CN104569190A - 一种快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法，属于分析化学技术领域。本发明反相高效液相色谱方法，在色谱柱：ZORBAX？Eclipse？Plus？C₁₈(250mm×4.6mm？i.d，5μm)，流动相组成的体积比：乙腈：0.1％磷酸水溶液＝5～23:95～77，流速：1.0mL/min，柱温：25℃，进样量：3～5μL的检测条件下分别建立四种单宁类物质标准曲线和测定乌桕叶提取物中四种单宁类物质的含量。本发明的方法能快速、同时对乌桕叶提取物中的四种单宁类物质的含量进行测定，本发明的方法准确度、重复性、稳定性好，为其它富含单宁类物质的植物开发利用提供了方法论基础。

Description

一种快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体地说是一种快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法。

背景技术

乌桕(Sapium sebiferum)，为大戟科乌桕属落叶乔木，分布范围广泛，在华南、中南、西南部分省市均有分布，其性凉、味苦、具小毒，叶、根、皮入药，能清热解毒、消积、利水通便等功效。现代药理试验表明乌桕具有多种生理活性和药理作用，离体抑菌作用、消炎作用、降压作用、降胆固醇作用、抗单纯疱疹病毒及抗癌作用等。和其它大戟属植物一样，乌桕叶片中含有大量的酚类物质，特别是单宁的含量很高。而单宁类物质具有抗菌消炎、清除自由基、降血压、抗病毒和抗氨基脲敏感性胺氧化酶等功效，因此对该类成分在药材中进行研究开发十分重要。

目前，尚无乌桕药材中单宁类物质定量测定的报道，虽然有测定单宁类物质含量的相关报道，但是已报道测定单宁类物质的方法大多是采用HPLC测定单一单宁成分或采用分光光度计法测定单宁酸的含量，如《HPLC法测定从五倍子提取的单宁酸中焦性没食子酸的含量》文中只是采用HPLC法将焦性没食子酸与其它单宁酸进行分离并且测定焦性没食子酸的含量；又如《Folin-Denis分光光度法测定五倍子中单宁酸的含量》文中只是利用Folin-Denis分光光度法测定五倍子中单宁酸的含量；尚未有同时测定多种单宁成分含量的报道。本研究采用高效液相色谱法，首次对乌桕中没食子酸、儿茶素、单宁酸和鞣花酸4种单宁含量进行同时测定，为乌桕叶资源的开发利用提供一种高效、快速的质量检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用反相高效液相色谱法快速测定乌桕叶片中没食子酸、儿茶素、单宁酸和鞣花酸4种单宁类物质的方法，以克服目前缺少乌桕药材的定量方法的问题。本发明提供的技术方案为：

一种快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分别配制四种单宁类物质的标样溶液及供试品溶液；

(2)紫外检测器在190～400nm进行扫描，得到最佳吸收波长；

(3)采用反相高效液相色谱方法，高效液相色谱条件为：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm i.d，5μm)，

流动相组成的体积比：乙腈：0.1％磷酸水溶液＝5～23:95～77，

流速：1.0mL/min，

柱温：25℃，

进样量：3～5μL；

(4)建立标准曲线，求出乌桕叶提取物中没食子酸、儿茶素、单宁酸、鞣花酸含量。

作为优选，所述流动相用以梯度进行洗脱。

作为优选，所述最佳吸收波长为270nm。

作为优选，所述四种单宁类物质标样溶液的配制方法为：精确称取20mg的没食子酸标准品，用乙腈溶解并定容至10mL，配置成2mg·mL^-1的没食子酸标准液；精确称取20mg鞣花酸，用二甲基亚砜溶解并定容至10mL，配制成2mg·mL^-1的鞣花酸标准液；分别精确称取10mg的单宁及儿茶素，用乙腈溶解并定容至10mL，配制成1mg·mL^-1的单宁酸、儿茶素标准液。

作为优选，所述供试品溶液的配制方法为：将乌桕叶片烘干、粉碎、过筛，准确称取100mg乌桕粉末，用10mL含甲醇和0.1％磷酸水溶液的流动相萃取24小时,然后再用超声波常温提取1小时，2500rpm离心30min，取500μL上清液，用0.45μm有机滤膜过滤即得。

作为优选，所述含甲醇和0.1％磷酸水溶液的流动相中体积比为：甲醇：0.1％磷酸水溶液＝1：1。

作为优选，所述0.1％磷酸水溶液的PH＝2.15。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

①本研究提供了一种能在30min内同时、快速、准确分析乌桕叶提取物中没食子酸、儿茶素、单宁酸、鞣花酸含量的方法，能缩短植物组织中这四种单宁类物质的检测时间，为其它富含单宁类物质的植物开发利用提供了方法论基础。

②本发明选用甲醇:0.1％磷酸(1:1v·v^-1)混合溶液对乌桕叶片中的单宁类物质进行提取，配合使用常温提取结合超声波提取的方法，能高效地将乌桕叶片中各单宁类物质提取出来。

附图说明

图1为乌桕HPLC图谱：

A-四种单宁类物质混合标样的HPLC图谱；B-供试品的HPLC图谱；

主要附图标记说明：

1-没食子酸；2-儿茶素；3-单宁酸；4-鞣花酸。

具体实施方式

参考下列实施例将更容易理解本发明，给出的实施例不是限制本发明的范围。

实施例所用仪器和材料：

Grant超声波提取仪；DIONEX公司Ultimate3000高效液相色谱仪；所用色谱柱为Agilent公司生产的ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；EYELA旋转蒸发仪；岛津UV-1700紫外分光光度计；

单宁酸标准品购自中国林科院林产化工研究所，鞣花酸(批号476-66-4)购自上海生工生物工程技术服务有限公司，没食子酸(批号110831-201204)和儿茶素(批号110877-201203)购自中国药品生物制品检定所；提取用甲醇和磷酸均为分析纯，所用水为纯净水(产自杭州娃哈哈集团有限公司)，乙腈为色谱纯；乌桕叶片分别采自湖南、湖北、广东、广西和浙江等省份。

实施例1：色谱条件和系统适用性试验

采用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，在洗脱流速为1mL·min^-1、柱温25℃、检测波长270nm下，以含乙腈(A相)和0.1％磷酸水溶液(B相；PH＝2.15)为流动相进行梯度洗脱(见表1)。将上述标准液在紫外分光光度计上于190～400nm波段进行扫描，综合考虑四种物质的紫外吸收特性，经过比较研究，检测波长为270nm，柱温为25℃，流速为1mL·min^-1,进样体积为10μL。在此色谱条件下，四种单宁类物质能很好地实现基线分离，形成单一、稳定的色谱峰(图1A)。没食子酸的出峰时间为5.9min；儿茶素的出峰时间为12.7min；单宁酸的出峰时间为20.3min；最后出峰的是鞣花酸，其出峰时间为21.1min。

表1 本研究中的梯度洗脱程序

注：表中(％)为流动相A与流动相B的体积比。

乌桕叶提取液样品在相同色谱条件下进行检测，没食子酸、儿茶素、单宁酸和鞣花酸也能形成4个稳定、独立的峰，且能很好地与其他杂质峰分离开来，重复性好(图1B)，说明这种色谱条件适合用于乌桕叶片中四种单宁类物质的测定。

实施例2：四种单宁类物质线性关系考察

分别取10μL没食子酸、50μL儿茶素、5μL鞣花酸、40μL单宁酸配制成混合母液，将母液分别稀释1倍、5倍、10倍、20倍、50倍及100倍，混匀，在最优色谱条件下进样，进样体积为10μL，重复3次，取平均值。

以标准品浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到各标准品的标准曲线如下：没食子酸标准曲线为：Y＝67.896X+0.9086，R²＝0.9942，且在0.002～0.095mg·mL^-1之间有良好的线性关系；儿茶素标准曲线为：Y＝61.241X+0.0355，R²＝0.9995，且在0.005～0.238mg·mL^-1之间有良好的线性关系；单宁酸标准曲线为：Y＝70.455X+0.7444，R²＝0.9984，线性范围为0.004～0.191mg·mL^-1；鞣花酸标准曲线为：Y＝30.853X+2.2143，R²＝0.9988，线性范围为0.002～0.095mg·mL^-1。

实施例3：标样和供试品溶液的制备

精确称取20mg的没食子酸标准品，用乙腈溶解并定容至10mL，配置成2mg·mL^-1的没食子酸标准液。精确称取20mg鞣花酸，用二甲基亚砜溶解并定容至10mL，配制成2mg·mL^-1的鞣花酸标准液。分别精确称取10mg的单宁及儿茶素，用乙腈溶解并定容至10mL，配制成1mg·mL^-1的单宁酸、儿茶素标准液。

将乌桕叶片置于80℃烘箱中烘干，粉碎，过850μm筛后备用。准确称取100mg乌桕粉末，用10mL甲醇:0.1％磷酸(1:1v·v^-1)萃取24小时,然后再用超声波常温提取1小时，2500rpm离心30min，取500μL上清液，用0.45μm有机滤膜过滤即得。

实施例4：加样回收率试验

用天平称取乌桕叶片样品9份，各50mg，加入没食子酸(10mg·L^-1)、儿茶素(200mg·L^-1)、单宁酸(2g·L^-1)和鞣花酸(200mg·L^-1)溶液各0.25、0.5、0.75mL，加10mL甲醇，萃取24小时,然后再用超声波常温提取1小时，每个处理各重复3次，在上述条件下进样分析，测量4种组分含量，并根据加入量计算加收率，见表2。

表2 供试品中4种单宁的加样回收率试验(n＝9)

实施例5：样品含量测定

分别各取3份10μL采自湖南、湖北、广东、广西和浙江的乌桕叶片经处理所得供试品溶液样品，按照最优色谱条件进行测定，测得的峰面积经标准曲线换算得出样品中各单宁组分的浓度，结果见表3。

表3 样品含量测定结果(n＝3)

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (6)

1.一种快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别配制四种单宁类物质的标样溶液及供试品溶液；

(2)紫外检测器在190～400nm进行扫描，得到最佳吸收波长；

(3)采用反相高效液相色谱方法，高效液相色谱条件为：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm i.d，5μm)，

流动相组成的体积比：乙腈：0.1％磷酸水溶液＝5～23:95～77，

流速：1.0mL/min，

柱温：25℃，

进样量：3～5μL；

(4)建立标准曲线，求出乌桕叶提取物中没食子酸、儿茶素、单宁酸、鞣花酸含量。

2.根据权利要求1所述的快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法，其特征在于，所述流动相按照梯度进行洗脱。

3.根据权利要求1所述的快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法，其特征在于，所述最佳吸收波长为270nm。

4.根据权利要求1所述的快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法，其特征在于，所述四种单宁类物质标样溶液的配制方法为：精确称取20mg的没食子酸标准品，用乙腈溶解并定容至10mL，配置成2mg·mL^-1的没食子酸标准液；精确称取20mg鞣花酸，用二甲基亚砜溶解并定容至10mL，配制成2mg·mL^-1的鞣花酸标准液；分别精确称取10mg的单宁及儿茶素，用乙腈溶解并定容至10mL，配制成1mg·mL^-1的单宁酸、儿茶素标准液；

所述供试品溶液的配制方法为：将乌桕叶片烘干、粉碎、过筛，准确称取100mg乌桕粉末，用10mL含甲醇和0.1％磷酸水溶液的流动相萃取24小时,然后再用超声波常温提取1小时，2500rpm离心30min，取500μL上清液，用0.45μm有机滤膜过滤即得。

5.根据权利要求4所述的快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法，其特征在于，所述含甲醇和0.1％磷酸水溶液的流动相中体积比为：甲醇：0.1％磷酸水溶液＝1：1。

6.根据权利要求4所述的快速测定乌桕叶片中四种单宁类物质的方法，其特征在于，所述0.1％磷酸水溶液的PH＝2.15。