ES2627316T3 - Síntesis del compuesto de polihidroxi benzopirano cetona y efecto antitumoral del mismo - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (I) **Fórmula** o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: R2, R3, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-4), alquilo (C1-4) sustituido con uno o más átomos de halógeno, halógeno, ciano y alcoxi (C1-4) sustituido con uno o más átomos de halógeno, y R4 es alquilo (C1-4) sustituido con uno o más átomos de halógeno.

Description

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Sfntesis del compuesto de polihidroxi benzopirano cetona y efecto antitumoral del mismo Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a compuestos de polihidroxi cromenona, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y una composicion farmaceutica que comprende los compuestos o similares. La presente invencion se refiere tambien al uso de los compuestos, sus sales farmaceuticamente aceptables, y una composicion farmaceutica en la preparacion de un medicamento para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con el tumor.

Estado de la tecnica

Los estrogenos son un grupo de hormonas que estan implicadas en muchas funciones fisiologicas crfticas en el cuerpo humano. Las funciones de los estrogenos incluyen la promocion del desarrollo de los organos sexuales femeninos, la preparacion completa de la mama y el utero para el embarazo y la lactancia materna despues del parto. Los estrogenos tambien juegan un papel importante en el mantenimiento de las funciones cardiovasculares adecuadas y la densidad osea. Es bien sabido que los estrogenos pueden estimular la proliferacion celular y pueden aumentar el riesgo de las mujeres que sufren de cancer, especialmente cancer de mama y cancer de utero.

Los estrogenos se unen a receptores de estrogenos en celulas diana para regular las funciones celulares. Dos tipos de receptores de estrogeno se encuentran en las celulas humanas (ER), ER-a y ER-p. Tienen una estructura de protefna similar, cada uno tiene tres dominios de funcion separados pero interactuantes: dominio terminal N (dominio A/B), dominio de union al ADN central (dominio C) y dominio de union al ligando terminal C (dominio D/E/F). El dominio terminal N tiene una funcion de activacion independiente del ligando (AF-1), que esta implicada en la interaccion con coactivadores y la activacion transcripcional de genes diana en ausencia de ligandos. El dominio de union al ADN desempena un papel importante en la dimerizacion del receptor y la secuencia de ADN especial de union. El dominio de union al ligando terminal C media la union al ligando y tiene una funcion de transactivacion dependiente del ligando (AF- 2), para activar la transcripcion genica en presencia de ligandos.

El ER -a de longitud completa se identifica como una protefna de 66 kDa y se denomina ER-a66. ER-a66 contiene los tres dominios de funcion. Una variante de empalme de ER-a66 se descubre posteriormente y se denomina como ER- a46. ER-a46 tiene un peso molecular de aproximadamente 46KDa y carece del dominio AF-1 terminal N de ER-a66. Recientemente, se identifico una novedosa variante de ERa de 36kDa, se identifica ER-a36. Carece del dominio AF-1 terminal N y del dominio AF-2 terminal C de ER-a66 (Wang et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 336, 1023-1027 (2005)).

Se cree que ER-a66 media la proliferacion celular estimulada por estrogenos a traves de la activacion transcripcional de sus genes diana. La union de estrogeno a ER-a66 activa el dominio de transactivacion de ER-a66 y por lo tanto estimula la expresion de genes diana en direccion 3' y conduce eventualmente a la proliferacion celular. ER-a46 se encuentra para mediar la sfntesis de NO rapida iniciada por la membrana y estimulada con estrogenos (Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 100: 4807-4812 (2003)). Tambien se muestra que ER-a46, que carece del dominio AF-1, inhibe la actividad de AF-1 de ER-a66 (Flouriot, G., EMBO, 19, 4688-4700, (2000)). Dado que ER-a36 carece de ambos dominios de activacion transcripcional AF-1 y AF-2, este funciona como un inhibidor negativo dominante para inhibir ambas funciones de AF-1 y AF-2 de ER-a y ER-p. Ademas, el ER-a36 se localiza principalmente en la membrana de plasma y media la senalizacion mitogenica de estrogenos iniciada por membrana que estimula la proliferacion celular. (Wang et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 336, 1023-1027 (2005); Wang et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA 103: 9063-9068 (2006)).

Estudios extensos han mostrado que la senalizacion de estrogenos esta mediada a traves de vfas clasicas de activacion de la transcripcion nuclear, asf como vfas de senalizacion iniciadas por membrana no clasicas. Parece que tanto ER- a66 como ER-a46 funcionan principalmente en el nucleo, mientras ER-a36 funciona principalmente por fuera del nucleo.

Tambien se muestra que ER-a36 carece de la helice 8-12 del dominio de union al ligando del ER-a66 original, que cambia totalmente la especificidad de union al ligando de ER-a36. De este modo, ER-a36 se puede unir a diferentes ligandos de los unidos a ER-a66 y ER-a.

Como las enfermedades relacionadas con el receptor de estrogeno continuan afectando a muchos individuos, sigue existiendo la necesidad urgente de descubrir nuevos compuestos y metodos utiles para prevenir y/o tratar tales enfermedades.

El documento CN101104611 describe un compuesto 3-metoxi-flavonoide que se puede usar como un farmaco contra el cancer.

El documento CN102018698 describe composiciones farmaceuticas y metodos para modular las funciones del receptor de estrogeno hER-alfa36, para prevenir y/o tratar enfermedades mediadas por el receptor de estrogeno hER-alfa36, para prevenir y/o tratar la osteoporosis, para inducir la muerte celular y/o inhibir la proliferacion celular y para prevenir y/o tratar enfermedades que implican una proliferacion celular anormal tal como canceres.

5 El documento WO2011047595 describe el uso de compuestos de hidroxibenzopirona en la preparacion de medicamentos utiles para tratar la leucemia.

El documento WO2008100977 describe esteres de acidos alquilcarbamicos que son inhibidores de la actividad de la amida hidrolasa de acidos grasos (FAAH). Tambien se describen procesos para la preparacion de esteres de compuestos de acido alquilcarbamico, composiciones que los incluyen, y metodos de uso de los mismos.

10 Resumen de la invencion

La presente invencion proporciona compuestos de cromenona mostrados como formula (I), o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, para modular el nuevo receptor de estrogeno ER-a36 y una composicion farmaceutica que comprende los compuestos o similares.

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15 En la que:

R2, R3, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo (C1-4), alquilo (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno, halogeno, ciano, alcoxi (C1-C4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno; y R4 es alquilo (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno.

Breve descripcion de las figuras

20 La figura 1 muestra resultados de Western blot que representan la expresion de ER-a66, ER-a46 y ER-a36 en muestras de cancer de mama humano. Carril 1: tejido de mama normal; Carril 2: carcinoma ductal infiltrante; Carril 3: carcinoma ductal infiltrante; Carril 4: carcinoma ductal invasivo; Carril 5: carcinoma lobular infiltrante; Carril 6: carcinoma lobular infiltrante; Carril 7: carcinoma ductal no invasivo.

La figura 2 (figura superior) muestra el resultado de tincion por inmunofluorescencia de celulas MDA-MB-231. Las 25 celulas MDA-MB-231 son lfneas celulares ER-negativas de cancer de mama que carecen de ER-a66 y ER-a46, tenidas con un anticuerpo que se une especfficamente a ER-a36 (se muestra en la figura izquierda marcada con "ER-a36 Ab": positivo mostrado en verde). El nucleo celular tambien se tine con 4,6-diamidina-2-fenilindol (mostrado en la figura central marcada con "DAPI": tincion positiva mostrada en azul). Las senales de tincion fusionadas se muestran en un carril con la etiqueta "merge". Se observa tincion negativa cuando el anticuerpo se preincuba con peptidos inmunogenos 30 que se unen al anticuerpo (figura inferior).

La figura 3 muestra resultados de Western blot que representan la expresion de ER-a36 en diferentes lfneas celulares tumorales. Carril 1: 293 lfneas celulares epiteliales renales humanas que tienen expresion transitoria de ER-a36; Carril 2-4: lfneas celulares SK-BR-3 de cancer de mama humano de diferentes laboratorios; Carriles 5-7: lfneas celulares MCF-7 de cancer de mama humano de diferentes laboratorios; Carril 8-9: lfneas celulares HL-60 de leucemia humana 35 de diferentes laboratorios; Carril 10-11: lfneas celulares MV-4-11 de leucemia humana de diferentes laboratorios; Carril 12-13: lfneas celulares K562 de leucemia mieloide cronica humana de diferentes laboratorios; Carril 14: lfnea celular A2780 de cancer de hfgado; Carril 15: lfnea celular HEL-7402 de cancer de hfgado; Carril 16: lfnea celular HEL-9204 de cancer de hfgado; Carril 17: lfnea celular primaria Hep-11 de cancer de hfgado de un paciente; Carril 18: lfnea celular primaria Hep-12 de cancer de hfgado de un paciente.

40 La figura 4-8 muestra la inhibicion in vitro de la lfnea celular BGC-823 de cancer gastrico, la lfnea celular H460 de cancer de pulmon, la lfnea celular LS174T de carcinoma de colon, la lfnea celular PANC-1 de cancer de pancreas y la lfnea celular PC-3 de cancer de prostata con el compuesto 1, ensayado por el metodo MTT. Los resultados muestran

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que el compuesto 1 tiene una inhibicion dominante en estas celulas de cancer con una buena dosis de dependencia. IC50 esta en el intervalo de 1-4pM.

La figura 9 muestra el peso medio del tumor (bar a) de ratones desnudos que portan tumor de cancer de mama humano BCAP-37 despues de 20 dfas de administracion continua respectivamente con control positivo de tamoxifeno (0.7 mg/raton/dfa), compuesto 1 (0.7 mg/raton/dfa) y el control negativo del vehfculo (0.2 mg/raton/dfa), y el resultado muestra la inhibicion del compuesto sobre los tumores.

La figura 10 muestra la curva de crecimiento tumoral de celulas Daudi de linfoma B humanas que llevan ratones desnudos administrados continuamente respectivamente con control positivo de rituximab, compuesto 1 (0.7 mg/raton/dfa) y control negativo de vehfculo (0.2 mL/raton/dfa) durante 21 dfas.

La figura 11 muestra el peso medio del tumor del carcinoma endometrial humano Ishikawa que lleva ratones desnudos despues de 20 dfas de administracion continua respectivamente con control positivo de DMPA (acetato de progesterona depomedroxi) (120 mg/kg), compuesto 1 de dosis baja (17.5 mg/kg), dosis media (35 mg/kg), dosis alta (70 mg/kg) y control negativo del vehfculo (0.2 mL/raton/dfa). El compuesto 1 tiene una inhibicion dominante en el crecimiento tumoral de ratones portadores de tumores, y el efecto de inhibicion es mayor que el del farmaco de control.

Descripcion detallada de la invencion

Compuestos y derivados

En algunas realizaciones de la presente invencion, se proporcionan los compuestos de cromenona, las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos y la composicion farmaceutica que comprende el compuesto o similares. Pueden funcionar para regular el receptor de estrogeno ER-a36, prevenir y/o tratar la enfermedad mediada por el receptor ER-a36, tal como cancer, etc.

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I), las sales farmaceuticamente aceptables del mismo, y la composicion farmaceutica que comprende el compuesto o similares, en la que:

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R2, R3, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo (C1-4), alquilo (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno, halogeno, ciano, y alcoxi (C1-C4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno; y R4 es alquilo (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno.

En una cierta realizacion, el compuesto de formula (I) comprende los compuestos

en los que:

R2, R3, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, alquilo (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno, halogeno, ciano, y alcoxi (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno; y R4 es alquilo (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno.

Tambien se describen en este documento, como referencia, compuestos de formula (III) que tienen la siguiente estructura:

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En la que,

R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo (C1-C4), alquilo (C1- C4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno, halogeno, ciano, y alcoxi (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno, y R2, R3, R4, R5 y R6 no son simultaneamente hidrogeno,

y cuando R3 y R5 son hidrogeno, R4 no es cloro.

Los compuestos especialmente preferidos de formula (I) estan comprendidos, pero no limitados a los siguientes compuestos:

2-(4-trifluorometilfenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona.

Los siguientes compuestos se describen en este documento como referencia:

2-(4-fluorofenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona;

2-(3-fluoro-4-clorofenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona;

2-(4-clorofenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona;

2-(4-trifluorometoxifenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4 -ona;

2-(3,4-diclorofenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona;

2-(3-trifluorometil-4-clorofenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona;

2-(4-bromofenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona;

2-(3,4-difluorofenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen -4-ona;

2-(4-trifluorometilfenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona;

2-(4-trifluorometoxifenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona;

2-(3-trifluorometil-4-clorofenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona;

2-(4-bromofenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona;

Los compuestos y los derivados de los mismos en la presente invencion se nombran de acuerdo con el sistema de nomenclatura IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) o el Sistema de Nomenclatura CAS (Chemial Abstract Service, Columbus, OH)

Los siguientes son la definicion de los terminos utilizados en la presente invencion. A menos que se indique lo contrario, las definiciones primarias de los grupos o los terminos que comprenden un grupo independiente o una parte de otros grupos son aplicables a toda la descripcion.

El termino “sustituido” significa que un atomo de hidrogeno de una molecula ha sido reemplazado por un atomo o molecula diferente. El atomo o molecula que reemplaza al atomo de hidrogeno se designa como un "sustituyente".

El valor mfnimo y maximo del numero de atomo de carbono del CnHn- se indica con el prefijo, tal como, el prefijo de alquilo (Ca-Cb) significa cualquier grupo alquilo que comprende el numero de atomos de carbono desde "a" a "b". De este modo, tal como alquilo (C1-C6) significa el alquilo que comprende atomos de carbono desde 1 a 6.

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El termino "alcoxi" significa el grupo lineal o ramificado de cadena grasa monovalente saturado unido con un atomo de oxfgeno en un extremo, incluyendo, pero no limitado a metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, iso-butoxi, tert-butoxi o similares.

El termino "alquilo" significa, cadena grasa saturada lineal o ramificada, monovalente, que comprende, pero no se limita al grupo tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo, iso-pentilo, hexilo o similares.

El termino "halogeno" o "atomo de halogeno" significa el atomo de cloro, bromo, fluor y yodo o el grupo correspondiente.

El termino “heteroarilo” significa un grupo aromatico de monociclo o policiclo en el que uno o mas atomos de carbono estan sustituidos por uno o mas heteroatomos tales como nitrogeno, oxfgeno o azufre. Ejemplos de anillos heterocicloalquilo incluyen pero no se limitan a benzofuranilo, benzotiofenilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, benzopiranilo, furilo, imidazolilo, indazolilo, indolizinilo, indolilo, isobenzofurilo, isoindolilo, isoquinolilo, isotiazol, isoxazol, naftiridinilo, oxadizolilo, oxazinilo, oxazolilo, ftalazinilo, pteridinilo, guaninilo, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, piridazinilo, pirido [3,4-b] indolilo, piridinilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, quinolizilo, quinolinilo, quinoxalinilo, tiadizolilo, tiatrizolilo, tiazolilo, tienilo, triazinilo, triazolilo, xantenilo o similares.

El termino "-oxo" significa un grupo carbonilo formado por la combinacion de un(os) atomo(s) de carbono y un(os) atomo(s) de oxfgeno.

Tambien se consideran los solvatos de los compuestos de la presente invencion. Tambien se describen profarmacos en este documento. El termino "profarmaco" se refiere a un compuesto que es un precursor de farmaco que, tras la administracion a un sujeto, libera el farmaco activo in vivo a traves de un proceso qufmico o el metabolismo (por ejemplo, al ser llevado a pH fisiologico o a traves de la actividad enzimatica). Se puede encontrar una discusion de la sfntesis y uso del profarmaco en "Produgs as Novel Delivery Systems", vol. 14 of the ACS Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987. El termino "profarmaco" puede incluir un precursor metabolico de un compuesto de la presente invencion. El profarmaco puede ser inactivo cuando se administra a un sujeto, pero se puede convertir in vivo en un compuesto de formula (I) de la invencion. El profarmaco puede ser compuesto naturalmente existente o compuestos de sfntesis.

El compuesto de formula (I) en la presente invencion puede estar en una forma no solvatada, o solvatada, tal como farmaceuticamente hidratada, etanolada o similares. Y se pretende que la presente invencion incluya todos los solvatos y no-solvatos de los compuestos. El solvato preferido del compuesto de formula (I) es hidrato.

Todos los estereoisomeros de los compuestos, tales como posibles estereoisomeros a partir del atomo de carbono asimetrico del grupo sustituyente R de formula (I) incluyendo enantiomero y diastereoisomero estan dentro del alcance de la presente invencion. La estereoisomerfa y la mezcla de los compuestos mostrados en la formula (I) incluyendo la mezcla racemica son tambien parte de la presente invencion. Ademas, todos los isomeros geometricos e isomeros de posicion tales como, si el compuesto de formula (I) tiene un doble enlace, el cis y el trans y la mezcla de los mismos estan todos dentro del alcance de la presente invencion.

Las mezclas diasteriomericas se pueden separar en sus diastereomeros individuales sobre la base de sus diferencias qufmicas ffsicas por metodos bien conocidos para los expertos en el arte tales como por cromatograffa y/o cristalizacion fraccionada. Los enantiomeros se pueden separar convirtiendo la mezcla enantiomerica en una mezcla diastereomerica por reaccion con un compuesto opticamente activo apropiado, separando luego los diastereomeros y convirtiendo (por ejemplo, hidrolizando) los diastereomeros a los correspondientes enantiomeros puros.

Ademas, algunos de los compuestos de formula (I) pueden ser atropisomeros (por ejemplo, biarilos sustituidos), que tambien se consideran como parte de la invencion.

La expresion "farmaceuticamente aceptable" indica que el portador, vehfculo, diluyentes, excipiente(s), y/o sal es/son generalmente compatibles qufmica y/o ffsicamente con los otros ingredientes que comprenden la formulacion y fisiologicamente compatibles con el receptor de los mismos.

El termino “sales” y “sales farmaceuticamente aceptables” se refieren a sal de acido y/o sal de base formada por compuestos de formula (I) o estereoisomero de los mismos y base y acido inorganico y/u organico. Las sales y sales farmaceuticamente aceptables tambien comprenden sal anfotera (sal intramolecular) y sal de amonio cuaternario tal como sal de alquilamonio. Las sales se pueden obtener directamente despues del aislamiento y purificacion. Ademas, las sales se pueden obtener a partir de los compuestos de formula (I) o el estereoisomero, profarmaco de los mismos, mezclado con acido o base apropiados (por ejemplo, equivalente). Las sales se pueden recoger filtrando el precipitado de la solucion o por evaporacion del solvente, o por liofilizacion despues de la reaccion en el medio acuoso.

Las sales de adicion de acido incluyen bromhidrato, yodhidrato, clorhidrato, sulfato, hidrosulfato, nitrato, acetato (incluyendo las sales formadas con acido acetico o tricloroacetico, por ejemplo, trifluoroacetico), oxalato, alginato, ascorbato, aspartato, butirato, alcanfor, alcanfor sulfonato, propionato de ciclopentilo, digluconato, etilen sulfonato, 2- hidroxietilsulfonato, 2-naftaleno sulfonato, nicotinato, persulfato, 3-fenil propionato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, benceno sulfonato, palmitato, estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato,

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fumarato, succinato, tartrato, tiocianato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, dodecilsulfonato, adipato o similares.

Las sales basicas (por ejemplo: la sal formada con carboxi o fenoxi del sustituyente R) incluyen amonio, la sal de metal alcalino (tal como sodio, litio y potasio), metal alcalinoterreo (tal como calcio y magnesio), la sal formada con una base organica (tal como amina organica) (incluyendo, pero sin limitarse a, dibenciletilenamina, diciclohexilamina, hidrabamina, N-metil-D-glucosamina, tetrabutilamina) y las sales formadas con aminoacidos tales como arginina, lisina o similares. Ademas, las sales basicas incluyen amonio cuaternario formado con un agente alcalino que comprende nitrogeno, y no se limita a amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina o similares. Para ejemplos adicionales vease, Berge, et al., J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977).

Tambien es posible que los compuestos de formula (I) puedan existir como isomeros tautomeros en equilibrio, y todas estas formas se incluyen dentro del alcance de la invencion.

En una realizacion, los compuestos marcados isotopicamente de formula (I), que son identicos a los citados en este documento, pero por el hecho de que uno o mas atomos es/estan reemplazados por otro atomo que tiene una masa atomica o un numero de masa diferente de la que comunmente existe en la naturaleza se proporcionan en la presente invencion. Ejemplos de isotopos que se pueden incorporar en compuestos de formula (I) incluyen isotopos de

__i____________wf_____________________4._|_______2U 3U 13^ 14^ 15m 17 q 18q 31 p 32p 350 18,—

S, 18f

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hidrogeno, carbono, nitrogeno, oxfgeno, fosforo, fluor y cloro, tales como H, H, C, C, N

y 36Cl. Los compuestos de formula (I) que comprenden los isotopos anteriores y/o los de otros atomos, sus estereoisomeros y las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos o estereoisomeros estan destinados a estar dentro del alcance de la presente invencion.

Algunos compuestos marcados isotopicamente de formula (I), por ejemplo, los compuestos marcados con 3H y 14C o similares se pueden usar en ensayos de distribucion de tejidos de compuesto y/o sustrato. Debido a que los isotopos de tritio (esto es, 3H) e isotopos de carbono 14 (esto es, 14C) son particularmente preferidos por su relativa facilidad de preparacion y facil deteccion. Ademas, algunos isotopos tales como deuterio (esto es, 2H) pueden proporcionar ciertas ventajas terapeuticas resultantes de una mayor estabilidad metabolica, (por ejemplo, semivida aumentada in vivo, o requisitos de dosificacion reducidos) y, por tanto, pueden ser preferidos en algunas circunstancias. Los compuestos marcados isotopicamente de formula (I) se pueden preparar generalmente por metodos conocidos para un experto en el arte, tales como sustituyendo un reactivo marcado isotopicamente por reactivo no marcado isotopicamente.

Uso de la invencion

El compuesto de la presente invencion es un nuevo modulador para el receptor de estrogeno ER-a36, y puede modular la funcion de ER-a36 en celulas in vivo e in vitro. Por lo tanto, el compuesto de formula (I) de la presente invencion se puede usar para el tratamiento y/o la prevencion de las enfermedades a traves de ER-a36, especialmente relacionadas con el tumor.

Tambien se describe en este documento un metodo para modular la funcion de ER-a36 en las celulas. El metodo comprende administrar el compuesto de formula (I) a celulas que expresan de forma endogena o exogena ER-a36 por ingenierfa genetica, tambien, a celulas con o sin otro receptor de estrogenos (tales como ER-a66, ER-a46 y ER -p). En un metodo descrito, las celulas expresan de forma endogena ER-a36. En otro metodo descrito, la celula es una celula cancerosa que expresa de forma endogena ER-a36. Las celulas que expresan ER-a36 comprenden, pero no se limitan a, las celulas de cancer de mama, leucemia, cancer de hfgado, linfoma, cancer de pulmon, mieloma, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer endometrial, cancer de colon y cancer gastrico. En un metodo adicional descrito en el presente documento, las celulas que expresan ER-a36 son cancer de mama, leucemia, cancer de hfgado, linfoma, cancer endometrial y celulas de cancer de ovario que expresan de forma endogena ER-a36. Las celulas de cancer de mama que expresan ER-a36 comprenden, pero no se limitan a las celulas de MCF7, MDA-MB-231 y SKBR-3. Las celulas de leucemia comprenden, pero no se limitan a, las celulas de K562, MV-4-11, SUM159, HL-60 y Molt-4. Las celulas de cancer endometrial que expresan ER-a36 comprenden, pero no se limitan a las celulas Hec1A. Las celulas de cancer de hfgado que expresan ER-a36 comprenden, pero no se limitan a A2780, BEL7402, BEL7404, HEL-9204, Hep2G, Hep3B y celulas madre de cancer hepatico primario Hep-12 originadas de pacientes. Las celulas de linfoma que expresan ER-a36 comprenden, pero no se limitan a Daudi. La expresion de ER-a36 endogeno se puede aumentar o disminuir mediante el tratamiento de un reactivo que comprende suero, E2p (17p-estradiol), tamoxifeno y fulvestrant. (ICI 182.780)

Tambien se describe un metodo para preparar las celulas que expresan ER-a36 exogeno. Las celulas se pueden preparar por ingenierfa genetica conocida para el experto en el arte (vease Sambook, etc., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). En resumen, se prepara un gen ER-a36 exogeno y se inserta en un vector de expresion, despues se transfecta a celulas huesped, y luego se cultivan las celulas huesped en el medio de cultivo aplicable a expresar ER-a36 exogeno. La secuencia genica de ER-a36 humano se describe en Biochem. Biophys. Res. Comun. 336, 1023-1027 (2005) Wang et al. (No. de registro GenBank BX640939). Las celulas que expresan ER-a36 exogeno pueden expresar ER-a36 endogeno o no. El nivel de expresion endogeno o exogeno de

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ER-a36 en las celulas se puede aumentar o disminuir mediante el tratamiento de un reactivo que comprende suero, E2p (17p-estradiol), tamoxifeno y fulvestrant. (ICI 182,780)

Por consiguiente, los compuestos de formula (I) de la presente invencion se pueden usar para preparar un medicamento para la prevencion y/o tratamiento del cancer relacionado con ER-a36 que comprende, pero no se limita a, cancer anal, cancer de conducto biliar, cancer de la vejiga, cancer de hueso, cancer colorrectal (cancer de colon, cancer de recto), cancer de cerebro, cancer de mama, el carcinoide, cancer cervical, cancer relacionado con el endocrino, cancer de endometrio, cancer de ojo, cancer de vesfcula biliar, cancer de cabeza y cuello, cancer de sarcoma de Kaposi, carcinoma de rinon, carcinoma de laringe, leucemia, cancer de hfgado, cancer de pulmon, linfoma, melanoma, mesotelioma, mieloma, cancer neuroendocrino, cancer de esofago, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer de pene, cancer de prostata, cancer de piel, sarcoma de tejidos blandos, cancer de medula espinal, cancer gastrico, cancer de testfculos, cancer de tiroides, cancer de vagina, cancer de vulva o cancer de utero. En la realizacion preferida, el cancer relacionado con ER-a36 incluye cancer de mama, cancer de cuello uterino, cancer de colon, cancer de endometrio, leucemia, cancer de hfgado, linfoma, cancer de pulmon, mieloma, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer gastrico, cancer de pancreas, carcinoma renal, melanoma, cancer de tiroides, cancer de sarcomas de tejidos blandos o cancer de utero. En una realizacion mas preferida, el cancer relacionado con ER-a36 incluye cancer de mama, cancer de hfgado, linfoma, cancer de prostata, cancer gastrico, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de pancreas, cancer de endometrio, cancer de ovario y leucemia.

El sujeto puede ser un mamffero, tal como un perro, gato, vaca, oveja, caballo o humano, preferiblemente un ser humano. La cantidad eficaz de los compuestos varfa de acuerdo con la diferencia de la enfermedad y es facilmente determinable por un experto en el arte que tiene beneficio de la presente divulgacion.

En ciertas realizaciones, los compuestos de la invencion se pueden usar en combinacion con uno o mas otros agentes contra el cancer. Los agentes contra el cancer apropiados incluyen, pero no se limitan a agentes alquilantes, mostazas de nitrogeno, antagonistas de folato, antagonistas de purina, antagonistas de pirimidina, venenos de huso, inhibidores de topoisomerasa, agentes inductores de apoptosis, inhibidores de angiogenesis, podofilotoxinas, nitrosoureas, antimetabolitos, inhibidores de la sfntesis de protefnas, inhibidores de quinasa, antiestrogenicos, cisplatino, carboplatino, interferon, asparginasa, leuprolida, flutamida, megestrol, mitomicina, bleomicina, doxorrubicina, adriamicina, irinotecan y taxol. En una realizacion, los agentes contra el cancer son antiestrogenos tales como tamoxifeno y fulvestrant (ICI182, 750).

En ciertas realizaciones de la presente invencion, se puede administrar un compuesto de formula (I), un estereoisomero, o una sal farmaceuticamente aceptable del estereoisomero, en forma de una composicion farmaceutica que comprende un portador, vehfculo o diluyente farmaceuticamente aceptable. Se pueden preparar para la medicacion para la prevencion y/o tratamiento de un sujeto que sufre de enfermedades relacionadas con ER-a36.

En ciertas realizaciones, la composicion de la presente invencion se puede usar para el tratamiento de enfermedades animales. El veterinario comun se puede administrar en una forma de preparacion farmaceuticamente aceptable de los presentes compuestos, o una sal aceptable para veterinaria, o un solvente aceptable para veterinaria o el profarmaco de los mismos. El veterinario puede determinar la dosis y el metodo de administracion a un animal apropiado.

Si se usa una combinacion de compuestos activos, se pueden administrar simultaneamente, por separado o de forma secuencial.

Metodos de preparacion de los compuestos

R1, R2, R3, R4, R5, R6 se definen como se ha mencionado

-j6

Los compuestos de formula (I) se pueden preparar por diferentes metodos^ de sfntesis. Por lo general, los metodos de preparacion se demuestran de la siguiente manera. anteriormente, a menos que se indique lo contrario.

Es obvio para la persona en la tecnica, que los metodos de detalle para preparar los compuestos varfan ligeramente de la diferencia de las estructuras de los compuestos. Ademas, es necesario proteger grupos inestables o activos mediante el grupo protector convencional (mostrado como P) en la mayorfa de los metodos de preparacion de la siguiente manera. La propiedad de los grupos protectores y los metodos para inducir o disponer los grupos son conocidos en la tecnica. (los ejemplos se refieren a Greene T. W. "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, NewYork, 1991). Los siguientes esquemas de 1 a 3 y la descripcion relacionada son como ejemplos de preparacion de los compuestos de formula (I), y no pretenden limitar el alcance de la presente invencion.

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Los compuestos de formula (I) se pueden preparar a traves de varias etapas. El compuesto HI se puede preparar mediante reaccion de Houben-Hoesch (acilacion de Friedel-Crafts) a partir del compuesto i y ii bajo catalisis del acido de Lewis. El acido de Lewis aplicable para la reaccion comprende cloruro de zinc anhidro, cloruro de aluminio anhidro, cloruro ferrico, tetracloruro de titanio, cloruro de estano, complejos de trifluoruro de boro, eter dietflico y etc. Esta reaccion durara de 1-20 horas entre 0°C y 120°C.

El compuesto v se puede preparar a partir del compuesto iii y el compuesto sustituido iv en solvente inerte a traves de la reaccion de condensacion. El solvente inerte aplicable a la reaccion comprende, tal como DME, 1,2-dietoxietano, THF, 1,4-dioxano, DMF, N,N-dimetilacetamida, piridina, N-metil-2-pirrolidona. El alcali aplicable a la reaccion comprende, por ejemplo, hidroxido de potasio, carbonato de potasio, carbonato de cesio, hidruro de sodio, metoxido de sodio, tert- butoxido de potasio, DBU (1,8-diazabiciclo-diciclo (5,4,0)-7-hendeceno) butil litio, LDA (diisopropil litio), LHMDS (hexametildisilazida de litio) y etc. Durante la reaccion se anadira catalizador de transferencia de fase (tal como 18- corona-6, TBAB (bromuro de tetrabutilamonio), TBAF (fluoruro de tetrabutilamonio, etc.) de cantidad estequiometrica o catalftica. Y la temperatura de reaccion es de aproximadamente 0-100°C, el tiempo de reaccion es 1-20 horas. El compuesto vii se puede preparar a partir de bromuro de prenilo y el compuesto v en condiciones alcalinas. El solvente aplicable a la reaccion comprende como tal metanol, DMF (N,N-dimetilacetamina), THF (tetrahidrofurano), agua, tolueno, DME (1,2-dimetoxietano) y mezcla de solventes, tal como metanol-agua, DMF-agua, THF-Agua y etc. El solvente preferido en la reaccion es agua. El alcalino aplicable a la reaccion comprende como tal hidroxido de potasio, carbonato de potasio, carbonato de cesio, metoxido de sodio, hidroxido de sodio, tert-butoxido de potasio, dBu (1,8- diazabiciclo-diciclo (5,4,0)-7-hendeceno), butil litio, LDA (diisopropil litio), LHMDS (hexametildisilazida de litio) y etc. La temperatura de reaccion es convencionalmente de aproximadamente 0-100°C, preferiblemente, el tiempo de reaccion es 1-20 horas

En los metodos de sfntesis qufmica, las dos etapas importantes son respectivamente induccion de isopentenilo y anillo original de cierre de cromenona. La secuencia de las dos etapas puede ser modulada de acuerdo con la propiedad de diferentes grupos sustituyentes. Por lo tanto, el compuesto de la presente invencion se puede preparar mediante el esquema 2.

imagen5

En el esquema 2, la condicion de reaccion de cada tipo de reaccion es similar a la del esquema 1. El compuesto viii se puede preparar a partir del compuesto iii y bromuro de prenilo en condiciones alcalinas. El solvente aplicable a la reaccion comprende como tal metanol, DMF (N,N-dimetilacetamina), THF (tetrahidrofurano), agua, tolueno, DME (1,25 dimetoxietano) y una mezcla de solventes tal como metanol-agua, DMF-agua, THF-agua, etc. El solvente preferido en la reaccion es agua. El alcalino aplicable a la reaccion comprende como tal hidroxido de potasio, carbonato de potasio, carbonato de cesio, metoxido de sodio, hidroxido de sodio, tert-butoxido de potasio, DBU (1,8-diazabiciclo-diciclo (5,4,0)-7-hendeceno), butil litio, LDA (diisopropil litio), LHMDS (hexametildisilazida de litio) y etc. La temperatura de reaccion es convencionalmente de aproximadamente 0-100°C, preferiblemente, el tiempo de reaccion es 1-20 horas.

10 El compuesto vii se puede preparar a partir del compuesto viii y cloruro de acilo sustituido iv en solvente inerte a traves de la reaccion de condensacion. El solvente inerte aplicable a la reaccion comprende eter, tal como DME, 1,2- dietoxietano, THF, 1,4-dioxano, DMF, N,N-metilacetamida, piridina, N-metil-2-pirrolidona. La reaccion es aplicable a una condicion alcalina, que comprende tal como hidroxido de potasio, carbonato de potasio, carbonato de cesio, hidroxido de sodio, metoxido de sodio, tert-butoxido de potasio, DBU (1,8-diazabiciclo-diciclo (5,4,0) hendeceno), butil-litio, LDA

15 (diisopropil-litio), LHMDS (hexametildisilazida de litio) y etc. Se puede adicionar una cantidad estequiometrica o catalftica de catalizador de transferencia de fase en la reaccion tal como 18-corona-6, TBAB (bromuro de tetrabutilamonio) TBAF (fluoruro de tetrabutilamonio) y etc. La temperatura de reaccion es convencionalmente de aproximadamente 0-140°C, preferiblemente, el tiempo de reaccion es 1-20 horas bajo reflujo de solvente. Cuando R1 es hidrogeno, el compuesto de formula (I) se puede preparar de acuerdo con el siguiente esquema 3.

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P es un grupo protector para el grupo hidroxi en el esquema 3. El compuesto xii se puede preparar mediante la eliminacion del grupo protector del compuesto xi. Los metodos de eliminacion varfan de acuerdo con diferentes grupos protectores, y los metodos se refieren principalmente a "grupos protectores en sfntesis organica" (Greene T.W et. John Wiley & Sons, NewYork, 1991). El grupo protector preferido se selecciona del grupo que consiste en bencilo, benzoilo, carbobenzoxi, TBDMS (tertbutildimetilsililo), THp (tetrahidropirano), metilo, MOM (metoximetilo), PMB (para- metoxibencilo) y etc.

El compuesto xiii se puede preparar por reaccion de bromuro de prenilo con el compuesto xii en condiciones alcalinas. El solvente aplicable a la reaccion comprende como tal metanol, DMF (N,N-dimetilacetamina), THF (tetrahidrofurano), agua, tolueno, DME (1,2-dimetoxietano) y mezcla de solventes tal como metanol-agua, DMF-agua, tetrahidrofurano- agua y etc. El solvente preferido es agua en la reaccion. El alcalino aplicable a la reaccion comprende, por ejemplo, hidroxido de potasio, carbonato de potasio, carbonato de cesio, metoxido de sodio, hidruro de sodio, tertbutoxido de potasio, DBU (1,8 diazabiciclo- diciclo (5,4,0)-7-hendeceno), butil litio, LDA (diisopropil litio), LHMDS (hexametildisilazida de litio) y etc. Y la temperatura de reaccion es de aproximadamente 0-100°C, el tiempo de reaccion es 1-20 horas.

Ejemplos

La invencion se ilustra mediante el compuesto 1 del Ejemplo 1. Los compuestos 2-13 de los ejemplos 2-13 se proporcionan como referencia. A menos que se indique lo contrario, la temperatura ambiente o la temperatura ambiente se refieren al rango de 18-25°C. La evaporacion del solvente se llevo a cabo usando un evaporador rotatorio a presion reducida; las reacciones fueron monitorizadas por cromatograffa en capa fina (TLC) y los tiempos de reaccion se dieron solo para ilustracion. La estructura y la pureza de todos los compuestos aislados se aseguraron por al menos una de las siguientes tecnicas: TLC, espectrometrfa de masas, resonancia magnetica nuclear (RMN), cromatograffa lfquida de alta presion (HPLC). Los rendimientos se dan solamente con fines ilustrativos.

Ejemplo 1

2-(4-trifluorometilfenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona (compuesto 1)

Etapa 1: preparacion de 2-metoxi-1-(2,4,6-trihidroxifenil) etanona

Se disolvio floroglucinol (35.1 g, 279 mmol) en solucion de eter etflico (500 mL), seguido de cloruro de zinc (8 g, 59 mmol) y se adiciono 2-metoxi acetonitrilo (18 g, 253 mmol) en la solucion bajo condicion de bano de agua de hielo. Se burbujeo gas HCl seco en la mezcla de reaccion, agitando vigorosamente durante 5 horas, y se formo el precipitado. El precipitado se filtro y se recogio, despues se disolvio en agua y se calento a reflujo durante 3 horas. Despues de enfriar,

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se recogio el precipitado rosado, y se puede obtener el compuesto blanco deseado despues de la recristalizacion con agua. (45 g, rendimiento 81%) 1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 8=12.14 (s, 2H), 10.41 (s, 1H), 5.79 (s, 2H), 4.56 (s, 2H), 3.32 (s, 3H).

Etapa 2: preparacion de 2-(4-trifluorometilfenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-4H-cromen-4-ona

Se disolvieron 2-metoxi-1-(2,4,6-trihidroxifenil)etanona (30 g, 151 mmol) y cloruro de 4-trifluometilbenzoilo (37.5 g, 180 mmol) en 250 mL de piridina seca. Se dejo caer en DUB (53.2 g 350 mmol) en la solucion a temperatura ambiente. Despues de terminar la adicion, la temperatura de la solucion se elevo a 75°C, y se mantuvo en agitacion durante la noche. El segundo dfa, la solucion se enfrio a temperatura ambiente, y la mayor parte del solvente se elimino a presion reducida.

El residuo de la solucion se vertio en una solucion ligera de clorhidrato. La solucion mixta se extrajo durante 3 veces con 500 mL de acetato de etilo. El extracto se combino, se lavo con 300 mL de solucion acuosa de carbonato de sodio 2N, se seco con sulfato de sodio anhidro y se condenso. Se obtuvo el compuesto deseado (21 g, rendimiento 40%) despues de cristalizar el producto en bruto con una mezcla de eter de petroleo y acetato de etilo (10:1)

Etapa 3: preparacion de 2-(4-trifluorometilfenil)-3,5,7-trihidroxi-4H-cromen-4-ona

Se disolvio 2-(4-trifluorometilfenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-4H-cromen-4-ona (10 g, 28.3 mmol) en 150 mL de diclorometano en un matraz de tres bocas de 250 mL. Se adiciono gota a gota tribromuro de boro (21.2 g, 84.9 mmol) en la solucion a 0°C. Despues de esto, la solucion se calento a temperatura ambiente y se hizo reaccionar durante 4 horas, y se inactivo con 80 mL de agua helada para terminar la reaccion qufmica. La solucion se extrajo con 500 mL de acetato de etilo durante 3 veces. Los extractos se combinaron, se lavaron una vez con una solucion acuosa saturada de cloruro de sodio y se secaron con sulfato de sodio anhidro. Despues de la filtracion, el producto en bruto se mezclo con 20 mL de acetato de etilo/petroleo (1:10) y se agito, y se obtuvo el compuesto diana de color amarillo despues de filtrar y secar. (7 g, rendimiento 70%).

Etapa 4: preparacion de 2-(4-trifluorometilfenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona (compuesto 1)

Se disolvieron el compuesto 2-(4-trifluometilfenil)-3,5,7-trihidroxi-4H-cromen-4-ona (3.38 g, 10 mmol) y carbonato de cesio (33 g, 100 mmol) en 100 mL de agua y bromuro de prenilo (1.9 g, 10 mmol) se adiciono en la solucion bajo condiciones de bano de agua helada. Despues de esto, la solucion se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente, y el pH se ajusto aproximadamente a 6 con clorhidrato 2N. La solucion se extrajo con acetato de etilo durante 2 veces. Las fases organicas se combinaron, se lavaron una vez con solucion acuosa saturada de cloruro de sodio y se secaron con sulfato de sodio anhidro. Despues de la filtracion, el producto en bruto se eluyo con acetato de etilo/petroleo (1:25) a traves de una columna de silica gel. Se obtuvo el compuesto diana de color amarillo (508 mg, rendimiento 12.5%).

1H RMN(300 MHz, DMSO-d6): 8=12.20 (s, 1H), 10.87 (brs, 1H), 10.07 (brs, 1H), 8.35 (d, 2H, J=8.1Hz), 7.94 (d, 2H, J=7.7Hz), 6.33 (s, 1H), 5.19 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.45 (d, 2H, J=6.0Hz), 1.75 (s, 3H), 1.64 (s, 3H); LC-MS (ESI, m/z): 407.0[M+H]-.

Haciendo referencia al metodo del ejemplo 1, los compuestos de referencia 2 al compuesto 8 se prepararon haciendo reaccionar el intermedio 2-metoxi-1-(2,4,6-trihidroxifenil) etanona como material de partida con muchos cloruros de alquilo sustituidos diferentes, cloruro de arilo o cloruro de heteroarilo, los detalles de los compuestos se muestran como se indica en la tabla 1.

Tabla 1 (compuestos de referencia 2 a 8)

1H-RMN LC-MS, m/z (ESI)

2

2-(4-fluorofenil)-3,5, 7-trihidroxi-8-(3- metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona (300 MHz, DMSO-d6): 8=12.30 (s, 1H), 10.81 (brs, 1H), 9.74 (brs, 1H), 8.21 (dd,2H, J1=8.7Hz, J2=5.7HZ), 7.44 (dd,2H, J1=8.7Hz, J2=5.7HZ), 6.33 (s, 1H), 5.19 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.45 (d, 2H, J=6.6 Hz), 1.76 (s, 3H), 1.65 (s, 3H). 357.0 [M+H]+.

3

2-(3-fluoro-4-clorofenil)-3,5,7- trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)- 4H- cromen-4-ona (300 MHz, DMSO-de): 8=12.16 (s, 1H), 8.06-8.00 (m, 2H), 7.82 (d, 1H, J=8.4Hz), 6.30 (s, 1H), 5.15 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.42 (d, 2H, J=5.7 Hz), 1.75 (s, 3H), 1.63 (s, 3H). 391.0 [M+H]+;

4

2-(4-clorofenil)-3,5, 7-trihidroxi- 8-(3- metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona (300 MHz, DMSO- d6): 8=12.25 (s, 1H), 10.83 (brs, 1H), 9.87 (brs, 1H), 8.16 (d, 2H, J=8.7Hz), 7.64 (d, 2H, J=8.4Hz), 6.31 (s, 1H), 5.17 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.42 (d, 2H, J=6.6 Hz), 1.74 (s, 3H), 373.1 [M+H]+

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1.63 (s, 3H).

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2-(4-trifluorometoxifenil)-3,5,7- trihidroxi -8-(3-metil-2-buten-1-il)- 4H-cromen-4-ona (300 MHz, DMSO- d6): 8=12.25 (s, 1H), 10.83 (brs, 1H), 9.93 (brs, 1H), 8.26 (d, 2H, J=8.7Hz), 7.58 (d, 2H, J=8.4Hz), 6.31 (s, 1H), 5.17 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.42 (d, 2H, J=6.6 Hz), 1.74 (s, 3H), 1.63 (s, 3H). 423.1 [M+H]+

6

2-(3,4-diclorofenil)-3,5,7- trihidroxi-8- (3-metil-2-buten-1-il)- 4H-cromen-4- ona (300 MHz, DMSO- d6): 8=12.18 (s, 1H), 10.90 (brs, 1H), 10.15 (brs, 1H), 8.29-8.11 (m, 2H), 7.85 (d, 1H, J=8.4Hz), 6.32 (s, 1H), 5.15 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.42 (d, 2H, J=5.7 Hz), 1.76 (s, 3H), 1.64 (s, 3H). 407.0 [M+H]+

7

2-(3 -trifluorometil-4-clorofenil)-3,5,7- trihidroxi-8-(3-metil-2-buten- 1-il)-4H- cromen-4 -ona (300 MHz, DMSO- d6): 8=12.16 (s, 1H), 10.76 (brs, 1H), 10.37 (brs, 1H), 8.56-8.36 (m, 2H), 7.95 (d, 1H, J=8.4Hz), 6.32 (s, 1H), 5.17 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.41 (d, 2H, J=5.7Hz), 1.72 (s, 3H), 1.62 (s, 3H). 441.0 [M+H]+

8

2-(4-bromofenil)-3,5, 7-trihidroxi- 8- (3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4- ona (300 MHz, DMSO- d6): 8=12.25 (s, 1H), 10.83 (brs, 1H), 9.87 (brs, 1H), 8.20 (d, 2H, J=8.7Hz), 7.75 (d, 2H, J=8.4Hz), 6.31 (s, 1H), 5.17 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.42 (d, 2H, J=6.6Hz), 1.74 (s, 3H), 1.63 (s, 3H). 417.2 [M+H]+

Ejemplo 9

2-(4-trifluorometilfenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona (compuesto 9)

Se disolvieron el intermedio 2-(4-trifluorofenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-4H-crom-4-ona (500 mg, 1.42 mmol) del compuesto 1 y carbonato de cesio (4.95 g, 15 mmol) en 25 mL de agua, y bromuro de prenilo (220 mg, 1.5 mmol) se adiciono en la solucion bajo condiciones de bano de agua helada. Despues de esto, la solucion se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente, y el pH se ajusto aproximadamente a 6 con clorhidrato 2N. La solucion se extrajo con acetato de etilo durante 2 veces. Las fases organicas se combinaron, se lavaron con solucion acuosa saturada de cloruro de sodio y se secaron con sulfato de sodio anhidro. Despues de la filtracion, el producto en bruto se eluyo con acetato de etilo/petroleo a traves de una columna de silica gel. Se obtuvo el compuesto diana de color amarillo (95 mg, rendimiento 16.5%).

1H RMN(300 MHz, DMSO-d6): 8=12.41 (1H, s), 10.92 (1H, brs), 8.20 (2H, d, J=8.1 Hz), 7.96 (2H, d, J=7.7 Hz), 6.34 (1H, s), 5.15 (1H, t, J=5.4Hz), 3.84 (3H, s), 3.41 (2H, d, J=6.0Hz), 1.68 (3H, s), 1.62 (3H, s); LC-MS (ESI, m/z): 421.1 [M+H]-.

Compuesto de referencia 10

2-(3,4-difluorofenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4 H-cromen-4-ona (compuesto 10)

Etapa 1: preparacion de 2-metoxi-1-[2,4,6-trihidroxi-3-(3-metilbut-2-eno) fenil] etanona

Se disolvio el compuesto 2-metoxi-1-(2,4,6-trihidroxifenil) etanona (2.0 g, 10.09 mmol) en solucion de hidroxido de potasio al 5% (1.132 g, 20.18 mmol), seguido de adicion gota a gota de bromuro de prenilo (1.504 g, 10.09 mmol) en la solucion bajo condiciones de bano de agua con hielo. La mezcla se hizo reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente y se vertio en agua helada. El pH de la solucion se ajusto a aproximadamente 2 y se extrajo con acetato de etilo durante 3 veces. Las fases organicas se combinaron, se secaron con sulfato de sodio anhidro. Despues de la filtracion, el producto en bruto se purifico (se eluyo con diclorometano/metanol (100:1)) a traves de una columna de silica gel. Se obtuvo el compuesto diana (0.5 g, rendimiento 18.6%).

1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 8=13.70 (s, 1H), 10.70 (s, 1H), 10.33 (9s, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.56 (s, 2H), 3.30 (s, 3H), 3.02 (m, 2H), 1.66 (s, 3H), 1.57 (s, 3H).

Etapa 2: preparacion 2-(3,4-difluorofenil)-3-metoxi-5,7-dihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona (compuesto 10)

2-metoxi-1-[2,4,6-trihidroxi-3,5-di(3-metil-2-buten-1-il)fenil]etanona (250 mg, 0.94 mmol, carbonato de potasio anhidro en polvo (779 mg, 5.63 mmol), TBAB (bromuro de tetrabutilamonio, 454 mg, 1.41 mmol) y 3,4-difluorometilbenzoilcloruro (331 mg, 1.88 mmol) en 30 mL de tolueno, calentando a reflujo para la reaccion durante 6 horas. Despues de enfriar, se elimino el tolueno y se adicionaron 20 mL de agua a la solucion. La solucion acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las fases organicas se combinaron, se lavaron con solucion acuosa saturada de NaCl y se secaron con solucion de sulfato

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35

de sodio anhidro, despues se obtuvo un residuo de color marron despues de eliminar el solvente. El residuo se disolvio en 20 mL de mezcla metanol-agua (relacion 4: 1), y se adiciono hidroxido de potasio (1 g). La solucion de la mezcla se calento y se calento a reflujo durante 2 horas, se enfrio a temperatura ambiente, se acidifico a pH=4 con clorhidrato 1N y se extrajo con diclorometano durante tres veces. Las fases organicas combinadas se secaron con sulfato de sodio anhidro para eliminar el solvente. Se obtuvo el compuesto deseado (13.1 mg, rendimiento 3.59%) despues de que el producto en bruto se purifico a traves de una columna de silica gel (eluyente: acetato de etilo/eter de petroleo = 1:50)

1H RMN (400 MHz, CDCla): 8=12.45 (s, 1H), 7.98-7.89 (m, 2H), 7.35-7.30 (m, 1H), 6.34 (s, 2H), 5.25 (br, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.55 (d, 2H, J=6.8Hz,2H), 1.84 (s, 3H), 1.77 (s, 3H); LC-MS: 390.1 [M+H]+; pureza: 98.6% (254nm).

Haciendo referencia al metodo del ejemplo 9, el compuesto 11 al compuesto 13 se preparo haciendo reaccionar intermedios correspondientes respectivos como materiales de partida con bromuro de prenilo a traves de un mecanismo de sustitucion unico. Los detalles de los compuestos se muestran como en la siguiente tabla 2.

Tabla 2 (compuestos de referencia 11 a 13)

1H-RMN LC-MS, m/z (ESI)

11

2-(4-fluorofe n i l )-3-metoxi-5,7 - dihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)- 4Hcromen-4-ona (300 MHz, DMSO-de): 8=12.45 (s, 1H), 10.90 (brs, 1H), 8.13 (d, 2H, J=8.7Hz), 7.60 (d, 2H, J=8.4Hz), 6.33 (s, 1H), 5.19 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.83 (s, 3H), 3.36 (d, 2H, J=6.6Hz), 1.61 (s, 3H). 437.1 [M+H]+.

12

2-(3-fluorometil-4-cloro fenil)-3- metoxi-5,7-dihidroxi-8-(3-metil-2- buten-1-il)-4H-cromen-4-ona (300 MHz, DMSO-de): 8=12.16 (s, 1H), 10.76 (brs, 1H), 8.568.36 (m, 2H), 7.95 (d, 1H, J=8.4Hz), 6.32 (s, 1H), 5.17 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.85 (s, 3H), 3.41 (d, 2H, J=5.7 Hz), 1.72 (s, 3H), 1.62 (s, 3H). 455.2 [M+H]+;

13

2-(4-bromofenil)-3-metoxi-5,7- dihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)- 4Hcromen-4-ona (300 MHz, (CDa)2CO): 8=12.56 (s, 1H), 9.71 (brs, 1H), 8.16 (d, 2H, J=8.7Hz), 7.64 (d, 2H, J=8.4Hz), 6.37 (s, 1H), 5.25 (t, 1H, J=5.4Hz), 3.94 (s, 3H), 3.52 (d, 2H, J=6.6Hz), 1.77 (s, 3H), 1.66 (s, 3H). 431.5 [M+H]+

Ensayo de prueba para la actividad biologica

Las actividades del compuesto de formula (I) se pueden ensayar mediante los siguientes ensayos.

Ejemplo 14. Expresion de variantes de ER-a en membrana de muestras A de cancer de mama humano previamente recubierta con tejidos de cancer de mama humano se compro de ProSci Incorporated (Poway, CA). La membrana se probo con un anticuerpo anti-ER-a36 que reconoce especificamente ER-a36 y un anticuerpo secundario conjugado con HRP, y se visualiza con reactivos de deteccion de quimioluminiscencia (ECL) mejorados (Amersham Pharmacia BiotecH). Los marcadores en la misma membrana se eluyeron y se detectaron con un anticuerpo receptor-a anti- estrogeno H222 (Novocastra Laboratories Ltd, Reino Unido) que reconoce los tres subtipos de ER-a: ER-a66, ER-a46 y ER-a36. La figura 1 muestra que ER-a66, ER-a46 y ER-a36 no se expresan en tejido de mama normal (Carril 1) sino que se expresan en una muestra de carcinoma ductal infiltrante (Carril 2), una muestra de carcinoma lobular infiltrante (Carril 5) y carcinoma ductal no invasivo (Carril 7). Ademas, ER-a36 se expreso en el carcinoma ductal invasivo (Carril 4) y otra muestra de carcinoma lobular infiltrante (Carril 6). Los carriles 2 y 3 presentaban carcinoma ductal infiltrante respectivamente de dos pacientes diferentes. Los carriles 5 y 6 tenian carcinoma lobular infiltrante de dos pacientes diferentes, respectivamente. Este resultado indica que ER-a36 no se expresa en el tejido de mama normal, sino que se expresa en muestras de cancer de mama ER-negativas que no expresan ER-a66 y ER-a46.

Ejemplo 15: ER-a36 expresado en la linea celular de cancer de mama de ER-negativa, MDA-MB-231

La linea celular MDA-MB-231 es bien conocida por carecer ER-a66 y ER-a46 (Relevancia de las lfneas celulares de cancer de mama como modelos para tumores de mama: una actualizacion Marc Lacroix, Guy Leclercq, Breast Cancer Research and Treatment 83: 249-289 (2004)). Las celulas MDA-MB-231 se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC). Las celulas MDA-MB-231 se hicieron crecer en portaobjetos de camara BIOCOAT de 8 pozos (BD Science Discovery Labware) en una atmosfera de CO2 al 8% en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y suero fetal bovino al 10% a 37°C, durante 12 horas. A continuacion, las celulas se lavaron dos veces con solucion salina estandarizada con fosfato esteril (PBS) y se fijaron con paraformaldehfdo al 4% en PBS (pH 7.4), durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues de esto, las celulas se lavaron con PBS, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0.5% (v/v) durante 10 minutos. Las celulas se lavaron de nuevo con PBS y se bloquearon con suero al 3% en PBS a temperatura ambiente durante 1 hora. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo especffico ER-a36 o el mismo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

anticuerpo preincubado con peptidos inmunogenos que se unen especfficamente al anticuerpo ER-a36 durante 30 minutos a temperatura ambiente durante 1 hora y se lavaron tres veces con PBS que contenfa Triton X-100 al 0.5% (PBST), despues se incubo con un anticuerpo secundario marcado con isotiocianato de fluorescefna (FITC). Finalmente, los portaobjetos se lavaron tres veces con PBST, una vez con PBS, luego se recubrieron con marcador inmunofluorescente (Molecular Probes, Eugene, OR) y se analizaron bajo un microscopio Nikon E600 y las imagenes se capturaron mediante el sistema de imagenes confocal MRC-1024 (Bio- Rad). La figura 2 (panel superior) muestra que las celulas MDA-MB-231 se tineron positivamente mediante un anticuerpo anti-ER-a36. Con el fin de demostrar la fiabilidad de este resultado, la imagen con el mismo anticuerpo anti-ER-a36 preincubado con peptidos de inmunogeno no mostro ninguna mancha (Figura 2, panel inferior), lo que indica la especificidad del anticuerpo.

Ejemplo 16: Expresion de ER-a36 en diferentes lfneas celulares tumorales por Western Blot

Las celulas de la muestra se cultivaron a 37°C, CO2 al 5% (MDA-MB-231, y el medio de cultivo es FBS-DMEM al 10%). Las celulas se recogieron hasta que las celulas de cada pozo alcanzaron una confluencia del 60-90% y se centrifugaron durante 5 minutos a 4°C, 4300 rpm. Se elimino el sobrenadante de la solucion y se adicionaron el lisado apropiado, solucion reguladora de lisis que comprendfa NP-40 al 1% y EDTA 0.7 mM, e inhibidor de proteasa, se mantuvo la lisis de las celulas en la solucion durante 30 minutos a 1 hora en bano de hielo. La solucion se centrifugo durante 15 minutos a 14000 rpm y el sobrenadante se recogio para ser cuantificado con protefna. El procedimiento general de Western blot se mostro de la siguiente manera: transmembrana en goma mezcladas o gomas prefabricadas, electroforesis, bloqueo del anticuerpo anti-ER-a36, elucion, bloqueo de anticuerpos secundarios, elucion, expresion de la exposicion en el laboratorio fotografico y mostrar los resultados. La figura 3 muestra el resultado de Western blot de la expresion de ERa en diferentes celulas tumorales.

Carril 1: 293 lfneas celulares epiteliales renales humanas de expresion transitoria de ER-a36; Carril 2-4: lfneas celulares SK-BR-3 de cancer de mama humano de diferentes laboratorios; Carril 5-7: lfneas celulares MCF-7 de cancer de mama humano de diferentes laboratorios; Carril 8-9: lfneas celulares HL-60 de leucemia humana de diferentes laboratorios; Carril 10-11: lfneas celulares MV-4-11 de leucemia humana de diferentes laboratorios; Carril 12-13: lfneas celulares K562 de leucemia mieloide cronica humana de diferentes laboratorios; Carril 14: lfnea celular A2780 de cancer de hfgado; Carril 15: lfnea celular HEL-7402 de cancer de hfgado; Carril 16: cancer de celula HEL-9204 de cancer de hfgado; Carril 17: lfnea celular primaria Hep-11 de cancer de hfgado de un paciente; Carril 18: lfnea celular primaria Hep-12 de cancer de hfgado de un paciente.

Ejemplo 17: el compuesto que inhibe el crecimiento in vitro de diferentes celulas de cancer de mama

A: Ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® sobre MDA-MB-231 de cancer de mama ER negativas in vitro:

Las celulas MDA-MB-231 se mantuvieron a 37°C, en una atmosfera de CO2 al 5% en DMEM y suero fetal bovino al

3 J

10%. Las celulas se colocaron a una densidad de 6x10 celulas por pozo en una placa de 96 pozos. Se trataron celulas MDA-MB-231 con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion de 0, 0.3pM, 0.5pM, 1pM, 2pM, 3pM, 5pM, 10pM, 20pM, 30pM, 50pM y 100pM, durante 72 horas. Las celulas tratadas se analizaron con el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega), y las luminiscencias se registraron con Envision.

B: Ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® sobre celulas MCF-7 de cancer de mama ER positivas in vitro:

La lfnea celular MCF7 es una lfnea celular de cancer de mama que expresa fuertemente ER-66, ER-46 y ER-36 (relevancia de las lfneas celulares de cancer de mama como modelos para tumores de mama: una actualizacion. Marc Lacroix, Guy Leclercq, Breast Cancer Research and Treatment (2004) 83, 249-289; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.103: 9063-9068 (2006)). Las celulas MCF7 de ATCC se mantuvieron en un medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), y suero fetal bovino al 10% a 37°C en una atmosfera de CO2 al 5%. Las celulas se colocaron a una densidad de 6x103 celulas por pozo en una placa de 96 pozos. Se trataron celulas MCF7 con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion de 0, 0.3pM, 0.5pM, 1pM, 2pM, 3pM, 5pM, 10pM, 20pM, 30pM, 50pM y 100pM, durante 72 horas. Las celulas tratadas se analizaron a traves kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega), y las luminiscencias se registraron con Envision.

La tabla 3 muestra la viabilidad de diferentes celulas de cancer de mama influenciadas por algunos compuestos de la presente invencion.

Ejemplo/Compuesto de referenda Inhibicion de la viabilidad de celulas de cancer de mama IC50 (pM)

No.

celulas MDA-MB-231 celulas MCF7

)xifenoa)

20.90±1.51b) 22.55±4.15

1

1.066 2.012

2

NAc) 3.167

3

2.867 8.603

4

4.325 16.011

5

4.476 6.854

6

1.875 6.854

7

9.303 7.542

9

NA NA

10

NA 31.46

a) tamoxifeno como compuesto de control positivo.

b) cuando el compuesto se ensayo mas de 3 veces, IC50 se ilustro con un valor medio ± desviacion estandar.

c) NA significa que no hay actividad, e IC50 es superior a 100 pM

d) : ND significa que no se detecta * * 5 * * * * 10 * * * * 15 * * * * 20

Ejemplo 18: Inhibicion del crecimiento de celulas de leucemia cronica in vitro por los compuestos

A: deteccion de la viabilidad de las celulas de leucemia cronica K562 por ensayo luminiscente CellTiter-Glo® in vitro

5 Las celulas de leucemia cronica K562 de ATCC se mantuvieron en IMDM y suero fetal bovino al 10% a 37°C en una

atmosfera de CO2 al 5%. Las celulas se subsembraron en una placa de cultivo de 96 pozos en una concentracion de

6x103 celulas/pozo. Las celulas K562 se trataron con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion de

0, 0.3pM, 0.5pM, 1pM, 2pM, 3pM, 5pM, 10pM, 20pM, 30pM, 50pM y 100pM, durante 72 horas. Las celulas tratadas se

analizaron mediante kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega), y las luminiscencias se

10 registraron con Envision.

Ejemplo 19: Inhibicion del crecimiento de celulas Daudi de linfoma B humano in vitro por los compuestos

A: Inhibicion de celulas Daudi de linfoma B humano por ensayo luminiscente CellTiter-Glo® in vitro

Las celulas Daudi del linfoma B humano de ATCC se mantuvieron en IMDM y suero fetal bovino al 10% a 37°C en una

atmosfera de CO2 al 5%. Las celulas se subsembraron en una placa de cultivo de 96 pozos a una concentracion de

15 6x103 celulas/pozo. Se trataron celulas Daudi de linfoma humano B con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la

concentracion de 0, 0.3pM, 0.5pM, 1pM, 2pM, 3pM, 5pM, 10pM, 20pM, 30pM, 50pM y 100pM, durante 72 horas. Las

celulas tratadas se analizaron mediante kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega), y las

luminiscencias se registraron con Envision.

La tabla 4 muestra la viabilidad de celulas de leucemia cronica K562 y celulas de linfoma Daudi humanas B

20 influenciadas por algunos compuestos de la presente invencion.

Ejemplo/Compuesto de referenda Inhibicion de la viabilidad de celulas de cancer de mama IC50 (pM)

No.

Celulas K562 Celulas Daudi

Gleeveca)

0.751 NDb)

citarabinen

ND 10.033

1

1.035 0.824

2

6.139 9.234

3

1.849 2.909

4

0.974 2.638

5

1.475 1.486

6

0.935 1.983

7

6.140 4.068

10

NA 21.75

11

NA NA

a) : gleevec y citarabinen, respectivamente, fueron el compuesto de control positivo para el modelo de celulas K562 y el modelo de celulas Daudi

b) : Nd significa que no hay deteccion

c) NA significa que no hay actividad, y IC50 es superior a 100 pM * * 5 * * * * 10 * * * * 15 * * * * 20

Ejemplo 20: Inhibicion del crecimiento de celulas de leucemia aguda in vitro por los compuestos

A: Inhibicion del crecimiento de celulas HL-60 de leucemia mieloblastica aguda por los compuestos detectados por el

5 metodo MTT

Las celulas HL-60 de leucemia mieloblastica aguda de ATCC se midieron en IMDM y suero fetal bovino al 10% a 37°C

en una atmosfera de CO2 al 5%. Las celulas se subsembraron en una placa de cultivo de 96 pozos a una concentracion

de 6x103 celulas/pozo. Las celulas HL-60 se trataron con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion

de 0, 10"4 M, 10"5 M, 10"6 M, 10"7 M, 10"8 M, durante 72 horas. El valor de OD se probo mediante el metodo MTT, y se

10 calculo la proporcion de inhibicion.

B: Inhibicion del crecimiento de celulas Molt-4 de leucemia linfoblastica aguda por los compuestos detectados por el

metodo MTT

Las celulas Molt-4 de leucemia linfoblastica aguda de ATCC se determinaron en RPMI-1640 y suero fetal bovino al 10%

a 37°C en una atmosfera de CO2 al 5%. Las celulas se subsembraron en una placa de cultivo de 96 pozos a una

15 concentracion de 6x103 celulas/pozo y se mantuvieron en RPMI-1640 y suero fetal bovino al 10% a 37°C y atmosfera de

CO2 al 5%. Las celulas Molt-4 se trataron con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion de 0, 10-4

M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, durante 72 horas. El valor de OD se probo mediante el metodo MTT, y se calculo la

proporcion de inhibicion.

La viabilidad de diferentes celulas de leucemia influenciadas por algunos compuestos de la invencion se enumero en la

20 siguiente tabla 5

5

10

Ejemplo/Compuesto de referencia El porcentaje de inhibicion de la proliferacion celular por los compuestos con No. una concentracion de 10-6 M (%)

Celulas HL-60 Celulas Molt-4

Doxorrubicinaa)

79.0 90.1

1

60.7 43.7

2

Nab) NA

3

28.5 14.4

4

0.974 14.7

5

59.8 69.4

6

61.9 67.4

7

NA 57.0

9

NA NA

11

NA NA

a): Doxorrubicina como compuesto de control positivo

b): NA significa que no hay actividad, inferior al 10%.

y el porcentaje de inhibicion en el compuesto con una concentracion de 10"6M fue

Ejemplo 21 La inhibicion de celulas de cancer de hfgado in vitro por los compuestos

A: inhibicion de la celula de cancer de hfgado BEL-7402 in vitro por los compuestos detectados por SRB

Las celulas HL-60 de cancer de hfgado de ATCC se midieron en DMDM, NCS al 10% y KANA a 50 pg/mL a 37°C en una atmosfera de CO2 al 5%, y se subsembraron en una placa de cultivo de 96 pozos a una concentracion de 6x103 celulas/pozo. Las celulas BEL-7402 se trataron con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion de 0, 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, durante 72 horas. El valor de OD se probo mediante el metodo SRB, y se calculo el porcentaje de inhibicion.

La inhibicion de las celulas de cancer de hfgado por algunos compuestos de la invencion se enumero en la siguiente Tabla 6

Tabla 6

Ejemplo/Compuesto de referencia No.

El porcentaje de inhibicion de la proliferacion celular por los compuestos con una concentracion de 10"6 M (%)

Celulas BEL-7402

Doxorrubicinaa)

55.2

1

23.7

2

21.8

3

28.6

4

46.4

5

15.6

6

14.9

5

10

15

20

25

30

35

40

9

11.7

10

17.4

a): Doxorrubicina como compuesto de control positivo

Ejemplo 22: La inhibicion de celulas de cancer gastrico in vitro por los compuestos

A: inhibicion de la celula de cancer gastrico BGC-823 in vitro por los compuestos mediante el metodo MTT

Las celulas BGC-823 de cancer gastrico se subsembraron en una placa de cultivo de 96 pozos a una concentracion de 3x103 celulas/pozo y se mantuvieron en medio DMEM libre de rojo de fenol que contenfa CS-FBS al 2.5% a 37°C en una atmosfera de CO2 al 5%. Las celulas BGC-823 se trataron con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion de 0, 1, 2, 4, 8, 10 y 20 pM, durante 72 horas. El valor de OD se probo mediante el metodo MTT, y se calculo el porcentaje de inhibicion. El resultado se muestra en la figura 4.

Ejemplo 23: La inhibicion de celulas de cancer de pulmon in vitro por los compuestos

A: inhibicion de celulas de cancer de pulmon H460 in vitro por los compuestos mediante el metodo MTT

Las celulas H460 de cancer de pulmon se subsembraron en una placa de cultivo de 96 pozos a una concentracion de

4.0x103 celulas/pozo y se mantuvieron en medio libre de rojo de fenol que contenfa CS-FBS al 2.5% a 37°C en una

atmosfera de CO2 al 5%. Las celulas H460 se trataron con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion de 0, 1, 2, 4, 8, 10 y 20 pM, durante 72 horas. El valor de OD se probo mediante el metodo MTT, y se calculo el porcentaje de inhibicion. El resultado se muestra en la figura 5

Ejemplo 24: La inhibicion de celulas de cancer de pulmon in vitro por los compuestos

A: inhibicion de celulas de cancer de colon LS174T in vitro por los compuestos mediante el metodo MTT

Las celulas LS174T de cancer de colon se subsembraron en una placa de cultivo de 96 pozos a una concentracion de 4.5x103 celulas/pozo y se mantuvieron en medio 1640 libre de rojo de fenol que contenfa CS-FBS al 2.5% a 37°C en una atmosfera de CO2 al 5%. Las celulas LS174T se trataron con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion de 0, 1, 2, 4, 8, 10 y 20 pM, durante 72 horas. El valor de OD se probo mediante el metodo MTT, y se calculo el porcentaje de inhibicion. El resultado se muestra en la figura 6.

Ejemplo 25: La inhibicion de celulas de cancer de pancreas in vitro por los compuestos

A: inhibicion de las celulas de cancer de pancreas PANC-1 in vitro por los compuestos mediante el metodo MTT

Las celulas PANC-1 de cancer de pancreas se subsembraron en una placa de cultivo de 96 pozos a una concentracion de 3x103 celulas/pozo y se mantuvieron en medio 1640 libre de rojo de fenol que contenfa CS-FBS al 2.5% a 37°C en una atmosfera de CO2 al 5%. Se trataron las celulas PANC-1 con un compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion de 0, 1, 2, 4, 8, 10 y 20 pM durante 72 horas. El valor de OD se probo mediante el metodo MTT, y se calculo el porcentaje de inhibicion. El resultado se muestra en la figura 7.

Ejemplo 26: La inhibicion de celulas de cancer de prostata in vitro por los compuestos

A: inhibicion de las celulas de cancer de prostata PC-3 in vitro por los compuestos mediante el metodo MTT

Las celulas PC-3 de cancer de pancreas se subsembraron en una placa de cultivo de 96 pozos a una concentracion de 3x103 celulas/pozo y se mantuvieron en medio que contenfa suero fetal bovino F12K al 10%. Las celulas PC-3 se trataron con el compuesto de ensayo disuelto en DMSO a la concentracion de 0, 1, 2, 4, 8, 10 y 20 pM, durante 72 horas. El valor de OD se probo mediante el metodo MTT, y se calculo el porcentaje de inhibicion. El resultado se muestra en la figura 8.

Ensayo in vivo:

Ejemplo 27: Inhibicion del crecimiento de tumores de xenoinjerto de celulas BCAP-37 de cancer de mama humano en ratones desnudos por los compuestos

Se trataron ratones desnudos con xenoinjertos de cancer de mama con los compuestos de ensayo para probar su efecto sobre la inhibicion del crecimiento tumoral. Se tomaron tejidos tumorales de ratones desnudos que llevaban

5

10

15

20

25

30

35

40

cancer de mama BCAP-37 y se cortaron en piezas pequenas. Varias piezas de los tejidos tumorales se implantaron en la axila bajo el miembro delantero derecho de los ratones desnudos femeninos. Despues de la implantacion, los ratones se alimentan con solucion E2p una vez al dfa a la dosis de 7 pg por raton durante 6 dfas para estimular el crecimiento del tumor en los ratones del experimento. A partir del septimo dfa, los ratones se administraron intragastricamente con la solucion de ensayo que contenfa los compuestos y aceite de mafz a la dosis de 35 mg/kg. El tamoxifeno se utilizo como un control positivo. Se utilizo aceite de mafz como control negativo. La solucion de ensayo se preparo dispersando el compuesto de ensayo en solucion de aceite de mafz. (20 mg/mL). A los ratones se les dio la solucion de ensayo y tamoxifeno a la dosis de 35 mg/kg o aceite de mafz una vez al dfa durante 15 dfas. Luego los ratones fueron sacrificados y los tejidos tumorales se diseccionaron y pesaron. La tasa de inhibicion del crecimiento tumoral fue un porcentaje calculado usando la formula: tasa de inhibicion del crecimiento tumoral = (peso promedio del tumor en el control negativo-peso promedio del tumor tratado con el compuesto de ensayo)/peso promedio del tumor en el control negativo. El resultado se dibuja como grafico de barras y se muestra en la figura 9.

Ejemplo 28: Inhibicion del crecimiento de tumor de xenoinjertos de Daudi de linfomas de celulas B humanas en ratones desnudos por los compuestos

Se trataron ratones desnudos con tumor de xenoinjerto daudi de linfomas de celulas B humanas con los compuestos de ensayo para probar su efecto sobre la inhibicion del crecimiento tumoral. Los linfomas de celulas B humanas fueron de ATCC. 1x107 celulas con 0.2 mL de Matrigel despues de 5 pases se implantaron en la axila bajo el miembro delantero derecho de ratones desnudos hembra. Cuando el tumor de los ratones desnudos alcanzo 150-200 mm3, los ratones desnudos portadores de tumores se agruparon aleatoriamente. Cada 10 ratones desnudos pertenecen a un grupo. La administracion intragastrica con el aceite mixto fue como control negativo y la administracion intravenosa con rituximab fue como control positivo. El compuesto de ensayo se disolvio en el aceite mixto. El perfodo de administracion fue de 21 dfas continuamente, y la suspension mixta de aceite (35 mg/kg) con el compuesto de ensayo se administro en los ratones desnudos del grupo positivo una vez al dfa. Se inyecto el rituximab (20 mg/kg) al control positivo dos veces por semana. El grupo negativo con el aceite mixto se administro intragastricamente todos los dfas. Durante el perfodo de administracion, se midio el volumen del tumor y el peso de los ratones desnudos dos veces por semana. El dibujo del crecimiento tumoral se baso en el volumen tumoral y en el tiempo de administracion (figura 10), por lo que se pudo estimar el efecto del compuesto sobre el crecimiento del tumor.

Ejemplo 29: Inhibicion del crecimiento de los xenoinjertos de celulas de Ishikawa de cancer endometrial humano por los compuestos

Se trataron ratones desnudos con tumor de xenoinjerto de celulas de Ishikawa cancer de endometrio humano con los compuestos de ensayo para probar su efecto sobre la inhibicion del crecimiento de tumores. El tumor fue tomado de ratones desnudos con celulas de Ishikawa y cortado en piezas pequenas. Piezas pequenas de tumor se implantaron en la axila bajo el miembro delantero derecho de los ratones desnudos femeninos. Despues de la implantacion, los ratones se inyectaron con solucion E2p una vez al dfa a la dosis de 7 pg por raton durante 6 dfas para estimular el crecimiento en los ratones del experimento. A partir del septimo dfa, los ratones se administraron intragastricamente con una solucion que contenfa los compuestos de ensayo y aceite de mafz a la dosis de 35 mg/kg. Se utilizo acetato de medroxiprogesterona como control positivo. Se uso aceite mixto como control negativo. El compuesto de ensayo se disperso en aceite mixto (20 mg/mL). A los ratones se les administro respectivamente el compuesto de ensayo, acetato de medroxiprogesterona y aceite mixto a la dosis de 35 mg/kg durante 15-21 dfas. Luego los ratones fueron sacrificados y los tejidos tumorales se diseccionaron y pesaron. La tasa de inhibicion del crecimiento tumoral fue un porcentaje calculado usando la formula: tasa de inhibicion del crecimiento tumoral = (peso promedio del tumor en el control negativo-peso promedio del tumor tratado con el compuesto de ensayo)/peso promedio del tumor en el control negativo. El resultado se dibuja como grafico de barras, con referencia a la figura 11.

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de formula (I)

   imagen1

   o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo,

   en la que:

   R2, R3, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo (C1-4), alquilo (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno, halogeno, ciano y alcoxi (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno, y R4 es alquilo (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno.
2. 2. El compuesto de formula (I) de la reivindicacion 1, o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que R2, R3, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, halogeno, ciano, alquilo (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno, y alcoxi (C1-4) sustituido con uno o mas atomos de halogeno.
3. 3. El compuesto de la reivindicacion 1, en el que dicho compuesto es: 2-(4-trifluorometilfenil)-3,5,7-trihidroxi-8-(3-metil-2-buten-1-il)-4H-cromen-4-ona.
4. 4. Una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto, sal o solvato farmaceuticamente aceptable, de las reivindicaciones 1-3, en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.
5. 5. Uso del compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo en la preparacion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento de un cancer relacionado con ER-a36.
6. 6. El uso segun la reivindicacion 5, en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en colangiocarcinoma, cancer de vejiga, cancer de hueso, cancer colorrectal (cancer de colon, cancer colorrectal), cancer de cerebro, cancer de mama, cancer de cuello uterino, cancer de endometrio, cancer de cabeza y cuello, cancer de sarcoma de Kaposi, cancer de rinon, laringocarcinoma, leucemia, cancer de hfgado, cancer de pulmon, linfoma, melanoma, celiotelioma, mieloma, cancer neuroendocrino, cancer de esofago, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer del pene, cancer de prostata, cancer cutaneo, cancer de sarcoma de tejidos blandos, cancer de medula espinal, cancer gastrico, cancer testicular, cancer tiroideo y cancer uterino.
7. 7. El uso segun la reivindicacion 6, en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer

   de cuello uterino, cancer de colon, cancer de endometrio, leucemia, cancer de hfgado, linfoma, cancer de pulmon,

   mieloma, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer gastrico, cancer de pancreas, cancer de rinon, melanoma, cancer de tiroides, cancer de sarcoma de tejido blando y cancer uterino.
8. 8. El uso segun la reivindicacion 7, en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer

   de hfgado, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de pancreas, cancer de endometrio, cancer de ovario y leucemia.