CN107991400A - 一种血栓通注射剂中鞣质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血栓通注射剂中鞣质的检测方法，采用高效液相法测定血栓通注射剂中的鞣质的含量，其色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱采用CAPCELLPAK C18，5μm，4.6×250mm；流动相为乙腈（A）‑0.1%磷酸溶液（B），进行梯度洗脱；流速0.85～1.0ml/min；柱温23～28℃；测定波长278～282nm；进样量10～20μl。该法具有操作简单、快速、准确度高、精密度高、稳定性好的优点，适合实验室对于血栓通注射剂的专门性检测工作，可批量进行检测，提高检测效率。

Description

一种血栓通注射剂中鞣质的检测方法

技术领域

本发明涉及药品检测领域，具体是一种血栓通注射剂中鞣质的检测方法。

背景技术

血栓通注射液和注射用血栓通统称为血栓通注射剂，其主要成分是三七总皂苷和氯化钠。血栓通注射液（别名：田七人参注射液），是一种注射剂处方药，为淡黄色至黄色的澄明液体，适用于视网膜中央静脉阻塞、眼前房出血、青光眼、脑血管病后遗症的治疗，也可用于治疗病毒性肝炎，还具备活血祛瘀，扩张血管，改善血循环的作用，但偶有过敏反应。注射用血栓通为类白色或淡黄色无定形粉末或疏松固体状物，昧微苦、微甘，有引湿性。适应症为活血祛瘀，通脉活络。用于瘀血阻络，中风偏瘫，胸痹心痛及视网膜中央静脉阻塞症。

鞣质（tannins），又称单宁、鞣酸、 丹宁酸、单宁、 没食子鞣酸、单宁酸、 落叶松栲胶、二倍酸，是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物。鞣质为黄色或棕黄色无定形松散粉末；在空气中颜色逐渐变深；有强吸湿性；不溶于乙醚、苯、氯仿，易溶于水、乙醇、丙酮；水溶液味涩；在210～215℃分解。鞣质广泛存在于植物界，存在于多种树木的树皮和果实中，含量达50%～70%，大约有70%的中草药中含有鞣质，三七药材也不例外。鞣质虽然具有一定的药理作用，但由于其能够与蛋白质结合生成不溶于水的沉淀，所以在中药注射液制剂必须设法除去，如果除不干净将会影响血栓通注射液、注射用血栓通的用药安全。传统方法中一般采用分光光度法或者薄层层析法测定其含量，所以，建立快速准确、灵敏度高、重现性好的高效液相色谱法来检测鞣质含量是非常有必要的。

目前公开文献中也有关鞣质检测的相关技术，但血栓通注射剂中鞣质的含量测定方法还未见有报道。下面是检索到相关的专利文献：

1、中国专利：一种快速测定丹参提取液中鞣质含量的方法；申请号：201010125531.5；申请日： 2010.03.16；申请人：浙江大学；摘要：本发明提供一种快速测定丹参提取液中鞣质含量的方法，首先收集不同煎煮时间、不同提取工序的丹参提取液作为校正集样本，采用磷钼钨酸/干酪素法进行鞣质含量的测定，并将测量结果作为参照值，同时采用紫外分光光度计测得这些校正集样本稀释液在200～480nm范围的光谱数据，应用化学计量学技术，建立丹参提取液紫外光谱与其鞣质含量的定量校正模型，将未知鞣质含量的丹参提取液样本，按同样的方法测定其紫外光谱数据，利用已建立的定量校正模型便可快速计算出鞣质的含量值。本发明方法仪器简单、操作简便、测量速度快、节省了大量的人力和物力，可用于丹参注射液生产过程中鞣质含量的快速检测，并可在中药注射剂生产中推广应用。

2、中国专利：一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法；申请号：200710176035.0；申请日： 2007.10.18；申请人：北京本草天源药物研究院；摘要：本发明公开了一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法,其特征在于采用高效液相色谱法,以磷酸溶液和乙腈为流动相,以没食子酸为对照品,进行制剂鞣质的检测分析;其中磷酸溶液是磷酸与水体积比为1∶10000-4∶10000的溶液;通过实验确证,本申请检测分析方法比现有技术中鞣质的检测分析方法灵敏度要高。

3、中国专利：注射用丹参多酚酸中鞣质类物质的检测方法；申请号：201210132467.2；申请日： 2012.04.28；申请人：天津天士力之骄药业有限公司；摘要：本发明提供一种丹参多酚酸中鞣质类物质的检测方法，所述检测方法步骤如下：步骤1，对照品溶液的制备；步骤2，取丹参多酚酸溶解，得水解前未水解样品溶液；步骤3，取丹参多酚酸溶解，然后水解，得水解样品溶液；步骤4，测定未水解样品溶液、水解样品溶液及对照品中的没食子酸；儿茶素；鞣花酸；步骤5，比较色谱图判断丹参多酚酸中是否存在鞣质类成分。

4、中国专利：一种裸花紫珠中鞣质的含量测定方法；申请号200910006086.8；申请日： 2009.01.22；申请人：九芝堂股份有限公司；摘要：本发明涉及一种裸花紫珠中鞣质的含量测定方法。本发明采用分光光度法对裸花紫珠中鞣质的含量进行测定,进一步提高了裸花紫珠药材及制剂的可控性,确保了裸花紫珠提取物的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种血栓通注射剂中鞣质的检测方法，该法具有操作简单、快速、准确度高、精密度高、稳定性好的优点。

本发明通过以下技术方案实现：

一种血栓通注射剂中鞣质的检测方法，包括以下步骤：

（a）对照品溶液的制备：取鞣质对照品、儿茶素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含鞣质50μg和儿茶素100μg的混合溶液；

（b）样品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为样品溶液或注射用血栓通配成37mg/ml的溶液作为样品；

（c）高效液相色谱法检测：分别精密吸取对照品溶液与样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定，得到色谱图；

（d）计算得出鞣质的含量：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；由色谱图计算出峰面积，将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中鞣质的含量。

在选择对照品时曾进行HPLC试验，发现鞣质对照品与没食子酸对照品在色谱图中保留时间一致，说明两者均含有结构相同的母核或为相同成分（在HPLC上有相同的色谱行为），故选择鞣质对照品做对照，另选择缩合鞣质的前提物质儿茶素作为对照。

所述色谱条件为：

色谱柱：CAPCELLPAK C18，5μm ，4.6×250mm；

流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B；

柱温：23～28℃；

流速：0.85～1ml/min

测定波长：278～282nm；

进样量：10～20μl

按下列程序进行梯度洗脱：

本发明采用的检测条件和方法是在查阅大量文献的基础上，经过多次实验探索研究之后筛选出来的，能够达到精确度高、稳定性好的目的。以下为本发明的稳定性和精密度验证试验：

（1）对照品混合溶液的稳定性试验

取对照品混合溶液按上述色谱条件，每隔一定时间测定一次，共考察17小时，测定了8次，其中鞣质和儿茶素的平均峰面积分别为282.737 、336.143，RSD分别为1.00％、0.87（n＝8），详见表1。试验结果表明，对照品混合溶液至少在17小时内稳定。

表1 稳定性试验结果

（2）精密度试验

取对照品混合溶液按上述色谱条件，连续测定5次。结果表明5次测定中，鞣质和儿茶素平均峰面积分别为280.243、336.367，RSD分别为0.42%、0.20%（n＝5），详见表2。试验表明本发明所述方法的精密度良好。

表2 精密度试验结果

本发明的有益效果：

1、本发明所述血栓通注射剂中鞣质的检测方法，经过对照品混合溶液的稳定性试验和精密度试验等考察研究之后，证实具有操作简单、快速、准确度高、精密度高、稳定性好、重现性好等优点。

2、本发明所述血栓通注射剂中鞣质的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，适合检测机构等实验室中对于血栓通注射剂的专门性检测工作，特别是可大批量检测，大大提高检测效率。此外，本发明所述方法可以为企业标准或者行业标准的建立提供重要的参考依据。

附图说明

图1是鞣质、儿茶素对照品混合溶液的HPLC图。

图2是血栓通注射液的HPLC图。

图3是注射用血栓通（冻干）的HPLC图。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例和附图，对本发明做进一步说明。

实施例1

（1）仪器和试剂

高效液相色谱仪: Agjlent 1100 ；鞣质对照品购自BioSmart Lot:468-80B，儿茶素对照品购自中国药品生物制品鉴定所，含测用，批号：877-200001；其高效液相色谱图如图1所示；乙腈为色谱纯；血栓通注射液生产企业为广西梧州制药（集团）股份有限公司，生产批号：090801。

（2）方法与结果

（a）对照品溶液的制备：取鞣质对照品、儿茶素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含鞣质50μg和儿茶素100μg的混合溶液；

（b）样品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为样品溶液或注射用血栓通配成37mg/ml的溶液作为样品；

（c）高效液相色谱法检测：分别精密吸取对照品溶液与样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定，得到色谱图；

（d）计算得出鞣质的含量：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；由色谱图计算出峰面积，将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中鞣质的含量。

在选择对照品时曾进行HPLC试验，发现鞣质对照品与没食子酸对照品在色谱图中保留时间一致，说明两者均含有结构相同的母核或为相同成分（在HPLC上有相同的色谱行为），故选择鞣质对照品做对照，另选择缩合鞣质的前提物质儿茶素作为对照。

所述色谱条件为：

色谱柱：CAPCELLPAK C18，5μm ，4.6×250mm；

流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B；

柱温：25℃；

流速：0.85～1.0ml/min

测定波长：280nm；

进样量： 20μl；

按下列程序进行梯度洗脱：

实施例2

（1）仪器和试剂

高效液相色谱仪: Agjlent 1100 ；鞣质对照品购自BioSmart Lot:468-80B，儿茶素对照品购自中国药品生物制品鉴定所，含测用，批号：877-200001；其高效液相色谱图如图1所示；乙腈为色谱纯；注射用血栓通（冻干）生产企业为广西梧州制药（集团）股份有限公司，生产批号：10040114。

（2）方法与结果

（a）对照品溶液的制备：取鞣质对照品、儿茶素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含鞣质50μg和儿茶素100μg的混合溶液；

（b）样品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为样品溶液或注射用血栓通配成37mg/ml的溶液作为样品；

（c）高效液相色谱法检测：分别精密吸取对照品溶液与样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定，得到色谱图；

（d）计算得出鞣质的含量：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；由色谱图计算出峰面积，将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中鞣质的含量。

在选择对照品时曾进行HPLC试验，发现鞣质对照品与没食子酸对照品在色谱图中保留时间一致，说明两者均含有结构相同的母核或为相同成分（在HPLC上有相同的色谱行为），故选择鞣质对照品做对照，另选择缩合鞣质的前提物质儿茶素作为对照。

所述色谱条件为：

色谱柱：CAPCELLPAK C18，5μm ，4.6×250mm；

流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B；

柱温：26℃；

流速：0.85～1.0ml/min

测定波长： 282nm；

进样量： 20μl；

按下列程序进行梯度洗脱：

分别取血栓通注射液34批，注射用血栓通（冻干）29批，按上述实施例1和实施例2色谱条件进行测定，结果样品中鞣质和儿茶素的含量均很低，未检出或刚达到检出限水平，且未达到定量限（信号噪音比10），表明生产工艺已对鞣质等物质进行控制并能有效去除。图2、图3为检测结果的高效液相色谱图。

Claims (2)

1.一种血栓通注射剂中鞣质的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（a）对照品溶液的制备：取鞣质对照品、儿茶素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含鞣质50μg和儿茶素100μg的混合溶液；

（b）样品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为样品溶液或注射用血栓通配成37mg/ml的溶液作为样品；

（c）高效液相色谱法检测：分别精密吸取对照品溶液与样品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定，得到色谱图；

（d）计算得出鞣质的含量：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；由色谱图计算出峰面积，将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中鞣质的含量。

2.根据权利要求1所述血栓通注射剂中鞣质的检测方法，其特征在于：其色谱条件为：

色谱柱：CAPCELLPAK C18，5μm ，4.6×250mm；

流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B；

柱温：23～28℃；

流速：0.85～1ml/min

测定波长：278～282nm；

进样量：10～20μl；

按下列程序进行梯度洗脱：

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