CN101104611A - 一种3-甲氧基黄酮类化合物,其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种3－甲氧基黄酮类化合物，包括5，7－二羟基－8－(3，3－二甲基烯丙基)－3，3′，4′－三甲氧基黄酮和5，7－二羟基－8－(3，3－二甲基烯丙基)－3，4′－二甲氧基黄酮。药理试验效果证明：该3－甲氧基黄酮类化合物是有效的脂肪酸合成酶抑制剂；对多种类型肿瘤细胞株的细胞毒性试验显示有广谱的抗肿瘤作用；应用人肿瘤移植裸鼠模型试验对人前列腺癌细胞LnCAP，人乳腺癌细胞ZR－75－1，人肺癌细胞NCI－H23或人结肠癌细胞HCT－116有强烈的抑制肿瘤生长作用，且该3－甲氧基黄酮类化合物对小鼠的急性毒性试验显示无毒性，因此可用于作为抗肿瘤药物，是一种具有很大开发前景的广谱抗肿瘤新药。

Description

一种3-甲氧基黄酮类化合物，其制备方法和应用
技术领域
本发明述及多甲氧基黄酮类化合物，具体是关于一种3-甲氧基黄酮类化合物，其制备方法和应用。
背景技术
3-甲氧基黄酮类化合物属于从柑桔属植物中分离出来的多甲氧基黄酮化合物(PMFs)，由于其具有包括抗炎、抗癌和抗动脉粥样硬化等广谱的生物学活性，一直受到特别的关注(Li S et al.，J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci，2007，846(1-2)：291-297；Li S et al.，J AgricFood Chem，2006，54(12)：4176-4185；Kim DK et al.，Arch PharmRes，1999，22(6)：642-645.)。因此，人们探索从甜桔皮中分离、鉴定PMFs特性，使桔皮桔汁加工的副产品得到新的应用的兴趣在不断增高。
关于3-甲氧基黄酮类化合物在文献上的报道还有例如：从桔子汁的乙酸乙酯提取物中分离得3，3′，4′，5，6，7，8-七甲氧基黄酮(一种3-甲氧基黄酮)，以浓度依赖性方式显著增强阿霉素抵抗的人髓细胞性白血病细胞摄取[3H]长春新碱。数据显示，3，3′，4′，5，6，7，8-七甲氧基黄酮抑制P-糖蛋白介导的[3H]长春新碱的输出，导致化疗药物在细胞内积聚。这一化合物有望成为肿瘤化疗中一个候选的多药耐药性逆转剂(Ikegawa T et al.，Cancer Lett，2000，160(1)：21-28.)。
从药用植物中分离的多聚甲基化黄酮和C-糖基化衍生物，它们对大鼠肝微体中FeSO4+半胱氨酸引起的脂类氧化的影响都已得到研究，其中栀子素D是非酶促脂类过氧化的抑制剂。
从Varthemia(Varthemia iphionoides Boiss)地上部分分离、鉴别得到七种3-甲氧基黄酮，研究了它们的基团清除活性、抗氧化活性和猪胰腺α-淀粉酶抑制活性(Al-Dabbas MM et al.，Biosci BiotechnolBiochem，2006，70(9)：2178-2184)。在3-甲氧基黄酮中，5，7，4′-三羟基-3，6-二甲氧基黄酮，5，7，4′-三羟基-3，3′-二甲基黄酮和5，4′-二羟基-3，7，3′-三甲基黄酮显示了显著的基团清除活性。5，7，4′-三羟基-3，6-二甲氧基黄酮，5，7，4′-三羟基-3，3′-二甲氧基黄酮和5，4′-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮具有亚油酸体系中的抗氧化活性。5，7，4′-二羟基-3，6-二甲氧基黄酮，5，7，4′-三羟基-3，3′-二甲氧基黄酮和5，4′-二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮，5，7，4′-三羟基-3-甲氧基黄酮和5，4′-二羟基-3，7-二甲氧基黄酮则表现出很高的猪胰腺α-淀粉酶抑制活性。
Sergeev的研究显示(Sergeev IN et al.，Life Sci，2006，23；80(3)：245-253.)，来源于甜桔的5-羟基-3，6，7，8，3′，4′-六甲氧基黄酮(5-OH-HxMF)和3′-羟基-5，6，7，4′-四甲氧基黄酮(3′-OH-TtMF)通过钙离子依赖性细胞凋亡机制抑制人乳腺癌细胞(MCF-7)生长。这些结果强烈提示，PMFs的细胞Ca2+调节活性是其细胞凋亡机制的基础，PMFs的羟基化对于它们能诱导Ca2+增加，进而活化钙离子依赖的细胞凋亡蛋白酶至关重要。
为了更广泛地对PMFs进行研究，除了前述的从柑桔或其它植物中分离鉴定外，采用合成方法进行新的PMFs的合成，也是一个新的科研工作方向。
发明内容
本发明提供一种新的3-甲氧基黄酮类化合物，其制备方法和应用。
一种3-甲氧基黄酮类化合物的化学结构通式如下：
Figure A20071004028600061
R＝OMe或H
R＝OMe时，化合物A为5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，3′，4′-三甲氧基黄酮；
R＝H时，化合物B为5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，4′-二甲氧基黄酮。
化合物A 5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，3′，4′-三甲氧基黄酮的制备方法，包括下列4个步骤，是参见文献(Daskiewicz JB et al.，J Med Chem.，2005 Apr.21；48(8)：2790-2804.)制备，对其中第(4)步中的反应加热温度和时间作了改进，制得本发明的新化合物A。
(1)3，4-二甲氧基苯甲酸和甲磺酰氯在室温下反应2小时，制得3，4-二甲氧基苯甲酸酐；
(2)2′，4′，6′-三羟基-2-甲氧基苯乙酮和3，4，-二甲氧基苯甲酸酐在三乙胺中40℃下反应4小时，再在KOH/MeOH中40℃下反应2小时，得到5，7-二羟基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮粗产物，在己烷和丙酮的混合溶剂中重结晶，得纯产品5，7-二羟基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮；
(3)5，7-二羟基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮，异戊二烯溴化物和含无水K2CO3的丙酮溶液在室温下反应5小时，过滤，滤液蒸发得的固体物，在甲醇中重结晶得5-羟基-7-异戊烯氧基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮；
(4)5-羟基-7-异戊烯氧基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮和含无水醋酸钠的乙酸酐溶液改进在40-80℃反应30-60小时(文献报道是在室温下反应8小时)，用氯仿萃取反应物，萃取液浓缩蒸发得固体物，在KOH/甲醇溶液中改进于50-70℃下搅拌2-6小时(文献报道是在室温下搅拌0.5-1小时)，所得溶液经乙酸乙酯酸化萃取后，在己烷和丙酮的混合液中析出结晶，得纯产物5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，3′，4′-三甲氧基黄酮(文献报道的产物是5，7-二羟基-8-(1，1二甲基烯丙基)-3，3′，4′-三甲氧基黄酮)。
化合物B 5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，4′-二甲氧基黄酮的制备方法，包括下列4个步骤，是参见文献(Daskiewicz JB et al.，JMed Chem.，2005 Apr.21；48(8)：2790-2804.)制备，对其中第(4)步中的反应加热温度和时间作了改进，制得本发明的新化合物B。
(1)对甲氧基苯甲酸和甲磺酰氯在室温下反应2小时，制得对甲氧基苯甲酸酐；
(2)2′，4′，6′-三羟基-2-甲氧基苯乙酮和对甲氧基苯甲酸酐在三乙胺中40℃下反应4小时，再在KOH/MeOH中40℃下反应2小时，制得麦角新碱；
(3)麦角新碱，异戊二烯溴化物和含无水K2CO3的丙酮溶液在室温下反应5小时，过滤，滤液蒸发得的固体物，在甲醇中重结晶得5-羟基-7-异戊烯氧基-3，4′-二甲氧基黄酮；
(4)5-羟基-7-异戊酰氧基-3，4′-二甲氧基黄酮和含无水醋酸钠的乙酸酐溶液改进在40-80℃反应30-60小时(文献报道是在室温下反应8小时)，用氯仿萃取反应物，萃取液浓缩蒸发得固体物，在KOH/甲醇溶液中改进于50-70℃下搅拌2-6小时(文献报道是在室温下搅拌0.5-1小时)，所得溶液经乙酸乙酯酸化萃取后，在己烷和丙酮的混合液中析出结晶，得纯产物5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，4′-二甲氧基黄酮(文献报道的产物是5，7-二羟基-8-(1，1-二甲基烯丙基)-3，4′-二甲氧基黄酮)。
本发明化合物A[5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，3′，4′-三甲氧基黄酮]和化合物B[5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，4′-二甲氧基黄酮]是在已有文献的基础上将反应加热温度提高和反应时间延长而制得的二个新化合物。与已有文献上制得的上述二个化合物相比较，本发明人作了更深入的研究和试验，证实本发明化合物A和化合物B的药理性能更强。通过试验证明化合物A和化合物B都是有效的脂肪酸合成酶(FAS)抑制剂，能广泛抑制多种类型的人肿瘤细胞系生长，并进一步诱导肿瘤细胞凋亡。在人肿瘤异种移植模型试验中，化合物A或化合物B被证明是一种有效的抗肿瘤剂，能强烈抑制人肺癌、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌等癌细胞在体内生长。化合物A和化合物B都具有被开发成为新的广谱抗肿瘤药物的巨大潜力。
本发明3-甲氧基黄酮类化合物的药理试验
1.体外试验
a)化合物A或化合物B对肿瘤细胞脂肪生成的抑制活性为了证实化合物A或化合物B抑制脂肪生成的能力，用不同浓度的化合物A或化合物B处理LnCAP前列腺癌细胞5小时，定量检测细胞脂质中2-14C标记醋酸盐的掺入量。如图1和图2所示，化合物A在0.1μM和化合物B在0.3μM浓度时抑制脂肪生成率超过50％。更高浓度则进一步减少脂肪生成，并呈现浓度依赖方式。处理24小时后则进一步降低。
b)化合物A或化合物B通过抑制脂肪酸合成酶(FAS)活性以降低肿瘤细胞中脂肪合成
为证实化合物A或化合物B是一个FAS抑制剂，用不同浓度的化合物A或化合物B处理LnCAP细胞蛋白提取物，定量检测脂肪酸中2-14C标记丙二酸单酰-CoA掺入量。如图3和图4所示，化合物A在0.1μM和化合物B在0.3μM浓度时降低体外脂肪酸合成酶活性50％以下。Western Blot分析显示，化合物A或化合物B不影响LnCAP细胞中FAS蛋白水平，由此可知，抑制脂类合成是抑制FAS酶活性的直接结果，而不是FAS表达减少的结果。
c)使用人肿瘤细胞株进行细胞毒性试验
33株人肿瘤细胞株在含化合物A或化合物B的普通培养基中培养。3天后应用MTT测定细胞生存力。结果如表1所示，大多数人肿瘤细胞对化合物A或化合物B敏感。并且发现，大多数人肿瘤细胞对化合物A或化合物B都较敏感，而化合物A比化合物B的作用更强。但是，正常人乳腺上皮细胞(MCF10A)和正常小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)对这两个化合物不敏感。两种化合物浓度为50μM时这些细胞仍能正常成长。体外细胞毒性试验证明化合物A或化合物B能广泛抑制人肿瘤细胞株生长，但不抑制正常细胞株生长。
2.应用人肿瘤移植裸鼠模型进行化合物A或化合物B的抗肿瘤有
效性试验
在化合物A或化合物B对肿瘤细胞株的体外抗增殖作用的基础上，应用人前列腺癌细胞(LnCAP)、人乳腺癌细胞(ZR-75-1)、人肺癌细胞(NCI-H23)或人结肠癌细胞(HCT-116)的皮下移植裸鼠模型评价化合物A或化合物B的抗肿瘤效果。化合物A在T/C值为14.2％，0％，31％和20％时分别强烈抑制LnCAP，ZR-75-1，NCI-H23和HCT-116肿瘤细胞生长(见图5，7，9，11)。化合物B在T/C值为17.5％，60％，50％和30％时分别强烈抑制LnCAP，ZR-75-1，NCI-H23和HCT-116肿瘤细胞生长(见图6，8，10，12)。同时未发现化合物A或化合物B给药的动物产生任何明显的副作用，包括体重减轻等。这些数据明显显示，化合物A或化合物B是可被开发为新的抗癌药物的很好的候选物。
化合物A或化合物B给药后对小鼠的急性毒性试验
受试小鼠处死后进行病理分析，结果显示，以单次剂量1000mg/kg和多次剂量200mg/kg(Q2D×15)给予化合物A或化合物B均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。
由以上药理试验的效果证明，本发明3-甲氧基黄酮类化合物化合物A[5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，3′，4′-三甲氧基黄酮]或化合物B[5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，4′-二甲氧基黄酮]是有效的脂肪酸合成酶抑制剂；多种类型肿瘤细胞株的细胞毒性试验结果显示有广谱的抗肿瘤作用；应用人肿瘤移植裸鼠模型试验，化合物A或化合物B显示出对人前列腺癌细胞LnCAP，人乳腺癌细胞ZR-75-1，人肺癌细胞NCI-H23或人结肠癌细胞HCT-116有强烈的抑制肿瘤生长的作用，证明是一种有效的抗肿瘤剂。同时未显示给药的动物有任何明显的副作用，包括体重减轻等。化合物A或化合物B对小鼠的急性毒性试验结果也显示未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。本发明3-甲氧基黄酮类化合物可应用于抗肿瘤药物的制备，化合物A或化合物B可作为抗肿瘤药物的有效成分，该抗肿瘤药物中也可含有有效量的化合物A或化合物B及可药用载体和/或赋形剂。本发明3-甲氧基黄酮类化合物是一种具有很大开发前景的广谱抗肿瘤药物。
口服有效剂量推荐为每日750mg/体表面积M2，连续三周，休息一周为一疗程，每日一次于早餐后半小时服用。具体病例可由医师根据病情调整。
表1化合物A或化合物B体外抑制人肿瘤细胞生长
人肿瘤细胞株 细胞类型 化合物A半数致死量(μM) 化合物B半数致死量(μM)
    LnCAP  前列腺     1.02     3.5
    D145  前列腺     1.86     5.1
    PC3  前列腺     1.88     5.3
    HCT-116  结肠     1.28     3.5
    Widr  结肠     2.12     6.6
    HT29  结肠     3.06     8.4
    LoCo  结肠     2.06     5.3
    CCL-225  结肠     1.76     4.5
    CCL-247  结肠     3.3     8.9
    NCI-H23  肺     1.2     3.4
    A549  肺     2.12     5.4
    MDA-MB-231  乳腺     1.06     3.3
    MDA-MB-435  乳腺     2.04     6.4
    AU-565  乳腺     1.52     4.5
    BT-549  乳腺     1.6     5
    MCF-7  乳腺     3.72     12.4
    Caki-1  肾     1.4     3.7
    ACHN  肾     1.9     4.9
    786-O  肾     2     5.5
    SN12C  肾     3.3     7.9
    SKOV3  卵巢     1.96     5.2
    IGROV1  卵巢     2.18     5.6
    Mid PaCa-2  胰腺     1.74     4.3
    U-251  恶性胶质瘤     1.42     3.7
    SK-MEL-5  皮肤     1.98     5.4
    G-361  皮肤     1.38     3.7
    MCF-10a  正常乳腺上皮细胞     ＞50     ＞50
    SGC-7901  胃     4.4     5.2
    EC109  食管     5.3     7.6
    CNE-2Z  鼻咽     6.8     7.9
    Raji  淋巴瘤     1.1     2.7
    Jurkat  白血病T细胞     1.02     2.45
    MEF  正常小鼠成纤维细胞     ＞50     ＞50
附图说明
图1是化合物A抑制人前列腺癌细胞LnCAP脂肪生成-浓度曲线图。
图2是化合物B抑制人前列腺癌细胞LnCAP脂肪生成-浓度曲线图。
图3是化合物A抑制人前列腺癌细胞LnCAP脂肪酸合成酶活性-浓度曲线图。
图4是化合物B抑制人前列腺癌细胞LnCAP脂肪酸合成酶活性-浓度曲线图。
图5是化合物A治疗小鼠皮下接种人前列腺癌细胞LnCAP肿瘤的肿瘤体积-治疗天数曲线图。
图6是化合物B治疗小鼠皮下接种人前列腺癌细胞LnCAP肿瘤的肿瘤体积-治疗天数曲线图。
图7是化合物A治疗小鼠皮下接种人乳腺癌细胞ZR-75-1肿瘤的肿瘤体积-治疗天数曲线图。
图8是化合物B治疗小鼠皮下接种人乳腺癌细胞ZR-75-1肿瘤的肿瘤体积-治疗天数曲线图。
图9是化合物A治疗小鼠皮下接种人肺癌细胞NCI-H23肿瘤的肿瘤体积-治疗天数曲线图。
图10是化合物B治疗小鼠皮下接种人肺癌细胞NCI-H23肿瘤的肿瘤体积-治疗天数曲线图。
图11是化合物A治疗小鼠皮下接种人结肠癌细胞HCT-116肿瘤的肿瘤体积-治疗天数曲线图。
图12是化合物B治疗小鼠皮下接种人结肠癌细胞HCT-116肿瘤的肿瘤体积-治疗天数曲线图。
具体实施方式
实施例1  化合物A 5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，3′，4′-三甲氧基黄酮的制备
(1)10g(55mmol)3，4-二甲氧基苯甲酸和2.2ml(28.4mmol)甲磺酰氯在室温下反应2小时，制得8.47g 3，4-二甲氧基苯甲酸酐，产率为89％。
(2)1.6g(8.1mmol)2′，4′，6′-三羟基-2-甲氧基苯乙酮和8.4g(21.0mmol)3，4-二甲氧基苯甲酸酐在100ml Et3N中40℃下反应4小时，再在100ml含5％KOH甲醇溶液中40℃下反应2小时，得到2.2g 5，7-二羟基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮粗产物，产率74％。在己烷∶Me2CO(50∶50，V/V)混合液中重结晶，得0.85g纯的5，7-二羟基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮。
(3)0.34g(0.98mmol)5，7-二羟基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮，0.25ml(1.97mmol)异戊二烯溴化物和含0.4g无水K2CO3(2.0mmol)的50ml丙酮溶液在室温下反应5小时。过滤，滤液蒸发后得的固体物，在甲醇中重结晶得0.3g 5-羟基-7-异戊烯氧基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮，产率为74％。
(4)0.3g(0.73mmol)5-羟基-7-异戊烯氧基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮和含0.12g(73mmol)无水醋酸钠的20ml(36.5mmol)乙酸酐溶液在60℃下反应48小时。用100ml氯仿萃取反应物，萃取液浓缩蒸发得固体物，在70ml含5％KOH甲醇溶液中于60℃下搅拌4小时。所得溶液经300ml乙酸乙醋酸化(pH＝4)萃取后，在己烷∶丙酮(50∶50)混合液中析出结晶，得0.183g纯产物5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，3′，4′-三甲氧基黄酮，产率为60％。该化合物A产物为黄色粉末，mp为216℃。
化合物A的1H NMR，13C NMR和质谱如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.68(s，6H，H4″+H5″)，3.82(s，3H，3OMe)，3.94(s，3H，3′OMe)，3.97(s，3H，4′OMe)，5.39(d，1H，J＝10.7Hz，H3″)，5.46(d，1H，J＝17.7Hz，H3″)，6.29(s，1H，H6)，6.46dd，1H，J＝17.7和10.7Hz，H2″)，7.00(d，1H，J＝8.7Hz，H5′)，7.25(s，1H，7OH)，7.53(d，1H，J＝2.1Hz，H2′)，7.63(dd，1H，J＝8.7和2.1Hz，H6′)，13.03(s，1H，5OH)；
13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ28.06(C4″+C5″)，40.64(C1″)，55.97(3′OMe)，55.98(4′OMe)，60.29(3-OMe)，101.17(C6)，106.95(C10)，109.70(C8)，110.84(C5′)，111.54(C2′)，113.68(C3″)，122.53(C6′)，122.74(C1′)，138.65(C3)，148.69(C3′)，148.96(C2″)，151.08(C4′)，155.27(C9)，156.54(C2)，60.54(C5)，161.48(C7)，179.07(C4)。
化学电离质谱(CI-MS)显示：m/e 413[M+H]+，提示化合物A分子量应为412，分子式为C23H24O7。
实施例2化合物B 5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，4′-二甲氧基黄酮的制备
(1)10g(65.7mmol)对甲氧基苯甲酸和2.6ml(33.6mmol)甲磺酰氯在室温下反应2小时得6.13g对甲氧基苯甲酸酐，产率89％。
(2)0.6g(3mmol)2′，4′，6′-三羟基-2-甲氧基苯乙酮和2.6g(9mmol)对甲氧基苯甲酸酐在100ml Et3N中40℃下反应4小时，再在100ml含5％KOH甲醇溶液中40℃下反应2小时。得到0.763g麦角新碱，产率81％。
(3)0.30g(0.95mmol)麦角新碱，0.2ml(1.73mmol)异戊二烯基溴化物和0.4g无水K2CO3(2.0mmol)的50ml丙酮溶液在室温下反应5小时。过滤，滤液蒸发后得的固体物，在甲醇中重结晶，得0.33g 5-羟基-7-异戊烯氧基-3，4’-二甲氧基黄酮，产率91％。
(4)0.28g(0.73mmol)5-羟基-7-异戊烯氧基-3，4’-二甲氧基黄酮和含0.12g(73mmol)无水醋酸钠的20ml(36.5mmol)醋酸酐溶液在60℃下反应48小时。用100ml氯仿萃取反应物，萃取液浓缩蒸发得固体物，在70ml含5％KOH甲醇溶液中于60℃下搅拌4小时。所得溶液经300ml乙酸乙酯酸化(pH＝4)萃取后，在己烷∶丙酮(50∶50，V/V)混合液中析出结晶，得0.21g纯产物5，7-二羟基8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，4′-二甲氧基黄酮，产率71％。该化合物B产物为黄色粉末，mp为212℃。
化合物B的1H NMR，13C NMR和质谱如下：
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)：δ1.55(s，6H，1″Me)，3.75(s，3H，3OMe)，3.84(s，3H，4′OMe)，4.77(dd，1H，J＝10.5和1.1Hz，H3″)，4.80(dd，1H，J＝17.5和1.1Hz，H3″)，6.27(dd，1H，J＝17.5和0.5Hz，H2″)，6.30(s1H，H6)，7.10(d，2H，J＝9.0Hz，H3′+H5′)，7.91(d，2H，J＝9.0Hz，H2′+H6′)，10.52(brs，1H，7OH)，13.00s，1H，5OH)；
13C NMR(50MHz，DMSO-d6)：δ29.54(1″Me)，40.34(C1″)，5.25(4′OMe)，59.66(3-OMe)，99.60(C6)，105.02(C10)，108.36 C3″)，10.75(C8)，113.80(C3′+C5′)，121.95(C1′)，130.33(C2′+C6′)，137.42(C3)，149.66(C2″)，154.75(C2)，156.07(C9)，58.98(C5)，61.03(C4′)，162.89(C7)，178.13(C4)。
化学电离质谱(CI-MS)显示m/e 383[M+H]+，提示化合物B分子量应为382，分子式为C22H22O6。
实施例3用[2-14C]醋酸盐掺入法测定化合物A或化合物B对LnCAP细胞脂肪生成的抑制能力
用不同浓度的化合物A或化合物B处理人前列腺癌细胞LnCAP 5小时或24小时，在LnCAP细胞培养液中加入2-14C标记的醋酸盐，孵育4小时，收集培养液和细胞，离心，0.8ml PBS重悬。应用Bligh Dyer法(Swinnen J.V. et al.，Endocrinology，1996，137，4468-4474.)抽提脂质，应用闪烁计数法定量掺入细胞脂质的[2-14C]醋酸盐，所得结果以样本蛋白含量校正。化合物A或化合物B抑制人前列腺癌细胞LnCAP脂肪生成-浓度曲线图见图1和图2。
实施例4化合物A或化合物B对人前列腺癌细胞LnCAP的脂肪酸合成酶活性抑制的测定
按文献(Brusselmans K et al.，J Biol Chem，2005，280(7)：5636-5645.)报道的方法测定LnCAP细胞提取物脂肪酸合成酶活性。收集LnCAP细胞，离心，低渗缓冲液(1mM EDTA，20mM Tris-HCl，pH 7.5)重悬；随后应用BCA法测定样品蛋白质含量。预先在含不同浓度的化合物A或化合物B(0.01-10μM)的2.5ml磷酸钾盐缓冲液(100mM，pH 7.0)中37℃孵育相同量的蛋白质(50μg)30分钟。然后加入20μl反应混和液(2.5 mM NADPH，1.25mM乙酰-CoA，1.25mM丙二酸单酰-CoA和0.02mM[2-14C]丙二酸单酰-CoA(60mCi/mmol；Perkin Elmer LifeSciences)，样品在37℃中孵育15分钟。加入3ml预冷的1M HCl/甲醇(6∶4，V/V)终止反应，石油醚萃取脂肪酸，闪烁计数法分析掺入的[2-14C]丙二酸单酰-CoA。结果如图3和图4所示。
实施例5细胞毒性试验(参见Carmichael J et al.，CancerResearch，1987，47：943-946.)
应用人肿瘤细胞株进行化合物A或化合物B(溶解于DMSO)的细胞毒性试验。人肿瘤细胞株购自ATCC(美国细胞菌种库)和NCI(美国国立癌症研究所)，在10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养液中，置于5％CO2的37℃孵箱中培养。细胞生长汇合后作毒性分析，胰蛋白酶消化细胞后用培养液洗涤，然后计数。96孔板每孔中加入3000-6000个细胞孵育16-24小时，再加入不同浓度的化合物A或化合物B。继续培养72小时后，对药物处理的细胞和对照细胞进行MTT(四氮唑蓝)试验。结果见表1。
实施例6应用人肿瘤异种移植裸鼠模型进行化合物A或化合物B的抗肿瘤有效性试验
(1)建立人肿瘤异种移植裸鼠模型(参见Harrison SD Jr；et al.，J NatlCancer Inst，1991，83(20)：1509.)
T细胞缺陷裸小鼠(nu/nu)，6周龄，购自Charles River实验室，按照大学动物饲养和使用委员会条例，在无菌环境中饲养、处理。48只鼠肋腹部分别皮下接种5×106个悬浮于0.2 ml HBSS/基质胶(50∶50，V/V)中的乳腺癌细胞ZR-75-1、前列腺癌细胞LnCAP、人肺癌细胞NCI-H23和人结肠癌细胞HCT-116。当肿瘤平均直径长至7-8mm，肿瘤体积约在100-200mm3大小时，24只鼠被分成治疗组(16只/2组)，按50mg/kg和100mg/kg化合物A或化合物B(溶解在15％Captisol，Captisol是美国CyDex公司生产)给药，对照组(8只)只接受赋形剂(15％Captisol)。
为保证化合物A或化合物B治疗组和对照组在处理开始时肿瘤大小的分布基本相同，小鼠被分成三类：小体积肿瘤(＜4mm)、中等体积肿瘤(4-8mm)和大体积肿瘤(＞8mm)。将每一类中相同数目的小鼠分别分在对照组和化合物A或化合物B治疗组中。
(2)裸小鼠肿瘤移植模型的给药
肿瘤移植裸鼠的化合物A或化合物B给药方案：口服给药，化合物A或化合物B溶解在15％Captisol。每日给予200μl含1.25mg或2.5mg化合物A或化合物B(15％Captisol)的药液，每周5天，连续3周，或200μl赋形剂(15％captisol)3周(对照组)。两组动物分开饲养，自由进食。
(3)抗肿瘤效果的评价
每3或4天测量肿瘤大小，采用下面的公式计算肿瘤体积：
V＝(a2×b)/2
其中a代表宽(较小的直径)，b代表长(较长的直径)。每个瘤体的相对肿瘤体积(RTV)定义为给定时间点的肿瘤体积与治疗开始时的体积的比率。每个治疗组计算平均RTV和SE。应用下面的公式计算肿瘤生长抑制值确定抗肿瘤活性。
TGI(％)＝T/C×100
其中T代表实验结束点(4周)治疗组肿瘤的平均RTV，C代表对照组的平均RTV。采用国立癌症研究所制定的抗肿瘤活性最低水平(T/C≤42％)标准。实验结束后切除瘤体并在甲醛中固定，进行组织学观察。试验结果见图5-图12。
实施例7化合物A或化合物B给药后对小鼠的急性毒性试验
取两组8周龄的BALB/c小鼠，每组10只(5只雄性和5只雌性)，分别以单次剂量1000mg/kg和多次剂量200mg/kg(Q2D×7)给予化合物A或化合物B(用15％Captisol配制)，然后分别观察2周。每两天称体重。试验结束后，将受试小鼠处死，进行病理分析。结果显示，以单次剂量1000mg/kg和多次剂量200mg/kg(Q2D×15)给予化合物A或化合物B，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。

Claims (4)

1.一种3-甲氧基黄酮类化合物，其特征在于是具有下述化学结构通式的化合物：
其中R＝OMe或H。
2.5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，3′，4′-三甲氧基黄酮的制备方法，包括4个步骤：(1)3，4-二甲氧基苯甲酸和甲磺酰氯反应制得3，4-二甲氧基苯甲酸酐；(2)2′，4′，6′-三羟基-2-甲氧基苯乙酮和3，4，-二甲氧基苯甲酸酐反应制得5，7-二羟基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮；(3)5，7-二羟基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮，异戊二烯溴化物和含碳酸钾的丙酮溶液一起反应制得5-羟基-7-异戊烯氧基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮；(4)5-羟基-7-异戊烯氧基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮和含无水醋酸钠的乙酸酐溶液在室温反应8小时，用氯仿萃取反应物，萃取液浓缩蒸发得固体物，在KOH/甲醇溶液中于室温下搅拌0.5-1小时，所得溶液经乙酸乙酯酸化萃取后，在己烷和丙酮的混合液中析出结晶，其特征在于在第(4)步中：5-羟基-7-异戊烯氧基-3，3′，4′-三甲氧基黄酮和含无水醋酸钠的乙酸酐溶液在40-80℃反应30-60小时，氯仿萃取液浓缩蒸发得的固体物在KOH/甲醇溶液中于50-70℃下搅拌2-6小时，最后在己烷和丙酮的混合液中析出结晶，得产物5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，3′，4′-三甲氧基黄酮。
3.5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，4′-二甲氧基黄酮的制备方法，包括4个步骤：(1)对甲氧基苯甲酸和甲磺酰氯反应制得对甲氧基苯甲酸酐；(2)2′，4′，6′-三羟基-2-甲氧基苯乙酮和对甲氧基苯甲酸酐反应制得麦角新碱；(3)麦角新碱，异戊二烯溴化物和含碳酸钾的丙酮溶液一起反应制得5-羟基-7-异戊烯氧基-3，4′-二甲氧基黄酮，(4)5-羟基-7-异戊酰氧基-3，4′-二甲氧基黄酮和含无水醋酸钠的乙酸酐溶液在室温反应8小时，用氯仿萃取反应物，萃取液浓缩蒸发得固体物，在KOH/甲醇溶液中于室温下搅拌0.5-1小时，所得溶液经乙酸乙酯酸化萃取后，在己烷和丙酮的混合液中析出结晶，其特征在于在第(4)步中：5-羟基-7-异戊酰氧基-3，4′-二甲氧基黄酮和含无水醋酸钠的乙酸酐溶液在40-80℃反应30-60小时，氯仿萃取液浓缩蒸发得的固体物在KOH/甲醇溶液中于50-70℃下搅拌2-6小时，最后在己烷和丙酮的混合液中析出结晶，得产物5，7-二羟基-8-(3，3-二甲基烯丙基)-3，4′-二甲氧基黄酮。
4.权利要求1所述3-甲氧基黄酮类化合物的应用，其特征在于所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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