为100:0、9:1、7:3、4:6、1:9。
本发明还提供了上述黄酮类化合物的盐、酯或溶剂化物。
本发明还提供了上述黄酮类化合物在制备治疗或抑制黑色素生成类疾病的药物的用途。
本发明还提供了上述黄酮类化合物的盐、酯或溶剂化物在制备抑制黑色素生成药物及产品中的用途。
同现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明以油茶种子榨油后所得到的残渣为原料，依次采用正己烷脱脂、70％乙醇提取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取几个步骤，再依次通过硅胶柱色谱、大孔吸附柱色谱、反相柱色谱、凝胶柱色谱及高效液相色谱分离，简便、快速的提取分离出化合物，具有使用溶剂毒性小，提取效果好的优点。同时所得黄酮类化合物具有抑制黑色素生成活性，可用于指导油茶饼的应用，实现了农业副产品的再利用和环境的保护。
附图说明
附图1：本发明实施例中黄酮类化合物1的1H-NMR谱图(300MHz,DMSO-d6)；
附图2：本发明实施例中黄酮类化合物1的13C-NMR谱图(150MHz,DMSO-d6)；
附图3：本发明实施例中黄酮类化合物2的1H-NMR谱图(300MHz,DMSO-d6)；
附图4：本发明实施例中黄酮类化合物2的13C-NMR谱图(75MHz,DMSO-d6)；
附图5：本发明实施例中黄酮类化合物3的1H-NMR谱图(300MHz,DMSO-d6)；
附图6：本发明实施例中黄酮类化合物3的13C-NMR谱图(75MHz,DMSO-d6)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，但不以任何方式限制本发明。
实施例1黄酮类化合物的分离纯化
(1)取脱脂后的油茶饼25.0Kg，粉碎后70％EtOH回流提取3次，其中，油茶饼与70％EtOH质量体积比为1:10g/m，每次提取3小时，合并提取液，减压浓缩，得到6.6Kg油茶饼浸膏。
(2)浸膏加水混悬，置于分液漏斗中，用与水混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，再用与水混悬液等体积的正丁醇萃取3次，回收溶剂后，分别得到乙酸乙酯萃取物乙酸乙酯部位浸膏35.0g、正丁醇萃取物858.0g。
(3)乙酸乙酯部位浸膏(35.0g)通过硅胶柱色谱法，采用EtOAc-CH3OH系统(30:1,20:1,10:1,5:1,1:1)梯度洗脱，得到5个流分[E1(3.1g)、E2(13.1g)、E3(6.8g)、E4(5.5g)、E5(5.0g)]。E2(13.1g)经反复硅胶柱色谱分离得到黄酮类化合物3(3.5mg)。E4(5.5g)经反复硅胶柱色谱，Sephadex LH-20凝胶柱色谱，HPLC等方法分离得到黄酮类化合物2(6.4mg)。
(4)正丁醇部位浸膏(858.0g)，通过大孔吸附树脂柱色谱，采用H2O-EtOH系统(100:0,9:1,7:3,4:6,1:9)梯度洗脱，得到5个流分[B1(97.0g)、B2(45.2g)、B3(122.0g)、B4(455.0g)、B5(29.0g)]。B3(122.0g)经反相硅胶柱色谱，HPLC分离得到黄酮类化合物1(15.0mg)。
试验例1：
(1)黄酮类化合物1的结构鉴定
对本发明实施例1所分离纯化的黄酮类化合物1的结构进行了鉴定：
实施例1分离获得到的黄酮化合物1，英文名称为：kaempferol-3-O-[2-O-β-D-xylopyranosyl-6-O-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D-glucopyranoside。
化学式为：C32H38O19。
黄酮类化合物1的相关分析如下：
黄酮类化合物1为淡黄色粉末。盐酸-镁粉反应呈阳性，三氯化铁反应呈阳性，香草醛浓硫酸显色剂加热呈黄色，提示该化合物可能为化合物。ESI-MS m/z 725.3[M-H]-，推测其分子量为726。
根据1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)谱数据显示，δH6.46(1H,s,H-8),6.26(1H,s,H-6)为A环上氢信号，根据耦合常数提示该化合物A环C-5，C-7位被取代。δH 8.13(2H,d,J＝8.7Hz,H-2',H-6'),7.05(2H,d,J＝8.7Hz,H-3',H-5')为B环上氢信号，根据耦合常数提示B环4'位氢信号被取代，推测该化合物苷元是山柰酚。δH5.69(1H,d,J＝5.1Hz,H-1””),4.75(1H,d,J＝7.5Hz,H-1”)为β型糖苷的端基氢信号，δH 4.48(1H,s,H-1”')为α型糖苷的端基氢信号，推测该化合物连有三个糖。δH1.11(3H,d,J＝6.0Hz,H-6”')为鼠李糖甲基氢信号。13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)谱中，δC155.5(C-2),132.5(C-3),177.0(C-4),161.0(C-5),98.2(C-6),165.2(C-7),94.0(C-8),156.5(C-9),104.3(C-10),121.1(C-1'),130.8(C-2'),115.2(C-3'),159.9(C-4'),115.2(C-5'),130.8(C-6')为黄酮苷元上碳信号。δC 103.2(C-1”),73.7(C-2”),76.0(C-3”),69.4(C-4”),65.6(C-5”),100.5(C-1”'),70.6(C-2”'),70.3(C-3”'),71.8(C-4”'),68.2(C-5”'),17.6(C-6”'),101.5(C-1””),81.6(C-2””),76.7(C-3””),69.5(C-4””),75.7(C-5””),66.1(C-6””)为三个糖上碳信号。以上数据与文献报道(参考文献：[1]Li B,Luo Y M.Studies on chemical constituents of Camellia oleifera Abel[J].Chem.J.Internet,2004,5(3):1–4.)的数据基本一致，故鉴定该化合物为kaempferol-3-O-[2-O-β-D-xylopyranosyl-6-O-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D-glucopyranoside，并判定该化合物的化学结构式确定为黄酮类化合物1：
(2)黄酮类化合物2的结构鉴定
对本发明实施例1所分离纯化的化合物2的结构进行了鉴定：
实施例1分离获得的是黄酮化合物2，英文名称为：kaempferol-3-O-robinobioside。
化学式为：C27H30O15。
黄酮类化合物2的相关分析如下：
黄酮类化合物2为淡黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，三氯化铁反应呈阳性，香草醛浓硫酸加热呈黄色，提示该化合物可能为化合物。ESI-MSm/z 617[M+Na]+，推测其分子量为594。
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)谱中，δH6.54(1H,s,H-8),6.34(1H,s,H-6)为A环上氢信号，根据耦合常数提示该化合物A环C-5，C-7位被取代。δH8.15(2H,d,J＝9.0Hz,H-2',H-6'),7.04(2H,d,J＝9.0Hz,H-3',H-5')为B环上氢信号，根据耦合常数提示B环4'位氢信号被取代，推测该化合物苷元是山柰酚。5.47(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”)为β型糖苷的端基氢信号，4.54(1H,s,H-1”')为α型糖苷的端基氢信号，1.15(3H,d,J＝6Hz,H-6”')为鼠李糖甲基氢信号。在13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)谱图中，δC156.6(C-2),133.2(C-3),177.2(C-4),161.1(C-5),99.0(C-6),164.9(C-7),93.8(C-8),156.6(C-9),103.6(C-10),120.9(C-1'),133.2(C-2'),115.1(C-3'),159.8(C-4'),115.1(C-5'),130.9(C-6')为黄酮苷元上碳信号。δC101.5(C-1”),74.2(C-2”),75.7(C-3”),69.9(C-4”),76.4(C-5”),68.2(C-6”),100.7(C-1”'),71.8(C-2”'),71.8(C-3”'),74.2(C-4”'),70.3(C-5”'),17.7(C-6”')为糖上碳信号。以上数据与文献报道(参考文献：[2]Brasseur T,Angenot L.Six flavonol glycosidesfrom leaves of Strychnosvariabilis[J].Phytochemistry,1988,27(5):1487–1490)的数据基本一致，故鉴定该化合物为kaempferol-3-O-robinobioside，并判定该化合物的化学结构式确定为黄酮类化合物2：
(3)黄酮类化合物3的结构鉴定
该试验例3对本发明实施例1所分离纯化的化合物3的结构进行了鉴定：
实施例1分离获得的是黄酮化合物3，中文名称为：槲皮素。
黄酮类化合物3的相关分析如下：
黄酮类化合物3为淡黄色粉末，盐酸-镁粉反应显阳性，三氯化铁反应呈阳性，香草醛浓硫酸加热呈黄色，提示该化合物可能为黄酮类化合物。
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)谱中，δH6.09(1H,d,J＝1.8Hz),6.31(1H,d,J＝1.8Hz)为A环上氢信号，根据耦合常数提示该化合物A环C-5，C-7位被取代。δH7.59(1H,d,J＝2.1Hz,H-2'),7.45(1H,dd,J＝2.1,8.4Hz,H-6'),6.78(1H,d,J＝8.4Hz,H-5')为B环上氢信号，根据耦合常数提示B环3'、4'位氢信号被取代。δH12.40(1H,s),9.28(1H,s),9.23(1H,s)为三个活泼氢质子信号，分别归属为C-5位，C-3'位，C-4'位羟基，推测该化合物是槲皮素。13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)谱中，δC146.7(C-2),135.8(C-3),175.8(C-4),156.2(C-5),98.3(C-6),164.1(C-7),93.4(C-8),160.8(C-9),103.1(C-10),122.0(C-1'),115.1(C-2'),145.1(C-3'),147.7(C-4'),115.7(C-5'),120.1(C-6')为槲皮素碳信号。以上数据与文献报道(参考文献：[3]李敏,高慧媛,孙博航等.茶叶正丁醇萃取物化学成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报,2008,25(10):785–789)的数据基本一致，故鉴定该化合物为槲皮素，并判定该化合物的化学结构式确定为黄酮类化合物3：
试验例2黄酮类化合物1–3的抑制黑色素生成活性测定
本试验例对黄酮类化合物1–3的抑制黑色素生成活性进行了探索，具体方法及结果如下：
1.材料的准备
鼠黑色素瘤细胞B16F10由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所提供。
熊果苷溶液的配制方法：先将熊果苷6.8mg溶于1000μLDMSO配制得到浓度为25.0mM的熊果苷溶液，再取100.0μL浓度为25.0mM的熊果苷溶液，加入2400.0μLDMEM得到浓度为1000.0μM的熊果苷溶液。取100.0μL浓度为1000.0μM的熊果苷溶液，加入900.0μLDMEM得到浓度为100.0μM的熊果苷溶液。再取40.0μL浓度为1000.0μM的熊果苷溶液,加入1560.0μL DMEM得到浓度为25.0μM的熊果苷溶液。
单体化合物样品的配制：先将分离得到的3个单体化合物溶于DMSO配制得到浓度为100.0mM的各化合物溶液；再取10.0μL浓度为100.0mM的各化合物溶液，加入990.0μLDMEM得到浓度为1000.0μM的各化合物溶液；再取100.0μL浓度为1000.0μM的各化合物溶液,加入900.0μL DMEM得到浓度为100.0μM的各化合物溶液；再取40.0μL浓度为1000.0μM的各化合物溶液，加入1560.0μL DMEM得到浓度为25.0μM的各化合物溶液。
培养：B16F10细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2保持饱和湿度条件下培养，2–3天传代一次。传代时用0.5％胰酶消化2–3min，弃去消化液，加入新的培养液吹打均匀，按所需细胞量移入新培养瓶中，添加完全培养液至适量。
2.方法
2.1MTT法细胞毒活性测试
取对数生长期的B16F10细胞，胰酶消化收集细胞后，以5×103个/孔的密度接种到96孔板中，每孔加入100μL含10％胎牛血清的DMEM培养基，孵育24h待细胞贴壁80％后，用移液枪吸弃上清液，用PBS清洗2次，样品溶液和熊果苷溶液以25μM、100μM浓度加入到各孔中，每孔加入100μL样品溶液，每组设置三个平行孔，平行实验三次。另设3孔加入100μLDMEM培养基作为对照组。继续孵育48h，取出96孔板，避光条件下加入10μL5mg/mL的MTT溶液，继续避光孵育3h，使用酶标仪在570nm波长下测定各孔的吸光度值，记录结果，按照下述公式计算细胞的存活率：
细胞存活率(％)＝(试验组吸光值/对照组吸光度值)×100％
2.2抑制黑色素生成活性测试
取对数生长期的B16F10细胞，胰酶消化收集细胞后，24孔细胞培养板中每孔加入500μL细胞悬液(每孔5×103个细胞)。24孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h待细胞贴壁80％后，用移液枪吸弃上清液，弃去培养基，PBS清洗2次。每孔加入500μL相应的含药培养基作为测试组，每组设置三个平行孔，平行实验三次；每孔加入500μLDMEM培养基作为阳性对照组，每组设置三个平行孔，平行实验三次。含药培养基，阳性对照组加入1μL100nM的α-MSH。置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后。每孔用PBS清洗2次，除去上清液，加入胰酶，消化细胞。收集细胞后加入2MNaOH溶解，80℃加热1h。λ＝405nm下测定吸光度值，按照下面公式计算各组别黑色素含量，实验结果如表1。
黑色素含量＝(测试组吸光度值/对照组吸光度值)×100％
表1化合物1-3对黑色素的抑制作用及其对鼠黑色素瘤细胞B16F10的毒性
结果显示，从油茶饼中分离得到的3个黄酮类化合物均对黑色素的生成具有较好的抑制活性，且对鼠黑色素瘤细胞B16F10的毒性较弱，表明本发明涉及的两个化合物能够抑制黑色素的生成，有可能发展成为抑制黑色素生成药物和产品，实现农业副产品的再利用和环境友好型社会。
以上所述，仅为本发明较佳具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限与此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种具有式Ⅰ结构的黄酮类化合物，其特征在于，所述黄酮类化合物的结构式为：
其中，R1独立选自-OH、H，R2独立的选自或者H。
2.一种油茶饼中提取权利要求1所述黄酮类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取脱脂后的油茶饼，粉碎后70％EtOH回流提取，合并提取液，减压浓缩，得到油茶饼浸膏；
(2)浸膏加水混悬，置于分液漏斗中，先用乙酸乙酯萃取，再用正丁醇萃取，回收溶剂后，分别得到乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇萃取物；
(3)取乙酸乙酯部位浸膏，通过硅胶柱色谱法，采用EtOAc-CH3OH系统梯度洗脱，得到5个流分E1、E2、E3、E4、E5；E2经反复硅胶柱色谱分离得到黄酮化合物3；
E4经反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、HPLC等方法分离得到黄酮类化合物2；
(4)取正丁醇部位浸膏，通过大孔吸附树脂柱色谱，采用H2O-EtOH系统梯度洗脱，得到5个流分B1、B2、B3、B4、B5。B3经反相硅胶柱色谱、HPLC分离得到黄酮类化合物1，
3.根据权利要求2所述的油茶饼中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中油茶饼与70％EtOH质量体积比为1:10g/ml，70％EtOH回流提取次数为3次，每次提取时间为3小时。
4.根据权利要求2所述的油茶饼中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中乙酸乙酯、正丁醇的体积均与水混悬液相同。
5.根据权利要求2所述的油茶饼中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中EtOAc-CH3OH系统梯度洗脱浓度比分别为30:1、20:1、10:1、5:1、1:1。
6.根据权利要求2所述的油茶饼中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(4)中H2O-EtOH系统梯度洗脱浓度比分别为100:0、9:1、7:3、4:6、1:9。
7.权利要求1所述的黄酮类化合物的盐、酯或溶剂化物。
8.权利要求1所述的黄酮类化合物在制备治疗或抑制黑色素生成类疾病的药物的用途。
9.权利要求7所述的黄酮类化合物的盐、酯或溶剂化物在制备抑制黑色素生成药物及产品中的用途。
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