CN105601602B - 黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法：以黄绿蜜环菌子实体为原料，磨成粉末后乙酸乙酯提取，浓缩至膏状；用正己烷‑乙醇溶剂溶；一维液相色谱分离：采用Silica色谱柱，A相正己烷、B相乙醇二元流动相，B相浓度由0％至75％梯度洗脱，收集23‑26min洗脱液；用乙醇‑正己烷溶剂溶解；二维液相色谱分离：采用Silica色谱柱，A相正己烷、B相乙醇二元流动相，B相浓度4％等度洗脱，收集13‑18min洗脱液，蒸发浓缩，得大豆素。该分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，成本低，大豆素提取率高；目的物对肺癌A549细胞和肝癌Hep‑G2细胞具有抑制作用，具有抗癌药物开发潜力。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，具体涉及一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，以及该大豆素单体化合物在制备抗肝癌药物和抗肺癌药物中的应用。
背景技术
黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-rivens)，又名黄蘑菇、金蘑菇、黄环菌，隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属。黄绿蜜环菌子实体中等大，菌盖扁半球形至平展，直径5-12cm，菌盖边缘内卷，表皮开裂形成近环状排列的纤毛状后磷片。菌褶近似菌盖色，稍密，弯生，不等长。菌柄柱形，茎部膨大，长2-10cm，直径2-2.5cm，白色或或带黄色，内实。菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色鳞片。在显微镜下观察，担孢子椭圆形，无色至微黄色，淀粉质，担孢子棒状，无色，具4个孢子，菌丝具明显锁状联合。菌丝分布在土壤5-10cm。该菌夏秋季生于针叶林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌丝可与主要植被为嵩草和高山杂类草等形成菌根。在牧草生长季节，由黄绿蜜环菌菌丝顶端生长，在草地上形成或大或小的圆圈、半圆或条带状的蘑菇圈。圈的宽度大约为50cm，圈的直径大约6cm左右(周连玉.黄绿蜜环菌的研究概述.安徽农学通报[J].2010,16(3):52-54)。
国内对黄绿蜜环菌营养成分进行了初步分析，富含氨基酸、蛋白质、多糖多肽等营养和药用成分，具有较高的保健和药用价值。但目前的蜜环菌制剂主要以初提混合物为原料，如郭顺星等在“蜜环菌的化学成分及应用研究”(微生物学通报[J].1996,23(4):239-240)中提出：蜜环菌糖浆以蜜环菌培养液(菌丝连同发酵液)为主要原料，煮沸浓缩制成，主治眩晕头痛，神经衰弱，失眠，美尼尔综合症；蜜环菌浸膏以菌丝体为原料，煮沸、过滤，残渣醇析，醇析物与滤液合并浓缩制成，用于治疗血管性头痛、神经衰弱、冠心病、脑动脉血管硬化等病；蜜环菌片以菌丝体烤干后磨成细粉压片而成，对高胆固醇血症、高甘油三酯血症、降低血压有一定效果。由于蜜环菌制剂成分一般为混合物，缺乏必要的药效物质基础和药效研究，所以其缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。可见，对黄绿蜜环菌的化学成分进行进一步提取和研究非常有必要。
袁兴利等在“蜜环菌的化学成分研究”(中国中药杂志[J].2013,38(16):2671-2674)提出以蜜环菌发酵培养物(包含菌丝体和发酵液)为原料进行有效成分提取：采用95％乙醇浸提后，用闪式提取器提取，合并提取液并浓缩；经两次硅胶柱色谱和一次Sephadex LH-20色谱柱，并使用不同的洗脱剂进行分离纯化后，得到大豆素(化学名5,7-二羟基-3-(4-羟苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮、4',5,7-三羟基异黄酮)单体化合物。但是使用该方法步骤繁琐，成本高，得到的大豆素含量极少，得率比较低，3.5kg干燥的蜜环菌发酵培养物只得到10mg大豆素，这大大限制了大豆素的进一步研究和应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，该方法采用二维高效液相色谱进行分离纯化，得到具有生物活性的大豆素单体化合物，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，成本低，大豆素提取率高。
本发明所采用的技术方案为：
一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL︰1g进行浸泡24-48h，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；
(2)使用乙醇体积分数为10-35％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；
(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％(即按体积百分比B相75％、A相25％混合而成的液体，下同理)进行梯度洗脱45-75min，根据紫外吸收光谱收集23-26分钟洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；
(4)用乙醇体积分数为2-15％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；
(5)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为500-2000μL/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为B相浓度4％进行等度洗脱20-30min，根据紫外吸收光谱收集13-18分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到大豆素单体化合物。
所述步骤(3)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径150mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
所述步骤(5)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
本发明还进一步提供上述提取得到的大豆素单体化合物在制备抗肺癌药物中的应用。该大豆素单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。
本发明进一步提供上述提取得到的大豆素单体化合物在制备抗肝癌药物中的应用。该大豆素单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。
按照本领域普通技术人员的理解，大豆素单体化合物的给药剂量应根据治疗对象的年龄、体重、疾病严重程度等因素而定，一般可以是0.35-1.26mg/天。
本发明采用二维液相色谱技术进行从黄绿蜜环菌中分离纯化大豆素：
首先：由于大豆素为苷元，极性非常小，所以粗提选用乙酸乙酯进行相似相溶提取，该溶剂可以尽可能多地溶解目的组分，且乙酸乙酯为脂溶性溶剂，与其相似相溶的目的组分也应该具备进入生物活性细胞所必需的脂溶性特性，从而具有更高的进入细胞参与细胞内作用的可能性；
其次，在一维分离的条件选择上：多次试验结果显示，Silica正相硅胶色谱柱对所提物质分离效果较好，而通过考察不同流动相组成和不同洗脱方式、流速及进样量后，结果显示采用本发明乙醇-正己烷0％-75％梯度洗脱分离效果最佳，且进样量在50-150mL/针范围内、流动相在550-600mL/min范围内时重复性良好，得到的一维液相组分中目的峰清晰、无拖尾吸收等现象，与其他峰之间分离好，有利于分离操作和后续进一步提纯；
再次，在二维分离的条件选择上：由于一维得到的组分中目的化合物含量已相当高，再使用Silica正相硅胶色谱柱，在洗脱条件选择为B相浓度4％等度洗脱时能将极性与大豆素非常接近的杂质分离开，得到纯度可达98％的大豆素单体化合物。
在液相色谱的溶剂选择上，一维色谱分离、二维色谱分离以及中间提取物的溶解，均采用正己烷、乙醇两种溶剂混合液，可以通过改变乙醇的比例来调节有效成分的溶解能力和流动相的洗脱能力，且整个色谱分离仅使用两种溶剂，有利于提取溶剂的回收再利用。
总的来说，本发明黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法工艺简单，成本低，试剂耗费量小，制备量大，稳定可控，重复性好，批次一致性较高，得到的大豆素纯度高，稳定性好，且具备较好的生物活性。通过细胞在线实时监测的方法观测其在体外的抗肿瘤作用，发现该大豆素单体化合物对肺癌A549细胞和肝癌Hep-G2细胞具有抑制作用；通过建立小鼠模型，发现该化合物对小鼠Lewis肺癌模型具有一定的疗效，对小鼠H22肝癌模型也具有一定的疗效。实验充分表明，该化合物大豆素单体在体内、体外实验抗肿瘤作用较好，具有抗癌药物开发潜力，为抗癌天然药物的开发提供了有力的依据。
附图说明
图1所示的是本发明实施例1黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法的一维高效液相色谱图；
图2所示的是本发明实施例1黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法的二维高效液相色谱图；
图3所示的是本发明实施例1所得到的目的组分的分析型高效液相色谱图；
图4所示的是本发明从黄绿蜜环菌中提取大豆素单体化合物的方法得到的目的组分的MS质谱图；
图5所示的是本发明从黄绿蜜环菌中提取大豆素单体化合物的方法得到的目的组分的C13NMR核磁图；
图6所示的是本发明从黄绿蜜环菌中提取大豆素单体化合物的方法得到的目的组分的H1NMR核磁图；
图7所示的是本发明实施例3黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法的一维高效液相色谱图；
图8所示的是本发明实施例3黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法的二维高效液相色谱图；
图9所示的是本发明实施例4黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法的一维高效液相色谱图；
图10所示的是本发明实施例4黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法的二维高效液相色谱图；
图11所示的是本发明实施例5中大豆素单体化合物对肺癌A549细胞的抑制作用；
图12所示的是本发明实施例6中大豆素单体化合物对肝癌Hep-G2细胞的抑制作用；
图13所示的是本发明实施例7中大豆素单体化合物抗肺癌实验小鼠平均瘤重，其中从左到右依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、CTX组、模型组；
图14所示的是本发明实施例7中大豆素单体化合物抗肺癌实验小鼠平均肺重，其中从左到右依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、CTX组、模型组、空白组；
图15所示的是本发明实施例7中大豆素单体化合物抗肺癌实验小鼠平均净体重变化，其中从左到右依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、CTX组、模型组、空白组；
图16所示的是本发明实施例7中大豆素单体化合物抗肺癌实验小鼠平均胸腺指数，其中从左到右依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、CTX组、模型组、空白组；
图17所示的是本发明实施例7中大豆素单体化合物抗肺癌实验小鼠平均脾指数，其中从左到右依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、CTX组、模型组、空白组；
图18所示的是本发明实施例7中大豆素单体化合物抗肺癌实验小鼠治疗期间平均体重；
图19所示的是本发明实施例7中大豆素单体化合物抗肺癌实验小鼠治疗期间平均饮食量；
图20所示的是本发明实施例8中大豆素单体化合物抗肝癌实验小鼠平均瘤重，其中从左到右依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、CTX组、模型组；
图21所示的是本发明实施例8中大豆素单体化合物抗肝癌实验小鼠平均净体重变化，其中从左到右依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、CTX组、模型组、空白组；
图22所示的是本发明实施例8中大豆素单体化合物抗肝癌实验小鼠平均胸腺指数，其中从左到右依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、CTX组、模型组、空白组；
图23所示的是本发明实施例8中大豆素单体化合物抗肝癌实验小鼠平均脾指数，其中从左到右依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、CTX组、模型组、空白组；
图24所示的是本发明实施例8中大豆素单体化合物抗肝癌实验小鼠治疗期间平均体重；
图25所示的是本发明实施例8中大豆素单体化合物抗肝癌实验小鼠治疗期间平均饮食量。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1：黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取
1.原料、材料：
黄绿蜜环菌子实体采摘自青海祁连并经过鉴定。
2.试剂：
无水乙醇购自天津市北方天医化学试剂厂；色谱级乙酸乙酯、正己烷购自Honeywell公司。
3.仪器设备：
超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；30升中药提取罐购自上海顺仪实验设备有限公司；恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪上海亚容生化仪器厂；silica正相硅胶色谱柱购自博纳艾吉尔有限公司；制备型高效液相色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司。
本实施例黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取，包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎1min，即得黄绿蜜环菌超微粉。
(2)取上述黄绿蜜环菌超微粉3kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡：3kg黄绿蜜环菌超微粉加入15L乙酸乙酯，25℃浸泡48h，浸泡结束后，20℃、4,000rpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清液通过旋转蒸发浓缩后转移至60℃恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡：第一次的残渣加入15L乙酸乙酯，25℃浸泡36h。(浸泡结束，按第一次浸泡方法进行处理，其中水体乙酸乙酯上清可与第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡：第二次浸泡残渣加入15L乙酸乙酯，25℃浸泡24h，浸泡结束，按第一次浸泡处理方法进行处理，将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。
(3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为25％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成125mg/mL的溶液，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。
(4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(150mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为100mL/针，流动相流速为580mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm；乙醇活化色谱柱3～10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱50min。得到的一维液相色谱图如图1所示，得到如图10个主要粗组分，收集24-25.5min洗脱液(图中7号峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分，称重为2.2克。
(5)用乙醇体积分数为10％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为75mg/mL，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到二维上样溶液。
(6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为1000μL/针，流动相流速为20mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式：B相浓度4％进行等度洗脱20min。得到的二维液相色谱图如图2所示，收集13-17.5min洗脱液(图中5号峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到白色细针形结晶，称重为0.016克，即为本发明目的组分。
实施例2：大豆素单体化合物的确认
1、HPLC进行纯度分析：
将实施例1得到的目的组分(图2中5号峰)进行HPLC进行纯度分析。经高效液相检测纯度达到98％，为单一化合物，HPLC谱图见图3。
2、质谱分析：
对目的组分(图2中7-5号峰)进行质谱分析：瀚盟生物技术(天津)有限公司，质谱图如图4所示。EI-MS m/z为:254(M+)；255(M+H)+，225(M-H-CO)。
3、核磁共振分析：
对目的组分(图2中5号峰)进行核磁共振分析：
1D 1HNMR谱中(DMSO-d6,400MHz)的数据结果如下：δ：10.73(1H,s,7-OH)，9.51(1H，s，4’-OH)，8.24(1H，s，2-H)，7.97(1H，d，J＝8.5Hz，5-H)，7.39(2H，d，J＝8.5Hz,2’,6’-H)，6.88(4H，m，6,8,3’,5’-H)，图谱如图5所示。
1D 13CNMR谱中(DMSO-d6,400MHz)的数据结果如下：153.09(C-2)，123.04(C-3)，175.18(C-4)，127.70((C-5)，115.4(C-6)，162.96(C-7)，157.6(C-9)，117.1(C-10)，124.02(C-1’)，130.5(C-2’)，115.5(C-3’)，157.6(C-4’)，115.0(C-5’)，130.5(C-6’)，图谱如图6所示。
根据EI-MS、NMR鉴定结果，经结构解析，确定实施例1得到的目的组分为大豆素，其分子式为C15H10O4，分子量为254，分子结构式如下：
实施例3：黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取
本实施例所用原料、材料、试剂、仪器设备同实施例1。
本实施例黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取，包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎1min，即得黄绿蜜环菌超微粉。
(2)取上述黄绿蜜环菌超微粉3kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡：3kg黄绿蜜环菌超微粉加入24L乙酸乙酯，25℃浸泡48h，浸泡结束后，20℃、4,000rpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清液通过旋转蒸发浓缩后转移至60℃恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡：第一次的残渣加入24L乙酸乙酯，25℃浸泡36h。(浸泡结束，按第一次浸泡方法进行处理，其中水体乙酸乙酯上清可与第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡：第二次浸泡残渣加入24L乙酸乙酯，25℃浸泡24h，浸泡结束，按第一次浸泡处理方法进行处理，将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。
(3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为20％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成110mg/mL的溶液，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。
(4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(150mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为60mL/针，流动相流速为550mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm；乙醇活化色谱柱3～10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱20min。得到的一维液相色谱图如图7所示，收集23.5-25.5min洗脱液(图中7号峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分，称重为2.23克。
(5)用乙醇体积分数为6％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为55mg/mL，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到二维上样溶液。
(6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为1000μL/针，流动相流速为12mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式：B相浓度4％进行等度洗脱25min洗脱。得到的二维液相色谱图如图8所示，收集13-17.5min洗脱液(图中7-5号峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到白色细针形结晶，称重为0.016克，即为本发明目的组分。
对目的组分进行EI-MS、NMR鉴定，结果同实施例1，即得到目的组分为大豆素。
实施例4：黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取
本实施例所用原料、材料、试剂、仪器设备同实施例1。
本实施例黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取，包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎1min，即得黄绿蜜环菌超微粉。
(2)取上述黄绿蜜环菌超微粉3kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡：3kg黄绿蜜环菌超微粉加入30L乙酸乙酯，25℃浸泡48h，浸泡结束后，20℃、4,000rpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清液通过旋转蒸发浓缩后转移至60℃恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡：第一次的残渣加入30L乙酸乙酯，25℃浸泡36h。(浸泡结束，按第一次浸泡方法进行处理，其中水体乙酸乙酯上清可与第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡：第二次浸泡残渣加入30L乙酸乙酯，25℃浸泡24h，浸泡结束，按第一次浸泡处理方法进行处理，将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。
(3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为30％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成130mg/mL的溶液，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。
(4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(150mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为120mL/针，流动相流速为600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm；乙醇活化色谱柱3～10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱50min。得到的一维液相色谱图如图9所示，收集23.5-25.5min洗脱液(图中7号峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分，称重为2.31克。
(5)用乙醇体积分数为6％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为85mg/mL，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到二维上样溶液。
(6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为1200μL/针，流动相流速为18mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式：B相浓度4％进行等度洗脱25min。得到的二维液相色谱图如图10所示，收集13-17.5min洗脱液(图中7-5号峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到白色细针形结晶，称重为0.015克，即为本发明目的组分。
对目的组分进行EI-MS、NMR鉴定，结果同实施例1，即得到目的组分为大豆素。
实施例5：抑制人肺肿瘤A549细胞生长的试验
主要材料与试剂：
人肺癌A549细胞由中国医学科学院血液病医院提供；F-12K培养基购自LifeTechnologies Corporation；iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪购自艾森生物(杭州)有限公司；DMSO购自天津康科德科技有限公司。
细胞培养：
在5％CO2、37℃饱和湿度下，用F-12K(10％FBS+1％PS)培养基培养人肺肿瘤A549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。
细胞生长情况监测：
将细胞实时监测仪放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150μL F-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的A549细胞悬液345μL，至每孔细胞数约2×104个，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μl稀释好的药物(实施例1得到的大豆素单体化合物)至终浓度为25μg/ml，含1‰DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。
空白对照孔(DMSO)：不加药物，加1‰DMSO；
实验孔(HMG7-5)：加实施例1所得的大豆素单体化合物。
试验结果如图11所示。
结果表明：本发明目的组分大豆素在25μg/ml时对A549细胞生长具有较强的抑制作用。
实施例6：抑制人肝肿瘤Hep-G2细胞生长的试验
主要材料与试剂：
人肝肿瘤Hep-G2细胞由中国医学科学院血液病医院提供；MEM培养基购自LifeTechnologies Corporation；iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪购自艾森生物(杭州)有限公司；DMSO购自天津康科德科技有限公司。
细胞培养：
在5％CO2、37℃饱和湿度下，用MEM(10％FBS、1％PS)培养基培养人肺肿瘤Hep-G2细胞，选取生长状态良好的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。
细胞生长情况监测：
将细胞实时监测仪放入5％CO2、37℃饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150μLMEM培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的Hep-G2细胞悬液345μL，至每孔细胞数约4×104个，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物(实施例1得到的大豆素单体化合物)至终浓度为25μg/mL，含1‰DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。
空白对照孔(DMSO)：不加药物，加入1‰DMSO；
实验孔(HMG7-5)：加实施例1所得的大豆素单体化合物。
实验结果如图12所示。
结果表明：本发明目的组分大豆素在25μg/ml时对能Hep-G2细胞具有较好的抑制作用。
实施例7：大豆素单体化合物抗lewis肿瘤试验
主要材料与试剂：
lewis肺癌瘤株(第2代)由天津国际生物医药联合研究院家蚕生物反应器平台赠予；环磷酰胺片(20130101)购自天津金世制药有限公司；吐温80由北京博润莱特科技有限公司分装；C57BL/6小鼠(16～22g)(动物许可证号：SCXK(京)2014-0013，合格证号：11400500007663)购自天津市奧臣实验动物销售有限公司。
本实施例拟在采用lewis荷瘤小鼠模型考察大豆素单体化合物抗肺癌肿瘤作用。具体步骤如下：
1.小鼠Lewis肺癌荷瘤模型建立
取接种肿瘤8-13天状态良好的荷瘤脱臼处死，体表酒精消毒，在无菌(超净台)环境下剥离小鼠肿瘤至盛有生理盐水的无菌平皿，剪至小块，将小块肿瘤放入组织匀浆器，按体积比1:3左右加入生理盐水匀浆，匀浆液倒入50ml无菌离心管，备用。用1ml注射器在C57小鼠右腋下注射接种0.2ml，肿瘤细胞混悬液的制备均在无菌条件下(超净工作台中)完成。从取出肿瘤腹水至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。
2.药物制备方法
大豆素(实施例1所得)灌胃剂：称定一定重量的黄绿蜜环菌提取物样品至离心管中，加入所需溶剂体积2％吐温-80，涡旋混合后再加入所需体积的生理盐水，混匀后，备用。
环磷酰胺灌胃剂：去掉环磷酰胺片的薄膜衣后进行称取，称取一定重量至研钵中，加入所需体积的生理盐水，充分研磨、混匀后备用。
3.分组及给药方法
将60只实验小鼠共分为6组，每组10只，雌雄各半，分为①低剂量(8.19mg/kg)组、②中剂量(24.57mg/kg)组、③高剂量(73.71mg/kg)组、④环磷酰胺组、⑤模型组、⑥空白组，以上除空白组及模型组外，其余各组在注射肿瘤混悬液后，均每日给药一次，每次每只0.2ml，连续给药10天，空白组及模型组在相同给药时间及给药时长灌胃给予2％吐温-80水溶液，连续灌胃10天。
4.观察指标
4.1 大体状态
每日对小鼠进行体重、饮食量的称定并记录，于最后一次计算小鼠除瘤后的体重净重。
4.2 瘤重及肿瘤抑制率
每日对小鼠右腋下进行观察，于最后一次给药24h后，解剖并取出肿瘤组织，称取肿瘤重量，按下述公式计算肿瘤生长抑制率。
4.3 肺组织重量
于最后一次给药24h后，解剖并取出肺组织，称取肺组织重量。
4.4 胸腺重量及胸腺指数
于最后一次给药24h后，解剖小鼠并取出胸腺组织，称量胸腺重量，按下述公式计算胸腺比。
4.5 脾脏重量及脾指数
于最后一次给药24h后，解剖小鼠并取出脾脏，称量脾脏重量，按下述公式计算脾指数。
5.数据统计
各组别小鼠相应数据均以表示，采用SPSS软件进行统计，各组别采用one-wayANOVA检验。各实验数据如表1、图13-19所示。
表1 大豆素提取物抗肺癌肿瘤试验结果
注：与模型组比较**p<0.01、*p<0.05；与空白组比较※※p<0.01、※p<0.05。
由以上数据可知，实施例1所得大豆素提取物在给予剂量为73.71mg/kg，服药天数为10天时与Lewis肺癌肿瘤模型小鼠比较有显著差异(P<0.01)，此剂量与环磷酰胺组比较无明显差异。
在净体重变化方面，除空白与模型组表现为体重上升，其余各组均出现体重下降的现象，各组别与模型组及空白组比较均表现出极显著差异(P<0.01)。
在胸腺指数方面，各实验组别胸腺指数均下降，且与空白组比较均表现出极显著差异(P<0.01)，与模型组比较低剂量组表现出显著差异(P<0.05)。
在脾指数方面，各实验组别脾指数均明显上升，且与空白组比较均表现出极显著差异(P<0.01)，黄绿蜜环菌各给药组别与模型组比较有显著差异(P<0.05)。
在给药治疗期间，各组小鼠体重均在一定范围内波动上升并无明显差别。
在给药治疗期间，除空白组饮食量维持恒定水平，各组小鼠饮食量均表现饮食量下降的趋势。
综上所述，推测本发明实施例1所得大豆素提取物在给药剂量为73.71mg/kg、服药剂量为10天时，其对小鼠Lewis肺癌模型具有一定的疗效，肿瘤抑制率为30.19％。通过小鼠胸腺指数及脾指数的比较，我们发现Lewis肺癌小鼠模型本身会降低胸腺指数，升高脾指数，本实验中大豆素提取物对肺癌模型小鼠的胸腺作用并不明显，但促进了模型小鼠的脾肿大现象。但整体来看，大豆素对小鼠的肺癌细胞有一定的杀伤力，从而抑制肿瘤细胞的过快增长。
实施例8：大豆素单体化合物抗H22肿瘤试验
主要材料与试剂：
H22肝癌瘤株(第2代)由天津国际生物医药联合研究院家蚕生物反应器平台赠与；环磷酰胺片(20130101)购自天津金世制药有限公司；吐温80由北京博润莱特科技有限公司分装；KM小鼠(16～22g)(动物许可证号：SCXK(京)2014-0013，合格证号：11400500007663)购自天津市奥臣实验动物销售有限公司。
本实施例拟在采用H22肝癌小鼠模型考察大豆素单体化合物抗肝癌肿瘤作用。具体步骤如下：
1.小鼠H22肝癌荷瘤模型建立
取接种肿瘤8-13天状态良好的荷瘤脱臼处死，体表酒精消毒，在无菌(超净台)环境下剥离小鼠肿瘤至盛有生理盐水的无菌平皿，剪至小块，将小块肿瘤放入组织匀浆器，按体积比1:3左右加入生理盐水匀浆，匀浆液倒入50ml无菌离心管，备用。用1ml注射器在KM小鼠右腋下注射接种0.2ml，肿瘤细胞混悬液的制备均在无菌条件下(超净工作台中)完成。从取出肿瘤至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。
2.药物制备方法
大豆素提取物(实施例1所得)灌胃剂：称定一定重量的大豆素提取物样品至研钵中，加入所需溶剂体积2％吐温-80，研磨混合后再加入所需体积的生理盐水，混匀后，备用。
环磷酰胺灌胃剂：去掉环磷酰胺片的薄膜衣后进行称取，称取一定重量至研钵中，加入所需体积的生理盐水，充分研磨、混匀后备用。
3.分组及给药方法
将60只实验小鼠共分为6组，每组10只，雌雄各半，分为①低剂量(7.06mg/kg)组、②中剂量(23.14mg/kg)组、③高剂量(71.07mg/kg)组、④环磷酰胺组、⑤模型组、⑥空白组，以上除空白组及模型组外，其余各组在注射肿瘤混悬液后，均每日给药一次，每次0.1ml/10g，连续给药10天，空白组及模型组在相同给药时间及给药时长灌胃给予2％吐温-80水溶液，连续灌胃10天。
4.观察指标
4.1 大体状态
每日对小鼠进行体重、饮食量的称定并记录，于最后一次计算小鼠除瘤后的体重净重。
4.2 瘤重及肿瘤抑制率
每日对小鼠右腋下进行观察，于最后一次给药24h后，解剖并取出肿瘤组织，称取肿瘤重量，按下述公式计算肿瘤生长抑制率。
4.3 胸腺重量及胸腺指数
于最后一次给药24h后，解剖小鼠并取出胸腺组织，称量胸腺重量，按下述公式计算胸腺比。
4.4 脾脏重量及脾指数
于最后一次给药24h后，解剖小鼠并取出脾脏，称量脾脏重量，按下述公式计算脾指数。
5.数据统计
各组别小鼠相应数据均以表示，采用SPSS软件进行统计，各组别采用one-wayANOVA检验。各实验数据如表2、图20-25所示。
表2 大豆素提取物抗肝癌肿瘤试验结果
注：与模型组比较**p<0.01、*p<0.05；与空白组比较※※p<0.01、※p<0.05。
由以上数据可知，实施例1所得以大豆素提取物在给予剂量为71.07mg/kg，服药天数为10天时与H22肝癌肿瘤模型小鼠比较有显著差异(P<0.05)，此剂量与环磷酰胺组比较无明显差异。
在净体重变化方面，各组别均表现为体重上升，且各组别之间比较并无显著差异。
在胸腺指数方面，各实验组别胸腺指数均下降，大豆素低剂量组与空白组比较表现出显著差异(P<0.05)，环磷酰胺组、模型组与空白组比较表现出极显著差异(P<0.01)。
在脾指数方面，各实验组别脾指数均明显上升，除大豆素高剂量组外，其余实验组别与空白组比较均表现出极显著差异(P<0.01)，大豆素高剂量组与模型组及空白组比较有显著差异(P<0.05)。
在给药治疗期间，各组小鼠体重均在一定范围内波动上升并无明显差别。
在给药治疗期间，除空白组饮食量维持恒定水平，各组小鼠饮食量均表现饮食量下降的趋势。
综上所述，推测大豆素提取物在给药剂量71.07mg/kg、服药剂量为10天时，其对小鼠H22肝癌模型具有一定的疗效，肿瘤抑制率为31.96％与环磷酰胺(31.44％)比较药效略高。通过小鼠胸腺指数及脾指数的比较，我们发现H22肝癌小鼠模型本身会降低胸腺指数，升高脾指数，本实验中大豆素提取物可肝癌模型小鼠胸腺缩小及脾肿大的现象，且该作用随着给药剂量的增加，效果更加明显。
实验证明，在小鼠给药期间没有致死现象，在一定浓度范围内，大豆素有具有潜在抗肺癌和抗肝癌肿瘤作用，该作用还并未被发掘。本发明提供了该化合物新的应用，为新药研发提供理论依据。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合中药提取的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (3)
1.一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL︰1g进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；
(2)使用乙醇体积分数为10-35％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；
(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱45-75min，根据紫外吸收光谱收集23-26分钟洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；
(4)用乙醇体积分数为2-15％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；
(5)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为500-2000μL/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为B相浓度4％进行等度洗脱20-30min，根据紫外吸收光谱收集13-18分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到大豆素单体化合物。
2.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径150mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
3.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(5)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
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