CN110455909A - 一种基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，采用橡子果实作为原料，包括以下步骤：1)提取，2)纯化，3)溶解，4)混合，5)，点样。本发明通过MALDI‑TOF MS技术，在反射模式和线性模式下对缩合单宁进行检测，分析缩合单宁的结构单元及结构单元的比例、缩合单宁中不同聚合度的聚合物分布信息，以获得完成可靠的缩合单宁MALDI‑TOF质谱信息。本发明提供的检测方法具有灵敏度高，准确率高，分辨率高、快速简便和高通量等。
Description
技术领域
本发明属于橡子中缩合单宁检测的技术领域，具体涉及一种基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法。
背景技术
橡子中不仅含有丰富的淀粉、蛋白质及脂肪等营养物质，还含有缩合单宁、鞣酸、黄酮类物质等多功能成分。缩合单宁具有极强的抗氧化活性，是一种良好的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂，可以与蛋白质等生物大分子通过非共价键或共价键形成复合物。缩合单宁也称原花色素，自然界中存在几种类型不同的缩合单宁，主要有原花青素、原翠雀定和原天竺葵定等，均由黄烷-3-醇形成。其中原花青素是由表/儿茶素为单位通过C4—C8或C4—C6骨架组成的低聚体与高聚体混合物。
目前，常用于单宁类物质分析的方法主要有紫外－可见光谱法、高效液相色谱法、质谱技术、核磁共振波谱法、红外吸收光谱法等。这些方法检测的单宁种类大部分为小分子的单宁，其检测到缩合单宁种类不全、信号偏弱，由此可见传统的检测方法对聚合度较大的缩合单宁的检测效果不佳。因此，如何建立一种高通量、快速检测橡子中缩合单宁的方法，成为急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，该分析方法具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的优点。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，包括以下步骤：
1)提取：将橡子果实粉碎后经第一有机溶剂进行提取，得到缩合单宁的粗提液，蒸发除去所述缩合单宁的粗提液中的所述第一有机溶剂，得到缩合单宁的水相提取物，将所述缩合单宁的水相提取物冻干处理，得到缩合单宁粗提取物，向所述缩合单宁粗提取物当中加入第二有机溶剂，得到缩合单宁粗提取物溶液，所述第一有机溶剂和第二有机溶剂均为乙醇水溶液或丙酮水溶液，且第二有机溶剂浓度高于第一有机溶剂；
2)纯化：所述缩合单宁粗提取物溶液经纯化柱纯化处理后得到缩合单宁纯化物溶液，将所得缩合单宁纯化物溶液冻干处理，得到固体粉末为缩合单宁样品；
3)溶解：将所述缩合单宁样品溶于第三有机溶剂中，配制得到缩合单宁样品溶液，所述第三有机溶剂为50％～75％乙醇、30～75％丙酮溶液或50～70％乙腈溶液；所述缩合单宁样品溶液溶液浓度为5～20mg/mL；基质采用0.1％三氟乙酸和10％的乙腈溶液配制成饱和基质溶液，其中所述0.1％三氟乙酸的用量为所述基质重量的0.05～0.2倍，所述基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸、2，5-二羟基苯甲酸或芥酸之中的一种；
4)混合：所述缩合单宁样品溶液和所述饱和基质溶液以1：2～5的体积比充分混合，得到混合溶液；
5)点样：取1～4μL混合溶液将其滴加在基质辅助激光解吸电离仪器(MALDI)的靶板上，利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)对橡子中的缩合单宁进行分析。
上述技术方案中，在步骤1)中，将所述橡子果实粉碎至100～300目的颗粒，之后经第一有机溶剂进行提取，得到缩合单宁的粗提液，蒸发除去所述缩合单宁的粗提液中的所述第一有机提取溶剂，得到缩合单宁的水相提取物，将所述缩合单宁的水相提取物冻干处理，得到缩合单宁粗提取物，向所述缩合单宁粗提取物当中加入第二有机溶剂，得到缩合单宁粗提取物溶液，所述第一有机溶剂为70％乙醇溶液或70％丙酮溶液，所述第二有机溶剂为75％乙醇溶液或75％丙酮溶液。
上述技术方案中，在步骤1)中所述提取过程的提取温度为50～60℃，回流时间为1.5～3小时。
上述技术方案中，在步骤2)中，所述纯化柱为HP2MG大孔树脂或Sephadex LH-20凝胶柱。
上述技术方案中，在步骤2)中，所述纯化处理采用所述缩合单宁粗提取物与所述大孔树脂的质量比1:12.5～20的比例进行吸附，用2.5倍柱体积的水进行水相洗涤，除去部分糖，水相洗涤之后用75％的乙醇洗脱，75％的乙醇洗脱液为所述缩合单宁纯化物溶液。
上述技术方案中，所述冻干处理过程为：将溶液在-20℃下冻成固体，然后在低于10Pa，温度为-70℃下的冻干机中冻干12h，得到固体粉末的过程。
上述技术方案中，在步骤3)中，所述基质为2，5-二羟基苯甲酸。
上述技术方案中，在步骤3)中，所述第三有机溶剂为50％的乙腈溶液或30％的丙酮溶液。
上述技术方案中，在步骤3)中，所述缩合单宁样品溶液溶液浓度为10mg/mL。
上述技术方案中，在步骤4)中，所述缩合单宁样品溶液和所述饱和基质溶液以1：3的体积比充分混合，得到混合溶液。
本发明的优点和有益效果为：
本发明将MALDI-TOF MS技术用于检测橡子中的缩合单宁，该检测方法所需样品量少，检测快速、简便、信号强度大、通量高。
附图说明
图1是实施例一中线性模式下橡子缩合单宁MALDI-TOF MS图。
图2负离子模式下橡子纯化产物的液质联用图。
图3正离子模式下橡子纯化产物的液质联用图。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例当中所用主要原料、设备及溶剂
反射模式及线性模式下MALDI-TOF MS仪器参数
实施例一
提取：取20g橡子果实，用多功能粉碎机将所述橡子果实粉碎至100～300目的颗粒，之后经70％的乙醇溶液进行提取，提取温度为50℃，回流时间为2小时，提取3次，合并提取液，得到缩合单宁的粗提液，蒸发除去所述缩合单宁的粗提液中70％的乙醇溶液，得到缩合单宁的水相提取物，将所述缩合单宁的水相提取物冻干处理，所述缩合单宁的水相提取物在-20℃下冻成固体，然后在低于10Pa，温度为-70℃下的冻干机中冻干12h，得到固体粉末为缩合单宁粗提取物，向所述缩合单宁粗提取物当中加入加入75％的乙醇，得到缩合单宁的水相提取物溶液。
纯化：所述缩合单宁的水相提取物溶液经60mL柱体积的HP2MG大孔树脂进行纯化，所述纯化处理采用缩合单宁粗提取物与HP2MG大孔树脂的质量比1:15的比例进行吸附，用2.5倍柱体积的水进行水相洗涤，除去部分糖，水相洗涤之后用75％的乙醇洗脱，75％的乙醇洗脱液为所述缩合单宁纯化物溶液，所述缩合单宁纯化物溶液在-20℃下冻成固体，然后在低于10Pa，温度为-70℃下的冻干机中冻干12h，得到固体粉末为缩合单宁样品。
溶解：所述缩合单宁样品溶于50％乙腈溶液中，配制得到缩合单宁样品溶液，缩合单宁样品溶液浓度为10mg/mL；基质采用0.1％TFA和10％的乙腈溶液配制成饱和基质溶液，其中所述0.1％TFA的用量为所述基质重量的0.1倍，所述基质为2，5-二羟基苯甲酸。
混合：所述缩合单宁样品溶液和所述饱和基质溶液以1：3的体积比充分混合，得到混合溶液；
点样：取2μL混合溶液将其滴加在MALDI的靶板上，室温下挥干溶剂，利用MALDI-TOF MS技术对橡子中的缩合单宁进行分析。
图2图3分别是负离子、正离子模式下的橡子纯化物的液质联用(HPLC)图谱，通过对其分子量的分析，我们发现应用HPLC并不能准确的测定出橡子中的缩合单宁，因为HPLC测定的大部分为小分子单体，对大分子缩合单宁并没有很好的检出效果。HPLC的主要峰核质比见表二表三。基于上述问题，我们采用MALDI-TOF技术，通过对图1的分析，我们发现MALDI-TOF能够清晰的测定出橡子中的缩合单宁，相应的分子量见表一。
表1:线性模式下基质辅助激光解析-串联飞行时间质谱分析橡子缩合单宁的结构组成
Table 1:the composition of condensed tannins from acorn was analyzedby MALDI-TOF MS in linear modes
表2负离子模式下橡子纯化产物主要峰的分子量
| 峰 | M/Z | 峰 | M/Z |
| 1 | 272.9656 | 6 | 711.4043 |
| 2 | 783.0733 | 7 | 679.3781 |
| 3 | 387.1717 | 8 | 327.2288 |
| 4 | 305.0785 | 9 | 329.2447 |
| 5 | 197.0601 | 10 | 517.3245 |
表3正离子模式下橡子纯化产物主要峰的分子量
| 峰 | M/Z | 峰 | M/Z |
| 1 | 350.2223 | 9 | 501.3129 |
| 2 | 935.0655 | 10 | 293.2048 |
| 3 | 935.0647 | 11 | 295.2205 |
| 4 | 227.1230 | 12 | 279.0829 |
| 5 | 439.0982 | 13 | 312.3543 |
| 6 | 771.0929 | 14 | 520.3291 |
| 7 | 309.1838 | 15 | 301.1330 |
| 8 | 359.1423 | 16 | 353.2573 |
实施例二
提取：取20g橡子果实，用多功能粉碎机将所述橡子果实粉碎至100～300目的颗粒，之后经70％的丙酮溶剂进行提取，提取温度为55℃，回流时间为2小时，提取3次，合并提取液，得到缩合单宁的粗提液，蒸发除去所述缩合单宁的粗提液中70％的丙酮溶液，得到缩合单宁的水相提取物，将所述缩合单宁的水相提取物冻干处理，得到缩合单宁粗提取物，向所述缩合单宁粗提取物当中加入75％的丙酮，得到缩合单宁的粗提物溶液。
纯化：所述缩合单宁的粗提物溶液经60mL柱体积的HP2MG大孔树脂进行纯化，所述纯化处理采用所述缩合单宁粗提取物与大孔树脂的质量比1:12.5的比例进行吸附，用3倍柱体积的水进行水相洗涤，除去部分糖，水相洗涤之后用75％的丙酮洗脱，75％的丙酮洗脱液为所述缩合单宁纯化物溶液，所述缩合单宁纯化物溶液在-20℃下冻成固体，然后在低于10Pa，温度为-70℃下的冻干机中冻干12h，得到固体粉末为缩合单宁样品。
溶解：所述缩合单宁样品溶于50％乙腈溶液中，配制得到缩合单宁样品溶液，缩合单宁样品溶液浓度为15mg/mL；基质采用0.1％TFA和10％的乙腈溶液配制成饱和基质溶液，其中所述0.1％TFA的用量为所述基质重量的0.067倍，所述基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。
混合：所述缩合单宁样品溶液和所述饱和基质溶液以1：4的体积比充分混合，得到混合溶液；
点样：取2μL混合溶液将其滴加在MALDI的靶板上，室温下挥干溶剂，利用MALDI-TOF MS技术对橡子中的缩合单宁进行分析。
实施例三
提取：取10g橡子树叶，用多功能粉碎机将所述橡子树叶粉碎至100～300目的颗粒，之后经70％的乙醇溶液剂进行提取，提取温度为50℃，回流时间为2小时，提取3次，合并提取液，得到缩合单宁的粗提液，蒸发所述缩合单宁的粗提液中70％的乙醇溶液，得到缩合单宁的水相提取物，将所述缩合单宁的水相提取物冻干处理，得到缩合单宁粗提取物，向所述缩合单宁粗提取物当中加入加入75％的乙醇，得到橡子树叶缩合单宁冻干粉末提取物溶液。
纯化：所述橡子树叶缩合单宁的提取物溶液经60mL柱体积的HP2MG大孔树脂进行纯化，所述纯化处理采用缩合单宁粗提取物与大孔树脂的质量比1:15的比例进行吸附，用2.5 倍柱体积的水进行水相洗涤，除去部分糖，水相洗涤之后用75％的乙醇洗脱，75％的乙醇洗脱液为所述缩合单宁纯化物溶液，所述缩合单宁纯化物溶液在-20℃下冻成固体，然后在低于 10Pa，温度为-70℃下的冻干机中冻干12h，得到固体粉末为缩合单宁样品。
溶解：所述缩合单宁样品溶于50％乙腈溶液中，配制得到缩合单宁样品溶液，缩合单宁样品溶液浓度为10mg/mL；基质采用0.1％TFA和10％的乙腈溶液配制成饱和基质溶液，其中所述0.1％TFA的用量为所述基质重量的0.1倍，所述基质为2，5-二羟基苯甲酸。
混合：所述缩合单宁样品溶液和所述饱和基质溶液以1：3的体积比充分混合，得到混合溶液；
点样：取2μL混合溶液将其滴加在MALDI的靶板上，室温下挥干溶剂，利用MALDI-TOF MS技术对橡子中的缩合单宁进行分析。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，包括以下步骤：
1)提取：将橡子果实粉碎后经第一有机溶剂进行提取，得到缩合单宁的粗提液，蒸发除去所述缩合单宁的粗提液中的所述第一有机溶剂，得到缩合单宁的水相提取物，将所述缩合单宁的水相提取物冻干处理，得到缩合单宁粗提取物，向所述缩合单宁粗提取物当中加入第二有机溶剂，得到缩合单宁粗提取物溶液，所述第一有机溶剂和第二有机溶剂均为乙醇水溶液或丙酮水溶液，且第二有机溶剂浓度高于第一有机溶剂；
2)纯化：所述缩合单宁粗提取物溶液经纯化柱纯化处理后得到缩合单宁纯化物溶液，将所得缩合单宁纯化物溶液冻干处理，得到固体粉末为缩合单宁样品；
3)溶解：将所述缩合单宁样品溶于第三有机溶剂中，配制得到缩合单宁样品溶液，所述第三有机溶剂为50％～75％乙醇、30～75％丙酮溶液或50～70％乙腈溶液；所述缩合单宁样品溶液溶液浓度为5～20mg/mL；基质采用0.1％三氟乙酸和10％的乙腈溶液配制成饱和基质溶液，其中所述0.1％三氟乙酸的用量为所述基质重量的0.05～0.2倍，所述基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸、2，5-二羟基苯甲酸或芥酸之中的一种；
4)混合：所述缩合单宁样品溶液和所述饱和基质溶液以1：2～5的体积比充分混合，得到混合溶液；
5)点样：取1～4μL混合溶液将其滴加在基质辅助激光解吸电离仪器的靶板上，利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪对橡子中的缩合单宁进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，其特征在于，在步骤1)中，将所述橡子果实粉碎至100～300目的颗粒，之后经第一有机溶剂进行提取，得到缩合单宁的粗提液，蒸发除去所述缩合单宁的粗提液中的所述第一有机提取溶剂，得到缩合单宁的水相提取物，将所述缩合单宁的水相提取物冻干处理，得到缩合单宁粗提取物，向所述缩合单宁粗提取物当中加入第二有机溶剂，得到缩合单宁粗提取物溶液，所述第一有机溶剂为70％乙醇溶液或70％丙酮溶液，所述第二有机溶剂为75％乙醇溶液或75％丙酮溶液。
3.根据权利要求2所述的一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，其特征在于，在步骤1)中所述提取过程的提取温度为50～60℃，回流时间为1.5～3小时。
4.根据权利要求1所述的一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，其特征在于，在步骤2)中，所述纯化柱为HP2MG大孔树脂或SephadexLH-20凝胶柱。
5.根据权利要求1所述的一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，其特征在于，在步骤2)中，所述纯化处理采用所述缩合单宁粗提取物与所述大孔树脂的质量比1:12.5～20的比例进行吸附，用2.5倍柱体积的水进行水相洗涤，除去部分糖，水相洗涤之后用75％的乙醇洗脱，75％的乙醇洗脱液为所述缩合单宁纯化物溶液。
6.根据权利要求1所述的一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，其特征在于，所述冻干处理过程为：将溶液在-20℃下冻成固体，然后在低于10Pa，温度为-70℃下的冻干机中冻干12h，得到固体粉末的过程。
7.根据权利要求1所述的一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，其特征在于，在步骤3)中，所述基质为2，5-二羟基苯甲酸。
8.根据权利要求1所述的一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，其特征在于，在步骤3)中，所述第三有机溶剂为50％的乙腈溶液或30％的丙酮溶液。
9.根据权利要求1所述的一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，其特征在于，在步骤3)中，所述缩合单宁样品溶液溶液浓度为10mg/mL。
10.根据权利要求8所述的一种基于基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析橡子中缩合单宁的分析方法，其特征在于，在步骤4)中，所述缩合单宁样品溶液和所述饱和基质溶液以1：3的体积比充分混合，得到混合溶液。
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| CN112798372A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-14 | 上海微谱化工技术服务有限公司 | 一种聚氨酯中聚醚多元醇结构的分析方法及其应用 |
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