KR102030207B1 - 폴리하이드록시 크로메논 화합물의 합성 및 이의 항종양 효과 - Google Patents

폴리하이드록시 크로메논 화합물의 합성 및 이의 항종양 효과 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 식 (I)로 표시되는 구조를 가지는 폴리하이드록시 벤조피란 케톤 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭 뿐만 아니라, 상기 화합물을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 화합물은 신규한 에스트로겐 수용체 ER-α36을 조절하고 제어하기 위해 사용되거나, 유방암, 백혈병 및 간암과 같은 ER-α36 수용체-매개된 종양 관련 질환을 예방하거나/하고 치료하기 위해 사용된다.
[식 (I)]

Description

폴리하이드록시 크로메논 화합물의 합성 및 이의 항종양 효과{Synthesis of Polyhydroxy Chromenone Compounds and Their Anti-Tumor Effect}
본 발명은 폴리하이드록시 크로메논 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이의 프로드럭 (prodrug) 및 상기와 같은 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이의 프로드럭 및 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
에스트로겐은 인체에서 수많은 중요한 생리적 기능에 관여하는 호르몬 군이다. 에스트로겐의 기능은 여성 생식기관의 발달을 촉진하고, 임신 및 출산 후 모유 수유를 위한 유방 및 자궁을 완전히 준비하는 것을 포함한다. 에스트로겐은 또한 적절한 심혈관 기능 및 골 밀도를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 에스트로겐이 세포 증식을 자극할 수 있고, 여성이 암, 특히 유방암 및 자궁암을 앓을 위험을 증가시킬 수 있음은 잘 공지되어 있다.
에스트로겐은 표적 세포에서 에스트로겐 수용체에 결합하여 세포의 기능을 조절한다. 2가지 유형의 에스트로겐 수용체는 인간 세포 (ER), 즉 ER-α 및 ER-β에서 발견된다. 이들은 유사한 단백질 구조를 가지며, 각각은 분리되지만 상호작용하는 3개의 기능성 도메인, 즉 N-말단 도메인 (A/B 도메인), 중심 DNA-결합 도메인 (C 도메인) 및 C-말단 리간드-결합 도메인 (D/E/F 도메인)을 가진다. N-말단 도메인은 리간드-독립적 활성화 기능 (AF-1)을 가지는데, 이는 공-활성제와의 상호작용 및 리간드 부재 하의 표적 유전자의 전사 활성화에 관여하고 있다. DNA-결합 도메인은 수용체 이합체화 및 특정 DNA 서열에 대한 결합에 중요한 역할을 한다. C-말단 리간드-결합 도메인은 리간드 결합을 매개하며, 리간드의 존재 하에 유전자 전사를 활성화하기 위해 리간드-의존적 전사 활성화 기능 (AF-2)을 가진다.
전장 ER-α는 66kDa의 단백질로 확인되며, ER-α66으로 언급된다. ER-α66은 모두 3가지의 기능적 도메인을 함유한다. ER-α66의 스플라이스 (splice) 변종은 최근에 발견되었으며, ER-α46으로 명명된다. ER-α46은 약 46KDa의 분자량을 가지며, ER-α66의 N-말단 AF-1 도메인이 결핍되어 있다. 최근, 신규한 36kDa ERα 변종, 즉 ER-α36이 확인되었다. 이는 ER-α66의 N-말단 AF-1 도메인 및 C-말단 AF-2 도메인이 결핍되어 있다 [Wang et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 336, 1023-1027 (2005)].
ER-α66은 이의 표적 유전자의 전사 활성화를 통해 에스트로겐-자극된 세포 증식을 매개하는 것으로 여겨진다. ER-α66에 대한 에스트로겐의 결합은 ER-α66의 전사 활성화 도메인을 활성화하고, 따라서 하류 표적 유전자의 발현을 자극하고, 궁극적으로 세포 증식을 야기한다. ER-α46은 막-개시되고 에스트로겐-자극된 신속한 NO 합성을 매개하는 것으로 밝혀졌다 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 100: 4807-4812 (2003)]. 또한, AF-1 도메인이 결핍된 ER-α46은 ER-α66의 AF-1 활성을 억제하는 것으로 보여진다 [Flouriot, G., EMBO, 19, 4688-4700, (2000)]. ER-α36은, AF-1과 AF-2 전사 활성화 도메인 둘 다가 결핍되어 있기 때문에, ER-α 및 ER-β의 AF-1과 AF-2 기능 둘 다를 억제하기 위해 우성-음성 억제제로서 기능한다. 또한, ER-α36은 주로 원형질막 상에 분포되어 있으며, 세포 증식을 자극하는 막-개시된 분열 촉진 에스트로겐 신호전달을 매개한다 [Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 1023-1027 (2005); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 103: 9063-9068 (2006)].
광범위한 연구에 의해, 에스트로겐 신호전달은 고전적인 핵 전사 활성화 경로 뿐만 아니라 비고전적 막-개시된 신호전달 경로를 통해 매개되는 것으로 나타났다. ER-α66과 ER-α46 둘 다는 주로 핵에서 작용하는 반면, ER-α36은 주로 핵의 외부를 통해 작용하는 것으로 보인다.
또한, ER-α36은 원래 ER-α66의 리간드-결합 도메인의 헬릭스 8-12가 결핍되어 있는데, 이는 ER-α36의 리간드 결합 특이성을 완전히 변화시킨다. 따라서, ER-α36은 ER-α66 및 ER-β에 결합된 것과 상이한 리간드에 결합할 수 있다.
에스트로겐 수용체 관련 질환은 많은 사람들에게 지속적으로 영향을 미치기 때문에, 이러한 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유용한 신규한 화합물 및 방법을 찾을 긴급한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 신규한 에스트로겐 수용체 ER-α36을 조절하기 위한 하기 식 (I)로 표시되는 크로메논 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이의 프로드럭과, 상기와 같은 화합물을 포함하는 약학적 조성을 제공한다.
[식 (I)]
Figure 112014076249131-pct00001
여기서,
R1은 수소, (C1 -6) 알킬, 및 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1 -6) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 수소, (C1-4) 알킬, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-4) 알킬, 할로겐, 시아노, 및 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-C4) 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2, R3, R4, R5 및 R6은 동시에 수소는 아니고;
R1이 메틸이고 R3 및 R5가 수소인 경우, R4는 염소가 아니다.
도 1은 인간 유방암 샘플에서 ER-α66, ER-α46 및 ER-α36의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 결과를 도시한 것이다. 레인 1: 정상 유방 조직; 레인 2: 침윤성 유관암종; 레인 3: 침윤성 유관암종; 레인 4: 침윤성 유관암종; 레인 5: 침윤성 소엽암종; 레인 6: 침윤성 소엽암종; 레인 7: 비침윤성 암종.
도 2는 MDA-MB-231 세포의 면역형광 염색 결과를 도시한 것이다 (상단 그림). MDA-MB-231 세포는, ER-α66 및 ER-α46이 결핍되어 있는 ER-음성 유방암 세포주로서, ER-α36에 특이적으로 결합하는 항체로 염색된다 ("ER-α36 Ab"로 표지된 좌측 그림: 녹색으로 표시된 양성 염색). 세포 핵은 또한 4,6-디아미딘-2-페닐인돌로 염색된다 ("DAPI"로 표지된 중간 그림: 청색으로 표시된 양성 염색). 병합된 염색 신호는 "병합"으로 표지된 레인에 표시된다. 항체가 이에 결합하는 면역원 펩타이드와 예비 배양될 때, 음성 염색이 관찰된다 (하단 그림).
도 3은 상이한 종양 세포주에서 ER-α36의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 결과를 도시한 것이다. 레인 1: ER-α36의 일시적 발현을 가지는 293개의 인간 신장 상피 세포주; 레인 2 내지 레인 4: 상이한 실험실로부터의 인간 유방암 세포주 SK-BR-3; 레인 5 내지 레인 7: 상이한 실험실로부터의 인간 유방암 세포주 MCF-7; 레인 8 및 레인 9: 상이한 실험실로부터의 인간 백혈병 세포주 HL-60; 레인 10 및 레인 11: 상이한 실험실로부터의 인간 백혈병 세포주 MV-4-11; 레인 12 및 레인 13: 상이한 실험실로부터의 인간 만성 골수성 백혈병 세포주 K562; 레인 14: 간암 세포주 A2780; 레인 15: 간암 세포주 HEL-7402; 레인 16: 간암 세포주 HEL-9204; 레인 17: 환자로부터의 간암 일차 세포주 Hep-11; 레인 18: 환자로부터의 간암 일차 세포주 Hep-12.
도 4 내지 도 8은 MTT 방법으로 시험된, 위암 세포주 BGC-823, 폐암 세포주 H460, 결장암종 세포주 LS174T, 췌장암 세포주 PANC-1 및 전립선암 세포주 PC-3에 대한 화합물 1의 시험관내 억제를 도시한 것이다. 그 결과는 화합물 1이 양호한 투여 의존성과 이들 암세포에 대한 우세한 억제를 보여준다. IC50은 1μM 내지 4μM의 범위이다.
도 9는 타목시펜의 양성 대조군 (0.7mg/마우스/일), 화합물 1 (0.7mg/마우스/일) 및 비히클의 음성 대조군 (0.2mg/마우스/일)을 각각 지속 투여한 20일 후에 인간 유방암 BCAP-37 종양을 가지는 누드 마우스의 평균 종양 중량 (막대 그래프)를 도시한 것이며, 그 결과는 종양에 대한 화합물의 억제를 보여준다.
도 10은 20일 동안 리툭시맙의 양성 대조군, 화합물 1 (0.7mg/마우스/일) 및 비히클의 음성 대조군 (0.2mL/마우스/일)을 각각 지속 투여한 인간 B 림프종 Daudi 세포의 종양 성장 곡선을 도시한 것이다.
도 11은 DMPA (데포메드록시 프로게스테론 아세테이트)의 양성 대조군 (120 mg/kg), 저 용량의 화합물 1 (17.5 mg/kg), 중간 용량의 화합물 1 (35 ㎎/kg), 고 용량의 화합물 1 (70 ㎎/kg) 및 비히클의 음성 대조군 (0.2mL/마우스/일)을 각각 지속 투여한 20일 후에 인간 자궁내막암종 Ishikawa를 가지는 누드 마우스의 평균 종양 중량을 도시한 것이다. 화합물 1은 종양을 가지는 마우스의 종양 성장에 대한 우세한 억제를 가지며, 억제 효과는 대조군 약물보다 높다.
화합물 및 유도체
본 발명의 일부 실시형태에서, 크로메논 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 프로드럭, 및 상기와 같은 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이들은 에스트로겐 수용체 ER-α36을 조절하는 기능을 하여 암 등과 같은 ER-α36 수용체에 의해 매개된 질환을 예방 및/또는 치료할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기 식 (I)의 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이의 프로드럭, 및 상기와 같은 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다:
[식 (I)]
Figure 112014076249131-pct00002
여기서,
R1은 수소, (C1 -6) 알킬, 및 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1 -6) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 수소, (C1 -4) 알킬, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1 -4) 알킬, 할로겐, 시아노, 및 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1 -4) 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2, R3, R4, R5 및 R6은 동시에 수소는 아니고;
R1이 메틸이고 R3 및 R5가 수소인 경우, R4는 염소가 아니다.
삭제
특정 실시형태에서, 상기 식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 식 (II)의 화합물을 포함한다:
[식 (II)]
Figure 112014076249131-pct00003
여기서,
R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 수소, (C1 -4) 알킬, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1 -4) 알킬, 할로겐, 시아노, 및 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1 -4) 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2, R3, R4, R5 및 R6은 동시에 수소는 아니다.
특정 실시형태에서, 상기 식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 식 (III)의 화합물을 포함한다:
[식 (III)]
Figure 112014076249131-pct00004
여기서,
R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 수소, (C1-4) 알킬, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-4) 알킬, 할로겐, 시아노, 및 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1 -4) 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2, R3, R4, R5 및 R6은 동시에 수소는 아니고;
R3 및 R5가 수소인 경우, R4는 염소가 아니다.
특히 바람직한 상기 식 (I)의 화합물은 하기 화합물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
2-(4-트리플루오로메틸페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(4-플루오로페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(3-플루오로-4-클로로페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(4-클로로페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(4-트리플루오로메톡시페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(3,4-디클로로페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(3-트리플루오로메틸-4-클로로페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(4-브로모페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(3,4-디플루오로페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(4-트리플루오로메틸페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(4-트리플루오로메톡시페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온;
2-(3-트리플루오로메틸-4-클로로페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온; 및
2-(4-브로모페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온.
하기 식 (IV)의 화합물.
[식 (IV)]
Figure 112014077337073-pct00048

여기서,
R1은 수소, (C1-6) 알킬, 및 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-6) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 수소, (C1-4) 알킬, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-4) 알킬, 할로겐, 시아노, 및 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-4) 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2, R3, R4, R5 및 R6은 동시에 수소는 아니고;
R1이 메틸이고 R3 및 R5가 수소인 경우, R4는 염소가 아니다.
식 (IV)의 화합물은 식 (I)의 화합물의 중간체이다.
본 발명의 화합물 및 이의 유도체는 IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) 명명 체계 또는 CAS (Chemial Abstract Service, Columbus, OH) 명명 체계에 따라 명명된다.
본 발명에 사용된 용어의 정의는 하기와 같다. 달리 명시되지 않는다면, 기의 주요 정의, 또는 독립적인 기 또는 다른 기의 일부를 포함하는 용어는 전체 명세서에 적용가능하다.
"치환됨"이란 용어는, 분자의 수소 원자가 상이한 원자 또는 분자로 대체된 것을 의미한다. 수소 원자를 대체하는 원자 또는 분자는 "치환기"로 표시된다.
CnHn-의 탄소 원자 수의 최소치 및 최대치는 접두어로 표시되는데, 예를 들면, (Ca-Cb) 알킬의 접두어는 "a" 내지 "b"의 탄소 원자 수를 포함하는 모든 알킬을 의미한다. 따라서, 예를 들면, (C1-C6) 알킬은 1 내지 6의 탄소 원자 수를 포함하는 알킬을 의미한다.
"알콕시"란 용어는, 말단에서 산소 원자와 결합된 선형 또는 분지형 1가 포화 지방쇄를 의미하는 것으로, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 이소-부톡시, 3급-부톡시 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"알킬"이란 용어란, 선형 또는 분지형 1가 포화 지방쇄를 의미하는 것으로서, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 이소-펜틸, 헥실 등과 같은 기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"할로겐" 또는 "할로겐 원자"란 용어는, 염소, 브롬, 불소, 요오드 또는 이들에 상응하는 기를 의미한다.
"헤테로아릴"이란 용어는, 하나 이상의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황과 같은 하나 이상의 헤테로원자로 대체된 모노사이클 또는 폴리사이클 방향족기를 의미한다. 헤테로사이클로알킬 환의 예에는 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조피라닐, 푸릴, 이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌리지닐, 인돌릴, 이소벤조푸릴, 이소인돌릴, 이소퀴놀릴, 이소티아졸, 이속사졸, 나프티리디닐, 옥사디졸릴, 옥사지닐, 옥사졸릴, 프탈라지닐, 프테리디닐, 구아니닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도[3,4-b] 인돌릴, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤리디닐, 퀴놀리질, 퀴놀리닐, 퀴녹살리닐, 티아디졸릴, 티아트리졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 트리아지닐, 트리아졸릴, 크산테닐이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"-옥소"란 용어는, 탄소 원자(들)와 산소 원자(들)의 조합으로 형성된 카보닐기를 의미한다.
본 발명의 화합물의 프로드럭 및 용매화물도 또한 고려된다. "프로드럭"이란 용어는, 피험자에 투여한 후 화학적 또는 대사 과정을 통해 (예를 들어, 생리학적 pH에 놓일 때 또는 효소 활성을 통해) 생체내에서 활성 약물을 방출하는 약물 전구체인 화합물을 의미한다. 합성 및 프로드럭의 사용에 대한 논의는 문헌 [Produgs as Novel Delivery Systems,”vol. 14 of the ACS Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에서 발견될 수 있으며, 이들 문헌은 본원에 참조에 의해 삽입된다. "프로드럭"이란 용어는 본 발명의 화합물의 대사 전구체를 포함할 수 있다. 프로드럭은 피험자에 투여될 때 불활성일 수 있으나, 본 발명의 식 (I)의 화합물로 생체내에서 전환될 수 있다. 프로드럭은 자연적으로 존재하는 화합물 또는 합성 화합물일 수 있다.
본 발명의 식 (I)의 화합물은 약제학적으로 수화되거나 에탄올화되는 등의 형태와 같은 비용매화되거나 용매화된 형태일 수 있다. 그리고, 본 발명은 화합물의 용매화물 및 비용매화물을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 바람직한 식 (I)의 화합물의 용매화물은 수화물이다.
거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체를 포함하여 식 (I)의 R 치환기의 비대칭 탄소 원자로부터 가능한 입체 이성질체와 같은 화합물의 모든 입체 이성질체는 본 발명의 범위내에 있다. 라세미 혼합물을 포함하여 식 (I)로 표시되는 화합물의 입체 이성질체 및 혼합물도 또한 본 발명의 일부이다. 또한, 식 (I)의 화합물이 이중 결합, 시스- 및 트랜스- 및 이들의 혼합물을 가지는 경우와 같은 기하 이성질체 및 위치 이성질체도 모두 본 발명의 범위내에 있다.
부분입체 이성질체 혼합물은 크로마토그래피 및/또는 분별 결정화에 의해서와 같은 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 이들의 물리 화학적 차이에 기초하여 이들의 개별 부분입체 이성질체로 분리될 수 있다. 거울상 이성질체는, 적절한 광학 활성 화합물과의 반응에 의해 거울상 이성질체 혼합물을 부분입체 이성질체 혼합물로 전환하고, 이어서 상기 부분입체 이성질체를 분리하고, 상기 부분입체 이성질체를 상응하는 순수한 거울상 이성질체로 전환 (예를 들면, 가수분해)함으로써 분리될 수 있다. 또한, 식 (I)의 화합물의 일부는 아트로프 이성질체 (atropisomer) (치환된 바이아릴)일 수 있으며, 이는 또한 본 발명의 일부로 간주된다.
"약제학적으로 허용 가능함"이란 표현은, 지정된 캐리어, 비히클, 희석제, 부형제(들) 및/또는 염이 일반적으로 제형을 포함하여 다른 성분과 화학적으로 및/또는 물리적으로 혼화가능하고 이의 수용자와 생리적으로 혼화가능하다는 것을 나타낸다.
"염" 및 "약제학적으로 허용가능한 염"이란 용어는, 식 (I)의 화합물 또는 이의 입체 이성질체와 무기산 및/또는 유기산 및 염기에 의해 형성된 산성 염 및/또는 염기성 염을 의미한다. 염 및 약제학적으로 허용가능한 염은 또한 양쪽성 염 (분자내 염) 및 4급 암모늄염, 예를 들면, 알킬 암모늄염을 포함한다. 염은 분리 및 정제 후 직접 수득될 수 있다. 또한, 염은 적절한 산 또는 염기 (예를 들면, 당량)와 혼합된 이들의 식 (I)의 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 프로드럭으로부터 수득될 수 있다. 염은 용액으로부터의 침전물을 여과시키거나, 용매를 증발시키거나, 물 매질에서의 반응 후 동결건조시킴으로써 회수될 수 있다.
산부가 염에는 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 하이드로클로라이드, 설페이트, 하이드로설페이트, 나이트레이트, 아세테이트 (아세트산으로 형성된 염, 즉 트리클로로 아세트산 또는 트리플루오로 아세트산을 포함한다), 옥살레이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르 설포네이트, 사이클로펜틸 프로피오네이트, 디글루코네이트, 에틸 설포네이트, 2-하이드록시 에틸 설포네이트, 2-나프탈렌 설포네이트, 니코티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐 프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 벤젠 설포네이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트, 도데실 설포네이트, 아디페이트 등이 포함된다.
염기성 염 (예를 들면, R 치환기의 카복시 또는 페녹시로 형성된 염)에는 암모늄, 알칼리 금속의 염 (예를 들면, 나트륨, 리튬 및 칼륨), 알칼리 토금속 (예를 들면, 칼슘 및 마그네슘), 유기 염기로 형성된 염 (예를 들면, 유기 아민) (디벤질 에틸렌 아민, 디사이클로헥실 아민, 하이드라바민, N-메틸-D-글루코사민, 테트라부틸 아민을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다) 및 아르기닌, 라이신 등과 같은 아미노산으로 형성된 염이 포함된다. 또한, 염기성 염에는 질소를 포함하는 알칼리제로 형성된 4급 암모늄급 암모늄, 예를 들면, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가 예의 경우는 문헌 [Berge, et al., J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977)]을 참조한다.
식 (I)의 화합물은 호변 이성질체로 평형으로 존재할 수 있는 것도 또한 가능하고, 모든 이러한 형태는 본 발명의 범위내에 포함된다.
실시형태에서, 본원에 기재된 것과 동일하지만 하나 이상의 원자가 일반적으로 자연에 존재하는 원자와 상이한 원자 질량 또는 질량수를 가지는 다른 원자로 대체된 동위원소-표지된 식 (I)의 화합물이 본 발명에 제공된다. 식 (I)의 화합물에 포함될 수 있는 동위원소의 예에는 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F 및 36Cl과 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 불소 및 염소의 동위원소가 포함된다. 상기 동위원소 및 다른 원자의 것을 포함하는 식 (I)의 화합물, 이의 입체 이성질체 및 프로드럭, 및 상기 화합물, 입체 이성질체 또는 프로드럭의 약제학적으로 허용가능한 염은 본 발명의 범위내에 있는 것으로 의도된다.
특정 동위원소-표지된 식 (I)의 화합물, 예를 들면, 3H, 14C 등으로 표지된 화합물은 화합물 및/또는 기질 조직 분포 어세이에 사용될 수 있다. 삼중 수소 (즉, 3H) 동위원소 및 탄소 14 (즉, 14C) 동위원소가 이의 상대적 제조 용이성 및 용이한 검출을 위해 특히 바람직하다. 또한, 중수소 (즉, 2H)와 같은 일부 동위원소는 큰 대사 안정성으로 인한 특정 치료 이점을 제공할 수 있고 (예를 들어, 생체내 반감기의 증가 또는 투여량 요구의 감소), 따라서 일부 상황에서 바람직할 수 있다. 동위원소-표지된 식 (I)의 화합물은 일반적으로 당업자에게 공지된 방법으로, 예를 들면, 비-동위원소-표지된 시약을 동위원소-표지된 시약으로 대체함으로써 제조될 수 있다.
발명의 용도
본 발명의 화합물은 에스트로겐 수용체의 ER-α36에 대한 신규한 조절제이며, 생체내 및 시험관내 세포에서 ER-α36의 기능을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 식 (I)의 화합물은 ER-α36를 통한 질환, 특히 종양 관련 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포에서 ER-α36의 기능을 조절하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 유전 공학에 의해 ER-α36을 내인성으로 또는 외인성으로 발현하는 세포에, 또한 다른 에스트로겐 수용체 (예를 들면, ER-α66, ER-α46 및 ER-β)를 가지거나 가지지 않은 세포에 식 (I)의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 ER-α36을 내인성으로 발현한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 세포는 ER-α36을 내인성으로 발현하는 암세포이다. ER-α36 발현 세포는 유방암, 백혈병, 간암, 림프종, 폐암, 골수종, 전립선암, 난소암, 자궁내막암, 결장암 및 위암 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 바람직한 실시형태에서, ER-α36 발현 세포는 유방암, 백혈병, 간암, 림프종, 자궁내막암 및 난소암 세포인데, 이는 ER-α36을 내인성으로 발현한다. ER-α36 발현 유방암 세포는 MCF7, MDA-MB-231 및 SKBR-3을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 백혈병 세포는 K562, MV-4-11, SUM159, HL-60 및 Molt-4 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. ER-α36 발현 자궁내막암 세포는 Hec1A 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. ER-α36 발현 간암 세포는 A2780, BEL7402, BEL7404, HEL-9204, Hep2G, Hep3B, 및 환자로부터 유래한 일차성 간암 줄기 세포 Hep-12를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. ER-α36 발현 림프종 세포는 Daudi를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 내인성 ER-α36의 발현은 혈청, E2β (17β-에스트라디올), 타목시펜 및 풀베스트란트 (ICI 182,780)를 포함하는 시약의 처리에 의해 증가하거나 감소할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 외인성 ER-α36 발현 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 세포는 당업계의 유전 공학자에 의해 제조될 수 있다 [Sambook etc, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)]. 간단히 말하자면, 외인성 ER-α36 유전자를 제조하고, 발현 벡터에 삽입하고, 이어서 숙주 세포에 형질감염시키고, 이어서 숙주 세포를 외인성 ER-α36 발현에 적용가능한 배지에서 배양한다. 인간 ER-α36의 유전자 서열은 문헌 [Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 1023-1027 (2005) Wang et al. (GenBank registration No. BX640939]에 개시되어 있다. 외인성 ER-α36 발현 세포는 내인성 ER-α36을 발현하거나 발현하지 않을 수 있다. 세포에서의 ER-α36의 내인성 또는 외인성 발현 수준은 혈청, E2β (17β-에스트라디올), 타목시펜 및 풀베스트란트 (ICI 182,780)를 포함하는 시약의 처리에 의해 증가하거나 감소할 수 있다.
이에, 본 발명의 식 (I)의 화합물은 ER-α36 관련 암의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에 사용될 수 있는데, 상기 암에는 항문암, 담도암, 방광암, 골암, 장암 (결장암, 직장암), 뇌암, 유방암, 유암종, 자궁암, 내분비 관련 암, 자궁내막암, 안암, 담낭암, 두경부암, 카포시 육종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 골수종, 신경내분비암, 식도암, 난소암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 피부암, 연조직 육종, 척수암, 위암, 고환암, 갑상선암, 질암, 외음부암 또는 자궁암이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시형태에서, ER-α36 관련 암에는 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 백혈병, 간암, 림프종, 폐암, 골수종, 난소암, 전립선암, 위암, 췌장암, 신장암, 흑색종, 갑상선암, 연조직 육종 또는 자궁암이 포함된다. 더욱 바람직한 실시형태에서, ER-α36 관련 암에는 유방암, 간암, 림프종, 전립선암, 위암, 폐암, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암 및 백혈병이 포함된다.
피험자는 개, 고양이, 소, 양, 말 또는 인간, 바람직하게는 인간과 같은 포유동물일 수 있다. 화합물의 유효량은 질병의 차이에 따라 달라지며, 본 발명의 이익을 가지는 당업자에 의해 용이하게 확인가능하다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 다른 항암제와 조합하여 사용할 수 있다. 적합한 항암제에는 알킬화제, 질소 머스타드, 엽산 길항제, 퓨린 길항제, 피리미딘 길항제, 방추체 독, 토포아이소머라아제 억제제, 아폽토시스 유도제, 혈관신생 억제제, 포도필로톡신, 니트로소우레아, 항대사물질, 단백질 합성 억제제, 키나아제 억제제, 항에스트로겐, 시스플라틴, 카보플라틴, 인터페론, 아스파라기나아제, 류프롤라이드, 플루타미드, 메게스트롤, 미토마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 아드리아마이신, 이리노테칸 및 탁솔이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양태에서, 항암제는 타목시펜과 풀베스트란트 (ICI 182,750)와 같은 항에스트로겐이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 식 (I)의 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 프로드럭, 또는 상기 입체 이성질체 또는 프로드럭의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 비히클 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이들은 ER-α36 관련 질환을 앓고 있는 피험자의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 동물 질병의 치료에 사용될 수 있다. 통상의 수의사는 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 제제, 또는 이의 수의학적으로 허용가능한 염, 수의학적으로 허용가능한 용매 또는 프로드럭의 형태로 투여할 수 있다. 수의사는 동물에 대한 적절한 투여량 및 투여 방법을 결정할 수 있다.
활성 화합물들의 조합을 사용하는 경우, 이들은 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여 할 수 있다.
화합물의 제조 방법
식 (I)의 화합물은 다양한 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 통상적으로, 제조 방법은 하기와 같이 설명한다. 달리 명시되지 않는다면, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 상기에서 정의한 바와 같다.
화합물의 상세한 제조 방법이 화합물 구조의 차이로부터 약간 다르다는 것은 당업자에게 명백하다. 또한, 하기와 같이 대부분의 제조 방법에서 종래의 보호기 (P로 나타냄)에 의해 불안정 또는 활성 그룹을 보호하는 것이 필요하다. 보호기의 특성 및 보호기를 유도하거나 배치하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, [Greene T. W. "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, NewYork, 1991] 참조). 하기 반응식 1 내지 3 및 관련 설명은 식 (I)의 화합물을 제조하는 예이며, 본 발명의 범위를 제한하려고 의도되지 않는다.
반응식 1
Figure 112014076249131-pct00005
식 (I)의 화합물은 여러 단계를 통해 제조될 수 있다. 화합물 iii은 루이스 산 촉매반응 하에서 화합물 i 및 ii의 화합물로부터 Houben-Hoesch 반응 (프리델-크래프츠 아실화)을 통해 제조될 수 있다. 반응에 적용가능한 루이스 산은 무수 염화아연, 무수 염화알루미늄, 염화제2철, 사염화티탄, 염화주석, 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트 착체 등을 포함한다. 이러한 반응은 0℃ 내지 120℃ 사이에서 1시간 내지 20시간 지속된다.
화합물 v는 축합 반응을 통해 불활성 용매 중에서 화합물 iii 및 치환된 화합물 iv로부터 제조될 수 있다. 상기 반응에 적용가능한 불활성 용매는 DME, 1,2-디에톡시에탄, THF, 1,4-디옥산, DMF, N,N-디메틸아세트아미드, 피리딘, N-메틸-2-피롤리돈과 같은 것을 포함한다. 상기 반응에 적용가능한 알칼리는, 예를 들면, 수산화칼륨, 탄산칼륨, 탄산세슘, 수소화나트륨, 메톡시화나트륨, 3급-부톡시화칼륨, DBU (1,8-디아자바이사이클로-디사이클로(5,4,0)-7-헨데센), 부틸 리튬, LDA (디이소프로필 리튬), LHMDS (리튬 헥사메틸디실라자이드) 등을 포함한다. 화학량론적 양 또는 촉매량의 상전이 촉매 (예를 들면, 18-크라운-6, TBAB (테트라부틸 암모늄 브로마이드), TBAF (테트라부틸 암모늄 플루오라이드) 등)를 반응 동안 첨가한다. 그리고, 반응 온도는 약 0℃ 내지 100℃이고, 반응 시간은 1시간 내지 20시간이다.
화합물 vii은 알칼리 조건 하에서 프레닐 브로마이드 및 화합물 v로부터 제조될 수 있다. 상기 반응에 적용가능한 용매는 메탄올, DMF (N,N-디메틸 아세트아민), THF (테트라하이드로푸란), 물, 톨루엔, DME (1,2-디메톡시 에탄) 및 용매 혼합물, 예를 들면, 메탄올-물 등과 같은 것을 포함한다. 상기 반응에서 바람직한 용매는 물이다. 상기 반응에 적용가능한 알칼리는 수산화칼륨, 탄산칼륨, 탄산세슘, 메톡시화나트륨, 수산화나트륨, 3급-부톡시화칼륨, DBU (1,8-디아자바이사이클로-디사이클로(5,4,0)-7-헨데센), 부틸 리튬, LDA (디이소프로필 리튬), LHMDS (리튬 헥사메틸디실라자이드) 등과 같은 것을 포함한다. 반응 온도는 통상적으로 약 0℃ 내지 100℃이고, 반응 시간은 바람직하게는 1시간 내지 20시간이다.
화학 합성 방법에서, 중요한 2개의 단계는 각각 이소펜테닐의 유도 및 크로메논의 모환 폐쇄이다. 2개의 단계의 순서는 상이한 치환기의 특성에 따라 조절될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 반응식 2를 통해 제조될 수 있다.
반응식 2
Figure 112014076249131-pct00006
반응식 2에서, 모든 유형의 반응의 반응 조건은 반응식 1의 것과 유사하다. 화합물 viii은 알칼리 조건 하에서 화합물 iii 및 프레닐 브로마이드로부터 제조될 수 있다. 상기 반응에 적용가능한 용매는 메탄올, DMF (N,N-디메틸 아세트아민), THF (테트라하이드로푸란), 물, 톨루엔, DME (1,2-디메톡시 에탄) 및 용매 혼합물, 예를 들면, 메탄올-물, DMF-물, THF-물 등과 같은 것을 포함한다. 상기 반응에서 바람직한 용매는 물이다. 상기 반응에 적용가능한 알칼리는 수산화칼륨, 탄산칼륨, 탄산세슘, 메톡시화나트륨, 수산화나트륨, 3급-부톡시화칼륨, DBU (1,8-디아자바이사이클로-디사이클로(5,4,0)-7-헨데센), 부틸 리튬, LDA (디이소프로필 리튬), LHMDS (리튬 헥사메틸디실라자이드) 등과 같은 것을 포함한다. 반응 온도는 통상적으로 약 0℃ 내지 100℃이고, 반응 시간은 바람직하게는 1시간 내지 20시간이다.
화합물 vii은 축합 반응을 통해 불활성 용매 중에서 화합물 viii 및 치환된 아실 클로라이드 iv로부터 제조될 수 있다. 상기 반응에 적용가능한 불활성 용매는 DME, 1,2-디에톡시에탄, THF, 1,4-디옥산, DMF, N,N-디메틸아세트아미드, 피리딘, N-메틸-2-피롤리돈과 같은 것을 포함한다. 상기 반응은, 수산화칼륨, 탄산칼륨, 탄산세슘, 수소화나트륨, 메톡시화나트륨, 3급-부톡시화칼륨, DBU (1,8-디아자바이사이클로-디사이클로(5,4,0)-7-헨데센), 부틸 리튬, LDA (디이소프로필 리튬), LHMDS (리튬 헥사메틸디실라자이드) 등과 같은 것을 포함한 알칼리 조건에 적용가능하다. 화학량론적 양 또는 촉매량의 상전이 촉매, 예를 들면, 18-크라운-6, TBAB (테트라부틸 암모늄 브로마이드), TBAF (테트라부틸 암모늄 플루오라이드) 등을 상기 반응에 첨가할 수 있다. 반응 온도는 통상적으로 약 0℃ 내지 140℃이고, 반응 시간은 바람직하게는 용매 환류 하에서 1시간 내지 20시간이다. R1이 수소인 경우, 식 (I)의 화합물은 하기 반응식 3에 따라 제조될 수 있다.
반응식 3
Figure 112014076249131-pct00007
P는 반응식 3에서 하이드록시기에 대한 보호기이다. 화합물 xii는 화합물 xi의 보호기의 제거를 통해 제조될 수 있다. 제거 방법은 다양한 보호기에 따라 달라지며, 상기 방법은 주로 문헌 [Greene T.W et al., "Protective groups in organic synthesis," John Wiley & Sons, New York, 1991]에 언급되어 있다. 바람직한 보호기는 벤질, 벤조일, 카보벤즈옥시, TBDMS (3급-부틸 디메틸 실릴), THP (테트라하이드로피란), 메틸, MOM (메톡시 메틸), PMB (파라-메톡시 벤질) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
화합물 xiii은 알칼리 조건 하에서 프레닐 브로마이드와 화합물 xii의 반응에 의해 제조될 수 있다. 상기 반응에 적용가능한 용매는 메탄올, DMF (N,N-디메틸 아세트아민), THF (테트라하이드로푸란), 물, 톨루엔, DME (1,2-디메톡시 에탄) 및 용매 혼합물, 예를 들면, 메탄올-물, DMF-물, 테트라하이드로푸란-물 등과 같은 것을 포함한다. 상기 반응에서 바람직한 용매는 물이다. 상기 반응에 적용가능한 알칼리는, 예를 들면, 수산화칼륨, 탄산칼륨, 탄산세슘, 메톡시화나트륨, 수소화나트륨, 3급-부톡시화칼륨, DBU (1,8-디아자바이사이클로-디사이클로(5,4,0)-7-헨데센), 부틸 리튬, LDA (디이소프로필 리튬), LHMDS (리튬 헥사메틸디실라자이드) 등을 포함한다. 그리고, 반응 온도는 통상적으로 약 0℃ 내지 100℃이고, 반응 시간은 1시간 내지 20시간이다.
실시예
본 발명은 하기 비제한적 실시예에서 예시되며, 달리 명시되지 않는다면, 실온 또는 주위 온도는 18℃ 내지 25℃ 범위를 의미한다. 용매의 증발은 감압 하에서 회전 증발기를 사용하여 수행되었고, 반응은 박막 크로마토그래피 (TLC)로 모니터링되었으며, 반응 시간은 예시를 위해만 제공되었다. 모든 분리된 화합물의 구조 및 순도는 적어도 다음의 기술 중 하나에 의해 확인되었다: TLC, 질량 분광법, 핵 자기 공명 (NMR), 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC). 수율은 예시 목적으로만 제공된다.
실시예 1
2-(4-트리플루오로메틸페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온 (화합물 1)
단계 1: 2-메톡시-1-(2,4,6-트리하이드록시페닐)에탄온의 제조
플로로글루시놀 (35.1g, 279 mmol)을 에틸 에테르 (500mL) 용액에 용해시킨 후, 빙수욕 조건 하에서 염화아연 (8g, 59 mmol) 및 2-메톡시 아세토니트릴 (18g, 253 mmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 5시간 동안 격렬하게 교반하면서 무수 HCl 가스를 반응 혼합물에 버블링시키고, 침전물을 형성하였다. 침전물을 여과하고, 회수하고, 이어서 물에 용해시키고, 3시간 동안 환류하였다. 냉각시킨 후, 분홍색 침전물을 회수하고, 물로 재결정화한 후, 목적하는 백색 화합물 (45g, 수율 81%)을 수득할 수 있다.
Figure 112014076249131-pct00008
Figure 112014076249131-pct00009

단계 2: 2-(4-트리플루오로메틸페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-4H-크로멘-4-온의 제조
2-메톡시-1-(2,4,6-트리하이드록시페닐)에탄온 (30g, 151 mmol) 및 4-트리플루오로메틸 벤조일 클로라이드 (37.5g, 180 mmol)를 무수 피리딘 250mL에 용해시켰다. DUB (53.2g, 350 mmol)를 실온에서 용액에 적하하였다. 적하를 완료한 후, 용액 온도를 75℃로 승온시키고, 밤새 계속 교반하였다. 2일째에, 용액을 실온으로 냉각시키고, 대부분의 용매를 감압하에 제거하였다. 용액의 잔류물을 묽은 염산 용액에 부었다. 혼합 용액을 에틸 아세테이트 500mL로 3회 추출하였다. 추출물을 함께 합하고, 2N 탄산나트륨 수용액 300mL로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켜 농축하였다. 조생성물을 석유 에테르와 에틸 아세테이트 (10:1)의 혼합물로 결정화한 후, 목적하는 화합물 (21g, 수율 40%)을 수득하였다.
단계 3: 2-(4-트리플루오로메틸페닐)-3,5,7-트리하이드록시-4H-크로멘-4-온의 제조
2-(4-트리플루오로메틸페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-4H-크로멘-4-온 (10g, 28.3 mmol)을 250mL 3목 플라스크 중의 디클로로메탄 150mL에 용해시켰다. 보론 트리브로마이드 (21.2g, 84.9 mmol)를 0℃에서 상기 용액에 서서히 적하하였다. 그 후, 상기 용액을 실온으로 가열하고, 4시간 동안 반응하고, 화학 반응을 종료하기 위해 빙수 80mL로 퀀칭 (quench)시켰다. 상기 용액을 에틸 아세테이트 500mL로 3회 추출하였다. 추출물을 합하고, 염화나트륨 포화 수용액으로 1회 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과한 후, 조생성물을 에틸 아세테이트/석유 (1:10) 20mL와 혼합하고, 교반하고, 여과하고, 건조시킨 후 목적하는 황색 화합물 (7g, 수율 70%)을 수득하였다.
단계 4: 2-(4-트리플루오로메틸페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온 (화합물 1)의 제조
화합물 2-(4-트리플루오로메틸페닐)-3,5,7-트리하이드록시-4H-크롬-4-온 (3.38g, 10 mmol) 및 탄산세슘 (33g, 100 mmol)을 물 100mL에 용해시키고, 프레닐 브로마이드 (1.9g, 10 mmol)를 빙수욕 조건 하에서 상기 용액에 적하하였다. 그 후, 상기 용액을 실온 하에 밤새 유지하고, 2N 염산으로 pH를 약 6으로 조정하였다. 상기 용액을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기상을 합하고, 염화나트륨 포화 수용액으로 1회 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과한 후, 조생성물을 에틸 아세테이트/석유 (1:25)로 실리카겔 칼럼을 통해 용출시켰다. 목적하는 황색 화합물 (508mg, 수율 12.5%)을 수득하였다.
Figure 112014076249131-pct00010
Figure 112014076249131-pct00011
Figure 112014076249131-pct00012
실시예 1의 방법을 참조하여, 화합물 2 내지 화합물 8은 출발 물질로서의 중간체 2-메톡시-1-(2,4,6-트리하이드록시페닐)에탄온을 다양하게 치환된 알킬 클로라이드, 아릴 클로라이드 또는 헤테로아릴 클로라이드와 반응시킴으로써 제조되었으며, 화합물의 상세내용은 하기 표 1로 나타낸다.
화합물 번호 화합물명 1H-NMR LC-MS, m/z (ESI)

2		 2-(4-플루오로페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
Figure 112014076249131-pct00013
357.0 [M+H]+.


3		 2-(3-플루오로-4-클로로페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
Figure 112014076249131-pct00014
391.0 [M+H]+;


4		 2-(4-클로로페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
Figure 112014076249131-pct00015
373.1 [M+H]+


5		 2-(4-트리플루오로메톡시페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
Figure 112014076249131-pct00016
423.1 [M+H]+


6		 2-(3,4-디클로로페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
Figure 112014076249131-pct00017
407.0 [M+H]+


7		 2-(3-트리플루오로메틸-4-클로로페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
Figure 112014076249131-pct00018
441.0 [M+H]+


8		 2-(4-브로모페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
Figure 112014076249131-pct00019
417.2 [M+H]+
실시예 9
2-(4-트리플루오로메틸페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온 (화합물 9)
화합물 1의 중간체 2-(4-트리플루오로페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-4H-크롬-4-온 (500mg, 1.42 mmol) 및 탄산세슘 (4.95g, 15 mmol)을 물 25mL에 용해시키고, 프레닐 브로마이드 (220mg, 1.5 mmol)를 빙수욕 조건 하에서 상기 용액에 적하하였다. 그 후, 상기 용액을 실온 하에서 밤새 유지시키고, pH를 2N 염산으로 약 6으로 조정하였다. 상기 용액을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기상을 합하고, 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 수성 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과한 후, 조생성물을 에틸 아세테이트/석유로 실리카겔 칼럼을 통해 용출시켰다. 목적하는 황색 화합물 (95mg, 수율 16.5%)을 수득하였다.
Figure 112014076249131-pct00020
Figure 112014076249131-pct00021
Figure 112014076249131-pct00022

실시예 10
2-(3,4-디플루오로페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온 (화합물 10)
단계 1: 2-메톡시-1-[2,4,6-트리하이드록시-3-(3-메틸부트-2-엔)페닐]에탄온의 제조
화합물 2-메톡시-1-(2,4,6-트리하이드록시페닐)에탄온 (2.0g, 10.09 mmol)을 5% 수산화칼륨 (1.132g, 20.18 mmoL) 용액에 용해시킨 후, 프레닐 브로마이드 (1.504g, 10.09 mmol)를 빙수욕 조건 하에서 상기 용액에 서서히 적하하였다. 혼합물을 실온 하에서 2시간 동안 반응시키고, 빙수에 부었다. 상기 용액의 pH를 약 2로 조정하고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과한 후, 조생성물을 실리카겔 칼럼을 통해 정제하였다 (디클로로메탄/메탄올 (100:1)로 용출함). 목적하는 화합물 (0.5g, 수율 18.6%)을 수득하였다.
Figure 112014076249131-pct00023
Figure 112014076249131-pct00024

단계 2: 2-(3,4-디플루오로페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸- 2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온 (화합물 10)의 제조
2-메톡시-1-[2,4,6-트리하이드록시-3,5-디(3-메틸-2-부텐-1-일)페닐]에탄온 (250mg, 0.94 mmol), 무수 탄산칼륨 분말 (779mg, 5.63 mmol), TBAB (테트라부틸 암모늄 브로마이드, 454mg, 1.41 mmol) 및 3,4-디플루오로메틸 벤조일 클로라이드 (331mg, 1.88 mmol)를 톨루엔 30mL에 용해시키고, 6시간 동안 환류 하에 반응시켰다. 냉각시킨 후, 톨루엔을 제거하고, 물 20mL를 상기 용액에 첨가하였다. 수용액을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기상을 합하고, NaCl 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨 용액으로 건조시키고, 이어서 용매를 제거한 후 갈색 잔류물을 수득하였다. 상기 잔류물을 메탄올-물 (비율 4:1) 혼합물 20mL에 용해시키고, 수산화칼륨 (1g)을 첨가하였다. 혼합물 용액을 가열하고, 2시간 동안 환류시키고, 실온으로 냉각시키고, 1N 염산으로 pH=4로 산성화하고, 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시켜 용매를 제거하였다. 조생성물을 실리카겔 칼럼 (용출액: 에틸 아세테이트/석유 에테르 = 1:50)을 통해 정제한 후, 목적하는 화합물 (13.1mg, 수율 3.59%)을 수득하였다.
Figure 112014076249131-pct00025
Figure 112014076249131-pct00026
Figure 112014076249131-pct00027
순도:
Figure 112014076249131-pct00028
실시예 9의 방법을 참조하여, 화합물 11 내지 화합물 13은 출발 물질로서의 각각 상응하는 중간체를 프레닐 브로마이드와 단일 치환 기작을 통해 반응시킴으로써 제조되었다. 화합물의 상세내용은 하기 표 2로 나타낸다.
화합물 번호 화합물명 1H-NMR LC-MS, m/z (ESI)
11 2-(4-플루오로페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
Figure 112014076249131-pct00029
437.1 [M+H]+.
12 2-(3-플루오로메틸-4-클로로페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
Figure 112014076249131-pct00030
455.2 [M+H]+;
13 2-(4-브로모페닐)-3-메톡시-5,7-디하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
Figure 112014076249131-pct00031
431.5 [M+H]+
생물 활성을 위한 시험 어세이
식 (I)의 화합물의 활성을 하기 어세이에 의해 시험할 수 있다.
실시예 14. 인간 유방암 표본에서 ER-α 변종의 발현
인간 유방암 조직으로 예비-코팅된 막을 ProSci Incorporated (Poway, CA)로부터 구입하였다. ER-α36을 특이적으로 인식하는 항 ER-α36 항체 및 HRP-접합된 이차 항체로 상기 막을 탐지하고, 향상된 화학발광 (ECL) 검출 시약 (Amersham Pharmacia BiotecH)으로 시각화하였다. 이어서, 동일한 막 상의 마커를 용출시키고, ER-α의 3가지 하위 유형 모두, 즉 ER-α66, ER-α46 및 ER-α36을 인식하는 항-에스트로겐 수용체-α 항체 H222 (Novocastra Laboratories Ltd, UK)로 검출하였다. 도 1은 ER-α66, ER-α46 및 ER-α36이 정상 유방 조직 (레인 1)에서 발현되지 않지만 침윤성 유관암종 시료 (레인 2), 침윤성 소엽암종 시료 (레인 5) 및 비침윤성 유관암종 (레인 7)에서 발현되는 것을 보여준다. 또한, ER-α36은 침윤성 유관암종 (레인 4) 및 또 다른 침윤성 소엽암종 시료 (레인 6)에서 발현되었다. 레인 2 및 레인 3은 각각 2명의 상이한 환자로부터의 침윤성 유관암종을 가지고 있다. 레인 5 및 6은 각각 2명의 상이한 환자로부터의 침윤성 소엽암종을 가지고 있다. 이러한 결과는 ER-α36이 정상 유방 조직에서 발현되지 않지만 ER-α66 및 ER-α46을 발현하지 않는 ER 음성 유방암 샘플에서 발현되는 것을 나타낸다.
실시예 15: ER 음성 유방암 세포주 MDA-MB-231에서 발현된 ER-α36
MDA-MB-231 세포주는 ER-α66 및 ER-α46이 결핍되어 있는 것으로 잘 공지되어 있다 [Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumors: an update. Marc Lacroix, Guy Leclercq, Breast Cancer Research and Treatment 83: 249-289 (2004)]. MDA-MB-231 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection: ATCC)으로부터 수득하였다. MDA-MB-231 세포를, 12시간 동안 37℃에서 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 10% 우태아 혈청에서 8% CO2 대기 하에 8웰 BIOCOAT 챔버 슬라이드 (BD Science Discovery Labware) 상에서 성장시켰다. 이어서, 세포를 멸균 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 2회 세척하고, 실온에서 30분 동안 PBS (pH 7.4) 중의 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고, 10분 동안 0.5% (v/v) 트리톤 X-100으로 투과시켰다. 이어서, 세포를 다시 PBS로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 3% 혈청으로 차단하였다. 슬라이드를, 실온에서 1시간 동안 30분 동안 ER-α36 항체에 특이적으로 결합하는 ER-α36 특이적 항체 또는 면역원 펩타이드로 예비 배양된 동일 항체와 함께 배양하고, 0.5% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS (PBST)로 3회 세척하고, 이어서 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-표지된 이차 항체와 함께 배양하였다. 최종으로, 슬라이드를 PBST로 3회, PBS로 1회 세척하고, 이어서 면역형광 표지 (Molecular Probes, Eugene, OR)로 코팅하고, Nikon E600 현미경으로 검사하고, 이미지를 MRC-1024 공초점 영상 시스템 (Bio-Rad)으로 캡쳐하였다. 도 2 (상단 패널)는 MDA-MB-231 세포가 항 ER-α36 항체에 의해 양성으로 염색되었음을 보여준다. 이러한 결과의 신뢰성을 증명하기 위해, 면역원 펩타이드로 예비 배양된 동일한 항 ER-α36 항체의 이미지는 항체의 특이성을 나타내는 어떤 얼룩 (도 2, 하단 패널)도 나타내지 않았다.
실시예 16: 웨스턴 블롯에 의한 다양한 종양 세포주에서 ER-α36의 발현
세포 샘플을 37℃, 5% CO2에서 배양하였고(MDA-MB-231), 배지는 10% FBS-DMEM이다. 각 웰의 세포가 60% 내지 90% 컨플루언스 (confluence)에 도달할 때까지 세포를 회수하고, 4℃, 4300rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 용액의 상청액을 제거하고, 적당한 용해물, 1% NP-40 및 0.7mM EDTA를 포함하는 용해 완충액 및 프로테아제 억제제를 첨가하고, 용액 중의 세포를 빙욕에서 30분 내지 1시간 동안 계속 용해시켰다. 상기 용액을 14,000rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 회수하여 단백질로 정량화하였다. 웨스턴 블롯의 일반 절차는 다음과 같이 나타낸다: 예비 제조된 접착제 또는 혼합 접착제 상의 막, 전기영동, 항 ER-α36 항체 차단, 용출, 이차 항체 차단, 용출, 사진 실험실에서의 노출 및 결과 표시. 도 3은 각종 종양 세포에서 ER-α의 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
레인 1: ER-α36의 일시적 발현에 대한 293개의 인간의 신장 상피 세포주; 레인 2 내지 레인 4: 상이한 실험실에서의 인간 유방암 세포주 SK-BR-3; 레인 5 내지 레인 7: 상이한 실험실에서의 인간 유방암 세포주 MCF-7; 레인 8 및 레인 9: 상이한 실험실에서의 인간 백혈병 세포주 HL-60; 레인 10 및 레인 11: 상이한 실험실에서의 인간 백혈병 세포주 MV-4-11; 레인 12 및 레인 13: 상이한 실험실에서의 인간 만성 골수성 백혈병 세포주 K562; 레인 14: 간암 세포주 A2780; 레인 15: 간암 세포주 HEL-7402; 레인 16: 간암 세포주 HEL-9204; 레인 17: 환자로부터의 간암 일차 세포주 Hep-11; 레인 18: 환자로부터의 간암 일차 세포주 Hep-12.
실시예 17: 각종 유방암 세포의 시험관내 성장을 억제하는 화합물
A: ER 음성 유방암 MDA-MB-231에 대한 시험관내 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 어세이:
MDA-MB-231 세포를 DMEM 및 10% 우태아 혈청에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. 세포를 96웰 플레이트에 웰당 6x103 세포의 밀도로 충전하였다. MDA-MB-231 세포를 0, 0.3μM, 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM, 20μM, 30μM, 50μM 및 100μM의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. 처리된 세포를 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 어세이 키트 (Promega)로 검사하고, 발광을 Envision으로 기록하였다.
B: ER 양성 유방암 MCF-7 세포에 대한 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 어세이:
MCF7 세포주는 ER-66, ER-46 및 ER-36을 강하게 발현하는 유방암 세포주이다 [Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Marc Lacroix, Guy Leclercq, Breast Cancer Research and Treatment (2004) 83, 249-289; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.103: 9063-9068 (2006)]. ATCC로부터 입수한 MCF7 세포를 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 10% 우태아 혈청에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. 세포를 96웰 플레이트에 웰당 6x103 세포의 밀도로 충전하였다. MCF 7 세포를 0, 0.3μM, 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM, 20μM, 30μM, 50μM 및 100μM의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. 처리된 세포를 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 어세이 키트 (Promega)로 검사하고, 발광을 Envision으로 기록하였다.
표 3은 본 발명의 일부 화합물에 의해 영향을 받은 각종 유방암 세포의 생존력을 나타낸다.
화합물 번호 유방암 세포의 생존력 억제 IC50 (μM)
MDA-MB-231 세포 MCF7 세포
타목시펜a) 20.90±1.51b) 22.55±4.15
1 1.066 2.012
2 NAc ) 3.167
3 2.867 8.603
4 4.325 16.011
5 4.476 6.854
6 1.875 6.854
7 9.303 7.542
9 NA NA
10 NA 31.46
a) 양성 대조군 화합물로서의 타목시펜
b) 화합물을 3회 이상 시험할 때, IC50은 평균값±표준 편차로 나타냈다.
c) NA는 불활성을 의미하고, IC50은 100μM 초과이었다.
d) ND는 미검출을 의미한다.
실시예 18: 화합물에 의한 만성 백혈병 세포의 시험관내 성장 억제
A: 시험관내 CellTiter-Glo® 발광 어세이에 의한 만성 백혈병 세포 K562에 대한 생존력 검출
ATCC로부터 입수한 만성 백혈병 세포 K562를 IMDM 및 10% 우태아 혈청에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. 상기 세포를 96웰 배양 플레이트에 웰당 6x103 세포의 농도로 접종(seed)하였다. K562 세포를 0, 0.3μM, 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM, 20μM, 30μM, 50μM 및 100μM의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. 처리된 세포를 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 어세이 키트 (Promega)로 검사하고, 발광을 Envision으로 기록하였다.
실시예 19: 화합물에 의한 인간 B 림프종 Daudi 세포의 시험관내 성장 억제
A: 시험관내 CellTiter-Glo® 발광 어세이에 의한 인간 B 림프종 Daudi 세포에 대한 억제
ATCC로부터 입수한 인간 B 림프종 Daudi 세포를 IMDM 및 10% 우태아 혈청에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. 상기 세포를 96웰 배양 플레이트에 웰당 6x103 세포의 농도로 접종하였다. 인간 B 림프종 Daudi 세포를 0, 0.3μM, 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM, 20μM, 30μM, 50μM 및 100μM의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. 처리된 세포를 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 어세이 키트 (Promega)로 검사하고, 발광을 Envision으로 기록하였다.
표 4는 본 발명의 일부 화합물에 의해 영향을 받은 만성 백혈병 세포 K562 및 인간 B 림프종 Daudi 세포의 생존력을 나타낸다.

화합물 번호		 세포의 시험관내 생존력 억제 IC50 (μM)
K562 세포 Daudi 세포
글리벡a)
시타라비넨		 0.751
ND		 NDb )
10.033
1 1.035 0.824
2 6.139 9.234
3 1.849 2.909
4 0.974 2.638
5 1.475 1.486
6 0.935 1.983
7 6.140 4.068
10 NA 21.75
11 NA NA
a) 글리벡 및 시타라비넨은 각각 K562 세포 모델 및 Daudi 세포 모델에 대해 양성 대조군이었다.
b) Nd를 미검출을 의미한다.
C) NA는 불활성을 의미하고, IC50은 100μM 초과이었다.
실시예 20: 화합물에 의한 급성 백혈병 세포의 시험관내 성장 억제
A: MTT 방법으로 검출된 화합물에 의한 급성 골수모세포성 백혈병 HL-60 세포의 성장 억제
ATCC로부터 입수한 급성 골수모세포성 백혈병 HL-60 세포를 IMDM 및 10% 우태아 혈청에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. 상기 세포를 96웰 배양 플레이트에 웰당 6x103 세포의 농도로 접종하였다. HL-60 세포를 0, 10-4M, 10-5M, 10-6M, 10-7M 및 10-8M의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. MTT 방법에 의해 OD 값을 시험하고, 억제율을 산출하였다.
B: MTT 방법으로 검출된 화합물에 의한 급성 림프구성 백혈병 Molt-4 세포의 성장 억제
ATCC로부터 입수한 급성 림프구성 백혈병 Molt-4 세포를 RPMI-1640 및 10% 우태아 혈청에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. 상기 세포를 96웰 배양 플레이트에 웰당 6x103 세포의 농도로 접종하고, RPMI-1640 및 10% 우태아 혈청에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. Molt-4 세포를 0, 10-4M, 10-5M, 10-6M, 10-7M 및 10-8M의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. MTT 방법에 의해 OD 값을 시험하고, 억제율을 산출하였다.
본 발명의 일부 화합물에 의해 영향을 받은 각종 백혈병 세포의 생존력을 하기 표 5에 나타낸다.

화합물 번호		 10-6M 농도의 시험 화합물에 의한 세포 증식의 억제율 (%)
HL-60 세포 Molt-4 세포
독소루비신a) 79.0 90.1
1 60.7 43.7
2 Nab ) NA
3 28.5 14.4
4 0.974 14.7
5 59.8 69.4
6 61.9 67.4
7 NA 57.0
9 NA NA
11 NA NA
a): 양성 대조군 화합물로서의 독소루비신
b): NA는 불활성을 의미하며, 10-6M 농도의 화합물에 의한 억제율은 10%이었다.
실시예 21: 화합물에 의한 간암 세포의 시험관내 억제
A: SRB 방법으로 검출된 화합물에 의한 간암 세포 BEL-7402의 억제
ATCC로부터 입수한 간암 세포 BEL-7402를 DMDM, 10% NCS 및 50 μg/mL KANA에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하고, 96웰 배양 플레이트에 웰당 6x103 세포의 농도로 접종하였다. BEL-7402 세포를 0, 10-4M, 10-5M, 10-6M, 10-7M 및 10-8M의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. SRB 방법에 의해 OD 값을 시험하고, 억제율을 산출하였다.
본 발명의 일부 화합물에 의한 간암의 억제율을 하기 표 6에 나타낸다.

화합물 번호		 10-6M 농도의 시험 화합물에 의한 세포 증식의 억제율 (%)
BEL-7402 세포
독소루비신a) 55.2
1 23.7
2 21.8
3 28.6
4 46.4
5 15.6
6 14.9
7 19.8
9 11.7
10 17.4
a) 양성 대조군 화합물로서의 독소루비신
실시예 22: 화합물에 의한 위암 세포의 시험관내 억제
A: MTT 방법에 의한 화합물에 의한 위암 세포 BGC-823의 억제
위암 BGC-823 세포를 96웰 배양 플레이트에 웰당 3x103 세포의 농도로 접종하고, 2.5% CS-FBS를 함유하는 페놀 레드 무함유 DMEM 배지에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. BGC-823 세포를 0, 1μM, 2μM, 4μM, 8μM, 10μM 및 20μM의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. MTT 방법에 의해 OD 값을 시험하고, 억제율을 산출하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.
실시예 23: 화합물에 의한 폐암 세포의 시험관내 억제
A: MTT 방법에 의한 화합물에 의한 폐암 세포 H460의 억제
폐암 H460 세포를 96웰 배양 플레이트에 웰당 4.0x103 세포의 농도로 접종하고, 2.5% CS-FBS를 함유하는 페놀 레드 무함유 배지에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. H460 세포를 0, 1μM, 2μM, 4μM, 8μM, 10μM 및 20μM의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. MTT 방법에 의해 OD 값을 시험하고, 억제율을 산출하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
실시예 24: 화합물에 의한 결장암 세포의 시험관내 억제
A: MTT 방법에 의한 화합물에 의한 결장암 세포 LS174T의 시험관내 억제
결장암 LS174T 세포를 96웰 배양 플레이트에 웰당 4.5x103 세포의 농도로 접종하고, 2.5% CS-FBS를 함유하는 페놀 레드 무함유 1640 배지에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. LS174T 세포를 0, 1μM, 2μM, 4μM, 8μM, 10μM 및 20μM의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. MTT 방법에 의해 OD 값을 시험하고, 억제율을 산출하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
실시예 25: 화합물에 의한 췌장암 세포의 시험관내 억제
A: MTT 방법에 의한 화합물에 의한 췌장암 세포 PANC-1의 시험관내 억제
췌장암 PANC-1 세포를 96웰 배양 플레이트에 웰당 3x103 세포의 농도로 접종하고, 2.5% CS-FBS를 함유하는 페놀 레드 무함유 1640 배지에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다. PANC-1 세포를 0, 1μM, 2μM, 4μM, 8μM, 10μM 및 20μM의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. MTT 방법에 의해 OD 값을 시험하고, 억제율을 산출하였다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.
실시예 26: 화합물에 의한 전립선암 세포에 대한 억제
A: MTT 방법에 의한 화합물에 의한 전립선암 세포 PC-3의 시험관내 억제
전립선암 PC-3 세포를 96웰 배양 플레이트에 웰당 3x103 세포의 농도로 접종하고, 10% F12K 우태아 혈청을 함유하는 배지에서 유지하였다. PC-3 세포를 0, 1μM, 2μM, 4μM, 8μM, 10μM 및 20μM의 농도로 DMSO에 용해된 시험 화합물로 72시간 동안 처리하였다. MTT 방법에 의해 OD 값을 시험하고, 억제율을 산출하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
생체내 어세이:
실시예 27: 화합물에 의한, 누드 마우스에서의 인간 유방암 BCAP-37 세포 이종이식 종양의 성장 억제
유방암 이종이식의 누드 마우스를 시험 화합물로 처리하여 종양 성장 억제에 대한 이들의 효과를 시험하였다. 종양 조직을 BCAP-37 유방암을 가지는 누드 마우스로부터 채취하고, 작은 조각으로 절단하였다. 여러 조각의 종양 조직을 암컷 누드 마우스의 우측 앞 다리 아래의 겨드랑이에 이식하였다. 이식 후, 마우스에 6일 동안 1일마다 1회 마우스당 7μg의 용량으로 E2β 용액을 공급하여 실험 마우스에서의 종양 성장을 자극하였다. 7일째부터, 화합물 및 옥수수 오일을 함유하는 시험 용액을 마우스에 35 ㎎/kg의 용량으로 위내 투여하였다. 타목시펜을 양성 대조군으로 사용하였다. 옥수수 오일을 음성 대조군으로 사용하였다. 옥수수 오일 용액에 시험 화합물을 분산시켜 시험 화합물을 제조하였다 (20 ㎎/mL). 마우스에 15일 동안 1일마다 1회 35 ㎎/kg의 용량으로 시험 화합물 및 타목시펜을 공급하거나 옥수수 오일을 공급하였다. 이어서, 마우스를 희생시키고, 종양 조직을 절개하고 칭량하였다. 종양 성장 억제율은 다음 식을 사용하여 계산된 백분율이다: 종양 성장 억제율 = (음성 대조군에서 종양의 평균 중량 - 시험 화합물로 처리된 종양의 평균 중량) / 음성 대조군에서 종양의 평균 중량. 그 결과를 도 9에 막대 그래프로 도시한다.
실시예 28: 화합물에 의한, 누드 마우스에서의 인간 B 세포 림프종 Daudi 이종이식 종양의 성장 억제
인간 B 세포 림프종 Daudi 이종이식 종양의 누드 마우스를 종양 성장 억제에 대한 이들의 효과를 시험하기 위해 시험 화합물로 처리하였다. 인간 B 세포 림프종은 ATCC로부터 입수하였다. 5 세대 후, 0.2mL 마트리겔을 가지는 1x107 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 앞 다리 아래의 겨드랑이에 이식하였다. 누드 마우스의 종양이 150mm3 내지 200mm3에 도달하면, 종양 누드 마우스를 무작위로 분류하였다. 모든 10마리의 누드 마우스는 하나의 그룹에 속한다. 혼합 오일의 위내 투여는 음성 대조군이었고, 리툭시맙의 정맥내 투여는 양성 대조군이었다. 시험 화합물을 혼합 오일에 용해시켰다. 투여 기간은 21일 지속적이고, 시험 화합물을 함유하는 혼합 오일 현탁액 (35 ㎎/kg)을 1일마다 1회 양성 군의 누드 마우스에 투여하였다. 리툭시맙 (20 ㎎/kg)을 7일마다 2회 양성 대조군에 주사하였다. 혼합 오일의 음성 군에 매일 위내 투여하였다. 투여 기간 동안, 종양 체적 및 누드 마우스 중량을 1주일마다 2회 측정하였다. 종양 체적 투여 시간에 기초하여 종양 성장 곡선을 도시하고 (도 10 참조), 이로써 종양의 성장에 대한 화합물의 효과를 추정할 수 있다.
실시예 29: 화합물에 의한 인간 자궁내막암 Ishikawa 세포 이종이식의 성장 억제
인간 자궁내막암 Ishikawa 세포 이종이식 종양의 누드 마우스를 종양 성장 억제에 대한 이들의 효과를 시험하기 위해 시험 화합물로 처리하였다. Ishikawa 세포를 가지는 누드 마우스로부터 종양을 채취하고, 작은 조각으로 절단하였다. 작은 조각의 종양을 암컷 누드 마우스의 우측 앞 다리 아래의 겨드랑이에 이식하였다. 이식 후, 마우스에 6일 동안 1일마다 1회 마우스당 7μg의 용량으로 E2β 용액을 주사하여 실험 마우스에서의 성장을 자극하였다. 7일째부터, 시험 화합물 및 옥수수 오일을 함유하는 시험 용액을 마우스에 35 ㎎/kg의 용량으로 위내 투여하였다. 메드록시프로게스테론 아세테이트를 양성 대조군으로 사용하였다. 혼합 오일을 음성 대조군으로 사용하였다. 혼합 오일에 시험 화합물을 분산시켰다 (20 ㎎/mL). 15일 내지 21일 동안 35 ㎎/kg의 용량으로 시험 화합물, 메드록시프로게스테론 아세테이트 및 혼합 오일을 마우스에 각각 투여하였다. 이어서, 마우스를 희생시키고, 종양 조직을 절개하고 칭량하였다. 종양 성장 억제율은 다음 식을 사용하여 계산된 백분율이다: 종양 성장 억제율 = (음성 대조군에서 종양의 평균 중량 - 시험 화합물로 처리된 종양의 평균 중량) / 음성 대조군에서 종양의 평균 중량. 그 결과를 도 11에 막대 그래프로 도시한다.

Claims (12)

  1. 하기 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
    [식 (I)]
    Figure 112019044743859-pct00032

    여기서,
    R1은 수소이고;
    R2, R3, R5 및 R6은 독립적으로 수소, (C1-4) 알킬, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-4) 알킬, 할로겐, 시아노, 및 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-4) 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-4) 알킬이다.
  2. 청구항 1에 있어서, 하기 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
    [식 (I)]
    Figure 112019044743859-pct00033

    여기서,
    R1은 수소이고;
    R2, R3, R5 및 R6은 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 할로겐, 시아노, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-4) 알킬, 및 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-4) 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 (C1-4) 알킬이다.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 화합물은
    2-(4-트리플루오로메틸페닐)-3,5,7-트리하이드록시-8-(3-메틸-2-부텐-1-일)-4H-크로멘-4-온
    인, 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  8. ER-α36 관련 암의 예방 또는 치료를 위한, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여, 치료 유효량의 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 약제학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 암은 유방암, 간암, 폐암, 결장암, 췌장암, 자궁내막암, 백혈병, 위암, 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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