WO2011017792A1

WO2011017792A1 - Método extrativo-analítico para determinação de taninos em insumos e produtos vegetais

Info

Publication number: WO2011017792A1
Application number: PCT/BR2010/000270
Authority: WO
Inventors: Rachel Oliveira Castilho; André Márcio de NASCIMENTO; Cristina Duarte Vianna Soares; Priscila Tavares Guedes
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais - Ufmg
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2010-08-13
Publication date: 2011-02-17
Also published as: BRPI0904246A2

Abstract

A presente invenção diz respeito a um método extrativo-analítico para determinação de taninos em insumos e/ou produtos vegetais. Em seu aspecto mais geral, se refere a determinação analítica de taninos a partir de uma etapa de pré-purificação direcionada para a análise de monõmeros, independente da quantidade de fenóis totais. A invenção proporciona melhoramento do perfil cromatográfico, possibilitando a separação e a quantificação de taninos em insumos e produtos vegetais em escala analítica e preparativa. O método pode ser utilizado no controle de qualidade em indústrias de alimentos indústrias farmacêuticas de fitoterápicos que contenham espécies vegetais ricas em fenólicos.

Description

«7 Λ»

r U I / D K ι υ / υ U U 2 7 0

MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS

EM INSUMOS E PRODUTOS VEGETAIS

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a um método extrativo-analítico para determinação de taninos em insumos e produtos vegetais. Em seu aspecto mais geral, se refere a determinação analítica de taninos a partir de uma etapa de pré-purificação direcionada para a análise de monômeros, independente da quantidade de fenóis totais. A invenção proporciona melhoramento do perfil cromatográfico, possibilitando a separação e a quantificação de taninos em

insumos e produtos vegetais em escala analítica e preparativa. O método pode ser utilizado no controle de qualidade em indústrias de alimentos indústrias farmacêuticas de fitoterápicos que contenham espécies vegetais ricas em

fenólicos.

Antecedentes da Invenção

Métodos analíticos para determinação de taninos condensados

Diversos métodos analíticos podem ser usados para a determinação de taninos condensados. A quantificação é um processo delicado tendo em vista que a extração é difícil de ser alcançada e nem todos os métodos baseados nas características fenólicas destes compostos são específicos (BRUNETON,

J. Tannins. In: BRUNETON, J. Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal

Plants. 2. Ed. Paris: Lavoisier Publishing Inc., 1999. Cap. Tannins., 369-403).

Essas dificuldades são devido à diversidade estrutural e às propriedades físico- química encontradas nesta classe de substâncias. Vários métodos analíticos têm sido usados para quantificar os taninos em drogas vegetais (SCHOFIELD,

P.; MBUGUA, D. M.; PELL, A. N. Analysis of condensed tannins: a review.

Animal Feed Science and Technology, v.91 , p.21-40, 2001.):

a) Métodos que incluem despolimerização oxidativa, como o doseamento com butanol-ácido o qual promove uma reação colorimétrica em que, o tanino condensado se fragmenta formando uma antocianidina de cor vermelha que pode ser determinada por espectrofotometria na região do visível; b) Métodos com reações do anel A com um aldeído aromático, como o doseamento com vanilina que forma um complexo colorido com os taninos condensados, os quais também podem ser quantificados por espectrofotometria na região do visível. Um método por injeção de fluxo, utilizando-se vanilina como reagente, foi proposto para determinação de taninos condensados (FERREIRA, E. C; NOGUEIRA, A. R. A. Vanillin- condensed tannin study using flow injection spectrophotometry. Talanta, v.51 , p. 1-6, 2000);

c) Métodos colorimétricos para fenólicos totais, tais como os doseamentos com azul da Prússia, com reagente de Folin-Denis ou com reagente de Folin- Ciocalteu. Estes métodos são baseados em reações de oxi-redução com formação de complexo colorido com máximo de absorção na região do visível. Infante e colaboradores propuseram um sistema de injeção de fluxo para determinação de taninos totais baseado na reação com o reagente de Folin- Denis (INFANTE, C. M. C; SOARES, V. R. B.; KORN, M.; ROCHA, F. R. P. An improved flow-based procedure for microdetermination of total tannins in beverages with minimized reagent consumption. Microchimica Acta, v.161 , p.279-283, 2008);

d) Métodos que envolvem reações de clivagem ácida, incluindo tiólise e degradação por floroglicinol. Nestas reações, a unidade final da cadeia polimérica dos taninos condensados é liberada permitindo-se determinar a composição e o tamanho do polímero de tanino condensado;

e) Métodos gravimétricos utilizando-se sal de itérbio (Yb⁺³) ou polivinilpirrolidona (PVP) como reagentes;

f) Métodos baseados na inibição da atividade enzimática de diversas enzimas;

g) Métodos que envolvem precipitação com proteínas, tais como a albumina bovina sérica, ou com polietilenoglicol 4000 (PEG 4000), substâncias que formam complexos insolúveis com os taninos condensados;

h) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tanto de fase normal quanto de fase reversa; i) Métodos por inibição do crescimento microbiano, em que se avalia o impacto da presença dos taninos no crescimento microbiano ou a formação de ligação entre os taninos com as bactérias de forma similar aos doseamentos por precipitação com proteína, citados previamente.

Na Farmacopéia Brasileira 2^a Edição - F. BRAS. II (FARMACOPEIA brasileira. 2. Ed. São Paulo: Companhia Editora Nacional, 1959) a monografia para o barbatimão especifica um teor de no mínimo 20% de taninos totais. Este valor foi modificado pela publicação mais recente de monografia para a mesma droga vegetal na Farmacopéia Brasileira 4^a Edição - F. BRAS. IV (FARMACOPÉIA brasileira, 4. Ed. São Paulo: Atheneu, 2002, pt. 2, 3^o fascículo) em que preconiza-se um teor bem menor de taninos totais, de no mínimo 8%, que deve ser determinado pelo método colorimétrico Folin-Denis.

Os taninos condensados podem ser quantificados por CLAE. Ambas as colunas de fase normal e fase reversa têm sido aplicadas (CHEYNIER, V.; SOUQUET, J. M.; LE ROUX, E.; GUYOT, S.; RIGAUD, J. Size separation of condensed tannins by normal-phase high performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. v. 299, p. 178-184, 1999; LAZARUS, S.A; ADAMSON, G.E.; HAMMERSTONE, J.F.; SCHMITZ, H.H. High-performance liquid chromatography/mass spectrometry analysis of proanthocyanidins in foods and Beverages. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 47, p.3693-3701 , 1999; WATERHOUSE, A. L; PRICE, S. F.; MACCORD, J. D. Reversed-phase high-performance liquid chromatography methods for analysis of wine polyphenols. Methods in Enzymology. v. 299, p. 113-121 , 1999). CLAE de fase reversa foi usada para separação de taninos condensados de baixo peso molecular, mas a ordem de eluição não está relacionada ao grau de polimerização (CHEYNIER et al., 1999). A separação de grandes polímeros (> tetrâmeros) com este método não é possível. A presença de muitos isômeros com polaridade similar resulta em sobreposição de tempos de retenção (LAZARUS et al., 1999; WATERHOUSE et al., 1999). CLAE de fase normal foi usada para separar oligômeros de taninos condensados e polímeros (LAZARUS et ai, 1999) de vários produtos vegetais alimentícios. O tempo de eluição aumenta com o aumento no grau de polimerização.

Vários modos de detecção têm sido aplicados conjuntamente com CLAE para determinação de taninos condensados. A detecção por ultravioleta é a mais comumente utilizada (WATERMAN, P. G.; MOLE, S. Analysis of phenolic plant metabolites. Oxford: Blackwell Scientific, 1994). Entretanto, este modo não é específico para os taninos condensados na presença de outros polifenóis (LAZARUS ef ai, 1999). Métodos alternativos incluem detecção eletroquímica ou fluorescência (WATERMAN & MOLE, 1994; LAZARUS et ai, 1999). As informações estruturais para identificação de oligômeros de taninos condensados podem ser obtidas por meio da utilização de espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear ou hidrólise química (HAMMERSTONE, J. F.; LAZARUS, S. A. MITCHELL, A. E.; RUCKER, R. SCHMITZ, H. H. Identification of procyanidins in cocoa (Theobroma cacaó) and chocolate using high-performance liquid chromatography/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 47, p. 490-496, 1999).

O uso de CLAE acoplada a vários tipos ou modos de detecção continuará, indubitavelmente, a aumentar e será o mais importante método de elucidação da complexidade da composição de taninos condensados e também de taninos hidrolisáveis (SCHOFIELD et ai, 2001).

Métodos analíticos para determinação de taninos hidrolisáveis

A mistura de taninos hidrolisáveis (galotaninos e elagitaninos) pode ser analisada por métodos gerais para doseamentos de tanino, tais como por precipitação com metais ou proteínas, por métodos colorimétricos para doseamento de fenólicos totais e pelo ensaio do iodato de potássio.

Um sistema de injeção de fluxo foi proposto para determinação de taninos hidrolisáveis pela reação com o iodato de potássio (BOSSU, C. M.; FERREIRA, E. C; CHAVES, F. S.; MENEZES, E. A.; NOGUEIRA, A. R. A. Flow injection system for hydrolysable tannin determination. Microchemical Journal, v.84, p.88-92, 2006). ,

Alguns taninos hidrolisáveis podem também ser quantificados por métodos colorimétricos mais específicos. Os galotaninos podem ser quantificados após sua hidrólise em meio ácido e complexação do ácido gálico liberado com o corante rodanina, gerando um produto colorido (INOUE, K. H.; HAGERMAN, A. E. Determination of gallotannins with rodanine. Analytical Biochemistry, v. 169, p. 363-369, 1988). Os elagitaninos também são hidrolisados e o ácido elágico liberado forma um complexo colorido com nitrito de sódio (WILSON, T. C; HAGERMAN, A. E. Quantitative determination of ellagic acid. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 38, p. 1678-1683, 1990). Embora os métodos colorimétricos sejam largamente utilizados, eles geralmente não fornecem dados quantitativos explícitos, e sim, dados totais com objetivo de comparação (MUELLER-HARVEY, I. Analysis of hidrolysable tannins. Animal Feed Science and Technology, v. 91 , p. 3-20, 2001).

Taninos hidrolisáveis são analisados e quantificados por CLAE usando colunas de fase normal e de fase reversa (MUELLER-HARVEY, 2001). Galotaninos podem ser analisados em coluna de fase reversa C18 utilizando gradiente de acetonitrila e solução aquosa de ácido fórmico a 5% (OSSIPOV, V.; LAPONEN, J.; OSSIPOVA, S.; HAUKIOJA, E.; PIHLAJA, K. Gallotannins of birch Betula pubescens leaves: HPLC separation and quantification. Biochemistry Systematic and Ecology, v. 25, p. 493-504, 1997). Hagerman propõe o uso de coluna em fase normal, com sistema isocrático de hexano:MeOH:THF:ácido trifluoracético, para separação e análise de ácido tânico (mistura de galotaninos) (HAGERMAN, A. E. Tannin Chemistry. 2002. Disponível em http://www.users.muohio.edu/hagermae/. Acesso em: 09 jul 2009). Para análise de elagitaninos pode-se empregar sistema isocrático em fase normal com hexano:MeOH:THF:ácido fórmico (47:42:10:1 ; V/V) e, em fase reversa, acetonitrila e tampão fosfato (H₃PO /KH₂PO₄ 0,05 M) (15:42,5:42,5; V/V) (LEE, M. H.; CHIOU, J. F.; YEN, K. Y.; YANG, L. L. EBV DNA polymerase inhibition of tannins from Eugenia uniflora. Câncer Letters, v. 154, p. 131-136, 2000). Problemas do estado da técnica:

Os métodos químicos e colorimétricos atuais (que utilizam ácido-butanol, vanilina, azul da Prússia, Folin-Ciocalteau, Folin-Denis, iodato de potássio, rodanina, nitrito de sódio) são inespecíficos, pois analisam fenóis totais e não somente taninos. Tais métodos ainda apresentam múltiplos interferentes como: tempo de reação e ordem de adição de reagente, temperatura, luz, pH, concentração de taninos e precipitação.

Os métodos químicos por tiólise e por utilização do floroglucinol são bons para determinação estrutural, possuem baixo rendimento e necessitam de taninos puros para análise, além de não serem indicados para quantificação.

Métodos gravimétricos (por precipitação por itérbio) são inespecíficos, necessitando de calcinação em mufla. Além disso, apresentam baixos rendimentos e podem ser variáveis em relação à razão do complexo Yb:tanino.

Os métodos enzimáticos (inibição enzimática) possuem variação devido à diferente suscetibilidade das enzimas utilizadas, além de serem inespecíficos.

Métodos de precipitação por proteína refletem a atividade biológica, mas também são inespecíficos e os resultados dependem de muitas variáveis inerentes à proteína.

O método de toxicidade (inibição de crescimento microbiológico) também é inespecífico e seus resultados são afetados pelo tipo de microrganismo e a composição do meio de cultura.

Vantagens da invenção

A presente invenção permite a análise de taninos utilizando marcadores característicos (monômeros) e não fenóis totais, como apresentado no estado da técnica.

Mais particularmente, o método de purificação de insumos e produtos vegetais contendo taninos para a análise cromatográfica (CLAE) possibilitou a separação, identificação e a quantificação de marcadores químicos específicos de taninos em um tempo de corrida adequado para análises de rotina. O método desenvolvido foi validado e apresentou-se específico, linear, preciso, exato e robusto para análises de insumos e produtos vegetais contendo taninos.

Em outro aspecto, o método da presente invenção viabiliza a utilização de pequenas quantidades de amostras, na ordem de grandeza de miligramas, o que permite a determinação para o controle de qualidade de insumos e produtos vegetais contendo taninos, tanto em escala analítica quanto em preparativa, ou até o isolamento em escala preparativa.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 - Cromatograma inicial obtido por eluição em gradiente exploratório amplo: 5% a 95% acetonitrila (ACN), 60 min., para extrato etanólico seco de S. adstringens 10 mg/mL, em metanol 10% V/V; volume de injeção 10 μΙ_; fase móvel ACN:água (5:95) ambos acidificados com ácido fosfórico 0,1% (V/V); fluxo 1 mIJmin; 40 °C; detecção λ 210 nm.

Figura 2 - Cromatograma inicial obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min., para extrato etanólico seco de S. adstringens 10 mg/mL, em metanol 10% VA/; volume de injeção 10 μΙ_; fase móvel ACN:água (5:95) ambos acidificados com ácido fosfórico 0,1% (VA ); fluxo 1 mL/min; 40 °C; detecção λ 210 nm.

Figura 3 - Cromatograma obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min., para a fração orgânica de S. adstringens 1 mg/mL, em metanol 10% VA/; volume de injeção 2,5 μί; fase móvel ACN:água (5:95) ambos acidificados com ácido fosfórico 0,1% (VA/); fluxo 1 mL/min; 40 °C; detecção λ 210 nm. Quantidade de partida 250 mg de extrato etanólico seco de S. adstringens.

Figura 4 - Cromatograma obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min., para a fração aquosa de S. adstringens 1 mg/mL, em metanol 10% VA/; volume de injeção 2,5 μί; fase móvel ACN:água (5:95) ambos acidificados com ácido fosfórico 0,1% (VA/); fluxo 1 mlJmin; 40 °C; detecção λ 210 nm. Quantidade de partida 250 mg de extrato etanólico seco de S. adstringens.

Figura 5 - Cromatograma obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min., para o extrato etanólico seco de S. adstringens 1 mg/mL, em metanol 10% V/V; fortificado com os padrões: ácido gálico, galocatequina, epigalocatequina, catequina, proantocianidina B2 e gaiato de epigalocatequina; volume de injeção 5 μΙ_; fase móvel ACN.água (5:95) ambos acidificados com ácido fosfórico 0,1% (V/V); fluxo 1 mIJmin; 40 °C; detecção λ 210 nm. Quantidade de partida 250 mg de extrato etanólico seco de S. adstringens.

Figura 6 - Sobreposição dos cromatogramas do extrato etanólico seco de S. adstringens 1 mg/mL, em metanol 10% V/V; volume de injeção 5 μΙ_; sem adição de padrões (linha cheia) e após adição dos padrões (linha tracejada): (1) ácido gálico, (2) galocatequina, (3) epigalocatequina, (4) catequina, (5) proantocianidina B2 e (6) gaiato de epigalocatequina.

Figura 7 - Cromatograma dos padrões reunidos em solução 0,1 mg/mL cada, em metanol; volume de injeção 2 μί.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção tem como conceito inventivo um método extrativo- analítico para determinação de taninos em insumos e produtos vegetais. Em seu aspecto mais geral, se refere à determinação analítica de taninos a partir de uma etapa de pré-purificação direcionada para a análise de monômeros, independente da quantidade de fenóis totais. É também revelada a etapa de pré-purificação da amostra por partição líquido-líquido.

O método pode ser utilizado no controle de qualidade de sucos, como uva, caju, maçã, de vinhos, chocolate e chás, como chá mate, chá verde, chá branco, chá preto, não limitante. Além da utilização em indústrias de alimentos, o método pode ser utilizado pela indústria farmacêutica no controle de qualidade de fitoterápicos que contenham espécies vegetais ricas em fenólicos como: Carvalho (Quercus robur), Tormentila (Potentila erecta), Arandos (Vaccinium myrtillus), Hamamelis (Hamamelis virginiana), Ratânia (Krameria triandra), Espinheira santa (Maytenus ilicifolia), Crataego (Crataegus monogyna).

A adaptação e a otimização do método extrativo-analítico para determinação de taninos em extratos de barbatimâo da espécie S. adstringens (Martius) Coville foi realizada utilizando soluções de extrato etanólico seco e de substâncias de referência (catequina, ácido gálico, galocatequina, epigalocatequina, proantocianidina B2 e gaiato de epigalocatequina).

Para estabelecer as melhores condições cromatográficas para a eluição das amostras, realizou-se, inicialmente, um gradiente exploratório amplo. Esta corrida cromatográfica em gradiente linear foi realizada como descrito por Snyder e colaboradores (SNYDER, L. R.; KIRKLAND, J. J.; GLAJCH, J. L. Practical HPLC method development. 2. Ed. New York: Wiley, 1997. 765 p.) utilizando-se condições cromatográficas descritas na Tabela 1. Para se avaliar a influência do perfil de uma solução branco, o procedimento foi realizado com a injeção dos solventes utilizados para a solubilização das soluções de extrato etanólico seco, nas mesmas condições de análise.

Diferentes volumes de injeção de amostras foram testados para otimização da massa ideal de extrato a ser utilizado. Variaram-se ainda o solvente das amostras e padrões, o pH da fase móvel, a temperatura da coluna e o comprimento de onda para detecção.

Para avaliar a eficiência da separação da condição cromatográfica estabelecida, foram avaliados parâmetros de adequação do sistema (resolução, R; fator de retenção, k; fator de cauda, T) e a pureza dos picos para os marcadores químicos. Para determinação do tempo morto (to), 5 μΙ_ de solução de nitrato de sódio 0,1 % (p/V), solubilizado em fase móvel ACN:água (5:95), ambos acidificados com 0,1% ácido fosfórico VA/, foram injetados nas mesmas condições de análise.

Os exemplos a seguir ilustram a determinação de taninos nas espécies de barbatimâo S. adstringens e S. obovatum, mas não limitam a estas, as formas de concretizar a invenção. Exemplo 1 - Preparo das amostras

Solução estoque de extrato etanólico seco de S. adstringens e de S. obovatum (10 mg/mL): Pesaram-se com exatidão cerca de 100 mg do extrato etanólico seco bruto, dissolveram-se em aproximadamente 8 mL de metanol. Transferiu-se quantitativamente para balão volumétrico de 10 mL, completou-se o volume com o mesmo solvente e homogeneizou-se. Filtrou-se por meio de dispositivos filtrantes de celulose regenerada de tamanho de poro de 0,45 μΐη diretamente em mini-frascos para CLAE.

Solução de extrato etanólico seco de S. adstringens e de S. obovatum diluída (1 mg/mL): Pipetou-se 1 mL da solução estoque, com auxílio de micropipeta, e transferiu-se para balão volumétrico de 10 mL. Completou-se o volume com água ultrapura e homogeneizou-se, obtendo-se solução a 1 mg/mL em metanol 10% (V/V). Filtrou-se por meio de dispositivos filtrantes de celulose regenerada de tamanho de poro de 0,45 μηη diretamente em mini- frascos para CLAE.

Solução padrão de categuina (substância guímica de referência, SQR) (1 mg/mL): Pesaram-se com exatidão cerca de 5 mg de catequina que foram transferidos para balão volumétrico de 5 mL. Dissolveu-se em aproximadamente 3 mL de metanol, completou-se o volume com o mesmo solvente e homogeneizou-se. Filtrou-se por meio de dispositivos filtrantes adequados diretamente em mini-frascos para CLAE.

As soluções de ácido gálico SQR, galocatequina SQR, epigalocatequina SQR, proantocianidina B2 SQR e gaiato de epigalocatequina SQR, todas na concentração 1 mg/mL também foram preparadas da mesma maneira como descrito para a catequina SQR.

Exemplo 2 - Condições cromatográficas para a corrida exploratória em gradiente

Inicialmente, a determinação dos melhores solventes para os extratos foi avaliada com base nos dados de solubilidade dos padrões e dos extratos de barbatimão. Selecionaram-se soluções hidroalcóolicas para solubilização das amostras e dos padrões, nas quais os marcadores químicos apresentaram estabilidade suficiente para a construção das curvas analíticas.

Por meio de uma corrida cromatográfica inicial em gradiente exploratório amplo (Tabela 1) obteve-se o cromatograma apresentado na Figura 1. As amostras apresentaram composição complexa, com grande elevação de linha de base e eluíram num tempo máximo de 25 minutos, em um tempo total de corrida de 60 minutos.

Tabela 1 - Condições cromatográficas para a corrida exploratória em gradiente para determinação de taninos em insumos ou produtos vegetais (barbatimão S. adstringens (Martius) Coville e S. obovatum Benth)

Parâmetros Condições

Volumes de injeção l (L a 10 (L

Modo de injeção Automático

Fase móvel e modo de eluição Água:ACN (95:5)

Etapa 1: Gradiente ACN 5% a 95% por 60 min

Etapa 2: Isocrático ACN 95% por 5 min

Etapa 3: Gradiente ACN 95% a 5% por 10 min

Fluxo da fase móvel 1 m L/min

Coluna ZORBAX( Eclipse XDB-C18, 250x4,6 mm, 5 (m, Agilent, lote:

B05108.

Temperatura da coluna 30 9C

Comprimentos de onda de 0 210 nm, 274 nm, 280 nm, 330 nm e 550 nm;

detecção Obtenção de espectros UV-VIS

Tempo de corrida 60 min

Após a avaliação do perfil cromatográfico em gradiente exploratório amplo apresentado pelo extrato etanólico seco de S. adstringens, outras condições cromatográficas pré-otimizadas foram estabelecidas para obtenção de uma eluição em gradiente mais brando (Tabela 2). Tabela 2 - Condições cromatográficas pré-otimizadas em gradiente para determinação de taninos em insumos ou produtos vegetais (barbatimão S. adstringens (Martius) Coville e S. obovatum Benth).

Parâmetros Condições

Volumes de injeçâo 10 μί

Fase móvel e modo de eluição Água:ACN (95:5)

Etapa 1 : Gradiente ACN 5% a 40% por 60 min

Etapa 2: Isocrático ACN 40% por 5 min

Etapa 3: Gradiente ACN 40% a 5% por 10 min

Fluxo 1 mL/min

Coluna ZORBAX^® Eclipse XDB-C18, 250x4,6 mm, 5 μπι, Agilent, lote B05108.

Temperatura da coluna 30 °C

Comprimentos de onda de detecção λ 210 nm, 274 nm, 280 nm, 330 nm e 550 nm;

aquisição de espectros UV-VIS/DAD

Tempo de corrida 60 min

Nestas condições, obteve-se o cromatograma apresentado na Figura 2. As amostras apresentaram os picos principais com melhor resolução e eluíram no tempo máximo de 40 minutos, em um tempo de corrida total de 60 minutos.

Observa-se neste cromatograma que a linha de base sofre grande alteração ao longo da análise. Com o intuito de minimizar tal problema, desenvolveu-se um método para prévia purificação da amostra, por partição líquido-líquido (PLL).

Exemplo 3 - Pré-purificação das amostras de extrato etanólico seco de S. adstringens e de S. obovatum por partição líquido-líquido

O objetivo da etapa de purificação foi eliminar interferentes da amostra que possam prejudicar a análise sem, no entanto, retirar os marcadores de interesse para quantificação no extrato. Tais interferentes podem prejudicar a eluição da amostra ao longo da coluna cromatográfica levando a obtenção de uma linha de base com alterações ao longo do gradiente no cromatograma. Este problema dificulta a integração adequada do cromatograma, perdendo-se exatidão e precisão do método.

Com a purificação por meio de PLL dos extratos etanólicos de S. adstringens e de S. obovatum obtiveram-se duas frações: orgânica e aquosa. Os cromatogramas das duas frações são apresentados nas Figuras 3 e 4, respectivamente.

Diversas composições de fases para PLL, assim como o número de lavagens, o volume da fase orgânica e da fase aquosa e a relação massa de amostras por volume de solventes foram avaliadas.

A purificação das amostras de extratos etanólicos secos de S. adstringens e de S. obovatum foi realizada por meio de fracionamento por PLL de acordo com a Tabela 3.

Tabela 3 - Composição do sistema extrator utilizado como tratamento prévio de insumos ou produtos vegetais.

Fase Composição Volume (mL) Amostra (mg)^a

Acetato de etila 3,5

Butanol

Orgânica

2-propanol

250,0

(isopropanol)

Aquosa Agua ultrapura 4,5

Total 9,5

a: para amostras maiores, ajustar as quantidades dos solventes do sistema proporcionalmente.

Para a preparação do sistema extrator utilizado para o tratamento prévio dos extratos por PLL procedeu-se da seguinte maneira:

1. Mediu-se, separadamente, em duplicata, cada volume do sistema extrator, transferindo-os para dois erlenmeyers com boca esmerilhada e tampa. Homogeneizou-se com auxílio de agitador magnético durante 30 minutos,

2. Transferiu-se o volume de sistema extrator (suficiente para 1 lavagem) de cada erlenmeyer para funil de separação.

3. Adicionaram-se cerca de 250 mg de extrato seco (pesados com exatidão). 4. Agitou-se, vigorosamente, por 30 s, três vezes, alternadas após a separação das fases;

5. Recolheu-se a fase aquosa (inferior) em um béquer e a fase orgânica I (superior) em cápsula de porcelana tarada.

6. Retornou-se a fase aquosa para o mesmo funil de separação e adicionou-se novo sistema extrator, previamente homogeneizado, repetindo-se os procedimentos 4 e 5.

7. Recolheu-se a fase orgânica II em cápsula de porcelana tarada, reunindo-a com a fase orgânica I coletada.

8. Recolheu-se a fase aquosa em cápsula de porcelana tarada.

9. Secaram-se a fase aquosa e as fases orgânicas reunidas até resíduo, sob ar aquecido (não mais que 40 °C.) em capela.

10. Após a secagem das frações aquosa e orgânicas, pesaram-se as cápsulas e calculou-se o rendimento da extração para as frações obtidas.

11. Armazenaram-se as amostras, em frasco âmbar, hermeticamente fechado, identificado, em geladeira.

Os cromatogramas obtidos (Figuras 3 e 4) com injeções de soluções de frações purificadas por PLL apresentaram linha de base com menor variação da inclinação ao longo da eluição em gradiente, com melhoria da resolução dos picos. Pode-se observar que a fração aquosa também apresentou picos dos marcadores galocatequina e gaiato de epigalocatequina em concentração muito baixa. Isto demonstra que tais marcadores tiveram o equilíbrio deslocado no sentido da fração orgânica quando dissolvidos no sistema particionai binário de purificação. Portanto, por meio da purificação por PLL desenvolvida foi possível retirar compostos da matriz da amostra, os quais poderiam interferir nas análises por CLAE e conservar em quase sua totalidade os marcadores.

Exemplo 4 - Otimização das condições cromatográficas

Para uma verificação individualizada do perfil de marcadores comuns para taninos condensados, uma solução de catequina SQR 1 mg/mL, em metanol, volume de injeção 1 μΙ_, foi injetada, sob variação do pH da fase móvel (em torno de 2 a 6). Dessa forma avaliou-se o fator de cauda obtido. Outros parâmetros cromatográficos obtidos em função da variação do pH e da fase móvel são apresentados na Tabela 5.

Tabela 4 - Parâmetros cromatográficos obtidos para catequina SQR 1 mg/mL em metanol, volume de injeção 1 μΙ_, em diferentes composições de fase móvel

Tempo de

Fator de Fator de pH

Fase móvel retenção (t_R)

retenção (k) cauda (T) aparente (min)

Agua:ACN (95:5) 12,792 4,51 1 ,582 6, 18

Água-Ácido acético 0,001 %:ACN (95:5) 13,701 4,90 1 ,585 4,42

Água-Ácido fosfórico 0,001 %: ACN (95:5) 12,835 4,53 1 ,688 3,96

Água-Ácido fosfórico 0,01 % : ACN (95:5) 13,625 4,87 1 ,526 2,94

Água-Ácido fosfórico 0,05% : ACN (95:5) 12,488 4,38 1 ,516 2,38

Água-Ácido fosfórico 0,075% : ACN (95:5) 13,420 4,78 1 ,446 2,29

Água-Ácido fosfórico 0, 1 % : ACN (95:5) 13,703 4,90 1 ,449 2, 14

Observa-se que o fator de cauda com menor valor foi obtido em fase móvel com pH aparente entre 2,0 e 3,0, alcançado com adição de ácido fosfórico de no mínimo 0,075% (V/V) na fase aquosa. Apesar desta faixa de pH estar próxima ao limite de trabalho para colunas de fase ligada, a redução do fator de cauda permite uma análise mais precisa e exata. A melhoria na simetria do pico ocorreu devido à supressão da ionização das hidroxilas fenólicas dos taninos condensados.

Como o método baseia-se em um gradiente linear, o pH aparente da fase móvel se altera ao longo da análise com a acidificação somente da fase aquosa, portanto, os dois componentes da fase móvel: aquoso e orgânico foram acidificados (ACN).

As condições cromatográficas finais estabelecidas para avaliação de soluções diluídas de extrato etanólico seco de S. adstringens 1 mg/mL, em metanol 10% VA , são apresentadas na Tabela 5. Em λ 210 nm houve maior sensibilidade na detecção uma vez que os taninos apresentam uma boa absortividade neste comprimento de onda. Com o aumento de temperatura de 30 °C para 40 °C houve melhoria do perfil cromatográfico aumentando-se a resolução entre os picos.

As condições estabelecidas na Tabela 5 também foram utilizadas para a validação do método.

Tabela 5 - Condições cromatográficas em gradiente otimizadas para análise de extratos de barbatimão

Parâmetros Condições

Volumes de injeção 10 μΐ

Fase móvel A:B (95:5)

Modo de eluição Etapa 1 : Gradiente B 5% a 40% por 60 min

Etapa 2. Isocrático B 40% por 5 min

Etapa 3: Gradiente B 40% a 5% por 10 min

Fluxo 1 mL/min

Coluna LiChroCART® 250x4 mm, LiChrospher® 100 RP-18, 5 μιτι, Merck, lote 849117.

Temperatura da coluna 40 °C

Comprimentos de onda de λ 210 nm com aquisição de espectros UV-VIS/DAD

detecção

Tempo de corrida 60 min

Foram injetadas, individualmente e em conjunto, soluções padrão de ácido gálico SQR, catequina SQR, epigalocatequina SQR, gaiato de epigalocatequina SQR, galocatequina SQR e proantocianidina B2 SQR para demonstração da resolução entre os picos e para avaliação dos tempos de retenção (Tabela 6).

Soluções de extrato etanólico seco de S. adstringens fortificadas com os padrões: ácido gálico, catequina, epigalocatequina, gaiato de epigalocatequina, galocatequina e proantocianidina B2 foram injetadas (Figura 6). A concentração 1 mg/mL para as amostras com volume de injeção de 10 μΙ_ foi considerada ideal. Analisando-se o cromatograma do extrato etanólico seco de S. adstringens fortificado conclui-se que o mesmo não possui o marcador proantocianidina B2 em sua composição. Estes dados podem ser confirmados pela sobreposição do cromatograma da solução sem adição de padrão e após adição de padrões apresentados na Figura 7. Os demais padrões estão presentes no extrato etanólico seco de S. adstringens. No entanto, o ácido gálico e a catequina estão em concentração mais baixa em relação aos demais marcadores químicos no S. adstringens do que no S. obovatum. Entretanto, pode-se, para o extrato de S. adstringens, quantificar a galocatequina e o gaiato de epigalocatequina no método desenvolvido por CLAE, enquanto que em S. obovatum pode-se quantificar a catequina, a galocatequina e o gaiato de epigalocatequina.

Ainda foi possível observar a presença de um pico de mais elevada intensidade no centro do cromatograma, com tempo de retenção próximo a 14 minutos. Não foi possível identificar esta substância por meio dos padrões utilizados, entretanto, pode-se afirmar que se trata de um derivado de flavan-3- ol pela semelhança do espectro UV/DAD (pureza de pico de 99,17%) obtido em relação aos espectros dos padrões avaliados.

Exemplo 6 - Validação do método analítico por CLAE

O método analítico para quantificação de galocatequina e gaiato de epigalocatequina nos extratos de barbatimão por CLAE foi validado de acordo com as figuras de mérito e as especificações recomendadas pela Resolução RE n° 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA (BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE n° 899, de 29 de maio de 2003. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 02 jun. 2003) e o Guia ICH de Validação de Procedimentos Analíticos (INTERNATIONAL Conference on Harmonisation (ICH) of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of Analytical Procedures, Q2(R1), Geneva. nov. 2005. Disponível em: http://www.ich.org/LOB/media/MEDIA417.pdf Acesso em: 05 jul 2009.). Foram avaliadas as figuras de mérito linearidade, precisão, exatidão, seletividade, robustez, limite de quantificação e limite de detecção.

Para a realização dos testes utilizou-se a fração orgânica do extrato etanólico seco da espécie S. adstringens. Após a validação do método, determinou-se também o teor dos marcadores na fração orgânica do extrato etanólico seco obtido de cascas da espécie S. obovatum.

Para determinação do tempo morto (to), 5 μΙ_ de solução de nitrato de sódio a 0,1 % p/V solubilizado em fase móvel ACN:água (5:95) acidificada com acido fosfórico 0,1 % V/V foram injetados nas mesmas condições de análise.

Seletividade

A seletividade foi avaliada pela determinação da pureza espectral dos picos dos marcadores químicos selecionados como substâncias químicas de referência, obtida com auxílio do detector UV/DAD, no intervalo λ 200 nm a 800 nm. Considerou-se uma pureza mínima, 98,0%, como valor aceitável demonstrando-se que o pico cromatográfico é atribuído a um só componente e o método é seletivo.

A seletividade também foi avaliada pela eficiência da separação da condição cromatográfica estabelecida através dos parâmetros de adequação do sistema (resolução, fator de retenção, fator de cauda, número de pratos teóricos) para os picos dos marcadores químicos, apresentados na Tabela 6. A Figura 7 apresenta o cromatograma dos padrões reunidos.

Os marcadores químicos galocatequina e gaiato de epigalocatequina apresentaram pureza de pico maior que 99,0% nas análises.

Tabela 6 - Resultados dos parâmetros cromatográficos obtidos para os marcadores reunidos 100 μg/mL cada, em metanol, por CLAE nas condições otimizadas (volume de injeção 2 μΙ_; demais condições descritas na Tabela 5).

Tempo de Fator de Fator de N° de

Marcador Pureza de retenção (min) pratos/

químico

pico (%) retenção (k) cauda (T) coluna (N)

AG 4,960 1 ,14 1 ,295 - 13.634 98,58

GC 7,749 2,34 1 ,236 14,745 22.272 100,00

EGC 12,062 4,19 1 ,197 20,180 48.523 100,00

C 13,722 4,91 1 ,198 7,210 51.980 99,89

P 16,254 6,00 1 ,155 10,199 65.051 99,90

GEGC 18,514 5,68 1 ,200 8,756 80.772 99,88

Q 40,806 16,57 1 ,223 75,555 246.798 99,35 a: A resolução foi calculada em relação ao pico precedente.

Linearidade

Foi realizada a construção de curvas analíticas, em dois dias diferentes, utilizando os marcadores químicos galocatequina (GC) SQR e gaiato de epigalocatequina (GEGC) SQR para verificação da linearidade. Preparou-se uma solução padrão única contendo 10 μg/mL de cada marcador químico em metanol 10% (V/V). A faixa de concentração dos marcadores foi estabelecida considerando a estimativa dos percentuais encontrados nos extratos preparados. Em seguida as soluções foram filtradas por meio de dispositivos filtrantes adequados e, transferidas para mini-frascos e injetadas no cromatógrafo.

Injetaram-se, em triplicata, os volumes 3, 9, 15, 21 , 27 e 33 μΙ_ da solução padrão única, totalizando-se 18 injeções, e a curva analítica foi construída para a relação massa da substância injetada versus área do pico (Tabela 7). . _

Tabela 7 - Construção da curva analítica para galocatequina e gaiato de epigalocatequina por CLAE-UV/DAD (10 μg/mL cada, em metanol 10% V/V).

Concentração de Faixa de concentração Volume de injeção Massa injetada trabalho (%) (μΙ-) GC e GEGC (ng)

20 3,0 3,0 30

60 9,0 9,0 90

100 15,0 15,0 150

140 21 ,0 21 ,0 210

180 27,0 27,0 270

220 33,0 33,0 330

A faixa linear avaliada para cada marcador químico foi de 20% a 220% da concentração de trabalho, o que corresponde à faixa de concentração de 3 μg/mL a 33 μg/mL.

A equação da reta e os resultados estatísticos foram obtidos a partir da regressão linear por meio do método dos mínimos quadrados. O coeficiente de correlação (r) foi superior a 0,99, o que indica linearidade satisfatória entre a área dos picos e as massas injetadas para os marcadores utilizados.

Tabela 8 - Parâmetros de linearidade obtidos para GC e GEGC (faixa linear de massa injetada 30-330 ng) por CLAE (n = 6, em triplicata).

GC GEGC

Parâmetros

Curva 1 Curva 2 Curva 1 Curva 2

Coeficiente de correlação (r) 0,9998 0,9998 0,9986 0,9985

Inclinação 16,033 16,173 10,936 10,715

Intercepto -2,775 -4,361 1 -23, 13 -23,302

Desvio padrão relativo 1 ,04 1 ,10 3,15 3,32 Precisão intra-ensaio e precisão inter-ensaio

A avaliação da precisão intra-ensaio (repetitividade) foi realizada, por meio de cálculo do desvio padrão relativo (DPR), a partir da injeção de soluções amostra de extrato etanólico seco de S. adstringens (n = 6) contendo os marcadores a 100% da concentração de trabalho. As soluções da amostra foram preparadas conforme descrito a seguir:

Solução da fração orgânica de extrato etanólico seco de S. adstringens (1 mg/mL): Pesaram-se com exatidão cerca de 100 mg da fração orgânica de extrato etanólico seco, transferiram-se para balão volumétrico de 10 mL. Adicionaram-se cerca de 5 mL de metanol, agitou-se manualmente para dissolução da amostra e completou-se o volume com metanol. Em seguida, pipetou-se 1 ,000 mL desta solução, em sextuplicata, com auxílio de micropipeta, para balões volumétricos de 10 mL. Completou-se o volume com água ultrapura e homogeneizou-se. As soluções, na concentração 1 mg/mL, foram filtradas por meio de dispositivos filtrantes adequados, transferidas para mini-frascos e 10 de cada solução foram injetados no cromatógrafo.

Os teores de GC e GEGC nas frações orgânicas foram calculados a partir das áreas dos picos obtidos com as soluções amostra e com auxílio das curvas analíticas construídas conforme item Linearidade.

A precisão inter-ensaio (precisão intermediária) foi avaliada após a repetição deste procedimento em dois dias diferentes, com o mesmo analista (n = 12) e também em dois diferentes, com analistas diferentes (n = 12). Os resultados foram agrupados e calculou-se o desvio padrão relativo (DPR). Na repetitividade (n = 6), os teores obtidos para GC e GEGC foram 1 ,29% (DPR= 1 ,62%) e 1 ,34% (DPR= 1 ,10%), respectivamente. Os valores de teor obtidos na precisão intermediária (n = 12), em dois dias diferentes com o mesmo analista, foram 1 ,29% (DPR= 1 ,76%) e 1 ,33% (DPR= 2,63%) para GC e GEGC, respectivamente. Os teores obtidos na precisão intermediária (n = 12), em dois dias diferentes por analistas diferentes foram 1 ,36% (DPR= 5,22%) e 1 ,31% (DPR= 2,77%) para GC e GEGC, respectivamente. Os valores de DPR (%) obtidos para a precisão inter e intra-ensaio indicam precisão satisfatória do método cromatográfico aplicado a matrizes vegetais.

Exatidão

A determinação da exatidão foi realizada em três níveis de concentração, em triplicata para cada nível, por meio do método de adição de padrões (marcadores químicos) a uma quantidade conhecida de amostra de fração orgânica.

As soluções amostra fortificadas e não fortificadas foram filtradas por meio de dispositivos filtrantes adequados, transferidas para mini-frascos e 10 μΙ_ de cada solução foram injetados no cromatógrafo. Os teores foram calculados a partir das áreas dos marcadores químicos e das curvas analíticas obtidas.

A exatidão foi calculada pela relação entre a concentração média de padrão determinada experimentalmente e a concentração de padrão teórica correspondente.

As recuperações médias (n = 9) de 104,98% (RSD = 3,21%) obtida para GEGC e de 76,50% (RSD = 4,53%) obtida para GC comprovam a exatidão do método.

Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)

Os limites de detecção e quantificação obtidos a partir das curvas analíticas são apresentados na Tabela 9.

Tabela 9 - Valores de limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) para os marcadores químicos GC e GEGC estimados pelas curvas analíticas.

Marcador ^LD <ⁿ9> ^LQ <ⁿ9>

q^uímico Dial DÍã^~2 Dial DÍa^~2^~

GC 2$5 3?TÕ 8^94 9^0

GEGC 8,81 9,29 26,69 28,16 Avaliação do extrato de S. obovatum pelo método por CLAE

Realizou-se o doseamento da fração orgânica do extrato etanólico seco de S. obovatum. Os teores médios encontrados foram 1 ,22% p/p para GC e 1 ,42% p/p para GEGC. Para a espécie S. adstringens os teores médios encontrados foram 1 ,35% p/p para GC e 1 ,32% p/p para GEGC.

Nas duas espécies, os marcadores químicos estão presentes na fração orgânica, variando-se somente a concentração dos mesmos.

Claims

ρ τ ί ρ ΓΝ Λ 4 Λ / Λ Λ Λ Λ „ _| 2011/017792 ^ ^ I ι ' ι L p PCT//nBuR2->n01i n0//n0n0n02' 7n0^ . I REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, caracterizado por utilizar monômeros como marcadores característicos e não fenóis totais, compreendendo as seguintes etapas:

A) Preparo das soluções de amostra em concentrações determinadas;

B) Pré-purificação das amostras por partição líquido-líquido;

C) Otimização das condições cromatográficas;

D) Validação do método analítico.

2. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, caracterizado pela etapa "A" da reivindicação 1, utilizar soluções de extrato etanólico seco e de substâncias de referência.

3. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo uso de marcadores químicos característicos selecionados do grupo compreendendo catequina, epicatequina, ácido gálico, galocatequina, epigalocatequina, proantocianidina B2 e gaiato de epigalocatequina.

4. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, caracterizado pela etapa "B" da reivindicação 1 , ocorrer por partição líquido-líquido.

5. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, caracterizado pela etapa "C" da reivindicação 1 , compreender:

A) Fase móvel A:B (95:5); A: H₃P0 0,1% V/V em água; B: H₃P0₄ 0,1%

V/V em acetonitrila;

B) Modo de eluição Gradiente B 5% a 40% por 60 min; Isocrático B 40% por 5 min; Gradiente B 40% a 5% por 10 min;

C) Fluxo 1 mL/min; 2011/017792 ²⁵ P C T / B PCT/BR2010/00027o] 2 7 0

D) Coluna C18, 250 x 4 mm, 5 μΓη;

E) Temperatura da coluna 40 °C;

F) Comprimento de onda de detecção λ 210 nm com aquisição de espectros UV-VIS/DAD;

G) Tempo de corrida de 60 a 100 min.

6. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, caracterizado pela etapa "D" compreender ensaios de linearidade, precisão, exatidão, seletividade, robustez, limite de quantificação e limite de detecção.

7. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por separar, identificar e quantificar marcadores químicos específicos de taninos compreendendo catequina, epicatequina, ácido gálico, galocatequina, epigalocatequina, proantocianidina B2 e gaiato de epigalocatequina em um tempo de corrida adequado para análises de rotina em matrix complexa de 60 a 100 min.

8. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado por possibilitar a utilização de pequenas quantidades de amostras, na ordem de grandeza de miligramas.

9. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser utilizado tanto em escala analítica, quanto em preparativa.

10. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, caracterizado por ser utilizado no controle de qualidade de alimentos, selecionados do grupo compreendendo sucos de uva, caju, maçã, vinhos, chocolate e chás, chá mate, chá verde, chá branco, chá preto. 2011/017792 ²⁶ P C T / B IPCT/BR2010/000270 2 7 0

11. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, caracterizado por ser utilizado no controle de qualidade de fitoterápicos que contenham espécies vegetais ricas em fenólicos.

12. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE

TANINOS, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pelas espécies vegetais serem selecionadas do grupo compreendendo Carvalho (Quercus robur), Tormentila (Potentila erecta), Arandos (Vaccinium myrtillus), Hamamelis (Hamamelis virginiana), Ratânia (Krameria triandra), Espinheira santa (Maytenus ilicifolia), Crataego (Crataegus monogyna).