CN110396076B - 一种异戊烯基化黄酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及异戊烯基化黄酮类化合物及其制备方法和应用，可有效解决异戊烯基化黄酮类化合物的制备和制备抗乳腺癌活性药物的问题，所述的异戊烯基化黄酮类化合物是从小叶莲中提取的桃儿七酮P(sinoflavonoid P)、桃儿七酮NB(sinoflavonoid NB)、桃儿七酮NC(sinoflavonoid NC)、桃儿七酮ND(sinoflavonoid ND)、桃儿七酮NE(sinoflavonoid NE)，可用于制备抗乳腺癌药物，原料丰富，制备方法易操作，具有实际的临床意义，经济和社会效益显著。

Description

一种异戊烯基化黄酮类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是具有抗乳腺癌活性的一种异戊烯基化黄酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病。现今，癌症已成为全世界首要的致死病因。乳腺癌通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，已经成为严重威胁中青年妇女健康和生命的主要疾病之一，发病率较高，多见于40-60岁之间绝经期前后的妇女，全国每年新发乳腺癌的人数约100万以上。目前治疗乳腺癌的药物虽很多，均具有较强的毒副作用，其中以减退消化功能和抑制骨髓造血功能最为明显，往往使乳腺癌患者难以坚持完整个化疗过程，难以彻底治愈。同时长期用药以后，出现多药耐药现象，这也是制约乳腺癌成功治疗的主要障碍。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，从中草药中寻找高效低毒的抗乳腺癌活性物质，研制选择性强、毒副作用低的新型抗乳腺癌药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。
小叶莲是小檗科桃儿七属植物鬼臼Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying.的干燥成熟果实。鬼臼是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见。不入汤。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、月经不调、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气管炎等症。鬼臼分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。小叶莲作为传统藏药始载于《月王药诊》，具有悠久的药用历史。化学成分研究表明主要含有木脂素类化合物和黄酮类化合物，其中异戊烯基化黄酮类化合物是小叶莲中代表性的活性成分，具有重要而广泛的生物活性如抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗骨质疏松、预防老年痴呆、抗糖尿病、心脑血管保护、雌激素样等。但涉及具有抗乳腺癌活性的异戊烯基化黄酮类化合物及其生物活性，迄今为止未见有专利或文献报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种异戊烯基化黄酮类化合物及其制备方法和应用，可有效解决异戊烯基化黄酮类化合物的制备和制备抗乳腺癌活性药物的问题。
本发明解决的技术方案是，一种异戊烯基化黄酮类化合物，是从小叶莲中提取的桃儿七酮P(sinoflavonoid P)、桃儿七酮NB(sinoflavonoid NB)、桃儿七酮NC(sinoflavonoid NC)、桃儿七酮ND(sinoflavonoid ND)、桃儿七酮NE(sinoflavonoid NE)，分子结构式分别为：
Figure BDA0002190255610000021
其制备方法是：以小叶莲药材6–9kg为原料，以2–5倍原料重量、体积浓度为75％–95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90–95℃，每次提取时间为1.5–2小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2–3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，每次2–3.2L，时间为1.5–2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、 0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用9.1–13L洗脱液，流速为 10–15mL/min，每350–500ml体积为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1–Fr.16；将组份Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为20–35mL/h，每4–8mL为一流份、收集32个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3 的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5 min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–15、流份16–27、流份28–32、得到3个亚组份Fr.10-1，Fr.10-2，Fr.10-3；将亚组份Fr.10-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为69:31 的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为62min的色谱峰得到化合物V、收集保留时间为66min色谱峰得到化合物Ⅲ；将组分Fr.11 经硅胶柱色谱，经体积比100:7、100:10、100:15、100:20石油醚-丙酮混合溶剂系统洗脱，每一梯度用50–80mL洗脱液，每5–8mL为一流份，收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比5:4的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90 的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–8、流份9–15、流份16–31、流份32–40，得到4个亚组份Fr.11-1、Fr.11-2、Fr.11-3、Fr.11-4；亚组份Fr.11-4经制备高效液相色谱，以体积比为80:20的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为21min的色谱峰得到化合物Ⅳ；将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液洗脱，每一梯度150–200mL，每一流份为15–20mL，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为26min的峰得到化合物I；将组分Fr.13经硅胶柱色谱，体积比10:40石油醚–丙酮混合溶液洗脱，每3–5mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅱ的流份，得到化合物Ⅱ。
本发明制备的具有抗乳腺癌活性的新型异戊烯基化黄酮类化合物桃儿七酮P(sinoflavonoid P)、桃儿七酮NB(sinoflavonoid NB)、桃儿七酮NC(sinoflavonoid NC)、桃儿七酮ND(sinoflavonoid ND)、桃儿七酮NE(sinoflavonoid NE)可用于制备抗乳腺癌药物，原料丰富，制备方法易操作，具有实际的临床意义，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明化合物I的核磁共振氢谱图。
图2为本发明化合物I的核磁共振碳谱图。
图3为本发明化合物I的HMBC谱图。
图4为本发明化合物I的HSQC谱图。
图5为本发明化合物Ⅱ的核磁共振氢谱图。
图6为本发明化合物Ⅱ的核磁共振碳谱图。
图7为本发明化合物Ⅱ的HMBC谱图。
图8为本发明化合物Ⅱ的HSQC谱图。
图9为本发明化合物Ⅲ的核磁共振氢谱图。
图10为本发明化合物Ⅲ的核磁共振碳谱图。
图11为本发明化合物Ⅲ的HMBC谱图。
图12为本发明化合物Ⅲ的HSQC谱图。
图13为本发明化合物Ⅳ核磁共振氢谱图。
图14为本发明化合物Ⅳ核磁共振碳谱图。
图15为本发明化合物Ⅳ的HMBC谱图。
图16为本发明化合物Ⅳ的HSQC谱图。
图17为本发明化合物V的核磁共振氢谱图。
图18为本发明化合物V的核磁共振碳谱图。
图19为本发明化合物V的HMBC谱图。
图20为本发明化合物V的HSQC谱图。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施时可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法是，由小叶莲药材9kg为原料，以18L、体积浓度为95％乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次3.2L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流速为15mL/min，每500ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到Fr.1-Fr.16个组份；将组份 Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为35mL/h，每8mL为一流份、收集 32个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4:1的二氯甲烷 -丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–15、流份16–27、流份28–32、得到3个亚组份Fr.10-1， Fr.10-2，Fr.10-3；将亚组份Fr.10-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为69:31的甲醇- 水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为62min 的色谱峰得到化合物V、收集保留时间为66min色谱峰得到化合物Ⅲ；将组分Fr.11经硅胶柱色谱，经体积比100:7、100:10、100:15、100:20石油醚-丙酮混合溶剂系统洗脱，每一梯度用 80mL洗脱液，每8mL为一流份，收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用 GF254薄层板，分别以体积比5:4的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–8、流份9–15、流份16–31、流份32–40，得到4个亚流份Fr.11-1、Fr.11-2、Fr.11-3、Fr.11-4；亚流份Fr.11-4 经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为80:20的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为 YMC-PackODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为21min的色谱峰得到化合物Ⅳ；将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20甲醇-水溶液洗脱，每一梯度200mL，每一流份为20mL，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3 个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为 YMC-PackODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为26min的色谱峰得到化合物I；将组分Fr.13经硅胶柱色谱，体积比10:40石油醚–丙酮混合溶液洗脱，每5mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅱ的流份，得到化合物Ⅱ。
实施例2
本发明一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法是，由小叶莲药材6kg为原料，以30L、体积浓度为75％乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用9.1L洗脱液，流速为10mL/min，每350ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比 10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份 196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到Fr.1–Fr.16个组份；将组份Fr.10 经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为20mL/h，每4mL为一流份、收集32个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4:1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–15、流份16–27、流份28–32、得到3个亚组份Fr.10-1，Fr.10-2， Fr.10-3；将亚组份Fr.10-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为69:31的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为62min的色谱峰得到化合物V、收集保留时间为66min色谱峰得到化合物Ⅲ；将组分Fr.11经硅胶柱色谱，经体积比100:7、100:10、100:15、100:20石油醚-丙酮混合溶剂系统洗脱，每一梯度用5mL洗脱液，每5mL为一流份，收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比5:4的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–8、流份9–15、流份16–31、流份32–40，得到4个亚组份Fr.11-1、Fr.11-2、Fr.11-3、Fr.11-4；亚组份Fr.11-4经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为80:20的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为21min的色谱峰得到化合物Ⅳ；将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20甲醇-水溶液洗脱，每一梯度150mL，每一流份为15mL，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为 YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为26min的峰得到化合物I；将组分Fr.13经硅胶柱色谱，体积比10:40石油醚–丙酮混合溶液洗脱，每3mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅱ的流份，得到化合物Ⅱ。
实施例3
本发明一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法是，由小叶莲药材8kg为原料，以24L、体积浓度为85％乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2.8L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用11.7L洗脱液，流速为13mL/min，每450ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到Fr.1-Fr.16个组份；将组份Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为28mL/h，每7mL为一流份、收集32个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比 4:1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热 3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–15、流份16–27、流份28–32、得到3个亚组份Fr.10-1，Fr.10-2，Fr.10-3；将亚组份Fr.10-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为 69:31的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为62min的色谱峰得到化合物V、收集保留时间为66min色谱峰得到化合物Ⅲ；将组分Fr.11经硅胶柱色谱，经体积比100:7、100:10、100:15、100:20石油醚-丙酮混合溶剂系统洗脱，每一梯度用75mL洗脱液，每7.5mL为一流份，收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比5:4的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90 的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–8、流份9–15、流份16–31、流份32–40，得到4个亚组份Fr.11-1、Fr.11-2、Fr.11-3、Fr.11-4；亚组份Fr.11-4经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为80:20的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-PackODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为21min的色谱峰得到化合物Ⅳ；将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20甲醇-水溶液洗脱，每一梯度190mL，每一流份为19mL，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为26min的峰得到化合物I；将组分Fr.13经硅胶柱色谱，体积比10:40石油醚–丙酮混合溶液洗脱，每4.5mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅱ的流份，得到化合物Ⅱ。
实施例4
本发明一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法是，由小叶莲药材7kg为原料，以28L、体积浓度为75％乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.4L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2.4L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、 0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用10.4L洗脱液，流速为12 mL/min，每400ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到Fr.1-Fr.16个组份；将组份 Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为24mL/h，每6mL为一流份、收集 32个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4:1的二氯甲烷 -丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3–15、流份16–27、流份28–32、得到3个亚组份Fr.10-1， Fr.10-2，Fr.10-3；将亚组份Fr.10-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为69:31的甲醇- 水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为62min 的色谱峰得到化合物V、收集保留时间为66min色谱峰得到化合物Ⅲ；将组分Fr.11经硅胶柱色谱，经体积比100:7、100:10、100:15、100:20石油醚-丙酮混合溶剂系统洗脱，每一梯度用 70mL洗脱液，每7mL为一流份，收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用 GF254薄层板，分别以体积比5:4的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–8、流份9–15、流份16–31、流份32–40，得到4个亚组份Fr.11-1、Fr.11-2、Fr.11-3、Fr.11-4；亚组份Fr.11-4 经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为80:20的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为 YMC-PackODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为21min的色谱峰得到化合物Ⅳ；将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20甲醇-水溶液洗脱，每一梯度180mL，每一流份为18mL，共收集30个流份，分别合并流份1–9、流份10–18、流份19–30，得到3 个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为 YMC-PackODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为26min的峰得到化合物I；将组分Fr.13经硅胶柱色谱，经体积比10:40石油醚–丙酮混合溶液洗脱，每4mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅱ的流份，得到化合物Ⅱ。
本发明方法稳定可靠，易操作，实施例1-4提取分离得到的新型异戊烯基化黄酮类化合物经过UV、IR、核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)及高分辨率质谱 (HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定，其分别为桃儿七酮P(sinoflavonoid P)、桃儿七酮NB(sinoflavonoid NB)、桃儿七酮NC(sinoflavonoid NC)、桃儿七酮ND(sinoflavonoid ND)、桃儿七酮NE(sinoflavonoid NE)。经试验，对人乳腺癌细胞MCF-7具有细胞毒活性，有关实验资料如下：
一、化合物的结构鉴定
化合物I，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 439.1760[M﹢H]+(calcd for C25H27O7,439.1757)，确定分子式为C25H26O7。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3356cm-1)，缔合羰基(1651cm-1)，苯环(1603 cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(260，364nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6) 显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.27(1H,s)、6.74(1H,d,J＝8.2Hz)、6.70(1H,d,J＝8.2 Hz)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个五取代和1,2,3,4-四取代苯环结构单元。由2组亚甲基质子信号δ3.25(2H,d,J＝6.8Hz)、3.21(2H,d,J＝6.8Hz)，四个与季碳相连的的甲基质子信号δ1.27(3H,s)、1.39(3H,s)、1.45(3H,s)、1.53(3H,s)，两个烯氢质子δ4.94(1H,t,J＝6.8)、5.01(1H,t,J＝6.8)，提示结构中存在2个异戊烯基。五个酚羟基质子δ12.46(1H,s)、10.64(1H,s)、9.73(1H,s)、8.77(1H,s)、8.42(1H,s)其中δ12.46(1H, s)为与4位羰基缔合的5位酚羟基质子信号。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有25个碳原子，除了2组异戊烯基碳信号δ 20.9、121.99、130.6、17.3、25.4、25.7、122.04、129.8、17.2、25.2之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ 176.5，两个与氧相连的烯碳信号δ 150.7、136.2，以上碳谱数据进一步表明化合物I为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ3.21(2H,d,J＝6.8Hz,H-1″)与δ160.8(C-7)、105.4(C-8)、154.2(C-9) 的远程相关，δ3.25(2H,d,J＝6.8Hz,H-1″′)与δ123.0(C-1′)、128.1(C-2′)、143.0(C-3′)的远程相关，表明两个异戊烯基分别连接在黄酮母核的C-8和C-2′位。将化合物I的1HNMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见Table 1)。因此化合物I的结构为 8,2′-di(3-methyl-2-butenyl)-5,7,3′,4′-tetrahydroxyflavone，命名为桃儿七酮P(sinoflavonoid P)。
Figure BDA0002190255610000091
Table 1.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments for I.
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_IMAGE002
化合物Ⅱ，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 371.0989[M﹢H]+(calcd for C20H19O7,371.1131)，确定分子式为C20H18O7。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3419cm-1)，缔合羰基(1651cm-1)，苯环(1596 cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(260，376nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6) 显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.12(1H,s)，7.73(1H,d,J＝2.1Hz)、6.89(1H,d,J＝8.5 Hz)、7.60(1H,dd,J＝8.5,2.1Hz)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个五取代和1,3,4-三取代苯环结构单元。由2组亚甲基质子信号δ1.87(2H,t,J＝6.6Hz)、 2.84(2H,t,J＝6.6Hz)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.32(6H,s)，提示结构中存在1个2,2- 二甲基二氢吡喃环。一个与4位羰基缔合的5位酚羟基信号δ12.24(1H,s,5-OH)。13C NMR (125MHz,DMSO-d6)显示含有20个碳原子，除了1组2,2-二甲基二氢吡喃基δ 15.7,30.9,76.2, 26.3(×2)之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ 175.9，两个连氧烯碳信号δ 147.7、 136.1，以上碳谱数据进一步表明化合物Ⅱ为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ2.84(2H,t,J＝6.6Hz,H-1″)与δ159.1(C-7)、99.7(C-8)、153.0(C-9)的远程相关，表明2,2-二甲基二氢吡喃环与黄酮母核的C-7和C-8位骈和。将化合物Ⅱ的1H NMR、13C NMR 信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见Table 2)。因此化合物Ⅱ的结构为 7,8-(2,2-dimethyldihydropyrano)-5,3,3′,4′-tetrahydroxyflavone，命名为桃儿七酮NB (sinoflavonoid NB)。
Figure BDA0002190255610000111
Table 2.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments forⅡ.
Figure DEST_PATH_IMAGE003
化合物Ⅲ，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 469.1853[M﹢H]+(calcd for C26H29O8,469.1862)，确定分子式为C26H28O8。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3279cm-1)，缔合羰基(1654cm-1)，苯环(1588cm-1)。 UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(264，342nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.17(1H,s)、6.92(1H,d,J＝8.2Hz)、6.75(1H,d,J＝8.2Hz)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个五取代和1,2,3,4-四取代苯环结构单元。由2组亚甲基质子信号δ2.68(2H,t,J＝6.6Hz)、1.73(2H,t,J＝6.6Hz)，2个与季碳相连的甲基质子信号δ1.32(6H,s)，表明结构中存在1个2,2-二甲基二氢吡喃环。由1个亚甲基质子信号δ2.83(1H,dd,J＝16.5,5.1Hz)、1.73(1H,dd,J＝16.5,6.7Hz)，1个与氧相连的活性次甲基质子信号δ3.69(1H,dd,J＝6.7,5.1Hz)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.23(3H, s)、1.27(3H,s)，提示结构中存在1个3-羟基2,2-二甲基二氢吡喃环。1个甲氧基质子信号δ3.58 (3H,s)。两个酚羟基质子信号δ12.44(1H,s)、9.21(1H,s)，其中δ12.44(1H,s)为与4位羰基缔合的5位酚羟基质子信号。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有26个碳原子，除了1 个甲氧基的碳信号δ 60.2，1组2-羟基-2,2-二甲基二氢吡喃环碳信号δ24.7、66.6、78.9、20.2、 25.2，1组2,2-二甲基二氢吡喃环的碳信号δ 21.1、31.8、73.9、26.0(×2)之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ 178.1，两个与氧相连的烯碳信号δ158.3、139.2，以上碳谱数据进一步表明化合物Ⅲ为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ2.68(2H, t,J＝6.6Hz,H-1″′)与δ120.3(C-1′)、121.3(C-2′)、142.0(C-3′)的远程相关，表明2,2-二甲基- 二氢吡喃环连接在C-2′和C-3′位。通过亚甲基质子信号δ2.83(1H,dd,J＝16.5,5.1Hz,H-1″), 2.54(1H,dd,J＝16.5,6.7Hz,H-1″)与δ158.82(C-7)、99.0(C-8)、154.0(C-9)的HMBC相关，提示3-羟基2,2-二甲基二氢吡喃环连接在C-7和C-8位。通过δ 3.58(3H,s)与δ139.2(C-3)的远程相关，表明甲氧基连接在C-3位。将化合物Ⅲ的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、 HMBC谱进行归属(见Table 3)。因此化合物Ⅲ的结构为 7,8-bis-2′,3′-(2,2-dimethyldihydropyrano)-5,4′,2″-trihydroxy-3-methoxyflavone，命名为桃儿七酮 NC(sinoflavonoid NC)。
Figure BDA0002190255610000121
Table 3.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments forⅢ.
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
化合物Ⅳ，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 499.1966[M﹢H]+(calcd for C27H31O9,499.1968)，确定分子式为C27H30O9。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3387cm-1)、缔合羰基(1654cm-1)、苯环(1599 cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(264、342nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6) 显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.16(1H,s)、6.76(1H,d,J＝8.2Hz)、6.89(1H,d,J＝8.2 Hz)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个五取代和1,2,3,4-四取代苯环结构。由2组亚甲基质子信号δ2.63(2H,m)、1.71(2H,m)，2个与季碳相连的甲基质子信号δ1.31(6H,s)，表明结构中存在1个2,2-二甲基-二氢吡喃环。由2个连氧次甲基质子信号δ4.20(1H,d,J＝2.7Hz)、3.80(1H,m)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.32(3H,s)、1.36(3H, s)，1个与脂肪碳相连的甲氧基质子信号δ3.31(3H,s)，提示结构中存在1个3-羟基-4-甲氧基 -2,2-二甲基二氢吡喃环。1个与芳香碳相连的甲氧基质子信号δ3.59(3H,s)。两个酚羟基质子信号δ12.65(1H,s)、9.22(1H,s)，其中δ12.65(1H,s)为与4位羰基缔合的5位酚羟基质子信号。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有27个碳原子，除了1个甲氧基的碳信号δ60.2， 1组3-羟基-4-甲氧基-2,2-二甲基二氢吡喃环碳信号δ 73.9、67.3、78.8、23.1、24.5，1组2,2- 二甲基-二氢吡喃环的碳信号δ 19.9、31.8、73.5、26.4(×2)之外，还给出12个芳香碳信号，1 个羰基碳信号δ 178.1，两个与氧相连的烯碳信号δ 158.0、139.5，以上碳谱数据进一步表明化合物Ⅳ为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ2.63(2H,m,H-1″′)与δ120.2(C-1′)、121.0(C-2′)、141.9(C-3′)的远程相关，表明2,2-二甲基二氢吡喃环连接在C-2′和C-3′位。通过连氧次甲基质子信号δ4.20(1H,d,J＝2.7Hz)与δ158.8(C-7)、100.3(C-8)、 156.0(C-9)的HMBC相关，表明3-羟基-4-甲氧基-2,2-二甲基二氢吡喃环连接在C-7和C-8位。通过δ 3.59(3H,s)与δ139.5(C-3)的远程相关，表明未归属的甲氧基连接在C-3位。将化合物Ⅳ的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见表4)。因此化合物Ⅳ的结构为7,8-bis-2′,3′-(2,2-dimethyldihydropyrano)-5,4′,2″-trihydroxy-3,1″-dimethoxyflavone，命名为桃儿七酮ND(sinoflavonoid ND)。
Figure BDA0002190255610000141
Table 4.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments forⅣ.
Figure DEST_PATH_IMAGE006
化合物V，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 469.1860[M﹢Na]+(calcd for C26H29O8,469.1862)，确定分子式为C26H28O8。IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3364cm-1)，缔合羰基(1651cm-1)，苯环(1591cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(265，349nm)。1H NMR(500MHz, DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.30(1H,s)、6.90(1H,d,J＝8.2Hz)、6.75(1H,d, J＝8.2Hz)，分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个五取代和1,2,3,4- 四取代苯环结构。由1个亚甲基质子信号δ3.13(2H,d,J＝8.5Hz)，一个连氧次甲基δ4.74(2H,t,J＝8.5Hz)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.14(3H,s)、1.13(3H,s)，提示结构中存在1个2-(1-羟基-1-甲乙基)-二氢呋喃基。由2组亚甲基质子信号δ2.66(2H,m)、1.73(2H,m)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.30(3H,s)、1.31(3H,s)，表明结构中存在1个2,2-二甲基二氢吡喃环。三个酚羟基质子信号δ12.87(1H,s)、9.21(1H,s)，其中δ12.87(1H,s)为与4位羰基缔合的5位酚羟基质子信号。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有26个碳原子，除了一个甲氧基碳信号δ 60.2，一组2-(1-羟基-1-甲乙基)-二氢呋喃基δ 25.2、91.5、69.9、24.8、25.7，1组2,2-二甲基-二氢吡喃环的碳信号δ 20.1、31.7、73.9、26.2、26.6之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ 178.1，两个与氧相连的烯碳信号δ 158.0、138.8，以上碳谱数据进一步表明化合物V为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ3.13(2H,d,J＝ 8.5Hz,H-1″)与δ166.2(C-7)、104.4(C-8)、151.3(C-9)的远程相关，表明2-(1-羟基-1-甲乙基)- 二氢呋喃基与黄酮母核的C-7和C-8位相骈和。通过亚甲基质子信号δ2.66(2H,m,H-1″′)与δ120.2(C-1′)、121.1(C-2′)、142.0(C-3′)的HMBC相关，表明2,2-二甲基二氢吡喃环连接在 C-2′和C-3′位。通过δ 3.57(3H,s)与δ138.8(C-3)的远程相关，表明未归属的甲氧基连接在C-3 位。将化合物V的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见Table5)。因此化合物V的结构为 7,8-[2-(1-hydroxy-1-methylethyl)dihydrofurano]-2′,3′-(2,2-dimethyldihydropyrano)-5,4′-dihydroxy -3-methoxyflavone，命名为桃儿七酮NE(sinoflavonoid NE)。
Figure BDA0002190255610000151
Table 5.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments for V.
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure DEST_PATH_IMAGE008
二、细胞毒活性
1.实验材料
人乳腺癌细胞MCF-7由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2.细胞培养
MCF-7细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。
3.MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含4000个肿瘤细胞)，置37℃、5％ CO2温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，设4-5个剂量组，每组至少设五个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37℃、5％CO2温箱中培养。 2天后弃培养液，每孔加50μL(1mg/ml)MTT溶液(培养基配置)。37℃孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490nm 条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS 13.0软件处理得到半数抑制浓度(IC50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。
Figure BDA0002190255610000171
4.实验结果
通过MTT法采用人乳腺癌细胞MCF-7对桃儿七酮P(sinoflavonoid P，I)、桃儿七酮NB (sinoflavonoid NB，Ⅱ)、桃儿七酮NC(sinoflavonoid NC，Ⅲ)、桃儿七酮ND(sinoflavonoid ND，Ⅳ)、桃儿七酮NE(sinoflavonoid NE，V)进行细胞毒活性测试，结果见Table 6。
Table 6.化合物I-V对MCF-7细胞的细胞毒活性
Figure DEST_PATH_IMAGE009
异戊烯基化黄酮类化合物由于黄酮母核及其所连异戊烯基化基团的位置、数目、种类的不同，其细胞毒活性会存在很大的差异。发明人通过大量的实验证实，本发明制备出的桃儿七酮P(sinoflavonoid P)、桃儿七酮NB(sinoflavonoid NB)、桃儿七酮NC(sinoflavonoid NC)、桃儿七酮ND(sinoflavonoid ND)、桃儿七酮NE(sinoflavonoid NE)对人乳腺癌细胞MCF-7具有细胞毒活性，具有制备临床上抗乳腺癌药物的前景。

Claims (5)

1.一种异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述的异戊烯基化黄酮类化合物是从小叶莲中提取的桃儿七酮P、桃儿七酮NB、桃儿七酮NC、桃儿七酮ND、桃儿七酮NE，分子结构式分别为：
Figure FDA0003184622330000011
制备方法是，以小叶莲药材6-9kg为原料，以体积为原料重量的2-5倍且体积单位为L、重量单位为kg、体积浓度为75％-95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90-95℃，每次提取时间为1.5-2小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2-3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，每次2-3.2L，时间为1.5-2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用9.1-13L洗脱液，流速为10-15mL/min，每350-500ml体积为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-35、流份36-85、流份86-104、流份105-115、流份116-132、流份133-144、流份145-157、流份158-163、流份164-170、流份171-182、流份183-188、流份189-195、流份196-204、流份205-208、流份209-234、流份235-260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组份Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为20-35mL/h，每4-8mL为一流份、收集32个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:3的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3-15、流份16-27、流份28-32、得到3个亚组份Fr.10-1，Fr.10-2，Fr.10-3；将亚组份Fr.10-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为69:31的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为62min的色谱峰得到化合物V，即桃儿七酮NE，收集保留时间为66min色谱峰得到化合物Ⅲ，即桃儿七酮NC；将组分Fr.11经硅胶柱色谱，经体积比100:7、100:10、100:15、100:20石油醚-丙酮混合溶剂系统洗脱，每一梯度用50-80mL洗脱液，每5-8mL为一流份，收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比5:4的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-8、流份9-15、流份16-31、流份32-40，得到4个亚组份Fr.11-1、Fr.11-2、Fr.11-3、Fr.11-4；亚组份Fr.11-4经制备高效液相色谱，以体积比为80:20的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为21min的色谱峰得到化合物Ⅳ，即桃儿七酮ND；将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20的甲醇-水溶液洗脱，每一梯度150-200mL，每一流份为15-20mL，共收集30个流份，分别合并流份1-9、流份10-18、流份19-30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为26min的峰得到化合物I，即桃儿七酮P；将组分Fr.13经硅胶柱色谱，体积比10:40石油醚-丙酮混合溶液洗脱，每3-5mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅱ的流份，得到化合物Ⅱ，即桃儿七酮NB。
2.根据权利要求1所述的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，由小叶莲药材9kg为原料，以18L、体积浓度为95％乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次3.2L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流速为15mL/min，每500ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-35、流份36-85、流份86-104、流份105-115、流份116-132、流份133-144、流份145-157、流份158-163、流份164-170、流份171-182、流份183-188、流份189-195、流份196-204、流份205-208、流份209-234、流份235-260，得到Fr.1-Fr.16个组份；将组份Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为35mL/h，每8mL为一流份、收集32个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4:1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3-15、流份16-27、流份28-32、得到3个亚组份Fr.10-1，Fr.10-2，Fr.10-3；将亚组份Fr.10-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为69:31的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为62min的色谱峰得到化合物V、收集保留时间为66min色谱峰得到化合物Ⅲ；将组分Fr.11经硅胶柱色谱，经体积比100:7、100:10、100:15、100:20石油醚-丙酮混合溶剂系统洗脱，每一梯度用80mL洗脱液，每8mL为一流份，收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比5:4的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-8、流份9-15、流份16-31、流份32-40，得到4个亚流份Fr.11-1、Fr.11-2、Fr.11-3、Fr.11-4；亚流份Fr.11-4经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为80:20的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为21min的色谱峰得到化合物Ⅳ；将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20甲醇-水溶液洗脱，每一梯度200mL，每一流份为20mL，共收集30个流份，分别合并流份1-9、流份10-18、流份19-30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMCPack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为26min的色谱峰得到化合物I；将组分Fr.13经硅胶柱色谱，体积比10:40石油醚-丙酮混合溶液洗脱，每5mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅱ的流份，得到化合物Ⅱ。
3.根据权利要求1所述的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，由小叶莲药材6kg为原料，以30L、体积浓度为75％乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用9.1L洗脱液，流速为10mL/min，每350ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-35、流份36-85、流份86-104、流份105-115、流份116-132、流份133-144、流份145-157、流份158-163、流份164-170、流份171-182、流份183-188、流份189-195、流份196-204、流份205-208、流份209-234、流份235-260，得到Fr.1-Fr.16个组份；将组份Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为20mL/h，每4mL为一流份、收集32个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4:1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3-15、流份16-27、流份28-32、得到3个亚组份Fr.10-1，Fr.10-2，Fr.10-3；将亚组份Fr.10-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为69:31的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为62min的色谱峰得到化合物V、收集保留时间为66min色谱峰得到化合物Ⅲ；将组分Fr.11经硅胶柱色谱，经体积比100:7、100:10、100:15、100:20石油醚-丙酮混合溶剂系统洗脱，每一梯度用5mL洗脱液，每5mL为一流份，收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比5:4的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-8、流份9-15、流份16-31、流份32-40，得到4个亚组份Fr.11-1、Fr.11-2、Fr.11-3、Fr.11-4；亚组份Fr.11-4经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为80:20的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-PackODSA，流速为7mL/min，收集保留时间为21min的色谱峰得到化合物Ⅳ；将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20甲醇-水溶液洗脱，每一梯度150mL，每一流份为15mL，共收集30个流份，分别合并流份1-9、流份10-18、流份19-30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为26min的峰得到化合物I；将组分Fr.13经硅胶柱色谱，体积比10:40石油醚-丙酮混合溶液洗脱，每3mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅱ的流份，得到化合物Ⅱ。
4.根据权利要求1所述的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，由小叶莲药材8kg为原料，以24L、体积浓度为85％乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2.8L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用11.7L洗脱液，流速为13mL/min，每450ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-35、流份36-85、流份86-104、流份105-115、流份116-132、流份133-144、流份145-157、流份158-163、流份164-170、流份171-182、流份183-188、流份189-195、流份196-204、流份205-208、流份209-234、流份235-260，得到Fr.1-Fr.16个组份；将组份Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为28mL/h，每7mL为一流份、收集32个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4:1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3-15、流份16-27、流份28-32、得到3个亚组份Fr.10-1，Fr.10-2，Fr.10-3；将亚组份Fr.10-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为69:31的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为62min的色谱峰得到化合物V、收集保留时间为66min色谱峰得到化合物Ⅲ；将组分Fr.11经硅胶柱色谱，经体积比100:7、100:10、100:15、100:20石油醚-丙酮混合溶剂系统洗脱，每一梯度用75mL洗脱液，每7.5mL为一流份，收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比5:4的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-8、流份9-15、流份16-31、流份32-40，得到4个亚组份Fr.11-1、Fr.11-2、Fr.11-3、Fr.11-4；亚组份Fr.11-4经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为80:20的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为21min的色谱峰得到化合物Ⅳ；将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20甲醇-水溶液洗脱，每一梯度190mL，每一流份为19mL，共收集30个流份，分别合并流份1-9、流份10-18、流份19-30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMCPack ODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为26min的峰得到化合物I；将组分Fr.13经硅胶柱色谱，体积比10:40石油醚-丙酮混合溶液洗脱，每4.5mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅱ的流份，得到化合物Ⅱ。
5.根据权利要求1所述的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，由小叶莲药材7kg为原料，以28L、体积浓度为75％乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.4L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次2.4L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用10.4L洗脱液，流速为12mL/min，每400ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-35、流份36-85、流份86-104、流份105-115、流份116-132、流份133-144、流份145-157、流份158-163、流份164-170、流份171-182、流份183-188、流份189-195、流份196-204、流份205-208、流份209-234、流份235-260，得到Fr.1-Fr.16个组份；将组份Fr.10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为24mL/h，每6mL为一流份、收集32个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4:1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3-15、流份16-27、流份28-32、得到3个亚组份Fr.10-1，Fr.10-2，Fr.10-3；将亚组份Fr.10-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为69:31的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为62min的色谱峰得到化合物V、收集保留时间为66min色谱峰得到化合物Ⅲ；将组分Fr.11经硅胶柱色谱，经体积比100:7、100:10、100:15、100:20石油醚-丙酮混合溶剂系统洗脱，每一梯度用70mL洗脱液，每7mL为一流份，收集40个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比5:4的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-8、流份9-15、流份16-31、流份32-40，得到4个亚组份Fr.11-1、Fr.11-2、Fr.11-3、Fr.11-4；亚组份Fr.11-4经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为80:20的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为7mL/min，收集保留时间为21min的色谱峰得到化合物Ⅳ；将组分Fr.12经开放ODS柱色谱，经体积比50:50、70:30、80:20甲醇-水溶液洗脱，每一梯度180mL，每一流份为18mL，共收集30个流份，分别合并流份1-9、流份10-18、流份19-30，得到3个亚组份Fr.12-1、Fr.12-2、Fr.12-3；亚组份Fr.12-3经制备型高效液相色谱纯化，色谱柱为YMCPackODS-A，再以体积比为60:40的甲醇-水混合溶剂系统洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为26min的峰得到化合物I；将组分Fr.13经硅胶柱色谱，经体积比10:40石油醚-丙酮混合溶液洗脱，每4mL为一流份，收集含有目标化合物Ⅱ的流份，得到化合物Ⅱ。
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