CN113980085B - 一种多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾g的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法及其应用，可有效解决从亚乎奴中制备亚乎奴甾G，实现在制备抗肿瘤药物中的应用问题。所述的亚乎奴甾G是从亚乎奴药材中制备得到，制备的亚乎奴甾G具有抗癌活性，可有效用于制备抗癌药物，实现亚乎奴甾G在制备抗癌药物中的应用，所述的癌为白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌或结直肠癌等，本发明原料丰富，制备方法简单，可从亚乎奴中制备出新型的多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G，纯度高，使用效果好，开拓了亚乎奴的新用途和治疗癌症的新药物，有显著的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。根据世界卫生组织的统计数据(2019年3月)，2018年，全球范围内，有1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例。在我国，2015年恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人。与历史数据相比，癌症负担呈持续上升态势，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿。近10多年来，恶性肿瘤发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。癌症带来的经济负担和对社会发展的不良影响日益突显。目前临床上广泛使用的合成的抗癌药物普遍存在着毒副作用如脱发、贫血和胃肠不适等现象。因此加强抗癌治疗的研究，延长患者的生存期，改善患者的生活质量是药学工作者的当务之急。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，从中草药中寻找高效低毒的抗肿瘤活性物质，研制选择性强、毒副作用低的新型抗肿瘤药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。
亚乎奴为防己科植物锡生藤属植物锡生藤(Cissampelos pareiraL.var.hirsuta)的干燥全株，是傣族习用药材。主要分布在热带及亚热带地区、中南美洲、非洲东部、印度、东南亚地区，我国广西、贵州、云南等地也有分布。现代研究表明亚乎奴中的化学成分主要有生物碱类、黄酮类、有机酸类、萜类、甾醇类、鞣质和少量糖类等，具有解热、镇痛、抗炎、抗癌症、抗氧化、免疫调节、抗菌、抗疟疾、抗糖尿病、抗蛇毒素等药理作用。本发明首次从锡生藤属植物中发现了多氧孕甾烷类化合物，具有重要而广泛的生物活性如免疫抑制、抗氧化、抗炎、抗癫痫、神经保护、抗糖尿病、抗增生、抗肥胖、胃肠保护等。本发明所涉及的多氧孕甾烷类化合物及其生物活性，迄今为止未见有专利或文献报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供新型的一种多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法及其应用，可有效解决从亚乎奴中制备亚乎奴甾G，实现在制备抗肿瘤药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法，所述的亚乎奴甾G是从亚乎奴药材中制备得到，分子结构式为：
制备方法是：以亚乎奴莲药材30.5～50.7kg为原料，以2～5倍原料重量体积、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，重量体积是指固体以kg计，液体L计，提取温度为92～95℃，每次提取时间为1～1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状的乙醇提取物，乙醇提取物混悬于4.8～9L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次4.8～9L，时间为3～5小时，回收溶剂，得到石油醚萃取部位、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100︰0、100︰1、100︰3、100︰5、100︰10、100︰30、100︰50、1︰1、1︰2的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用6.7～9.3L洗脱液，流速为10～15mL/min，每670～930mL体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～30、流份31～50、流份51～60、流份61～70、流份71～90，得到组份Fr.1～Fr.5；组份Fr.4经MCI柱色谱，经体积比甲醇-水溶液10︰90、30︰70、40︰60、70︰30、80︰20梯度洗脱，每一梯度用300～500mL洗脱液，流速为20～35mL/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份Fr.4-1、Fr.4-2、Fr.4-3、Fr.4-4、Fr.4-5；亚组份Fr.4-4经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10︰1、8︰1、5︰1、3︰1、2︰1、1︰1、1︰2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用24mL～40mL洗脱液，流速为2～5mL/min，每24～40mL体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～2、流份3、流份4、流份5～7，得到组份Fr.4-4-1～Fr.4-4-4；将组份Fr.4-4-4经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为10～15mL/h，每10～17mL为一流份、收集20个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比7︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3～5、流份6～17、流份18～20，得到3个亚组份Fr.4-4-4-1、Fr.4-4-4-2、Fr.4-4-4-3；将亚组份Fr.4-4-4-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为60︰40的乙腈-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为6mL/min，收集保留时间为48min的色谱峰，回收溶剂，即得亚乎奴甾G(cissasteroid G)。
该方法制备的亚乎奴甾G具有抗癌活性，可有效用于制备抗癌药物，实现亚乎奴甾G在制备抗癌药物中的应用，所述的癌为白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌或结直肠癌等(不仅限于上述癌症)。
本发明原料丰富，制备方法简单，可从亚乎奴中制备出新型的多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G，纯度高，使用效果好，开拓了亚乎奴的新用途和治疗癌症的新药物，有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明化合物亚乎奴甾G的分子结构图。
图2为本发明化合物亚乎奴甾G的1H NMR谱图(500MHz)。
图3为本发明化合物亚乎奴甾G的13C NMR谱图(125MHz)。
图4为本发明化合物亚乎奴甾G的DEPT谱图。
图5为本发明化合物亚乎奴甾G的1H-1H COSY谱图。
图6为本发明化合物亚乎奴甾G的HSQC谱图。
图7为本发明化合物亚乎奴甾G的HMBC谱图。
图8为本发明化合物亚乎奴甾G的NOESY谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法，以亚乎奴莲药材50.7kg为原料，以180L、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状的乙醇提取物(2.7kg)，乙醇提取物混悬于9L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次9L，时间为5小时，回收溶剂，得到石油醚萃取部位(351.1g)、二氯甲烷萃取部位(740.1g)、正丁醇萃取部位(594.5g)；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100︰0、100︰1、100︰3、100︰5、100︰10、100︰30、100︰50、1︰1、1︰2的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用9.3L洗脱液，流速为15mL/min，每930mL体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～30、流份31～50、流份51～60、流份61～70、流份71～90，得到组份Fr.1～Fr.5；组份Fr.4(10.32g)经MCI柱色谱，经体积比甲醇-水溶液10︰90、30︰70、40︰60、70︰30、80︰20梯度洗脱，每一梯度用500mL洗脱液，流速为35mL/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份Fr.4-1、Fr.4-2、Fr.4-3、Fr.4-4、Fr.4-5；亚组份Fr.4-4经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10︰1、8︰1、5︰1、3︰1、2︰1、1︰1、1︰2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用40mL洗脱液，流速为5mL/min，每40mL体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～2、流份3、流份4、流份5～7，得到组份Fr.4-4-1～Fr.4-4-4；将组份Fr.4-4-4(686.6mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为15mL/h，每17mL为一流份、收集20个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比7︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3～5、流份6～17、流份18～20，得到3个亚组份Fr.4-4-4-1、Fr.4-4-4-2、Fr.4-4-4-3；将亚组份Fr.4-4-4-2(280.3mg)经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为60︰40的乙腈-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为6mL/min，收集保留时间为48min的色谱峰，回收溶剂，即得亚乎奴甾G(cissasteroid G)(12.5mg,纯度为98.0％)。
实施例2
本发明一种多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法，以亚乎奴莲药材30.5kg为原料，以91L、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状的乙醇提取物1.6kg，乙醇提取物混悬于4.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次4.8L，时间为3小时，回收溶剂，得到石油醚萃取部位(208.2g)、二氯甲烷萃取部位(439.8g)、正丁醇萃取部位(353.7g)；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100︰0、100︰1、100︰3、100︰5、100︰10、100︰30、100︰50、1︰1、1︰2的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用6.7L洗脱液，流速为10mL/min，每670mL体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～30、流份31～50、流份51～60、流份61～70、流份71～90，得到组份Fr.1～Fr.5；组份Fr.4(6.1g)经MCI柱色谱，经体积比甲醇-水溶液10︰90、30︰70、40︰60、70︰30、80︰20梯度洗脱，每一梯度用300mL洗脱液，流速为20mL/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份Fr.4-1、Fr.4-2、Fr.4-3、Fr.4-4、Fr.4-5；亚组份Fr.4-4(0.8g)经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10︰1、8︰1、5︰1、3︰1、2︰1、1︰1、1︰2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用24mLmL洗脱液，流速为2mL/min，每24mL体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～2、流份3、流份4、流份5～7，得到组份Fr.4-4-1～Fr.4-4-4；将组份Fr.4-4-4(408.3mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为10mL/h，每10mL为一流份、收集20个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比7︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3～5、流份6～17、流份18～20，得到3个亚组份Fr.4-4-4-1、Fr.4-4-4-2、Fr.4-4-4-3；将亚组份Fr.4-4-4-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为60︰40的乙腈-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-PackODS-A，流速为6mL/min，收集保留时间为48min的色谱峰，回收溶剂，即得亚乎奴甾G(cissasteroid G)(7.4mg,纯度为97.5％)。
实施例3
本发明一种多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法，以亚乎奴莲药材40.5kg为原料，以121.5L、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为94℃，每次提取时间为1.2小时，减压回收乙醇，得浸膏状的乙醇提取物(2.1kg)，乙醇提取物混悬于6.9L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次6.9L，时间为4小时，回收溶剂，得到石油醚萃取部位(279.8g)、二氯甲烷萃取部位(590.3g)、正丁醇萃取部位(473.9g)；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100︰0、100︰1、100︰3、100︰5、100︰10、100︰30、100︰50、1︰1、1︰2的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用8L洗脱液，流速为13mL/min，每80mL体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～30、流份31～50、流份51～60、流份61～70、流份71～90，得到组份Fr.1～Fr.5；组份Fr.4(8.23g)经MCI柱色谱，经体积比甲醇-水溶液10︰90、30︰70、40︰60、70︰30、80︰20梯度洗脱，每一梯度用400mL洗脱液，流速为30mL/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份Fr.4-1、Fr.4-2、Fr.4-3、Fr.4-4、Fr.4-5；亚组份Fr.4-4(1.03g)经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10︰1、8︰1、5︰1、3︰1、2︰1、1︰1、1︰2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用30mL洗脱液，流速为4mL/min，每30mL体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～2、流份3、流份4、流份5～7，得到组份Fr.4-4-1～Fr.4-4-4；将组份Fr.4-4-4(547.8mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为13mL/h，每16mL为一流份、收集20个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比7︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3～5、流份6～17、流份18～20，得到3个亚组份Fr.4-4-4-1、Fr.4-4-4-2、Fr.4-4-4-3；将亚组份Fr.4-4-4-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为60︰40的乙腈-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为6mL/min，收集保留时间为48min的色谱峰，回收溶剂，即得亚乎奴甾G(cissasteroidG)(9.6mg,纯度为98.2％)。
实施例4
本发明一种多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法，以亚乎奴莲药材35.8kg为原料，以143.2L、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为93℃，每次提取时间为1.3小时，减压回收乙醇，得浸膏状的乙醇提取物(1.9kg)，乙醇提取物混悬于5.7L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次5.7L，时间为4小时，回收溶剂，得到石油醚萃取部位(247g)、二氯甲烷萃取部位(521.3g)、正丁醇萃取部位(418.6g)；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100︰0、100︰1、100︰3、100︰5、100︰10、100︰30、100︰50、1︰1、1︰2的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用7.5L洗脱液，流速为11mL/min，每750mL体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～30、流份31～50、流份51～60、流份61～70、流份71～90，得到组份Fr.1～Fr.5；组份Fr.4(7.25g)经MCI柱色谱，经体积比甲醇-水溶液10︰90、30︰70、40︰60、70︰30、80︰20梯度洗脱，每一梯度用350mL洗脱液，流速为25mL/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份Fr.4-1、Fr.4-2、Fr.4-3、Fr.4-4、Fr.4-5；亚组份Fr.4-4(0.95g)经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10︰1、8︰1、5︰1、3︰1、2︰1、1︰1、1︰2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用29mL洗脱液，流速为3mL/min，每29mL体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～2、流份3、流份4、流份5～7，得到组份Fr.4-4-1～Fr.4-4-4；将组份Fr.4-4-4(483.5mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为11mL/h，每15mL为一流份、收集20个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比7︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3～5、流份6～17、流份18～20，得到3个亚组份Fr.4-4-4-1、Fr.4-4-4-2、Fr.4-4-4-3；将亚组份Fr.4-4-4-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为60︰40的乙腈-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为6mL/min，收集保留时间为48min的色谱峰，回收溶剂，即得亚乎奴甾G(cissasteroidG)(8.5mg,纯度为98.3％)。
本发明方法稳定可靠，易操作，所得产物经UV、IR、核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HSQC、HMBC、H-H COSY、NOESY)及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术鉴定为对人白血病细胞HL-60、人非小细胞肺癌细胞A549、人肝癌细胞SMMC-721、人乳腺癌细胞MCF-7、人结肠癌细胞SW480具有细胞毒活性的新型多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G(cissasteroidG)，有关资料如下：
一、化合物的结构鉴定
1、仪器与试药
比旋光度值用Rudolph AP-IV polarimeter(Rudolph,Hackettstown,NJ,USA)测定；ECD光谱用Applied Photophysics Chirascanq CD spectropolarimeter(AppliedPhotophysics,Leatherhead,Surrey,UK)测定；UV和IR光谱分别用ThermoEVO300spectrometer(Thermo,Waltham,MA,USA)和ThermoNicolet IS 10spectrometer(Thermo,Waltham,MA,USA)测定；核磁共振光谱和质谱分别在Bruker Avance III500spectrometer(Bruker,Germany)和Bruker maXisHD mass spectrometer(Bruker,Germany)测定；制备液相色谱分离在LC50型高压制备液相色谱仪(北京赛谱锐思科技有限公司)上进行；单糖的分离在Waters 2695separation module进行(Waters,Milford,MA,USA)；MCI gel CHP-20、反相硅胶ODS(50μm)、凝胶sephadex LH-20(40-70μm)、硅胶(160-200目)分别购于TOSOH公司(Tokyo,Japan)、YMC Group(Kyoto,Japan)、AmershamPharmacia Biotech AB(Uppsala,Sweden)，和青岛海洋化工有限公司；有机试剂购自天津四友精细化学品有限公司生产；生物试剂购自Sigma公司；人肝癌细胞(SMMC-7721)来自于北京协和药物研究所；人白血病细胞(HL-60)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人结直肠癌细胞(SW-480)来自于American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,VA,USA)。
药物为本发明多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G。
2、结构鉴定
本发明实施例1-4制备的亚乎奴甾G为结构相同的化合物，白色不定形粉末，易溶于二氯甲烷；(c 0.03，MeOH)；紫外254nm下有暗斑，10％硫酸乙醇显墨绿色(105℃)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:[M+Na]+797.4087(计算值为797.4088)，确定其分子式为C42H62O13，不饱和度为12；红外光谱显示存在共轭羰基(1708cm-1)、羟基(3379cm-1)和苯基(1602cm-1,1451cm-1)，相关图谱见图2-8。
13C-NMR和DEPT显示有42个碳信号，有8个季碳信号，其中包括1个羰基碳信号δC165.8(C-1′)，2个烯碳信号δC139.7(C-5)、130.1(C-1′)，3个含氧季碳信号δC 72.4(C-8)、87.9(C-14)、87.9(C-17)；18个次甲基碳信号，其中有10个含氧次甲基碳δC 78.0(C-3)、74.0(C-12)、74.6(C-20)、96.2(C-1″)、77.4(C-3″)、82.5(C-4″)、68.5(C-5″)、99.4(C-1″′)、77.3(C-3″′)、71.0(C-4″′)、70.7(C-5″′)，6个烯碳/芳碳信号δC 118.4(C-6)、129.6(C-2′,6′)、128.7(C-3′,5′)、133.4(C-4′)；9个亚甲基碳；7个甲基碳，其中有2个甲氧基碳δC 57.2(C-7″)、58.0(C-7″′)。1H-NMR和13C-NMR光谱数据给出一组苯甲酰基、两组甲醚化的2,6-二去氧糖基及一组孕甾骨架。一个单取代苯基δH 8.07(2H,d,J＝7.2Hz)、7.45(2H,t,J＝7.4Hz)、7.57(1H,t,J＝7.4Hz)，一个酯羰基碳信号δC 165.8，提示结构中存在一组苯甲酰基。两个亚甲基氢信号δH 2.17(1H,m)、1.59(1H,m)、2.07(1H,m)、1.53(1H,m)，δC 34.5、35.5；两个甲氧基信号δH 3.40(3H,s)、3.42(3H,s)，δC 57.2、58.0；两个甲基信号δH 1.03(3H,d,J＝6.2Hz)、1.20(3H,d,J＝6.2Hz)，δC 18.2、18.3；六个氧代脂肪碳信号δC 77.4、82.5、68.5、77.3、71.0、70.7，两个糖端基碳δC 96.1、99.4，两个糖端基氢δH 4.82(1H,dd,J＝9.7,1.6Hz)、4.65(1H,dd,J＝9.7,1.0Hz)，表明结构中存在两个加拿大麻糖基结构片段。一个苯酰基，两个烯碳δC 140.3,120.1，两个加拿大麻糖基共计占去了分子结构中12个不饱和度中的8个，剩余4个，提示结构中存在四个环。三个甲基δH 1.62(3H,s)、1.13(3H,s)、1.24(3H,d,J＝6.2Hz)，δC 11.1、18.2、15.5；七个亚甲基；三个氧代次甲基δH 3.53(1H,m)、4.87(1H,dd,J＝11.4,4.3Hz)、3.55(1H,q,J＝6.2Hz)，δC 78.0、74.0、74.6；三个氧代季碳δC72.4、87.9(×2)；一个烯氢δH 5.37(1H,br s)，两个烯碳δC 139.7,118.4，表明结构中存在3β,8β,12β,14β,17β,20-hexahydroxypregn-5-ene骨架，苷元被鉴定为肉珊瑚苷元(sarcostin)。以上光谱数据进一步表明化合物1为糖苷化的多氧取代孕甾衍生物。根据1H-NMR和13C-NMR，结合DEPT、HSQC、HMBC、1H-1H COSY对其数据进行归属(见表1)。
Table 1.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments for cissasteroid G.
根据糖端基氢的偶合常数(9.7,1.6Hz；9.7,1.0Hz)和亚甲基碳的化学位移δc34.5、35.5，确定两个加拿大麻糖端基氢的相对构型为β型。该化合物经酸水解，水解产物通过制备液相色谱分离得到单糖，通过与标准D-加拿大麻糖的比旋光度值比较，确定为D-加拿大麻糖。1H-1HCOSY谱给出8个自旋偶合系统：从H-1至H-4、从H-6至H-7、从H-9至H-12、从H-15至H-16、从H-20至H-21、从H-2′至H-6′、从H-1″至H-6″、以及从H-1″′至H-6″′。在HMBC谱中，由氧代次甲基δH 4.87(1H,dd,J＝11.4,4.3Hz,H-12)与苯甲酰基上的酯羰基δC 165.8(C-7′)的远程相关，提示苷元的12-OH被苯甲酸酯化。由糖端基氢信号δH 4.82(1H,dd,J＝9.7,1.6Hz,H-1″)与苷元连氧脂肪碳信号δc 78.0(C-3)的HMBC相关，说明苷元的C-3被加拿大麻糖糖苷化。由糖端基氢信号δH 4.65(1H,dd,J＝9.7,1.0Hz,H-1″′)与内侧加拿大麻糖δc82.5(C-4)的HMBC相关，说明两个加拿大麻糖基通过(1→4)相连。
由NOESY谱，确定该化合物苷元上的取代基的构型。由H-1α与H-3、H-9，H-16α与H-20，H-12与H-20，H-19与H-18，以及H-1β与H-19的NOE相关，提示H-3、H-9、H-12为α取向，Me-19、Me-18、H-20为β取向。所有天然来源的孕甾A/B、B/C、C/D环的稠合方式分别为反式、反式、顺式，由此推测8-OH与14-OH均为β取向。结合孕甾的生物合成途径，确定该化合物孕甾骨架上手性碳的绝对构型分别为3S,8S,9S,10R,12S,13S,14R,17S。因此，该化合物的结构确定为12-O-benzoylsarcostin 3-O-β-D-cymaropyranoide-(1→4)-β-D-cymaropyranoside，命名为亚乎奴甾G(cissasteroid G)，为一未见文献报道的新化合物。
二、活性试验(以实施例3为例)
1.实验材料
人肝癌细胞SMMC-7721由中国医学科学院药物研究所提供。人白血病细胞HL-60、人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人结直肠癌SW-480，购自ATTC。
2.细胞培养
HepG2细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。
3.MTS法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含4000个肿瘤细胞)，置37℃、5％CO2温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，设4～5个剂量组，每组至少设3个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37℃、5％CO2温箱中培养。2天后弃培养液，每孔加20μL(1mg/ml)MTS溶液(培养基配置)。37℃孵育4小时。用酶标仪，在检测波长492nm条件下测定光密度值(OD)。IC50值通过Reed-Muench方法计算。
4.实验结果
通过MTS法采用人白血病细胞HL-60、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞SMMC-7721、人乳腺癌细胞MCF-7、人结直肠癌SW-480对亚乎奴甾G(cissasteroid G)进行细胞毒活性测试，结果表明，IC50值分别为2.19、14.38、2.00、7.58、7.44μM。
在上述试验的同时，还对其他实施例进行了同样的试验，均取得了相同和相近似的结果，这里不再一一列举。
通过大量的实验证实，多氧孕甾烷类化合物由于母核及其所取代基的位置、数目、种类的不同，其细胞毒活性会存在很大的差异，由上述实验表明，本发明制备出的亚乎奴甾G(cissasteroid G)对人白血病细胞HL-60、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞SMMC-7721、人乳腺癌细胞MCF-7、人结直肠癌SW-480具有细胞毒活性，具有制备临床上抗癌药物的前景。
由上述可以清楚看出，本发明原料丰富，制备方法简单，可从亚乎奴中制备出新型的多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G，纯度高，达97.5％以上，使用效果好，可有效用于制备抗癌药物，开拓了亚乎奴的新用途和治疗癌症的新药物，有显著的经济和社会效益。
Claims (5)
1.一种多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法，其特征在于，所述的亚乎奴甾G是从亚乎奴药材中制备得到，化学结构式为：
制备方法是：以亚乎奴莲药材30.5～50.7kg为原料，体积以2～5倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92～95℃，每次提取时间为1～1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状的乙醇提取物，乙醇提取物混悬于4.8～9L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次4.8～9L，时间为3～5小时，回收溶剂，得到石油醚萃取部位、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100︰0、100︰1、100︰3、100︰5、100︰10、100︰30、100︰50、1︰1、1︰2的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用6.7～9.3L洗脱液，流速为10～15mL/min，每670～930mL体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～30、流份31～50、流份51～60、流份61～70、流份71～90，得到组份Fr.1～Fr.5；组份Fr.4经MCI柱色谱，经体积比甲醇-水溶液10︰90、30︰70、40︰60、70︰30、80︰20梯度洗脱，每一梯度用300～500mL洗脱液，流速为20～35mL/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份Fr.4-1、Fr.4-2、Fr.4-3、Fr.4-4、Fr.4-5；亚组份Fr.4-4经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10︰1、8︰1、5︰1、3︰1、2︰1、1︰1、1︰2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用24mL～40mL洗脱液，流速为2～5mL/min，每24～40mL体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～2、流份3、流份4、流份5～7，得到组份Fr.4-4-1～Fr.4-4-4；将组份Fr.4-4-4经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为10～15mL/h，每10～17mL为一流份、收集20个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比7︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3～5、流份6～17、流份18～20，得到3个亚组份Fr.4-4-4-1、Fr.4-4-4-2、Fr.4-4-4-3；将亚组份Fr.4-4-4-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为60︰40的乙腈-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为6mL/min，收集保留时间为48min的色谱峰，回收溶剂，即得亚乎奴甾G。
2.根据权利要求1所述的多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法，其特征在于，以亚乎奴莲药材50.7kg为原料，以180L、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状的乙醇提取物，乙醇提取物混悬于9L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次9L，时间为5小时，回收溶剂，得到石油醚萃取部位、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100︰0、100︰1、100︰3、100︰5、100︰10、100︰30、100︰50、1︰1、1︰2的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用9.3L洗脱液，流速为15mL/min，每930mL体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～30、流份31～50、流份51～60、流份61～70、流份71～90，得到组份Fr.1～Fr.5；组份Fr.4经MCI柱色谱，经体积比甲醇-水溶液10︰90、30︰70、40︰60、70︰30、80︰20梯度洗脱，每一梯度用500mL洗脱液，流速为35mL/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份Fr.4-1、Fr.4-2、Fr.4-3、Fr.4-4、Fr.4-5；亚组份Fr.4-4经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10︰1、8︰1、5︰1、3︰1、2︰1、1︰1、1︰2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用40mL洗脱液，流速为5mL/min，每40mL体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～2、流份3、流份4、流份5～7，得到组份Fr.4-4-1～Fr.4-4-4；将组份Fr.4-4-4经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为15mL/h，每17mL为一流份、收集20个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比7︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3～5、流份6～17、流份18～20，得到3个亚组份Fr.4-4-4-1、Fr.4-4-4-2、Fr.4-4-4-3；将亚组份Fr.4-4-4-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为60︰40的乙腈-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为6mL/min，收集保留时间为48min的色谱峰，回收溶剂，即得亚乎奴甾G。
3.根据权利要求1所述的多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法，其特征在于，以亚乎奴莲药材30.5kg为原料，以91L、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状的乙醇提取物1.6kg，乙醇提取物混悬于4.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次4.8L，时间为3小时，回收溶剂，得到石油醚萃取部位、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100︰0、100︰1、100︰3、100︰5、100︰10、100︰30、100︰50、1︰1、1︰2的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用6.7L洗脱液，流速为10mL/min，每670mL体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～30、流份31～50、流份51～60、流份61～70、流份71～90，得到组份Fr.1～Fr.5；组份Fr.4经MCI柱色谱，经体积比甲醇-水溶液10︰90、30︰70、40︰60、70︰30、80︰20梯度洗脱，每一梯度用300mL洗脱液，流速为20mL/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份Fr.4-1、Fr.4-2、Fr.4-3、Fr.4-4、Fr.4-5；亚组份Fr.4-4经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10︰1、8︰1、5︰1、3︰1、2︰1、1︰1、1︰2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用24mLmL洗脱液，流速为2mL/min，每24mL体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～2、流份3、流份4、流份5～7，得到组份Fr.4-4-1～Fr.4-4-4；将组份Fr.4-4-4经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为10mL/h，每10mL为一流份、收集20个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比7︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3～5、流份6～17、流份18～20，得到3个亚组份Fr.4-4-4-1、Fr.4-4-4-2、Fr.4-4-4-3；将亚组份Fr.4-4-4-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为60︰40的乙腈-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为6mL/min，收集保留时间为48min的色谱峰，回收溶剂，即得亚乎奴甾G。
4.根据权利要求1所述的多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法，其特征在于，以亚乎奴莲药材40.5kg为原料，以121.5L、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为94℃，每次提取时间为1.2小时，减压回收乙醇，得浸膏状的乙醇提取物，乙醇提取物混悬于6.9L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次6.9L，时间为4小时，回收溶剂，得到石油醚萃取部位、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100︰0、100︰1、100︰3、100︰5、100︰10、100︰30、100︰50、1︰1、1︰2的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用8L洗脱液，流速为13mL/min，每80mL体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～30、流份31～50、流份51～60、流份61～70、流份71～90，得到组份Fr.1～Fr.5；组份Fr.4经MCI柱色谱，经体积比甲醇-水溶液10︰90、30︰70、40︰60、70︰30、80︰20梯度洗脱，每一梯度用400mL洗脱液，流速为30mL/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份Fr.4-1、Fr.4-2、Fr.4-3、Fr.4-4、Fr.4-5；亚组份Fr.4-4经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10︰1、8︰1、5︰1、3︰1、2︰1、1︰1、1︰2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用30mL洗脱液，流速为4mL/min，每30mL体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～2、流份3、流份4、流份5～7，得到组份Fr.4-4-1～Fr.4-4-4；将组份Fr.4-4-4经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为13mL/h，每16mL为一流份、收集20个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比7︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3～5、流份6～17、流份18～20，得到3个亚组份Fr.4-4-4-1、Fr.4-4-4-2、Fr.4-4-4-3；将亚组份Fr.4-4-4-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为60︰40的乙腈-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为6mL/min，收集保留时间为48min的色谱峰，回收溶剂，即得亚乎奴甾G。
5.根据权利要求1所述的多氧孕甾烷类化合物亚乎奴甾G的制备方法，其特征在于，以亚乎奴莲药材35.8kg为原料，以143.2L、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为93℃，每次提取时间为1.3小时，减压回收乙醇，得浸膏状的乙醇提取物，乙醇提取物混悬于5.7L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次5.7L，时间为4小时，回收溶剂，得到石油醚萃取部位、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100︰0、100︰1、100︰3、100︰5、100︰10、100︰30、100︰50、1︰1、1︰2的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用7.5L洗脱液，流速为11mL/min，每750mL体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～30、流份31～50、流份51～60、流份61～70、流份71～90，得到组份Fr.1～Fr.5；组份Fr.4经MCI柱色谱，经体积比甲醇-水溶液10︰90、30︰70、40︰60、70︰30、80︰20梯度洗脱，每一梯度用350mL洗脱液，流速为25mL/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份Fr.4-1、Fr.4-2、Fr.4-3、Fr.4-4、Fr.4-5；亚组份Fr.4-4经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10︰1、8︰1、5︰1、3︰1、2︰1、1︰1、1︰2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用29mL洗脱液，流速为3mL/min，每29mL体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比10︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1～2、流份3、流份4、流份5～7，得到组份Fr.4-4-1～Fr.4-4-4；将组份Fr.4-4-4经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为11mL/h，每15mL为一流份、收集20个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比7︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3～5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份3～5、流份6～17、流份18～20，得到3个亚组份Fr.4-4-4-1、Fr.4-4-4-2、Fr.4-4-4-3；将亚组份Fr.4-4-4-2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为60︰40的乙腈-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为6mL/min，收集保留时间为48min的色谱峰，回收溶剂，即得亚乎奴甾G。
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