CN102153668A - 一种抗癌的黄绿蜜环菌多糖及提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明一种抗癌的黄绿蜜环菌多糖及其提取工艺，属药物或保健品技术领域。其技术方案为：黄绿蜜环菌多糖及提取工艺，包括如下步骤：(1)采摘新鲜黄绿蜜环菌，得黄绿蜜环菌粉；(2)黄绿蜜环菌粉经超声处理后得黄绿蜜环菌匀浆液；(3)黄绿蜜环菌匀浆液经提取合并得黄绿蜜环菌多糖提取液；(4)黄绿蜜环菌多糖提取液再制得黄绿蜜环菌多糖沉淀；(5)黄绿蜜环菌多糖沉淀经真空冷冻干燥得黄绿蜜环菌多糖。本发明的黄绿蜜环菌多糖，对肿瘤有良好的预防和治疗效果，且几乎无毒副作用。其提取工艺，提取率高，工艺流程简单，能耗低，设备投入小，易于推广，使用的溶媒为水和乙醇，这两种溶剂可回收利用，环境污染小。

Description

一种抗癌的黄绿蜜环菌多糖及提取工艺

一、技术领域：本发明提供了一种新型抗癌活性多糖——绿蜜环菌多糖及其提取工艺，黄绿蜜环菌多糖在抑制肿瘤生长、侵袭与转移方面具有很好的疗效，与化疗药物同时使用能够起到减毒增效之作用，可制备成预防和治疗肿瘤的药物或保健品。

二、技术背景：癌症是一种世界性的疾病，已经成为导致人类死亡的重要病种。世界卫生组织国际癌症研究中心日前公布的一份研究报告表明，根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。目前，我国每年新发癌症病例200万人，因癌症死亡人数为140万。癌症死亡率比90年代初期增加了22.5％，更可怕的是，癌症发病年龄提前了15-20年。众多的癌症患者，无疑形成了一个庞大的抗癌症药物市场。

当前癌症临床治疗方法主要包括机械治疗(手术治疗和放射治疗)和药物治疗。机械治疗同时也需药物辅助治疗，药物治疗多用化疗药，虽然近年来国外相继开发出许多针对性强、疗效较好的新型化疗药，但多数化疗药物都伴随有不同程度的毒副作用，化疗药物最大的副作用是缺乏对肿瘤细胞的选择性杀伤，杀伤癌细胞的同时，也损害造血系统和胃肠道系统，有些药物对心脏、肝脏有明显的毒性，化疗还可产生延迟或远期的副作用。因此诚待开发疗效好、毒副作用小的新型抗癌药，以及缓解化疗药毒副作用的辅助药物。

黄绿蜜环菌(Armillaria luteovirens)，又名黄蘑菇，黄环菌，是一种名贵食用菌，也是一种重要的高原生物资源，主要分布于青海、西藏、四川、甘肃，其海拔分布范围约为3000-4300m，其中以祁连的黄蘑菇最为质优。黄绿蜜环菌鲜味独特，口感极佳，颇受世人欢迎。它的蛋白质含量极高，富含各种营养物质，具有较高的营养价值和食疗保健作用，但目前黄绿蜜环菌多仅用于食用。

三、发明内容：

本发明的一个目的是提供一种新型抗癌活性多糖---黄绿蜜环菌多糖，用于预防和治疗肿瘤；本发明的另一个目的是提供一种简单高效、无污染、低能耗、易推广的黄绿蜜环菌多糖提取工艺。

本发明的技术方案为：

本发明黄绿蜜环菌多糖的提取工艺，包括如下步骤：

(1)采摘新鲜黄绿蜜环菌，经清洗、匀浆，真空冷冻干燥后，粉碎，过40-120目筛，得黄绿蜜环菌粉；

(2)上述黄绿蜜环菌粉加6-14倍体积蒸馏水匀浆，超声处理后8-35分钟后得到黄绿蜜环菌匀浆液；

(3)上述黄绿蜜环菌匀浆液加15-25倍体积蒸馏水，60-80℃水浴提取0.2-0.8小时，提取三次，3000rpm离心5-15分钟，提取液合并，得到黄绿蜜环菌多糖提取液；

(4)上述黄绿蜜环菌多糖提取液浓缩后加入适量乙醇，使醇沉浓度达到87-93％，醇沉18-30小时，3000rpm离心5-15分钟，得到黄绿蜜环菌多糖沉淀；

(5)上述黄绿蜜环菌多糖沉淀经真空冷冻干燥后得到黄绿蜜环菌多糖；

步骤(1)中采用真空冷冻干燥处理原材料，可以使材料在较低的温度下干燥，以避免高温破坏黄绿蜜环菌多糖成分。

步骤(2)在提取多糖前，对材料进行超声波预处理，利用超声波破碎细胞壁，从而有助于多糖的溶出，缩短了多糖提取的时间，提高了多糖提取的效率。

步骤(3)(4)所用的水提醇沉条件是通过单因素试验和正交试验得到的最佳提取工艺。

步骤(5)所采用真空冷冻干燥法制备黄绿蜜环菌多糖，避免了高温加热对多糖活性的破坏，且所得固体产品易粉碎，易于进行下一步的纯化研究。

本发明的黄绿蜜环菌多糖在使用时，可以将其与药学上常用的辅料制备成注射剂、胶囊剂、滴丸剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液等。

所述辅料包含稀释剂如乳糖、木糖醇、甘露醇、甲壳胺等，根据选择剂型的不同，可以按照现有的常规制剂方法选择不同的辅料。

可以选择的崩解剂如羧甲基淀粉钠、微晶纤维素等；

粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、聚乙二醇等；

稳定剂如山梨酸、对羟基苯甲酸酯、乙醇、枸橼酸等；

包合剂如α-环糊精、β-环糊精和N-LOK变性淀粉等；

包衣剂如羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、丙烯酸树脂等；

矫味剂如蜂蜜、蔗糖等。

本发明具有如下优点：

(1)本发明提供的黄绿蜜环菌多糖，其对肿瘤有良好的预防和治疗效果，且几乎无毒副作用。

(2)本发明提供的黄绿蜜环菌多糖提取工艺，采用了单因素实验和正交试验法优选最佳提取工艺，提取率高；采用超声辅助提取多糖，缩短了多糖提取的时间，提高了多糖提取的效率；采用水提醇沉法，工艺流程简单，能耗低，设备投入小，易于推广到工业生产中；所使用的溶媒为水和乙醇，均安全无毒，价格低廉，且这两种有机溶剂可回收利用，对环境的污染小；所得黄绿蜜环菌多糖含量高，活性强，可直接作为食品添加剂，以及直接作为抗癌药品或保健品的原料。

黄绿蜜环菌多糖对荷瘤(肝癌H₂₂)小鼠的抗癌作用

实验动物：CD-(ICR)小鼠，雌雄各半，体重19-21g。

药物剂量及给药方式：将实施例2所得的黄绿蜜环菌多糖颗粒作为供试药物，取50只小鼠，随机分为5组，大、中、小剂量组分别按552，276，138mg/kg剂量每天灌胃，连续13天，荷瘤对照组以等体积蒸馏水灌胃，阳性对照环磷酰胺(来源)组腹腔注射给药。

评价方法：末次给药24小时后，各组动物颈椎脱臼处死，解剖并剥离瘤体，摘取胸腺、脾，电子天平称重，以t检验进行统计学处理。结果显示阳性对照药环磷酰胺可明显抑制荷瘤(肝癌H₂₂)小鼠瘤体重量，但使小鼠体重减轻。ALP高、中、低三个剂量组都能明显减轻荷瘤(肝癌H₂₂)小鼠瘤体重量，中剂量组的效果相对较差；三个剂量组均使小鼠体重增长且明显高于阳性对照药环磷酰胺组，高剂量组明显高于荷瘤对照组。体重是衡量药物毒性作用的综合性指标之一，ALP给药组使荷瘤小鼠体重增加的速度加快，而环磷酰胺组则明显的降低小鼠的体重，说明ALP在抑制肿瘤的同时对小鼠没有明显的副作用，或者说与阳性对照药环磷酰胺组相比，毒副作用较小。三个剂量组对小鼠胸腺、脾指数均高于环磷酰胺组，但无统计学意义。

取小鼠骨髓，检测骨髓有核细胞数，结果显示环磷酰胺组小鼠有核细胞数比正常小鼠降低80％，说明化疗药物严重损伤小鼠免疫能力；而黄绿蜜环菌多糖口服治疗组小鼠的骨髓有核细胞数较对照组无显著差异。

取瘤体进行RNA的提取，并以之作为模板，用针对鼠源性的VEGF(血管内皮生长因子)的引物进行RT-PCR检测。我们发现相对于生理盐水组来说，低剂量、中剂量和高剂量的黄绿蜜环菌多糖组都能明显地抑制肿瘤组织中VEGF的表达。结果表明，黄绿蜜环菌多糖具有抑制肿瘤的作用。

黄绿蜜环菌多糖的免疫促进作用

以C57小鼠为实验模型，取40只小鼠，随机分为4组。将实施例2所得的黄绿蜜环菌多糖颗粒作为供试药物处理环磷酰胺组，大、中、小剂量组分别按552，276，138mg/kg剂量每天灌胃，对照组采用生理盐水灌胃，连续2周。然后，取脾脏的B淋巴细胞进行实验。

取106的B细胞，用Balb/c小鼠的淋巴细胞作为抗原刺激，4天后加入³H-TdR掺入细胞，18小时后收细胞，利用液闪测定同位素的掺入，以此来检测小鼠的免疫增强情况。将常对照组的3H-TdR掺入的增高比率定为100％，则低剂量、中剂量和高剂量的黄绿蜜环菌多糖组的增高比率分别为132％、147％和196％，这证实了口服黄绿蜜环菌多糖能够刺激B细胞的增殖从而激发机体的体液免疫。

取小鼠脾脏淋巴细胞进行RNA的提取，并以之作为模板，用针对鼠源性的TNF-α，IL-2和β-Actin的引物进行RT-PCR检测。我们发现相对于生理盐水组来说，低剂量、中剂量和高剂量的黄绿蜜环菌多糖组都能明显地增加TNF-α与IL-2的表达。

取脾脏检测小鼠CD₄T/CD₈T，黄绿蜜环菌多糖组小鼠显著高于对照组，说明黄绿蜜环菌多糖能够明显刺激CD₄T淋巴细胞的增殖，具有免疫促进作用。

由于本申请为一种新药，目前还没有做人体临床实验，为抢申请日故在未做人体临床实验前就申请。

四、具体实施方案：

实施例1：(1)采摘新鲜黄绿蜜环菌，经清洗、匀浆，真空冷冻干燥后，粉碎，过40目筛，得黄绿蜜环菌粉；

(2)上述黄绿蜜环菌粉加6倍体积蒸馏水匀浆，超声处理后8分钟后得到黄绿蜜环菌匀浆液；

(3)上述黄绿蜜环菌匀浆液加15倍体积蒸馏水，60℃水浴提取0.2小时，提取三次，3000rpm离心5分钟，提取液合并，得到黄绿蜜环菌多糖提取液；

(4)上述黄绿蜜环菌多糖提取液浓缩后加入适量乙醇，使醇沉浓度达到87％，醇沉18小时，3000rpm离心5分钟，得到黄绿蜜环菌多糖沉淀；

(5)上述黄绿蜜环菌多糖沉淀经真空冷冻干燥后得到黄绿蜜环菌多糖；

实施例2：(1)采摘新鲜黄绿蜜环菌，经清洗、匀浆，真空冷冻干燥后，粉碎，过120目筛，得黄绿蜜环菌粉；

(2)上述黄绿蜜环菌粉加14倍体积蒸馏水匀浆，超声处理后35分钟后得到黄绿蜜环菌匀浆液；

(3)上述黄绿蜜环菌匀浆液加25倍体积蒸馏水，80℃水浴提取0.8小时，提取三次，3000rpm离心15分钟，提取液合并，得到黄绿蜜环菌多糖提取液；

(4)上述黄绿蜜环菌多糖提取液浓缩后加入适量乙醇，使醇沉浓度达到93％，醇沉30小时，3000rpm离心15分钟，得到黄绿蜜环菌多糖沉淀；

(5)上述黄绿蜜环菌多糖沉淀经真空冷冻干燥后得到黄绿蜜环菌多糖；

实施例3：(1)采摘新鲜黄绿蜜环菌，经清洗、匀浆，真空冷冻干燥后，粉碎，过80目筛，得黄绿蜜环菌粉；

(2)上述黄绿蜜环菌粉加9倍体积蒸馏水匀浆，超声处理后25分钟后得到黄绿蜜环菌匀浆液；

(3)上述黄绿蜜环菌匀浆液加20倍体积蒸馏水，70℃水浴提取0.5小时，提取三次，3000rpm离心8分钟，提取液合并，得到黄绿蜜环菌多糖提取液；

(4)上述黄绿蜜环菌多糖提取液浓缩后加入适量乙醇，使醇沉浓度达到90％，醇沉24小时，3000rpm离心8分钟，得到黄绿蜜环菌多糖沉淀；

(5)上述黄绿蜜环菌多糖沉淀经真空冷冻干燥后得到黄绿蜜环菌多糖。

Claims (2)

1.一种抗癌的黄绿蜜环菌多糖，其特征是：它由如下提取工艺步骤制得：

(1)采摘新鲜黄绿蜜环菌，经清洗、匀浆，真空冷冻干燥后，粉碎，过40-120目筛，得黄绿蜜环菌粉；

(2)上述黄绿蜜环菌粉加6-14倍体积蒸馏水匀浆，超声处理后8-35分钟后得到黄绿蜜环菌匀浆液；

(3)上述黄绿蜜环菌匀浆液加15-25倍体积蒸馏水，60-80℃水浴提取0.2-0.8小时，提取三次，3000rpm离心5-15分钟，提取液合并，得到黄绿蜜环菌多糖提取液；

(4)上述黄绿蜜环菌多糖提取液浓缩后加入适量乙醇，使醇沉浓度达到87-93％，醇沉18-30小时，3000rpm离心5-15分钟，得到黄绿蜜环菌多糖沉淀；

(5)上述黄绿蜜环菌多糖沉淀经真空冷冻干燥后得到黄绿蜜环菌多糖。

2.一种抗癌的黄绿蜜环菌多糖的提取工艺，其特征是：它包括如下步骤完成：

(1)采摘新鲜黄绿蜜环菌，经清洗、匀浆，真空冷冻干燥后，粉碎，过40-120目筛，得黄绿蜜环菌粉；

(2)上述黄绿蜜环菌粉加6-14倍体积蒸馏水匀浆，超声处理后8-35分钟后得到黄绿蜜环菌匀浆液；

(3)上述黄绿蜜环菌匀浆液加15-25倍体积蒸馏水，60-80℃水浴提取0.2-0.8小时，提取三次，3000rpm离心5-15分钟，提取液合并，得到黄绿蜜环菌多糖提取液；

(4)上述黄绿蜜环菌多糖提取液浓缩后加入适量乙醇，使醇沉浓度达到87-93％，醇沉18-30小时，3000rpm离心5-15分钟，得到黄绿蜜环菌多糖沉淀；

(5)上述黄绿蜜环菌多糖沉淀经真空冷冻干燥后得到黄绿蜜环菌多糖。