CN111735894A - 一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用，所述黄酮类化合物为泽兰黄酮‑7‑(6’’‑丙二酰)葡萄糖苷‑4'‑葡萄糖苷。本发明还公开了一种玫瑰蜂花粉的真实性评价方法，以泽兰黄酮‑7‑(6’’‑丙二酰)葡萄糖苷‑4’‑葡萄糖苷为指示性物质，当其在蜂花粉中含量介于500‑800 mg/kg时，可将其判断为真实的玫瑰蜂花粉；当其在蜂花粉中的含量低于500 mg/kg，则将其判定为其它类型的蜂花粉或掺假玫瑰蜂花粉。本发明提供的方法还具有简单、准确等优点，便于操作和推广，对保护玫瑰蜂花粉消费者的合法权益和维护蜂产品消费行业的健康发展具有重要的现实意义。

Description

一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用。
背景技术
蜂产品是目前一种常见的食品类型，按其来源和形成状态的不同可以分为三大类：蜜蜂的采制物，如蜂蜜、蜂花粉和蜂胶等；蜜蜂的分泌物，如蜂王浆、蜂毒和蜂蜡等；蜜蜂自身生长发育各类虫态的躯体，如蜜蜂幼虫和蜜蜂蛹等。其中，蜂花粉是蜜蜂采集粉源植物的花粉，与自身分泌物相混合，加工成花粉团，储存在蜂巢中。
蜂花粉中含有丰富的蛋白质、维生素、酚酸黄酮和矿物质等对身体有益的物质，是蜜蜂蛋白质食物的主要来源，是人们美容、养生、保健的重要天然食品之一，深受人们喜爱。由于粉源植物的不同，蜂花粉的色泽、口感和功效存在较大的差异，其中能够形成商品化的蜂花粉种类有：油菜、茶花、荞麦、玫瑰、玉米、荷花以及来源不清晰的杂花粉等。其中，玫瑰蜂花粉因具有良好的保健功效，最为受消费者喜爱。由于玫瑰蜂花粉产量有限，售价较高，市场供不应求，不良商家为了谋取高额利润，采用掺假售假等方式欺骗消费者。当前，尚未有关于玫瑰蜂花粉真实性的标准和鉴别方法，产品的真实性主要基于企业的自律和信誉。如何维护玫瑰蜂花粉的真实性，保护蜂农和消费者的权益成为广大蜂产品行业从业者的共识。
玫瑰蜂花粉中含有丰富的内源性物质，其中以具有药理活性的酚酸黄酮为代表，但是有关玫瑰蜂花粉中的酚酸黄酮的种类和化学结构，鲜有文献报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用，具体为泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用。本发明以玫瑰蜂花粉中的特征性内源性物质泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷作为其标志物，用来评价玫瑰蜂花粉的真实性。
本发明首先通过液相色谱串联高分辨质谱的正负模式对大量的玫瑰蜂花粉以及其它常见的蜂花粉进样分析。实验结果表明玫瑰蜂花粉在正模式下的总离子流色谱图中存在一个含量较高的化合物，其色谱保留时间为7.50 min，精确质量数为m/z 727.17162，但是该物质的化学结构尚不清晰。为了明确该物质的化学结构，本发明从玫瑰蜂花粉中提取纯化了该物质，获得该物质的高纯度对照品。基于核磁共振(NMR)和高分辨质谱提供的数据，明确了该物质的化学结构为泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷（Nepetin-7-(6''-Malonyl)Glucoside-4'-Glucoside），化学结构如下所示：
Figure 71904DEST_PATH_IMAGE001
。
基于获得的对照品，本发明采用LC-MS初步建立了花粉中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的准确定量分析方法。另外，本发明从玫瑰蜂花粉的各产地共采集了20余份花粉样本，样本经前处理之后，由开发的LC-MS方法进样分析，结果发现玫瑰蜂花粉中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量较为稳定为500-800 mg/kg。而其它品种的蜂花粉中，该物质的含量很低，甚至检测不到。因此，可以将泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷作为玫瑰蜂花粉的特征性物质，用于玫瑰蜂花粉的真实性鉴别及纯度评价。
本发明进一步提出一种玫瑰蜂花粉的真实性评价方法，以泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷为特征性标志物对蜂花粉样本进行检测；若所述蜂花粉样本中所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量介于500-800 mg/kg，判断所述蜂花粉样本为玫瑰蜂花粉；若所述蜂花粉样本中所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量低于500mg/kg，判定所述蜂花粉样本为其它蜂花粉或者掺假玫瑰蜂花粉。
作为优选，通过加入泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的空白蜂花粉（油菜蜂花粉，该花粉中不含有此物质）确认泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量与峰面积间的线性关系，根据蜂花粉样本中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的峰面积推算其含量。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap （超高液相色谱串联四极杆/高分辨静电轨道阱质谱）或 LC-MS/MS检测蜂花粉样本。
作为优选，泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z727.17162 ([M+H]+)准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5 ppm；优选泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷色谱峰的保留时间为7.50 min，保留时间允许的偏差应小于0.3 min。
此外，为了提高玫瑰蜂花粉的鉴别能力，泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的精确质量数和保留时间除了满足上述条件之外，该物质的MS/MS图谱(子离子图谱)中应该含有其主要的碎片离子，本发明进一步发现了其特征碎片离子：m/z 565.11880、m/z 479.11840和m/z 317.06558，其精确质量数的误差应当小于10 ppm。基于上述MS/MS图谱中提供的主要碎片离子，即便是在无泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷对照品的情况，依然可以通过液相色谱串联质谱法来判定蜂花粉样本中是否含有玫瑰蜂花粉，并可积分母离子峰面积用于玫瑰蜂花粉含量的计算。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂花粉样本进行检测时，液相条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0.0-2.0 min，5%的流动相B；2.0-7.0 min，5-30%的流动相B；7.0-14.0 min，30-95%的流动相B；14.0-18.0 min，95%的流动相B；18.0-20.0 min，5%的流动相B。
作为优选，液相的流速为0.30 mL/min。
作为优选，进样量为5.0 µL。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂花粉样本进行检测时，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0 arb； 电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为 60 V；离子源的温度350℃；
作为优选，采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2，其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：80-1200 Da；Spectrum data：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：2； Isolation window：2.0 Da； NCE：35 eV；Spectrum data：Centroid；在dd settings中，Minimum AGC： 8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
采用LC-MS/MS对蜂花粉样本进行检测时，由于检测仪器的不同，LC-MS/MS的液相和质谱设置条件与UHPLC-Q-Orbitrap差异较大，优选液相条件如下：采用C18色谱柱(优选采用较短的C18色谱柱)，柱温为25℃，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5 min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B。
作为优选，液相的流速为0.30 mL/min。
作为优选，进样量为3.0 µL。
作为优选，为了准确定量蜂花粉中的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷，采用LC-MS/MS对蜂花粉样本进行检测时，选择多反应监测(MRM)的监测方式，MRM关键参数的设置如下：泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的Fragementor：60V，727.2>317.1，30 eV，727.2>565.1，15 eV。
质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子喷雾电压：3500V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：5 L/min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11 L/min。
其中，泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的详细MRM参数设置参见表1。
Figure 404797DEST_PATH_IMAGE002
为验证建立的LC-MS/MS方法科学合理性，本发明考察了该方法的准确度和精密度，变异系数均小于10%，完全符合残留检测分析的要求。
基于本方法采用的仪器和公布的参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱或者液相串联三重四极杆质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整。
作为优选，在检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂花粉样本进行提取的步骤；
优选所述蜂花粉样本与甲醇水的质量体积比1：（9~11）；更优选为1：10。
在所述甲醇水中，优选甲醇与水的体积比为2：（7~9），更优选为2：8。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂花粉样本进行检测前，将蜂花粉按1:10000的质量体积比充分溶于甲醇水中，进行提取。
作为优选，所述提取具体包括如下步骤：将蜂花粉研磨成粉末，取0.8 g蜂花粉粉末样品：7.2 mL甲醇水的比例将其混合，并使蜂花粉充分混匀，20194 g高速离心20 min，再取10 µL提取液：990 µL甲醇水的比例稀释一次，再按照100 µL提取液，900 µL甲醇水的比例稀释一次。
本发明涉及到的试剂在市场上均可获得，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到较优的实施方式。
本发明的有益效果在于：
(1) 本发明首次公布了高含量泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷可作为玫瑰蜂花粉真实性和纯度评价的指标，并提出了采用液相串联质谱(UHPLC-Q-Orbitrap或LC-MS/MS)检测蜂花粉中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的方法。基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度，检出限可以达到1 µg/L。
(2) 本发明对泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的LC-MS/MS检测方法和关键的检测参数进行了优化，可以准确定量玫瑰蜂花粉中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷含量。
(3) 本发明提供的检测方法还具有简单、高效等优点，便于操作和推广，对保护蜂花粉消费者的合法权益和维护蜂花粉消费行业的健康发展具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明实施例1提供玫瑰蜂花粉中特征性标志物泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的化学结构；
图2为本发明实施例1提供的玫瑰蜂花粉在UHPLC-Q-Orbitrap正离子模式下的离子流图谱；其中A为总离子流色谱图，B为泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的精确提取离子流色谱图；
图3为本发明实施例1提供的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷在UHPLC-Q-Orbitrap正离子模式下的质谱图；其中A为全扫描质谱图，B为精确质量数的子离子质谱图，C为碎片离子m/z 317.06558的子离子图谱(MS3)；
图4为本发明实施例2提供的LC-MS/MS的MRM模式检测8种主要的不同品种蜂花粉中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量；
图5为本发明实施例3提供的20种商品化玫瑰蜂花粉样品中的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷含量情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
仪器与试剂：
1. 质谱仪(Q-Exactive Plus)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
2. 1200 series液相色谱-6460三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；
3.台式低温离心机(Microfuge 22R Centrifuge)，美国 BeckMAN Coul TER公司；
4.电子分析天平(PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；
5.超纯水机(Milli-Q Gradient)，美国Millipore公司；
6.涡动仪(G560E)，美国Scientific Industries公司；
甲酸(FA) 购买于上海安谱实验科技股份有限(CNW)公司；乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)购买于Fisher公司。
实施例1
本实施例首先通过液相色谱串联高分辨质谱的正负模式对大量的玫瑰蜂花粉以及其它常见的蜂花粉进样分析。实验结果表明玫瑰蜂花粉在正模式下的总离子流色谱图中存在一个含量较高的化合物，如图2所示，其中的A为玫瑰蜂花粉总离子流色谱图，B为发现的含量较高的化合物的精确提取离子流色谱(提取窗口为5 mDa)，其色谱保留时间为7.50 min，精确质量数为m/z 727.17162 （如图3中的A所示）。此外，该化合物在玫瑰蜂花粉中的含量显著区别于其它常见蜂花粉品种。图3中的A、B和C分别展示了该化合物的全扫描质谱图(MS)、子离子质谱图(MS/MS)以及碎片离子的子离子质谱图(MS3)。
基于高分辨质谱提供的精确质量数m/z 727.17162，本实施例获得该物质的元素组成为C31H35O20 +。在该物质的MS/MS图谱中；该物质峰的主要碎片含有m/z 565.11880，m/z 479.11840和m/z 317.06491。随后，本实施例采用Compound Discoverer 2.0软件对该物质进行多重化学物质数据库进行检索，如m/z Cloud、Chem Bank等。实验结果表明数据库中并没有检索到该化合物，表明该物质属于一个全新的化合物。尽管如此，数据库对比数据表明碎片离子m/z 317.06491为泽兰黄酮（Nepetin），其子离子图谱(图3中的C)中的精确质量数的碎片离子能够与m/z Cloud中的数据完全匹配上，匹配率高达99%。
另外，该化合物的MS/MS图谱(图3B)中，母离子m/z 727.17047与碎片离子m/z565.11780、碎片离子 m/z 479.11749与碎片离子m/z 317.06482的质量数均相差162 Da，表明两者均存在一个葡萄糖的中中性丢失(C6H10O5)；另外，碎片离子m/z 565.11780与碎片离子m/z 479.11749存在一个86 Da中性丢失，精确质量数的数据表明该中性丢失的元素组成为C3H2O3，暗示该中性丢失可能为丙二酸。综合上述获得的信息，本实施例推断该化合物为Nepetin的双葡萄糖结合产物，其中一个葡萄糖上结合了丙二酸。由于Nepetin中含有多个可供结合的羟基化位点。单纯的基于质谱信息难以明确该物质的精确化学结构。为此，本实施例联合中国农业大学动物医学院采用制备色谱从玫瑰花粉中分离纯化出了该物质，并获得高纯度对照品约10 mg。随后采用核磁共振仪器(NMR)对该物质进行了1H谱和13C谱的解析，详细数据见表2。通过对NMR的数据的解析，明确了该物质为泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷，其详细化学结构见图1。
Figure 156852DEST_PATH_IMAGE003
此外，为保证泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷鉴定结果的有效性，本实施例采用β-葡萄糖醛酸酶对纯化后的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷进行了酶解处理，然后再次采用液相串联高分辨质谱分析，结果发现了一个高含量的色谱峰m/z 317.06486，通过与购买的Nepetin标准品进行了对比，发现两者具有相同的保留时间、母离子(MS)和碎片离子(MS/MS)。该结果再次验证了泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷化学结构鉴定的准确性。
实施例2
1. 样品来源
从市场或者蜂农处购买常见的真实蜂花粉样本共24份，分别为油菜蜂花粉（3份）、茶花蜂花粉（3份）、荷花蜂花粉（3份）、玉米蜂花粉（3份）、玫瑰蜂花粉（3份）、党参蜂花粉（3份）、五味子蜂花粉（3份），荞麦蜂花粉（3份）。用于检测各种蜂花粉中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量。
2. 溶液配制
提取溶液：移取甲醇20 mL，超纯水定容到100 mL。4 ℃保存。泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷标准溶液：称取10 mg的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷标准品，甲醇定容至10 mL。4 ℃保存，有效期2个月。
3.1 Q Exactive plus测试条件如下：
(1) 样品处理：
将蜂花粉研磨成粉，称取0.8 g研磨后的蜂花粉，加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜；吸取10 µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100 µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
(2) 空白蜂花粉加标：
将空白蜂花粉（不含泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷）研磨成粉，称取0.8 g研磨后的空白蜂花粉，加入7.2 mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜转移至进样品中，吸取10 µL提取液，990µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100 µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。取900µL稀释过滤后的液体加入进样瓶，再移取100 µL浓度为1 mg/kg的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
(3) UHPLC-Q Exactive plus仪器设置
色谱条件为：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离：0.0-2.0 min，5%的流动相B；2.0-7.0 min，5-30%的流动相B；7.0-14.0min，30-95%的流动相B；14.0-18.0 min，95%的流动相B；18.0-20.0 min，5%的流动相B。液相的流速为0.30 mL/min；进样量：5.0 µL。
离子源参数：鞘气的流速45 arb； 辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0 arb；电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为 60 V；离子源的温度350℃。
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2。
其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：80-1200 Da； Spectrum data：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：2； Isolationwindow：2.0 Da； NCE：35 eV；Spectrum data：Centroid；在dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
质谱生成的数据通过Xcalibur软件收集并存储，将质谱采集的raw数据通过Xcalibur的Qualitative browser分析，比较样品与空白加标样品中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的Full MS色谱图（见图2）及MS/MS图谱（见图3），确定样品中含有泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷。
(4) 标准曲线的绘制：在空白蜂花粉样品提取后过滤膜的溶液中制备一系列泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷溶液(20，50，100，200，500，1000 ng/mL)。数据通过Trace Finder软件处理，定量蜂花粉样品中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量。
3.2. Agilent1200液相色谱-6460三重四级杆质谱分析条件如下：
(1) 样品处理：
将蜂花粉研磨成粉，称取0.8 g研磨后的蜂花粉，加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜；吸取10 µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100 µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
（2）空白蜂花粉加标：
将空白蜂花粉（油菜蜂花粉，不含泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷）研磨成粉，称取0.8 g研磨后的空白蜂花粉，加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜转移至进样品中，吸取10µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100µL提取液，900 µL甲醇-水的比例稀释一次。取900 µL稀释过滤后的液体加入进样瓶，再移取100 µL浓度为1 mg/kg的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
（3）Agilent 1200-6460仪器参数设置如下：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离：0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B，优选液相的流速为0.30 mL/min；进样量：3.0 µL。
LC-MS/MS的质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM)；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11 L/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11 L/min。
采集的模式为正离子模式下的MRM模式。MRM参数：727.2>317.1，30 eV (定量离子)，727.2>565.1，15 eV (定性离子)。
(4) 在空白蜂花粉样品提取后过滤膜的稀释10000倍的溶液中制备一系列泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷 (20，50，100，200，500，1000 ng/mL)。并指定200 ng/mL的空白添加为质控样本。
通过Agilent 的MassHunter定量软件分析样品及空白加标样品。外标法定量，得到标曲公式为Y=1.4218e4X-0.50e4，R2=0.9998 (X为浓度Y定量离子响应积分值)。
通过定量软件即可分析蜂花粉样品中的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷含量，通过浓度稀释计算，得到蜂花粉样品中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量。对7种不同品种蜂花粉样本的检测结果见图4。由图4可知，玫瑰蜂花粉中的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量显著区别于其他花粉源的蜂花粉样本，当样品中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量高于500mg/kg可被判别为样品花粉源为玫瑰，该样品为玫瑰蜂花粉。
实施例3
1.样品来源
从市场购买20份不同厂家生产的商品化玫瑰蜂花粉。
2. 实验步骤
(1) 溶液配制
提取溶液：移取甲醇20 mL，超纯水定容到100 mL。4 ℃保存。泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷标准溶液：称取10 mg的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷标准品，甲醇定容至10 mL。4 ℃保存，有效期2个月。
(2) 样品处理：
将蜂花粉研磨成粉，称取0.8 g研磨后的蜂花粉，加入7.2 mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜；吸取10 µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100 µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
(3)空白蜂花粉加标：
将空白蜂花粉（油菜蜂花粉，不含泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷）研磨成粉，称取0.8 g研磨后的空白蜂花粉，加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜转移至进样品中，吸取10µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取10 0µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。取900 µL稀释过滤后的液体加入进样瓶，再移取100 µL浓度为1 mg/kg的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
(3) Agilent 1200-6460仪器参数设置如下：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离：0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B优选液相的流速为0.30 mL/min；进样量：3.0 µL。
LC-MS/MS的质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM)；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11 L/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11 L/min。
采集的模式为正离子模式下的MRM模式。MRM参数：727.2>317.1，30 eV (定量离子)，727.2>565.1，15 eV (定性离子)。
（4）在空白蜂花粉样品提取后过滤膜的稀释10000倍的溶液中制备一系列泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷 (20，50，100，200，500，1000 ng/mL)。并指定200 ng/mL的空白添加为质控样本。
通过Agilent 的MassHunter定量软件分析样品及空白加标样品。外标法定量，得到标曲公式为Y=1.4125e4X-0.50e4, R2=0.9997 (X为浓度，Y定量离子响应积分值)。
通过定量软件即可分析20种玫瑰蜂花粉样品中的泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷含量，通过浓度稀释计算，得到蜂花粉中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量如图5。其中编号为1、4、5、6、7、10、12、13、15、17、19的玫瑰蜂花粉泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量在500-800 mg/kg。因此判定编号为1、4、5、6、7、10、12、13、15、17、19的玫瑰蜂花粉花为真实的玫瑰蜂花粉，编号为2、3、8、9、11、14、16、18、20为其它蜂花粉或掺假玫瑰蜂花粉。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用，其特征在于，所述黄酮类化合物为泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷，所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的化学结构如下：
Figure 328259DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种玫瑰蜂花粉的真实性评价方法，其特征在于，以泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷为特征性标志物对蜂花粉样本进行检测；若所述蜂花粉样本中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量介于500-800 mg/kg，判断所述蜂花粉样本为玫瑰蜂花粉；若泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量低于500 mg/kg，则判定所述蜂花粉样本为其它蜂花粉或者掺假玫瑰蜂花粉；所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的化学结构式如下：
Figure 448661DEST_PATH_IMAGE002
。
3.根据权利要求2所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap和/或LC-MS/MS检测所述蜂花粉样本。
4.根据权利要求3所述的真实性评价方法，其特征在于，所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z727.17162 [M+H]+准分子离子峰，其精确质量数的误差小于5 ppm；所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷色谱峰的保留时间为7.50 min，保留时间允许的偏差小于±0.3 min，所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的MS/MS图谱中含有以下一个或多个碎片离子蜂，m/z 565.11880、m/z 479.11840和m/z 317.06558，其精确质量数的误差小于10 ppm。
5.根据权利要求3或4所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对所述蜂花粉样本进行检测时，液相色谱条件如下：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2 min，5%的流动相B；1.2-7min，5-30%的流动相B；7-14min，30-95%的流动相B；14-18.0 min，95%的流动相B；18.0-20.0min，5%的流动相B；
质谱条件如下：离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0arb；电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为60 V；离子源的温度350 ℃；采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2，其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：80-1200 Da；Spectrum data：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：2； Isolation window：2.0 Da； NCE：35 eV；Spectrum data：Centroid；在dd settings中，Minimum AGC： 8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
6.根据权利要求3或4所述的真实性评价方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对所述蜂花粉样本进行检测时，液相色谱条件如下：采用C18色谱柱，柱温为25 ℃，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5 min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B；
质谱选择多反应监测的监测方式，泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的MRM关键参数的设置如下：727.2>317.1，30 eV，727.2>565.1，15 eV；离子源条件如下：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；离子喷雾电压：3.5 kV；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：5 L/min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11 L/min。
7.根据权利要求2-4任一项所述的真实性评价方法，其特征在于，在检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂花粉样本进行提取的步骤；所述蜂花粉样本与所述甲醇水的质量体积比1：（9~11），在所述甲醇水中，甲醇与水的体积比为2：（7~9）。
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