CN103204838A - 多羟基苯并吡喃酮类化合物的合成及其抗肿瘤作用 - Google Patents

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Abstract

在本发明的某些实施方式中提供了一类具有式（I）结构的多羟基苯并吡喃酮类化合物及其药学上可接受的盐或前药，以及含该类化合物的药物组合物，它们可用于调控新型雌激素受体ER-α36的功能，预防和/或治疗由ER-α36受体介导的相关肿瘤疾病，如乳腺癌，白血病，肝癌等。

Description

多羟基苯并吡喃酮类化合物的合成及其抗肿瘤作用
技术领域
本发明涉及多羟基苯并吡喃酮类化合物及其盐或前药，以及含有这类化合物的药物组合物，它们在用于制备预防和/或治疗肿瘤疾病的药物中的用途。
背景技术
雌激素是与人体中许多关键生理功能有关的一组激素。雌激素的功能包括促进女性性器官发育、为怀孕时的乳腺和子宫以及分娩后的母乳喂养做好充分准备。雌激素在维持适当的心血管功能及骨密度方面也起着重要的作用。众所周知，雌激素可以刺激细胞增殖，由此可能增加女性患上癌症的危险，特别是乳腺癌与子宫癌。
雌激素通过与靶细胞中的雌激素受体相结合来调节细胞功能。在人体细胞中已发现两种雌激素受体（ERs），ER-α和ER-β。他们具有相似的蛋白质结构，每种均拥有三个独立却相互作用的功能结构域：N末端结构域（A/B结构域）、中段DNA结合结构域（C结构域）以及C末端配体结合结构域（D/E/F结构域）。N末端结构域具有非配体依赖性激活功能（AF-1），可与共激活因子相互作用，在缺乏配体情况下转录激活靶基因。DNA结合结构域在受体二聚化以及与特定DNA序列结合方面具有重要作用。C末端配体结合域可介导配体结合并具有配体依赖性转录激活功能（AF-2），可在配体存在时激活基因转录。
全长的ER-α是分子量为66kDa的蛋白，被称为ER-α66。ER-α66包含全部三种功能结构域。后来人们又发现了ER-α66的剪接变异体，将其命名为ER-α46。ER-α46的分子量约为46kDa，其缺少hER-α66的N末端AF-1结构域。最近又发现了一个新的36kDa的ER-α变异体，ER-α36。它缺少ER-α66的N末端AF-1结构域及C端AF-2结构域（参见wang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.336,1023-1027,(2005)）。
通常认为ER-α66通过转录激活其靶基因来介导雌激素刺激的细胞增殖。雌激素与ER-α66的结合可激活ER-α66的转录激活结构域，从而刺激下游靶基因的表达，并最终导致细胞增殖。ER-α46被证明可介导由膜启动且受雌激素刺激的快速NO合成（参见Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:4807-4812,(2003)）。并且人们也发现缺失AF-1结构域的ER-α46会抑制ER-α66的AF-1活性（参见Flouriot,G.，EMBO,19,4688-4700,(2000)）。由于ER-α36缺失AF-1和AF-2转录激活结构域，可将其作为显性负面抑制剂来抑制ER-α和ER-β的AF-1和AF-2功能。另外，ER-α36主要分布在细胞膜上，并且介导膜引发的促有丝分裂雌激素信号的传导，所述雌激素信号传导刺激细胞增殖。（参见wang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.336,1023-1027,(2005)；wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:9063-9068,(2006)）。
深入研究表明，雌激素信号是通过传统的细胞核转录激活通路与非传统的膜启动的信号传导通路来进行介导。ER-α66和ER-α46似乎主要在细胞核内起作用，而ER-α36似乎主要通过在细胞核外起作用。
另据显示，ER-α36缺少原始ER-α66带有的配体结合结构域的螺旋8-12，这完全改变了ER-α36配体结合的特异性。因此，ER-α36可能与ER-α66和ER-β结合不同的配体。
由于与雌激素受体相关的疾病仍然影响着许多人，目前急需找到一种新型的，用于预防和/或治疗这些相关疾病的化合物及其药物组合物。
发明内容
本发明提供了可用于调控新型雌激素受体ER-α36的功能的一类多羟基苯并吡喃酮类化合物及其盐或前药，以及含该类化合物的药物组合物，如式（I）所示：
Figure BDA00002645769900021
其中：
R1可选自氢，(C1-C6)烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C6)烷基；
R2，R3，R4，R5和R6可独立选自氢，(C1-C4)烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷基，卤素，氰基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C6)烷氧基；；但R2，R3，R4，R5和R6不可同时为氢；
且当R1为甲基，R3和R5为氢时，R4不可为氯原子。
附图说明
图1显示了ER-α66、ER-α46和ER-α36在人乳腺癌样品中表达的蛋白免疫印迹结果。道1：正常乳腺组织；道2：浸润性导管癌；道3：浸润性导管癌；道4：侵袭性导管癌；道5：浸润性小叶癌；道6：浸润性小叶癌；道7：非侵袭性导管癌。
图2(上图)为MDA-MB-231细胞的免疫荧光染色结果。MDA-MB-231细胞是缺乏ER-α66和ER-α46的ER阴性乳腺癌细胞系。用与ER-α36特异性结合的抗体对MDA-MB-231细胞进行染色（图中标为“ER-α36Ab”的左图：正染色显示为绿色）。用4,6-二脒-2-苯基吲哚对细胞核进行染色。（图中标为“DAPI”的中图：正染色显示为蓝色)。合并的染色信号被标为“合并”。当将所述抗体与结合到所述抗体上的免疫原多肽预温育时，结果显示为阴性（下图）。
图3显示了不同肿瘤细胞株表达ER-α36的蛋白免疫印迹结果。道1：瞬时过表达ER-α36的293人肾上皮细胞株；道2-4：不同实验室来源的人乳腺癌SK-BR-3细胞株；道5-7：不同实验室来源的人乳腺癌MCF-7细胞株；道8-9：不同实验室来源的人白血病HL-60细胞株；道10-11：不同实验室来源的人白血病MV-4-11细胞株；道12-13：不同实验室来源的人慢性粒细胞白血病K562细胞；道14：人肝癌A2780细胞；道15：人肝癌HEL-7402细胞；道16：人肝癌HEL-9204细胞；道17：来源于病人的原代肝癌Hep-11细胞；道18：来源于病人的原代肝癌Hep-12细胞。
图4至图8分别是用MTT法检测化合物1在体外对胃癌BGC-823细胞、肺癌H460细胞、结肠癌LS174T细胞、胰腺癌PANC-1和前列腺癌PC-3细胞的生长抑制作用。结果显示化合物1对这些肿瘤细胞都有显著的生长抑制作用，且呈较好的剂量依赖关系。IC50在1~4μΜ。
图9显示了当分别以阳性对照他莫昔芬（0.7mg/鼠/天），化合物1（0.7mg/鼠/天）以及阴性对照空白溶媒（0.2mL/鼠/天）对荷瘤人乳腺癌BCAP-37瘤株裸鼠连续给药20天后的平均瘤重（直方图a），显示了化合物的肿瘤生长的抑制作用。
图10显示了当分别以利妥昔单抗为阳性对照，以化合物1（0.7mg/鼠/天）以及阴性对照空白溶媒（0.2mL/鼠/天）对荷瘤人B淋巴瘤Daudi细胞裸鼠连续给药21天的肿瘤的生长曲线图。
图11显示了当分别以阳性对照醋酸甲孕酮（120mg/kg），和化合物1的低（17.5mg/kg）、中（35mg/kg）、高剂量(70mg/kg)以及阴性对照空白溶媒（0.2mL/鼠/天）对荷瘤人子宫内膜癌Ishikawa瘤株裸鼠连续给药20天后的平均瘤重。化合物1对荷瘤小鼠的肿瘤生长有显著地抑制作用，且优于阳性对照药物。
发明详述
化合物及其衍生物
在本发明的某些实施方式中提供了一类苯并吡喃酮类化合物及其药学上可接受的盐或前药，以及含该类化合物的药物组合物，它们可用于调控新型雌激素受体ER-α36的功能，预防和/或治疗由ER-α36受体介导的疾病，如癌症，等。
在某些实施方式中，本发明提供了式（I）的化合物：
Figure BDA00002645769900041
及其药学上可接受的盐、前药或药物组合物，其中：
R1可选自氢，(C1-C6)烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C6)烷基；
R2，R3，R4，R5和R6可独立选自氢，(C1-C4)烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷基，卤素，氰基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷氧基，但R2，R3，R4，R5和R6不可同时为氢；
且当R1为甲基，R3和R5为氢时，R4不可为氯原子。
本发明的一个实施方式，包括一组带式（I）结构的化合物，称为化合物（II）,其所述化合物具有下式：
Figure BDA00002645769900042
其中：
R2，R3，R4，R5和R6可独立选自氢，(C1-C4)烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷基，卤素，氰基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷氧基；但R2，R3，R4，R5和R6不可同时为氢。
本发明的一个实施方式，包括一组带式（I）结构的化合物，称为化合物（III）,其所述化合物组具有下式：
其中：
R2，R3，R4，R5和R6可独立选自氢，(C1-C4)烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷基，卤素，氰基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷氧基；但R2，R3，R4，R5和R6不可同时为氢。
且当R3和R5为氢时，R4不可为氯原子。
本发明特别优选的式（I）结构的化合物包括但不限于下列化合物：
2-(4-三氟甲基苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-氟苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(3-氟-4-氯苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-氯苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-三氟甲氧基苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(3,4-二氯苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-溴苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(3,4-二氟苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-三氟甲基苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-三氟甲氧基苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-溴苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮。
本文中提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。
以下是本说明书中使用的术语的定义。除非另外说明，本文中为基团或术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或术语，无论是单独的或是作为另一基团的一部分。
“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。替换氢原子的原子或分子称之为“取代基”。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca-Cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，(C1-C6)烷基是指包含1-6个碳原子的烷基。
术语“烷氧基”是指与一个氧原子键合的直链或带有支链的、单价的、饱和脂肪链，包括但不限于如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基以及其它类似基团。
术语“烷基”指直链或带有支链的、单价的、饱和脂肪链，包括但不限于如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、己基以及其它类似基团。
术语“卤素”或“卤原子”是指氯、溴、氟和碘原子或基团。
术语“杂芳基”是指其中一个或多个碳原子已被如氮、氧或硫等杂原子取代的单环或多环芳香烃基团。如果杂芳基含有不止一个杂原子，则这些杂原子可能相同，也可能是不同的。杂芳基包括但不限于如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并吡喃基、呋喃基、咪唑基、吲唑基、吲嗪基、吲哚基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、噁嗪基、噁唑基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并[3,4-b]吲哚基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹嗪基、喹啉基、喹喔啉基、噻二唑基、噻三唑基、噻唑基、噻吩基、三嗪基、三唑基、呫吨基以及其它类似基团。
术语“氧代”是指碳原子和氧原子结合形成的羰基基团。
本发明化合物的前药和溶剂化物也在考虑之内。术语“前药”是指一种作为药物前体的化合物，该化合物在被服用后，在体内通过代谢或化学过程(例如，被置于生理pH条件下或通过酶的活性)发生化学转化，释放活性药物。关于前药的合成与使用的讨论，参见T.Higuchi和W Stella的文章：“Prodrugs as Novel Delivery Systems”vol.14of the ACS Symposium Series,and in Bioreversible Carriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,American PharmaceuticalAssociation and Pergamon Press,1987。这两篇文章的内容均被引用入本文中。本发明的“前药”也可包括本发明化合物的代谢前体，该类前药在对主体给药时可能不具有活性，但可在体内转化为本发明的式（I）化合物或其盐和/或溶剂化物。前药也可以是天然存在或者化学合成的化合物。
本发明的式（I）化合物可以以非溶剂化形式或者诸如水，乙醇等的可药用溶剂的溶剂化形式存在，且可预期的是本发明包括所有溶剂化和非溶剂化的形式。式（I）化合物的溶剂化物优选为水化物。
本发明化合物的所有立体异构体，例如由于式（I）化合物的R取代基上的不对称碳原子而可能存在的异构体，包括对映体和非对映体形式，均属于本发明的范围。所有式（I）所示的化合物的立体异构体及其混合物，包括外消旋混合物也都是本发明的一部分。另外，也包括所有的几何异构体和位置异构体。例如：如果式（I）所示的化合物含有双键，则其顺式与反式两种形式及其混合物也都包括在本发明的范围之内。
非对映异构体混合物可以通过本领域普通技术人员熟知的方法（如色谱法和/或分步结晶法）基于它们的物理化学差异来分离为它们的各个非对映异构体。对映异构体的分离可通过与具有光学活性的化合物反应，将对映异构体混合物转化成非对映异构体混合物，然后分离非对映异构体，再将单独的非对映异构体转化（如水解）成相应的纯对映异构体。另外，某些式（I）所示的化合物可以为阻转异构体（如，取代的联芳烃），也是本发明中的一部分。
术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
术语“盐”和“可药用的盐”是指式（I）所示的化合物或其立体异构体，或其前药与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐（内盐），还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将式（I）所示化合物，或其立体异构体，或其前药，与一定数量的酸或碱适当（例如等当量）进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。
酸加成的盐包括如氢溴酸盐、氢碘酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐（包括与乙酸或三卤乙酸如三氟乙酸形成的盐）、草酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、苯磺酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、十二烷基磺酸盐、己二酸盐以及其它类似盐。
碱性盐（例如在R取代基含有酸性部分如羧基或酚羟基的情形所形成的盐）包括铵盐，碱金属盐（例如钠盐、锂盐和钾盐），碱土金属盐（例如钙盐和镁盐），与有机碱（如有机胺）形成的盐（例如二苄基乙二胺、二环己胺、哈胺、N-甲基-D-葡糖胺、叔丁胺），以及与氨基酸如精氨酸、赖氨酸形成的盐等。也包括与含氮碱性试剂形成季铵盐，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙铵、甲胺、二甲胺盐、三甲基胺盐、三乙胺盐、乙胺以及其它类似物。其他例子详见本专利的参考文献Berge,et al.,J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)。
所述的式（I）化合物还可以作为处于平衡中的互变异构体存在，且所有这些形式都包括在本发明的范围内。
本发明的一种实施方式中，本发明包括了同位素标记的式（I）化合物，所述同位素标记化合物是指与本文中所列化合物相同，但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或质量数不同于自然界中常见的的原子质量或质量数。可以引入式（I）化合物中的同位素包括包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯，即2H,3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。含有上述同位素和/或其它原子同位素的式（I）的化合物及其立体异构体和前药，以及该化合物、立体异构体或者前药的可药用的盐均应包含在本发明范围之内。
某些同位素标记的式（I）化合物，例如那些被如3H和14C等放射性同位素标记的化合物，可被用作化合物和或底物的组织分布分析中。由于含氚（即3H）的同位素和碳14（即14C）的同位素相对容易制备与检测，我们优选3H的同位素和14C的同位素。另外，一些同位素，如氘代（即2H），由于有更好的代谢稳定性（如提高体内半衰期、或者降低给药剂量）从而提供某些治疗优势，因此，可在某些情况下优选。所述同位素标记的式（I）化合物通常可用本领域普通技术人员已知的方法诸如用同位素标记的试剂替代非同位素标记的试剂来制备。
发明用途
本发明所述的化合物是新型雌激素受体ER-α36的调节剂，并可用于调节ER-α36在体外和体内细胞中的功能，因此，本发明所述式（I）化合物可用于预防和/或治疗由ER-α36介导的相关疾病，尤其是相关的肿瘤疾病。
在本发明的某些实施方式中，提供了调节ER-α36在细胞中的功能的方法，该方法包括将式(I)的化合物作用于一个表达ER-α36的细胞。所述细胞可内源性表达ER-α36或通过基因工程来外源性地表达ER-α36，而且，可同时表达或不表达其它雌激素受体（如ER-α66、ER-α46和ER-β）。在某一个实施方式中，所述细胞内源性地表达ER-α36。在优选实施方式中，所述细胞是内源性地表达ER-α36的癌细胞。表达ER-α36的癌细胞包括但不限于如乳腺癌细胞、白血病细胞、肝癌细胞、淋巴瘤细胞、肺癌细胞、骨髓瘤细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞、结肠癌细胞和胃癌细胞。在更优选的实施方式中，所述表达ER-α36的细胞是内源性地表达ER-α36的乳腺癌细胞、白血病细胞、肝癌细胞、淋巴瘤细胞、子宫内膜癌细胞和卵巢癌细胞。表达ER-α36的乳腺癌细胞包括但不限于MCF7、MDA-MB-231和SKBR-3细胞。表达ER-α36的白血病细胞包括但不限于K562，MV-4-11，SUM159，HL-60和Molt-4细胞。表达ER-α36的子宫内膜癌细胞包括但不限于Hec1A细胞。表达ER-α36的肝癌细胞包括但不限于A2780，BEL7402，BEL7404，HEL-9204，Hep2G，Hep3B和来源于病人的原代肝癌干细胞Hep-12。表达ER-α36的淋巴瘤细胞包括但不限于Daudi。内源性ER-α36的表达可以通过用一种或多种试剂处理而增加或减少。这些试剂包括如血清、E2β(17β-雌二醇)、他莫昔芬和氟维司群（ICI182,780）。
在另一实施方式中，本发明提供了表达外源性ER-α36的细胞的制备方法。该细胞可用本领域普通技术人员已知的基因工程方法制备(参见Sambrook等，Molecular Cloning,ALaboratory Manual(2d Ed.1989)(Cold Spring Harbor Laboratory))。简要来说，先制备一个外源性ER-α36基因，并将其插入至一个表达载体中，再将所述表达载体转染到宿主细胞内，然后将宿主细胞放入适于表达外源性ER-α36的培养液中生长。人ER-α36的基因序列公开在Wang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.336,1023-1027(2005)(GenBank登录号BX640939)。表达外源性ER-α36的细胞可以表达或不表达内源性ER-α36。细胞中内源性或外源性ER-α36的表达水平可以通过用一种或多种其它试剂处理而增加或减少。这些试剂包括如血清、E2β(17β-雌二醇)、他莫昔芬和氟维司群（ICI182,780）。
因此，本发明所述的式(I)化合物可用于制备预防和/或治疗与ER-α36相关癌症的药物，包括但不限于肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌(结肠癌、直肠癌)、脑癌、乳腺癌、类癌、宫颈癌、内分泌相关癌症、子宫内膜癌、眼癌、胆囊癌、头颈癌、卡波济肉瘤癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、神经内分泌癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤癌、脊髓癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、阴道癌、外阴癌或子宫癌。在更优选的实施方式中，所述与ER-α36相关癌症包括乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、白血病、肝癌、淋巴瘤、肺癌、骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、黑色素瘤、甲状腺癌、软组织肉瘤癌、或子宫癌。。在更加优选的实施方式中，所述与ER-α36相关癌症包括乳腺癌，肝癌、淋巴瘤、前列腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和白血病。
所述受试对象可以为哺乳动物，如狗、猫、牛、羊、马或人，优选人。所述药物的必需治疗量根据具体疾病不同而变化并且可由获益于本公开的本领域普通技术人员容易地确定。
在某些实施方式中，本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用。也可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试剂结合使用，用于制备调控细胞功能或治疗疾病的药物或药物组合物。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。
在某些实施方式中，本发明的化合物可以与一种或多种其它抗癌剂联合使用。可联用的抗癌剂包括但不限于烷化剂、氮芥类药物、叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、纺锤体毒素、拓扑异构酶抑制剂、凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、鬼臼毒素、亚硝基脲、抗代谢物、蛋白合成抑制剂、激酶抑制剂、抗雌激素药、顺铂、卡铂、干扰素、天冬酰胺酶、亮丙瑞林、氟他胺、甲地孕酮、丝裂霉素、博莱霉素、阿霉素、依立替康和紫杉醇。在某一个实施方式中，所述抗癌剂是抗雌激素药物，诸如他莫昔芬和氟维司群（ICI182,780）。
在本发明某些实施方式中，式(I)所示的化合物、或其立体异构体或前药，或所述化合物的立体异构体或前药的一种可药用盐可以以药物组合物的形式，其中包含可药用载体、运载剂或稀释剂。它们也可用于制备预防和/或治疗受试对象与ER-α36相关的疾病的药物。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物也可用于治疗动物疾病。普通兽医可根据从业经验将本发明的一种化合物、或其可兽用的盐、或其可兽用的溶剂或其前药以合适的可接受的制剂形式给药。兽医可决定对某一动物最适合的剂量和给药途径。
如果将多种活性化合物组合起来给药，则这些活性化合物可以被同时、分别或以一定顺序依次给药。
化合物的制备方法
式(I)的化合物可以通过不同的合成方法来制备。典型的制备过程如下所列。除非有其它表示，R1,R2,R3,R4,R5,R6的定义如前所述。
对于本专业技术人员显而易见的是，化合物的确切制备方法是可根据化学结构而略有不同的。而且，在下面所阐述的多数制备过程中，利用常规的保护基团（以P来表示）来保护不稳定或活泼基团是必要的。上述保护基团的性质，以及它们引入或去除的制备方法都是公开的技术。（实例见Greene T.W“有机合成中的保护基团”，JohnWiley&Sons，纽约，1991）。以下所列的方案1至方案3以及相关描述仅作为本发明所述的式（I）化合物的制备方法的某些实例，并非限制本发明的范围。
Figure BDA00002645769900111
方案1
根据以上实施方案1，式(I)的化合物可通过几个步骤制备。化合物iii是由化合物i和ii在路易斯酸的催化下，经霍本-赫施反应（改良傅-克酰基化反应）而制备得到。适用于该反应的路易斯酸包括，如无水氯化锌，无水三氯化铝，三氯化铁，四氯化钛，氯化锡，三氟化硼乙醚复合物等等。该反应通常在约0°C至约120°C之间反应1至20个小时。
将化合物iii与各种取代的化合物iv在惰性溶剂中缩合反应可制备化合物v。适用于该反应的惰性溶剂包括醚，如DME，1,2-二乙氧基乙烷，THF，1,4-二氧六环，DMF，N,N-二甲基乙酰胺，吡啶，N-甲基-2-吡咯烷酮。该反应可在碱性条件下进行，如氢氧化钾，碳酸钾，，碳酸铯，氢化钠，甲醇钠，叔丁醇钾，DBU(1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯)，正丁基锂，LDA(二异丙基氨基锂)，LHMDS（六甲基二硅基胺基锂）等等。反应时可加入化学当量的或催化量的相转移催化剂，如18-冠-6，TBAB(四丁基溴化铵)，TBAF(四丁基氟化铵)等等。反应的温度通常在约0°C至约140°C之间，优选为在溶剂回流温度下反应1至20个小时。
将异戊烯基溴与化合物v在碱性条件下反应，可制备vii化合物。适用于该反应的溶剂包括，如甲醇，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，THF(四氢呋喃)，水，甲苯，DME(1,2-二甲氧基乙烷)，以及混合溶剂，如甲醇-水，DMF-水，四氢呋喃-水等等。在反应中使用的溶剂优选为水。适用于该反应的碱包括，如氢氧化钾，碳酸钾，碳酸铯，甲醇钠，氢化钠，叔丁醇钾，DBU(1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯)，正丁基锂，LDA(二异丙基氨基锂)，LHMDS（六甲基二硅基胺基锂）等等。反应温度通常在约0°C至约100°C之间，反应时间为1至20个小时。
在化学合成策略上，异戊烯基的引入和苯并吡喃酮母环的关环反应是本发明化合物合成的关键步骤。根据不同取代基的特性，这两个关键步骤的先后顺序也可适当调整。因此，本发明中的化合物也可采用方案2来制备。
Figure BDA00002645769900121
方案2
在方案2中，各类型反应所涉及的反应条件均与方案1中类似。将化合物iii在碱性条件下异戊烯基溴反应，可制备化合物viii。适用于该反应的溶剂包括，如甲醇，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，THF(四氢呋喃)，水，甲苯，DME(1,2-二甲氧基乙烷)，以及混合溶剂，如甲醇-水，DMF-水，四氢呋喃-水等等。在反应中使用的溶剂优选为水。适用于该反应的碱包括，如氢氧化钾，碳酸钾，碳酸铯，甲醇钠，氢化钠，叔丁醇钾，DBU(1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯)，正丁基锂，LDA(二异丙基氨基锂)，LHMDS（六甲基二硅基胺基锂）等等。反应温度通常在约0°C至约100°C之间，反应时间为1至20个小时。
将化合物viii与各种取代酰氯iv在惰性溶剂中缩合反应可制备化合物vii。适用于该反应的惰性溶剂包括醚，如DME，1,2-二乙氧基乙烷，THF，1,4-二氧六环，DMF，N,N-甲基乙酰胺，吡啶，N-甲基-2-吡咯烷酮。该反应可在碱性条件下进行，如氢氧化钾，碳酸钾，碳酸铯，氢化钠，甲醇钠，叔丁醇钾，DBU(1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯)，正丁基锂，LDA(二异丙基氨基锂)，LHMDS（六甲基二硅基胺基锂）等等。反应时可加入化学当量的或催化量的相转移催化剂，如18-冠-6，TBAB(四丁基溴化铵)，TBAF(四丁基氟化铵)等等。反应的温度通常在约0°C至约140°C之间，优选为在溶剂回流温度下反应1至20个小时。当式（I）化合物的R1为氢时，其可依据以下实施方案3来制备。
Figure BDA00002645769900131
方案3
在方案3中，P为羟基的保护基团。将化合物xi的保护基脱除可得到化合物xii。根据保护基的不同，去除的方法也相应变化，主要参见“有机合成中的保护基团”（Greene T.W等著.John Wiley&Sons，纽约，1991）其中的方法。优选的保护基为苄基，苯甲酰基，苄氧羰基，TBDMS(叔丁基二甲基硅基)，THP(四氢吡喃基)，甲基，MOM(甲氧基甲基)，PMB(对甲氧基苄基)等。
化合物xii与异戊烯基溴在碱性条件下反应，可制备化合物xiii。适用于该反应的溶剂包括，如甲醇，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，THF(四氢呋喃)，水，甲苯，DME(1,2-二甲氧基乙烷)，以及混合溶剂，如甲醇-水，DMF-水，四氢呋喃-水等等。在反应中使用的溶剂优选为水。适用于该反应的碱包括，如氢氧化钾，碳酸钾，碳酸铯，甲醇钠，氢化钠，叔丁醇钾，DBU(1，8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯)，正丁基锂，LDA(二异丙基氨基锂)，LHMDS（六甲基二硅基胺基锂）等等。反应温度通常在约0°C至约100°C之间，反应时间为1至20个小时。
具体实施方式
通过以下非限制性的实施例对本发明进行阐述，除非另有所述，否则：室温或环境温度是指18-25°C范围内，溶剂是在减压条件下使用旋转蒸发仪来脱除的，反应过程是通过薄层层析法（TLC）进行监测的。反应时间仅用于阐述说明。化合物的结构和纯度通过至少以下一种技术确认：TLC，质谱，核磁共振（NMR），高效液相色谱（HPLC）。所述产率仅用于阐述说明。
实施例1
2-(4-三氟甲基苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮(化合物1)
步骤1：制备2-甲氧基-1-(2,4,6-三羟基苯基)乙酮
将间苯三酚（35.1g，279mmol）溶于乙醚（500mL）中，在冰水浴条件下，加入无水氯化锌（8g，59mmol）和2-甲氧基乙腈（18g，253mmol）。将干燥的氯化氢气体通入到反应体系中，剧烈搅拌5小时。在这个过程中，会有沉淀析出。过滤收集沉淀物，并将其溶于水中，加热回流3小时。冷却后，收集粉红色沉淀，并用水重结晶可得到白色目标化合物（45g，产率81%）。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ=12.14(s,2H),10.41(s,1H),5.79(s,2H),4.56(s,2H),3.32(s,3H)。
步骤2：制备2-(4-三氟甲基苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-4H-苯并吡喃-4-酮
将2-甲氧基-1-(2,4,6-三羟基苯基)乙酮（30g，151mmol）和4-三氟甲基苯甲酰氯(37.5g,180mmol)溶于250mL干燥的吡啶中，室温滴加DBU(53.2,350mmol)。滴加完毕后，将反应体系加热至75°C，搅拌反应过夜。将反应混合物冷却至室温，并减压除去大部分溶剂，残余物倒入到冰浴冷却的稀盐酸溶液中。用500mL乙酸乙酯萃取3次，合并的萃取液用300mL的2N碳酸钠水溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥后，浓缩，粗产品用石油醚/乙酸乙酯（10:1）重结晶得到目标化合物（21g，产率40%)。
步骤3：制备2-(4-三氟甲基苯基)-3,5,7-三羟基-4H-苯并吡喃-4-酮
在250mL的三颈烧瓶中，将2-(4-三氟甲基苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-4H-苯并吡喃-4-酮(10g,28.3mmol)溶于150mL二氯甲烷中。在0°C下慢慢滴加三溴化硼(21.2g,84.9mmol)。加完后，反应体系升至室温反应4小时，然后用80mL冰水淬灭反应，用500mL乙酸乙酯萃取3次。合并的萃取液用饱和氯化钠水溶液洗涤1次，无水硫酸钠干燥。过滤浓缩后，粗产物用20mL的乙酸乙酯/石油醚（1:10）打浆后，过滤干燥得到黄色目标化合物（7g，产率70%)。
步骤4：制备2-(4-三氟甲基苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮(化合物1)
将化合物2-(4-三氟甲基苯基)-3,5,7-三羟基-4H-苯并吡喃-4-酮(3.38g,10mmol)和碳酸铯(33g,100mmol)溶于100mL水中，在冰水浴条件下滴加异戊烯基溴(1.9g,13mmol)。加完后，反应体系在室温下反应过夜，用2N的盐酸调pH至6左右，然后用乙酸乙酯萃取2次。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤浓缩后，粗产物用硅胶柱层析纯化，以乙酸乙酯/石油醚（1:25）为洗脱液，得黄色目标化合物508mg，产率12.5%。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ=12.20(s,1H),10.87(brs,1H),10.07(brs,1H),8.35(d,2H,J=8.1Hz),7.94(d,2H,J＝7.7Hz),6.33(s,1H),5.19(t,1H,J=5.4Hz),3.45(d,2H,J＝6.0Hz),1.75(s,3H),1.64(s,3H)；LC-MS(ESI,m/z):407.0[M+H]-。
参照实施例1的制备方法，化合物2至化合物8是以中间体2-甲氧基-1-(2,4,6-三羟基苯基)乙酮为原料与各种不同取代的烷基酰氯、芳基酰氯或杂芳基酰氯反应，采用类似的方法制备得到，具体如下表1所示。
表1
Figure BDA00002645769900151
实施例9
2-(4-三氟甲基苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮(化合物9)
将制备化合物1时的中间体2-(4-三氟甲基苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-4H-苯并吡喃-4-酮(500mg,1.42mmol)和碳酸铯(4.95g,15mmol)溶于25ml水中，在冰水浴条件下滴加异戊烯基溴(220mg,1.5mmol)。加完后，反应体系在室温下反应过夜，用2N的盐酸调pH至6左右，然后用乙酸乙酯萃取2次。合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤浓缩后，粗产物用硅胶柱层析纯化，以乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，得黄色目标化合物95mg，产率16.5%。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ=12.41(1H,s),10.92(1H,brs),8.20(2H,d,J=8.1Hz),7.96(2H,d,J＝7.7Hz),6.34(1H,s),5.15(1H,t,J+5.4Hz),3.84(3H,s),3.41(2H,d,J＝6.0Hz),1.68(3H,s),1.62(3H,s)；LC-MS(ESI,m/z):421.1[M+H]-。
实施例10
2-(3,4-二氟苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮(化合物10)
步骤1：制备2-甲氧基-1-[2,4,6-三羟基-3-(3-甲基丁-2-烯)苯基]乙酮
将化合物2-甲氧基-1-(2,4,6-三羟基苯基)乙酮(2.0g,10.09mmol)溶于5%氢氧化钾水溶液中(1.132g,20.18mmol)，然后在冰浴条件下，慢慢滴加异戊烯基溴(1.504g,10.09mmol)。反应混合物在室温下反应2小时，然后倒入到冰水中，用1N盐酸调节pH至2左右，再用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后，粗产物用硅胶柱层析纯化（以二氯甲烷：甲醇=100:1为洗脱体系）得目标化合物（0.5g，产率18.6%）。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ=13.70(s,1H),10.70(s,1H),10.33(9s,1H),5.97(s,1H),5.08(s,1H),4.56(s,2H),3.30(s,3H),3.02(m,2H),1.66(s,3H),1.57(s,3H).
步骤2：制备2-(3,4-二氟苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮（化合物10）
在氮气保护下，将2-甲氧基-1-[2,4,6-三羟基-3,5-二(3-甲基-2-丁烯-1-基)苯基]乙酮（250mg，0.94mmol），无水碳酸钾粉末（779mg，5.63mmol），TBAB（四丁基溴化铵，454mg，1.41mmol）和3,4-二氟苯甲酰氯（331mg，1.88mmol）溶于甲苯中（30mL）中，回流反应6小时。冷却后，去除甲苯，加入20mL水。水溶液用乙酸乙酯萃取。合并的有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，去除溶剂后得到褐色残余物。将残余物溶于20mL甲醇-水混合液(比例4:1)，加入氢氧化钾(1g)。混合物加热回流2小时，冷却到室温，并用1N盐酸溶液酸化至pH=4，用二氯甲烷萃取三次。合并的有机相用无水硫酸钠干燥并去除溶剂。粗产物用硅胶柱层析（洗脱液：乙酸乙酯/石油醚=1：50）纯化得到目标化合物（13.1mg，收率3.59%）。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ=12.45(s,1H),7.98-7.89(m,2H),7.35-7.30(m,1H),6.34(s,2H),5.25(br,1H),3.89(s,3H),3.55(d,J=6.8Hz,2H),1.84(s,3H),1.77(s,3H);LC-MS:390.1(MH)+;Purity:98.6%(254nm).
参照实施例9的制备方法，化合物11和化合物13以各自相应的中间体为原料与异戊烯基溴发生单取代反应而制备得到。具体如下表2所示。
表2
Figure BDA00002645769900171
生物活性测试方法
本发明的式（I）化合物的活性是通过以下分析方法测试的。
实施例14：ER-α变体在人乳腺癌试样中的表达
自ProSci Incorporated(Poway,CA)公司处购买了一个预先涂抹了人乳腺癌细胞组织的薄膜。用特异性识别ER-α36的抗ER-α36抗体和HRP共轭第二抗体检测薄膜，再用增强化学发光(ECL)检测剂(Amersham Pharmacia Biotech提供)进行显像。洗脱该同一薄膜上的标记，并用可识别ER-α所有三种亚型——ER-α66、ER-α46和ER-α36的抗雌激素受体-α抗体H222(Novocastra Laboratories Ltd,UK公司提供)进行检测。图1显示了ER-α66、ER-α46和ER-α36三种雌激素受体亚型在正常乳腺组织中(道1)没有表达，但它们在浸润性导管癌的一个试样(道2)、浸润性小叶癌的一个试样(道5)和非侵袭性导管癌(道7)中都有表达。另外，ER-α36在侵袭性导管癌(道4)和浸润性小叶癌的另一试样(道6)中有表达。其中，道2和道3是分别来自2个不同患者的浸润性导管癌组织。道5和道6是分别来自2个不同患者的浸润性小叶癌组织。此结果表明ER-α36在正常乳腺组织中不表达，而其在不表达ER-α66和ER-α46的ER阴性乳腺癌样本中有表达。
实施例15：ER-α36在ER阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达
MDA-MB-231是一种大家熟知的缺失ER-α66和ER-α46的细胞系(参见Relevance ofbreast cancer cell lines as models for breast tumours:an update.Marc Lacroix,Guy Leclercq,BrestCancer Research and Treatment83:249-289(2004))。MDA-MB-231细胞来自美国菌种保藏中心(ATCC)。将MDA-MB-231细胞放在含有Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和10%胎牛血清的8孔BIOCOAT载玻片(BD Science Discovery Labware公司提供)中，在37°C和5%CO2气氛中培养12小时。然后所述细胞用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，并在室温用4%多聚甲醛的PBS(pH7.4)溶液固定30分钟。其后，所述细胞用PBS冲洗，并用0.5%(体积/体积)TritonX-100通透破膜10分钟。再用PBS冲洗细胞，并加入3%血清的PBS溶液，在室温下封闭1小时。在所述载玻片上加入ER-α36特异性抗体，或加入预先与可结合ER-α36特异性抗体的免疫原多肽孵育30分钟的相同抗体在室温下孵育1小时，然后用含0.5%Triton X-100的PBS(PBST)冲洗3次，再用异硫氰酸荧光素(FTIC)标记的第二抗体孵育。最后，所述玻片用PBST冲洗3次，PBS冲洗1次，再加入免疫荧光标记(Molecular Probes,Eugene,OR公司提供)，在Nikon E600显微镜下检测并通过MRC-1024共聚成像系统(Bio-Rad公司提供)采集图像。图2(上图)显示了MDA-MB-231细胞被抗ER-α36抗体染色呈阳性。为了进一步证实该实验的可信度，通过将被免疫原多肽预孵育过的抗ER-α36抗体孵育后未显示出任何染色(图2，下图)，表明所述抗体的特异性。
实施例16：蛋白免疫印迹法检测ER-α36在不同肿瘤细胞株上的表达情况
在37℃和5%CO2条件培养实验细胞（如MDB-MA-231，培养基为10%-FBS-DMEM）。待每孔细胞长到60%--90%满度，收集细胞，并于4℃，4300rpm条件下离心5分钟。除去上清后，加入适量裂解液以及含1%NP-40和0.7mM EDTA的Lysis缓冲液，再加入蛋白酶抑制剂，与冰浴条件下裂解30分钟至1小时。再次以14000rpm离心15分钟，取上清液，并进行蛋白定量。蛋白免疫印迹法通用程序：在预制胶或自配胶上进行转膜、电泳、抗ERα-36抗体封闭、洗脱、二抗封闭、洗脱、最后在暗室下进行压片曝光，显示结果。图3显示了不同肿瘤细胞株表达ER-α36的蛋白免疫印迹结果。道1：瞬时过表达ER-α36的293人肾上皮细胞株；道2-4：不同实验室来源的人乳腺癌SK-BR-3细胞株；道5-7：不同实验室来源的人乳腺癌MCF-7细胞株；道8-9：不同实验室来源的人白血病HL-60细胞株；道10-11：不同实验室来源的人白血病MV-4-11细胞株；道12-13：不同实验室来源的人慢性粒细胞白血病K562细胞；道14：人肝癌A2780细胞；道15：人肝癌HEL-7402细胞；道16：人肝癌HEL-9204细胞；道17：来源于病人的原代肝癌Hep-11细胞；道18：来源于病人的原代肝癌Hep-12细胞。
实施例17：化合物对不同乳腺癌细胞的体外生长抑制作用
A:对ER-阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外
Figure BDA00002645769900181
ATP发光法细胞活力检测
在37°C和5%CO2气氛条件下将MDA-MB-231细胞保存在含有10%胎牛血清的DMEM中。细胞以6x103个/孔的密度接种在96孔板上。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，0.3μM，0.5μM，1μM，2μM，3μM，5μM，10μM，20μM，30μM，50μM and100μM作用于MDA-MB-231细胞72小时。然后用
Figure BDA00002645769900182
发光法细胞活力检测试剂盒(Promega)来检测被化合物作用后的细胞，并用Envision记录下发光值。
B:对ER-阳性乳腺癌MCF-7细胞的体外
Figure BDA00002645769900183
ATP发光法细胞活力检测
MCF7细胞是高表达ER-66,ER-46and ER-36的乳腺癌细胞系。(Relevance ofbreast cancer cell lines as models for breast tumours:an update.Marc Lacroix,Guy Leclercq,Breast Cancer Research and Treatment(2004)83,249-289;Wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:9063-9068(2006)).MCF7细胞来自于ATCC，并且维持在37°C，5%CO2气氛以及在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和10%胎牛血清中。细胞以6x103个/孔的密度接种在96孔板上。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，0.3μM，0.5μM，1μM，2μM，3μM，5μM，10μM，20μM，30μM，50μM and100μM作用于MCF7细胞72小时。然后用
Figure BDA00002645769900191
发光法细胞活力检测试剂盒(Promega)来检测被化合物作用后的细胞，并用Envision记录下发光值。
本发明部分化合物对不同乳腺癌细胞的细胞活力影响结果列举在下表3中。
表3
Figure BDA00002645769900192
a):他莫昔芬作为阳性对照化合物。
b):当化合物被测试的次数大于3次，IC50值用平均值±标准差来表示。
c):NA代表没有活性，其IC50值大于100μM。
d):ND代表没有测定。
实施例18：化合物对慢性白血病K562细胞的体外生长抑制作用
A:慢性白血病K562细胞的体外
Figure BDA00002645769900193
ATP发光法细胞活力检测
白血病K562来自于ATCC，并维持在37°C，5%CO2气氛以及在IMDM和10%胎牛血清中。细胞以6x103个/孔的密度接种在96孔板上。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，0.3μM，0.5μM，1μM，2μM，3μM，5μM，10μM，20μM，30μM，50μM and100μM作用于K562细胞72小时。然后用
Figure BDA00002645769900194
发光法细胞活力检测试剂盒(Promega)来检测被化合物作用后的细胞，并用Envision记录下发光值。
实施例19：化合物对人B淋巴细胞瘤Daudi细胞的体外生长抑制作用
A:人B淋巴细胞瘤Daudi细胞的体外
Figure BDA00002645769900201
ATP发光法细胞活力检测
人B淋巴细胞瘤Daudi细胞来自于ATCC，并维持在37°C，5%CO2气氛以及在IMDM和10%胎牛血清中。细胞以6x103个/孔的密度接种在96孔板上。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，0.3μM，0.5μM，1μM，2μM，3μM，5μM，10μM，20μM，30μM，50μMand100μM作用于K562细胞72小时。然后用
Figure BDA00002645769900202
发光法细胞活力检测试剂盒(Promega)来检测被化合物作用后的细胞，并用Envision记录下发光值。
本发明部分化合物体外对白血病K562细胞和人B淋巴细胞瘤Daudi细胞的细胞活力影响结果列举在下表4中。
表4
Figure BDA00002645769900203
a):格列卫和阿糖胞苷分别作为K562细胞模型和Daudi细胞模型的阳性对照化合物。
b):ND代表没有测定。
c):NA代表没有活性，其IC50值大于100μM。
实施例20：化合物对急性白血病细胞的体外生长抑制作用
A:体外MTT法检测化合物对急性粒细胞白血病细胞HL-60细胞增殖的抑制作用
急性粒细胞白血病细胞HL-60来自于ATCC，并维持在37°C，5%CO2气氛以及在IMDM和10%胎牛血清中。细胞以6x103个/孔的密度接种在96孔板上。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，10-4M，10-5M，10-6M，10-7M，10-8M作用于HL-60细胞72小时。然后用MTT法来检测OD值，计算细胞增殖被抑制的百分率。
B:体外MTT法检测化合物对急性淋巴母细胞白血病细胞Molt-4细胞增殖的抑制作用
急性淋巴母细胞白血病细胞Molt-4来自于ATCC，并维持在37°C，5%CO2气氛以及在RPMI-1640和10%胎牛血清中。细胞以6x103个/孔的密度接种在96孔板上。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，10-4M，10-5M，10-6M，10-7M，10-8M作用于Molt-4细胞72小时。然后用MTT法来检测OD值，计算细胞增殖被抑制的百分率。
本发明部分化合物对不同白血病细胞的细胞活力影响结果列举在表5中。
表5
Figure BDA00002645769900211
a):以阿霉素分别作为阳性对照化合物。
b):NA代表没有活性，化合物在10-6M浓度下对细胞增殖的抑制百分率小于10%。
实施例21：化合物对肝癌细胞的体外生长抑制作用
A:体外SRB法检测化合物对肝癌细胞BEL-7402细胞增殖的抑制作用
肝癌细胞HL-60来自于ATCC，并维持在37°C，5%CO2气氛以及在DMEM和10%10%NCS以及50μg/mlKANA中。细胞以6x103个/孔的密度接种在96孔板上。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，10-4M，10-5M，10-6M，10-7M，10-8M作用于BEL-7402细胞72小时。然后用SRB法来检测OD值，计算细胞增殖被抑制的百分率。
本发明部分化合物对肝癌细胞的生长抑制作用结果列举在表6中
表6
Figure BDA00002645769900221
a):阿霉素作为阳性对照化合物。
实施例22：化合物对胃癌细胞的体外生长抑制作用
A:体外MTT法检测化合物对胃癌细胞BGC-823细胞增殖的抑制作用
将胃癌细胞BGC-823以3x103个/孔的密度接种在96孔板上，并在37°C，5%CO2气氛中，用含有2.5%CS-FBS的无酚红的DMEM培养基养24小时。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，1，2，4，8，10，20μM作用于BGC-823细胞72小时。然后用MTT法来检测OD值，计算细胞增殖被抑制的百分率。结果见附图4。
实施例23：化合物对肺癌细胞的体外生长抑制作用
A:体外MTT法检测化合物对肺癌细胞H460细胞增殖的抑制作用
将肺癌细胞H460以4.0x103个/孔的密度接种在96孔板上，并在37°C，5%CO2气氛中，用含有2.5%CS-FBS的无酚红的1640培养基养24小时。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，1，2，4，8，10，20μM作用于H460细胞72小时。然后用MTT法来检测OD值，计算细胞增殖被抑制的百分率。结果见附图5。
实施例24：化合物对结肠癌细胞的体外生长抑制作用
A:体外MTT法检测化合物对结肠癌细胞LS174T细胞增殖的抑制作用
将结肠癌细胞LS174T以4.5x103个/孔的密度接种在96孔板上，并在37°C，5%CO2气氛中，用含有2.5%CS-FBS的无酚红的1640培养基养24小时。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，1，2，4，8，10，20μM作用于LS174T细胞72小时。然后用MTT法来检测OD值，计算细胞增殖被抑制的百分率。结果见附图6。
实施例25：化合物对胰腺癌细胞的体外生长抑制作用
A:体外MTT法检测化合物对胰腺癌细胞PANC-1细胞增殖的抑制作用
将胰腺癌细胞PANC-1以3x103个/孔的密度接种在96孔板上，并在37°C，5%CO2气氛中，用含有2.5%CS-FBS的无酚红的1640培养基养24小时。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，1，2，4，8，10，20μM作用于PANC-1细胞72小时。然后用MTT法来检测OD值，计算细胞增殖被抑制的百分率。结果见附图7。
实施例26：化合物对前列腺细胞的体外生长抑制作用
A:体外MTT法检测化合物对前列腺细胞PC-3细胞增殖的抑制作用
将前列腺癌细胞PC-3以3x103个/孔的密度接种在96孔板上，并在37°C，5%CO2气氛中，用含有10%胎牛血清的F12K培养基养24小时。将测试化合物溶于DMSO中，并以浓度为0，1，2，4，8，10，20μM作用于PC-3细胞72小时。然后用MTT法来检测OD值，计算细胞增殖被抑制的百分率。结果见附图8。
体内评价
实施例27：化合物对裸鼠体内人乳腺癌BCAP-37细胞移植瘤的生长抑制作用
将测试化合物作用于带有乳腺癌移植瘤的裸鼠，以测试它们抑制肿瘤生长的效果。从具有BCAP-37细胞的裸鼠体内提取肿瘤组织，切成小片。将几片肿瘤组织植入雌性裸鼠右前肢的腋下。植入后，以每只裸鼠7μg的剂量连续6天每天一次对其注射E2β溶液，以刺激肿瘤在受注鼠体内的生长。从第7天开始，以35mg/kg的剂量给荷瘤裸鼠灌胃于被测化合物的玉米油溶液。使用他莫昔芬作为阳性对照，玉米油作为阴性对照，将被测化合物溶于玉米油溶液中（20mg/mL）中。连续15-21天，每天向裸鼠给药35mg/kg的被测化合物和他莫昔芬，或玉米油。裸鼠死亡后，对其解剖并取出肿瘤组织称重。用以下公式百分比计算肿瘤组织的生长抑制率：肿瘤的生长抑制率=（阴性对照组肿瘤平均重量-被测化合物治疗过的肿瘤平均重量）/阴性对照组肿瘤的平均重量。将实验结果作柱状图，列于图9中。
实施例28：化合物对裸鼠体内人B淋巴细胞瘤Daudi细胞移植瘤的生长抑制作用
将测试化合物作用于带有人B淋巴细胞瘤Daudi细胞移植瘤的裸鼠，以测试它们抑制肿瘤生长的效果。人B淋巴细胞瘤Daudi细胞来源于ATCC。5次传代后的1×107个细胞加入0.2mL Matrigel后一起皮下植入到雄性裸鼠右前肢的腋下。当裸鼠体内的肿瘤达到150~200mm3时，将荷瘤裸鼠随机分组，每十只为一组。使混合油灌胃给药组作为阴性对照，静脉给予利妥昔单抗作为阳性对照组，被测化合物溶于混合油中灌胃给药。给药周期为连续21天，每天向测试组裸鼠灌胃给药被测化合物的混合油悬浮液（35mg/kg）一次；每周两次次向阳性对照组注射给药利妥昔单抗（20mg/kg），同时每天灌胃给予阴性对照组空白混合油溶媒一次。在给药周期中，每周测量两次肿瘤体积和裸鼠体重。以肿瘤体积和给药时间做肿瘤生长曲线图（图10），评估化合物对肿瘤生长的抑制作用。
实施例29：化合物对裸鼠体内人子宫内膜癌Ishikawa细胞移植瘤的生长抑制作用
将测试化合物作用于带有子宫内膜癌移植瘤的裸鼠，以测试它们抑制肿瘤生长的效果。从具有Ishikawa细胞的裸鼠体内提取肿瘤组织，切成小片。将几片肿瘤组织植入雌性裸鼠右前肢的腋下。植入后，以每只裸鼠7μg的剂量连续6天每天一次对其注射E2β溶液，以刺激肿瘤在受注鼠体内的生长。从第7天开始，以35mg/kg的剂量给荷瘤裸鼠灌胃于被测化合物的混合油溶液。使用醋酸甲孕酮作为阳性对照，混合油作为阴性对照，将被测化合物溶于混合油溶液中（20mg/mL）中。连续15-21天，每天向裸鼠给药35mg/kg的被测化合物和醋酸甲孕酮，或混合油。裸鼠死亡后，对其解剖并取出肿瘤组织称重。用以下公式百分比计算肿瘤组织的生长抑制率：肿瘤的生长抑制率=（阴性对照组肿瘤平均重量-被测化合物治疗过的肿瘤平均重量）/阴性对照组肿瘤的平均重量。将实验结果作柱状图，列于图11中。

Claims (10)

1.式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药，
Figure FDA00002645769800011
其中：
R1可选自氢，(C1-C6)烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C6)烷基；
R2，R3，R4，R5和R6可独立选自氢，(C1-C4烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷基，卤素，氰基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷氧基；但R2，R3，R4，R5和R6不可同时为氢；
且当R1为甲基，R3和R5为氢时，R4不可为氯原子。
2.如权利要求1所述的式（I）化合物或其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药，其中：
Figure FDA00002645769800012
其中：
R1可选自氢，甲基，乙基，三氟甲基，二氟甲基；
R2，R3，R4，R5和R6可独立选自氢，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，卤素，氰基，，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷氧基；但R2，R3，R4，R5和R6不可同时为氢；
且当R1为甲基，R3和R5为氢时，R4不可为氯原子。
3.如权利要求2所述的化合物，当R1为氢时，其化学结构如式（II）所示，
Figure FDA00002645769800021
其中：
R2，R3，R4，R5和R6可独立选自氢，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，卤素，氰基，，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C6)烷氧基；但R2，R3，R4，R5和R6不可同时为氢。
4.如权利要求2所述的化合物，当R1为甲基时，其化学结构如式（III）所示，
Figure FDA00002645769800022
其中：
R2，R3，R4，R5和R6可独立选自氢，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，卤素，氰基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C4)烷基，含有一个或多个卤原子取代的(C1-C6)烷氧基，但R2，R3，R4，R5和R6不可同时为氢；
且当R3和R5为氢时，R4不可为氯原子。
5.如权利要求1-4所述，本发明优选的化合物可选自：
2-(4-三氟甲基苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-氟苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(3-氟-4-氯苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-氯苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-三氟甲氧基苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(3,4-二氯苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-溴苯基)-3,5,7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(3,4-二氟苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-三氟甲基苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-三氟甲氧基苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮；
2-(4-溴苯基)-3-甲氧基-5,7-二羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4H-苯并吡喃-4-酮。
6.如权利要求1-5所述化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物或者前体药物的有效剂量组成的药物组合物，其中含有一个或多个可药用辅料。
7.如权利要求1-5所述的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物或者前体药物，及其药物组合物在制备预防或治疗与ER-α36有关的肿瘤疾病的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述的癌症选自胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌(结肠癌、直肠癌)、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、卡波济肉瘤癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、神经内分泌癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤癌、脊髓癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、或子宫癌。
9.如权利要求8所述的应用，其中所述的癌症选自乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、白血病、肝癌、淋巴瘤、肺癌、骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、黑色素瘤、甲状腺癌、软组织肉瘤癌、或子宫癌。
10.如权利要求9所述的应用，其中所述的癌症是乳腺癌，肝癌、淋巴瘤、前列腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和白血病。
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