CN116789657B - 一种具有抗炎活性的化合物及其提取分离方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中医药技术领域，涉及一种具有抗炎活性的化合物及其提取分离方法和应用。采用醇提取、硅胶柱层析和HPLC进行分离纯化与制备，成功提取分离出新的化合物，该方法操作步骤仅为四步，操作方法简便及快速，且经该方法分离得到的化合物纯度均大于96％，研究表明本化合物可显著抑制脂多糖(LPS)引起的小鼠巨噬细胞RAW246.7和小胶质细胞BV‑2中NO的水平，具有显著的抗炎活性，因此本发明新化合物及其衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎等药物，具有良好的经济效益和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于中医药技术领域，具体为一种具有抗炎活性的化合物及其提取分离方法和应用。
背景技术
二色补血草(Limonium bicolor(Bunge.)Kuntze)是白花丹科补血草属植物，别名燎眉蒿、补血草、扫帚草、匙叶草、血见愁、秃子花、苍蝇花等。二色补血草的药用部位为其干燥根或全草，具有补气血、健脾胃和活血止血的功效，主治病后体弱、胃脘痛、消化不良、月经不调、崩漏、带下和尿血等症。现代药理学研究表明，二色补血草具有补血止血、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等活性。
目前临床上常用的抗炎药主要有两类：非甾体抗炎药和甾体类抗炎药。虽然这两类抗炎药都有很好的临床应用效果，但长期大量使用均会产生一系列不良反应或副作用，如胃粘膜损伤、肝脏损伤、肾脏损害等，应用时间长亦可产生耐受性。因此寻找新的高效低毒的抗炎药物仍将是抗炎药物研究的热点领域。
小胶质细胞(BV-2)作为中枢神经系统内的免疫细胞，既可通过吞噬脑组织中的病原体及有害颗粒对神经元起保护作用，又可在致炎因子的作用下，激活成反应性小胶质细胞，分泌炎性细胞因子对神经元起毒性作用，是治疗神经炎症及神经退行性疾病的一个重要靶点。
巨噬细胞(RAW264.7)是一种组织内的白血球，源自单核细胞，巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在机体内参与非特异性防卫和特异性防卫(细胞免疫)，它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。巨噬细胞和小胶质细胞能够被多种炎症性因子所激活，如细胞因子、细菌脂多糖LPS、细胞外基质蛋白以及其他化学介质等。LPS是十分重要的致炎因子，它能够刺激体内的巨噬细胞和小胶质细胞合成和释放多种内源性活性因子，进而诱发炎症。
江西中医药大学申请的公开号为CN111281921A发明专利申请公开了一种治疗感冒、肺炎、肠炎、肾炎的肺形草银翘解毒消炎组合物，发挥了中医药治疗肺炎并伴有肠炎和肾炎辩证论治、病证结合的特点与优势，提供了一种治疗感冒、肺炎、肠炎、肾炎的肺形草银翘解毒消炎组合物的制备方法及其在制备治疗感冒、肺炎、肠炎、肾炎药物中的应用，提供了肺形草银翘解毒消炎组合物新的制备工艺及其具体新用途和新功效。
目前，国内外学者对中药二色补血草的研究主要是提取物，对其所含化学成分的具体药理活性研究较少，多与其他药材配伍使用，成分复杂，其作用机制尚不明确，较少见有关二色补血草成分抗炎的相关文献，因此，从分离鉴定其中的单体化合物入手，找到其发挥各药效的有效成分，以便进行深入的研究与开发利用，是具有十分重要意义的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种具有抗炎活性的新化合物及其在制备抗炎药物中的应用。用这种方法制备的该化合物具有抑制LPS诱导的RAW264.7、BV-2细胞中NO的释放，显示良好的抗炎活性，可用于开发抗炎的相关药物。
为了达到本发明的上述目的，本发明采用的具体技术方案为：
一种具有抗炎活性的新化合物，其结构式如下：
本发明还涉及一种具有抗炎活性的化合物的提取分离方法，包括以下步骤：
(1)将二色补血草粉碎，用醇溶剂提取，萃取，浓缩，得浸膏；
(2)将浸膏经硅胶柱色谱1分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，浓缩，得组分A；
(3)将组分A经硅胶柱色谱2分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，浓缩，得组分B；
(4)将组分B经半制备色谱分离，即得化合物。
优选地，步骤(1)中所述醇溶剂的质量浓度为70％-90％；所述醇溶剂与二色补血草的质量比为8-15：1；所述提取为回流提取，提取次数为1-3次，每次提取1-3小时。
优选地，步骤(1)中所述萃取为依次用石油醚和二氯甲烷萃取，萃取次数分别为1-3次；所述浸膏为二氯甲烷层浸膏。
优选地，步骤(2)中所述硅胶柱色谱1中硅胶粒度为200-300目；所述浸膏与硅胶的质量比为1:10-20；所述梯度洗脱为依次用体积比为100:0、(98.5-99.5):(0.5-1.5)、(96.5-97.5):(2.5-3.5)、(94.5-95.5):(4.5-5.5)的氯仿-甲醇混合溶液洗脱，每个梯度洗脱4-6个保留体积，合并(96.5-97.5):(2.5-3.5)洗脱部位。
优选地，步骤(3)中所述硅胶柱色谱2中硅胶粒度为300-400目；所述组分A与硅胶的质量比为1:40-60；所述梯度洗脱为依次用体积比为100:0、(94-96):(4-6)、(89-91):(9-11)、(84-86):(14-16)、(79-81):(19-21)、(74-76):(24-26)和0:100的石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱，合并0:100洗脱部位。
优选地，步骤(4)所述色谱中的填料为为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-水溶液。
优选地，步骤(4)中所述分离条件为：甲醇:水(v:v)＝(35-45):(55-65)，流速0.8-1.2mL/min，柱温22-28℃，吸收波长为205-215nm和249-259nm，所述化合物的保留时间tR＝6.5-7.5min。
进一步优选地，所述分离条件为甲醇:水(v:v)＝40:60、流速1mL/min、柱温25℃、吸收波长为210nm和254nm，所述化合物的保留时间tR＝7.15min。
本发明还涉及上述具有抗炎活性的化合物或上述提取分离方法得到的化合物在制备抗炎产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明中所述二色补血草新化合物的分离和药理活性研究未被现有论文期刊所报道；
(2)本发明提供来源于二色补血草的新化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离方法，采用醇提取、硅胶柱层析和HPLC进行分离纯化与制备，成功提取分离出新的化合物，该方法操作步骤仅为四步，操作方法简便及快速，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，均大于96.0％；
(3)本发明中的化合物具有显著的抗炎活性，因此本发明新化合物及其衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎等药物。
附图说明
图1为本发明实施例1中具有抗炎活性的化合物的分离条件图；
图2为本发明实施例1中具有抗炎活性的化合物的高分辨质谱图；
图3为本发明实施例1中具有抗炎活性的化合物的1H-NMR谱图；
图4为本发明实施例1中具有抗炎活性的化合物的13C-NMR谱图；
图5为本发明实施例1中具有抗炎活性的化合物的DEPT-C谱图；
图6为本发明实施例1中具有抗炎活性的化合物的HSQC谱图；
图7为本发明实施例1中具有抗炎活性的化合物的HMBC谱图；
图8为本发明实施例1中具有抗炎活性的化合物的1H-1H-COSY谱图；
图9为本发明实施例1中具有抗炎活性的化合物的NOESY谱图；
图10为本发明实施例1中具有抗炎活性的化合物的ECD谱图；
图11为本发明实施例5中NO抑制率对比图；
图12为本发明实施例5中RAW264.7、BV-2细胞的细胞活力对比图。
具体实施方式
对本发明实施例中的技术方案作进一步清晰地描述，所描述的实施例只是本发明的一部分，用于解释本发明，但不用于限定本发明，因此本领域其他技术人员在没有创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明的保护范围。
以下实施例中未特别说明的试剂，均为本领域常规试剂，可商购获得。
实施例1化合物的提取分离
本发明化合物的提取分离方法，具体步骤为：
(1)干燥药材5kg，粉碎成细粉，用10倍量的75％乙醇加热回流提取2次，每次3h，减压浓缩回收提取液至无醇味后，加入蒸馏水分散，依次使用等体积的石油醚、二氯甲烷进行萃取，减压浓缩回收试剂，得到石油醚层浸膏70.8g，二氯甲烷层浸膏20.3g，剩余水相保存在-20℃。
(2)将二氯甲烷层浸膏上样于200-300目硅胶柱色谱1，浸膏质量：硅胶质量＝1:15，依次用体积比为100:0、99:1、97:3、95:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱5个保留体积，合并97:3的洗脱部位，减压浓缩至干，得到组分A。
(3)将组分A上样于200-300目硅胶柱色谱2，浸膏质量：硅胶质量＝1:50，依次用体积比为100:0、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25和0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，合并0：100的洗脱部位，减压浓缩至干，得到组分B。
(4)将组分B用甲醇溶解后经HPLC分析分离条件，得到与其他杂质峰有较好分离效果的条件如图1所示，分离条件为甲醇：水(v:v)＝40：60、流速1mL/min、柱温25℃、吸收波长为210nm和254nm，目标化合物的保留时间tR＝7.158min。等比例放大应用于半制备液相色谱，分离得到该化合物，归一法测定纯度为96.7％。
实施例2化合物的提取分离
本发明化合物的提取分离方法，具体步骤为：
干燥药材4kg，粉碎成细粉，用8倍量的80％乙醇加热回流提取3次，每次1h，减压浓缩回收提取液至无醇味后，加入蒸馏水分散，依次使用等体积的石油醚、二氯甲烷进行萃取，减压浓缩回收试剂，得到石油醚层浸膏56.7g，二氯甲烷层浸膏16.3g，剩余水相保存在-20℃。
将二氯甲烷层浸膏上样于200-300目的硅胶柱色谱1，浸膏质量：硅胶质量＝1:10，依次用体积比为100:0、98.5:1.5、96.5:3.5、94.5:5.5的氯仿-甲醇梯度洗脱，合并96.5:3.5的洗脱部位，减压浓缩至干，得到组分A。
将组分A上样于300-400目的硅胶柱色谱2，浸膏质量：硅胶质量＝1:40，依次用体积比为100:0、94:6、89:11、84:16、79:21、74:26和0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，合并0:100的洗脱部位，减压浓缩至干，得到组分B。
将组分B用甲醇溶解后经HPLC分析分离条件，得到分离条件为甲醇:水(v:v)＝35:65、流速1.2mL/min、柱温28℃、吸收波长为212nm和256nm，目标化合物的保留时间tR＝7.255min。等比例放大应用于半制备液相色谱，分离得到该化合物，归一法测定纯度为96.5％。
实施例3化合物的提取分离
本发明化合物的提取分离方法，具体步骤为：
干燥药材2kg，粉碎成细粉，用15倍量的80％乙醇加热回流提取1次，提取3h，减压浓缩回收提取液至无醇味后，加入蒸馏水分散，依次使用等体积的石油醚、二氯甲烷进行萃取，减压浓缩回收试剂，得到石油醚层浸膏28.1g，二氯甲烷层浸膏8.1g，剩余水相保存在-20℃。
将二氯甲烷层浸膏上样于200-300目的硅胶柱色谱1，浸膏质量：硅胶质量＝1:20，依次用体积比为100:0、99.5:0.5、97.5:2.5、95.5:4.5的氯仿-甲醇梯度洗脱，合并97.5:2.5的洗脱部位，减压浓缩至干，得到组分A。
将组分A上样于300-400目的硅胶柱色谱2，浸膏质量：硅胶质量＝1:60，依次用体积比为100:0、96:4、91:9、86:14、81:19、76:24和0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，合并0：100的洗脱部位，减压浓缩至干，得到组分B。
将组分B用甲醇溶解后经HPLC分析分离条件，得到分离条件为甲醇：水(v:v)＝45：55、流速0.8mL/min、柱温22℃、吸收波长为208nm和252nm，目标化合物的保留时间tR＝7.201min。等比例放大应用于半制备液相色谱，分离得到该化合物，归一法测定纯度为96.5％。
实施例4新化合物的结构鉴定
本发明实施例1制备的化合物高分辨质谱数据如图2所示ESI-[M-H]+m/z＝413.1242，ESI+[M+H]+m/z＝415.1403，[M+Na]+m/z＝437.1218，[M+K]+m/z＝453.0960，[2M+Na]+m/z＝851.2537结合核磁数据，推断其精确分子量为414.1315，结合核磁数据推断其分子式为C22H22O8。
结合表1和图3、图4分析，1H-NMR(600MHz,CDCl3):δH 7.40(dd,J＝8.2,4.2Hz,1H),7.32(d,J＝4.2Hz,1H),6.82(d,J＝8.2Hz,1H)为苯环上ABX型偶合系统的3个氢信号，6.33(s,2H)为对称的芳香氢信号，δH 6.05(s,2H)为亚甲二氧基-OCH2-的氢信号，δH 4.55(dd,J＝9.0,7.0Hz,1H),4.14(dd,J＝9.0,5.8Hz,1H)为连氧亚甲基的两个磁不等价氢信号，δH4.21(d,J＝6.1Hz,1H),3.42(m,1H)为均为次甲基的氢，δH 3.81(s,3H),3.79(s,6H)为甲氧基的氢信号，δH2.84(dd,J＝13.8,7.7Hz,1H),2.74(dd,J＝13.8,8.3Hz,1H)为亚甲基的两个磁不等价氢信号。
13C-NMR(150MHz,CDCl3):δC 190.9,172.7分别为酮羰基和酯羰基的碳信号，δC153.5,152.7,148.4,137.1,133.1,130.3,126.6,108.6,108.0,105.9为10个芳香碳信号，提示存在对称结构，结合图5的DEPT-C谱可知，结构中有5个sp2杂化的-CH-，2个sp3杂化的-CH-，3个sp3杂化的-CH3以及3个sp3杂化的-CH2-,其中δC 102.1,δH 71.9为连氧的-CH2-碳信号,δC60.9,56.1为甲氧基的碳信号，提示δC 60.9两侧均有δC 56.1的甲氧基，δC 53.8,41.2为-CH-的碳信号,δC 38.7为-CH2-的碳信号。
根据图6的HSQC谱对化合物直接相关的H,C信号进行了归属，数据见表1。图7所示的HMBC谱中关键的H→C远程关联，δH 7.32(1H,d,H-2),7.40(1H,dd,H-6)与δH 190.9(C-7)存在远程相关，δH 6.05(s,2H)与148.4(C-3),152.7(C-4)远程相关，δH 7.40(1H,dd,H-6)与152.7(C-4)远程相关，以上表明酮羰基C-7与亚甲二氧基连在同一苯环上，可推出片段1。另一个苯环是3个相邻甲氧基取代的对称结构，苯环H-2',6'(2H，s)与δC 38.7(C-7')远程相关形成片段2，剩下内酯环为片段3。δH 2.84(1H,dd,H-7'a),2.74(1H,dd,H-7'b)与δC 172.7(C-9)无远程相关，说明C-9朝向上而非下。图8的1H-1H-COSY谱中，δH 4.21(1H,d,H-8)只与δH3.42(1H,m,H-8')相关，说明H-8两侧均为羰基，即C-7,C-9羰基均朝上，3个片段的结构如下：
3个片段相连即是化合物的平面结构，化合物的相对构型由图9的NOESY谱进行确定，该化合物手性中心有两个，分别为C-8和C-8'，H-8与H2-7'存在NOE相关，同时H2-7'与Ha-9'存在NOE相关，因此H-8和H-8'为反式。因此，化合物绝对构型为(8S,8'R)或(8R,8'S)，根据图10的ECD谱图可知，其绝对构型为(8S,8'R)。
新化合物的结构如下式：
表1为本发明化合物的1H-NMR(600MHz，CDCl3)与13C-NMR(150MHz，CDCl3)数据。
表1信号归属
实施例5化合物的抗炎活性测试
1.主要材料
药品和试剂：实验所用新化合物由上述方法制备，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。
表2实验材料
细胞株：RAW264.7巨噬细胞、BV-2细胞(冻存于自然资源部第三海洋研究所海洋生物资源开发利用工程技术创新中心2号楼204室液氮罐中)
2.实验过程
细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
2.1对RAW264.7细胞和BV-2细胞活力的影响
将RAW264.7细胞和BV-2细胞复苏后，用DMEM完全培养基(DMEM+10％胎牛血清FBS+1％ PS)在细胞培养皿中培养，并将培养皿置于细胞培养箱(37℃,5％ CO2)内。取对数生长期的RAW264.7细胞和BV-2细胞分别接种到24孔板中(1×105/孔)，在培养箱内培养过夜。待细胞完全贴壁后，用LPS(终浓度1μg/mL)诱导细胞炎症模型，并给入新化合物(终浓度100、30、10μM)共孵育约18h后，取出上述部分上清液后，向24孔板内加入体积为培养基体积10％的CCK-8试剂，按试剂盒说明书测定吸光度值并计算出细胞活力。
2.2LPS诱导RAW264.7细胞和BV-2细胞产生NO水平影响
将RAW264.7细胞和BV-2细胞复苏后，用DMEM完全培养基(DMEM+10％胎牛血清FBS+1％ PS)在细胞培养皿中培养，并将培养皿置于细胞培养箱(37℃,5％ CO2)内。取对数生长期的RAW264.7细胞和BV-2细胞分别接种到24孔板中(1×105/孔)，在培养箱内培养过夜。待细胞完全贴壁后，用LPS(终浓度1μg/mL)诱导细胞炎症模型，并给入新化合物(终浓度100、30、10μM)共孵育约18h后，取出部分细胞上清液，按Griess试剂盒说明书测定细胞上清中NO浓度，计算出NO抑制率。
研究表明本化合物可显著抑制脂多糖(LPS)引起的小鼠巨噬细胞RAW246.7和小胶质细胞BV-2中NO的水平，如图11所示；且无显著细胞毒性，如图12所示，具有显著的抗炎活性，因此本发明新化合物及其衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎等药物。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种具有抗炎活性的化合物，其结构式如下：
2.一种如权利要求1所述的化合物的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将二色补血草粉碎，用醇溶剂提取，萃取，浓缩，得浸膏；
(2)将浸膏经硅胶柱色谱1分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，浓缩，得组分A；
(3)将组分A经硅胶柱色谱2分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，浓缩，得组分B；
(4)将组分B经半制备色谱分离，即得化合物。
3.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述醇溶剂的质量浓度为70％-90％；所述醇溶剂与二色补血草的质量比为8-15：1；所述提取为回流提取，提取次数为1-3次，每次提取1-3小时。
4.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述萃取为依次用石油醚和二氯甲烷萃取，萃取次数分别为1-3次；所述浸膏为二氯甲烷层浸膏。
5.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述硅胶柱色谱1中硅胶粒度为200-300目；所述浸膏与硅胶的质量比为1:10-20；所述梯度洗脱为依次用体积比为100:0、(98.5-99.5):(0.5-1.5)、(96.5-97.5):(2.5-3.5)、(94.5-95.5):(4.5-5.5)的氯仿-甲醇混合溶液洗脱，每个梯度洗脱4-6个保留体积，合并(96.5-97.5):(2.5-3.5)洗脱部位。
6.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述硅胶柱色谱2中硅胶粒度为300-400目；所述组分A与硅胶的质量比为1:40-60；所述梯度洗脱为依次用体积比为100:0、(94-96):(4-6)、(89-91):(9-11)、(84-86):(14-16)、(79-81):(19-21)、(74-76):(24-26)和0:100的石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱，合并0:100洗脱部位。
7.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(4)所述色谱中的填料为为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-水溶液。
8.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(4)中所述分离条件为：甲醇:水(v:v)＝(35-45):(55-65)，流速0.8-1.2mL/min，柱温22-28℃，吸收波长为205-215nm和249-259nm，所述化合物的保留时间tR＝6.5-7.5min。
9.根据权利要求8所述的提取分离方法，其特征在于，所述分离条件为甲醇:水(v:v)＝40:60、流速1mL/min、柱温25℃、吸收波长为210nm和254nm，所述化合物的保留时间tR＝7.15min。
10.一种权利要求1所述的具有抗炎活性的化合物或权利要求2-9任一项所述的提取分离方法得到的化合物在制备抗炎产品中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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