CN103063762A - 一种高效液相色谱法测定西瓜中瓜氨酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本方法公开了一种高效液相色谱法测定西瓜中瓜氨酸含量的方法，包括以下步骤：取粉碎后的西瓜样品加入无水乙醇，振荡提取，提取液离心后，取上清液经滤膜过滤，滤液中加入9-羟基呫吨衍生剂，在酸性条件下衍生，衍生产物经碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。本方法具定量快速准确、基质干扰小、避免假阳性等特点。

Description

一种高效液相色谱法测定西瓜中瓜氨酸含量的方法

技术领域

本发明涉及一种瓜氨酸测定方法，具体涉及一种高效液相色谱法测定西瓜中瓜氨酸含量的方法。

背景技术

瓜氨酸，英文名称Citrulline，因其最初发现于西瓜汁而得名，是一种非蛋白质L-α-氨基酸，它具有肽键形成的能力，但不参与蛋白质的合成。瓜氨酸曾一度被人们认为是尿素循环的中间产物，然而，最近的研究表明，瓜氨酸能广泛应用于医药、食品保健等各个方面，具有良好的药理作用。瓜氨酸可以使人的血管获得松弛，用于增强男性性功能，以及治疗性功能障碍。维护健康的肺功能，提高脑力清晰度，有帮助脑神经细胞具贮藏与调回讯息的功能。

瓜氨酸的测定方法主要包括：分光光度法、酶-比色法、柱前衍生-高效液相色谱法。分光光度法主要是利用瓜氨酸结构的某官能团反应生成有色物质比色测定，由于某些物质具有相似结构，此法特异性较差，易造成假阳性影响实验结果；酶-比色法中，酶可以专一性酶解瓜氨酸，但酶制剂价格昂贵，限制了其在实际检测中的应用；柱前衍生方法，瓜氨酸与特定试剂发生衍生反应后，依靠液相色谱实现与其他物质的分离，方法较为准确可靠。田瑶等(中药新药与临床药理，2012，23(2)：180-183)公开了利用邻苯二甲醛(OPA)作为柱前衍生试剂，反相高效液相色谱测定家兔关节微透析液中精氨酸和瓜氨酸的方法；刘放南等(肠外与肠内营养，2004，11(2)：116-117)公开了将异硫氰酸苯酯(PITC)作为柱前衍生剂，反相高效液相色谱测定血清中瓜氨酸的方法。

本发明建立了一种新的瓜氨酸测定方法，9-羟基呫吨作为柱前衍生剂，采用液相色谱-荧光检测器检测，本方法具有前处理简单、基质干扰小、准确度高等特点，能够满足日常检测工作的需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于选择合适的溶剂，提取西瓜中的瓜氨酸，采用9-羟基呫吨作为衍生剂，酸性条件下进行衍生，降低基质干扰，开发一种新的测定西瓜中瓜氨酸的方法。

本发明所述的的技术问题可通过以下技术方案得以解决：

(1)准确称取1-2g去皮去籽粉碎后的西瓜样品于50mL离心管中，加无水乙醇至10mL，震荡提取20-30min；

(2)提取液在5000-8000r/min条件下离心3-5min，取上清液过0.45μm有机滤膜，得滤液；

(3)取上述滤液0.5-1.0mL于1.5mL进样瓶中，加入0.02mol/L 9-羟基呫吨衍生剂50-200μL，1.5mol/L盐酸25-100μL，使得衍生反应比例按体积比为：试样提取液∶0.02mol/L 9-羟基呫吨∶1.5mol/L盐酸＝10∶2∶1-20∶2∶1，混匀，室温条件下避光反应20-30min；

(4)衍生后的样液采用高效液相色谱法分离检测，外标法定量，计算西瓜中瓜氨酸的含量。

优选高效液相色谱条件：

色谱柱：以碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：乙腈+0.02mol/L乙酸钠水溶液(梯度洗脱，程序见表1)；

流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；

柱温：35℃；

激发波长：213nm，发射波长：308nm。

表1液相色谱梯度洗脱条件

时间/min	乙腈/％	0.02mol/L乙酸钠/％
			0.00	20	80

0.05	20	80
			12.0	50	50
13.0	100	0
			20.0	100	0
22.0	20	80
			25.0	20	80

本发明的有益效果在于，建立了一种新的西瓜中瓜氨酸含量的测定方法，采用一定体积的无水乙醇提取西瓜中的瓜氨酸，降低基质干扰。方法具有基质干扰小、准确度高、有效避免假阳性等特点。

附图说明

图1瓜氨酸标准品衍生产物的高效液相色谱图

图2西瓜样品衍生产物的高效液相色谱图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。

实施例某市售西瓜中瓜氨酸含量的测定

1、分析步骤

称取去皮去籽粉碎后西瓜试样2.00g(精确到0.001g)于50mL离心管中，加无水乙醇至10mL，振荡提取30min，6000r/min离心3min，上清液经0.45μm有机滤膜过滤。取750μL滤液于1.5mL进样瓶中，加入100μL 0.02mol/L 9-羟基呫吨和50μL 1.5mol/L盐酸溶液，室温条件下避光衍生反应30min，待测。

2、标准工作曲线

用将1000μg/mL的瓜氨酸标准储备液逐级稀释得20、100、200、500μg/mL的标准工作液。分别取配制的标准工作液750μL，加入100μL 0.02mol/L9-羟基呫吨溶液和50μL 1.5mol/L盐酸溶液，避光衍生反应30min。按照上述仪器条件测定，所得标准曲线方程为：Y＝13.68X-10.56，相关系数R²＝0.9998。

3、试样测定

经6次平行实验测定，该市售西瓜中瓜氨酸含量平均值为1.27mg/g，相对标准偏差RSD为4.2％。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。

Claims (4)

1.一种高效液相色谱法测定西瓜中瓜氨酸含量的方法，其特征包括如下步骤： 

(1)取1-2g试样于离心管中，加入有机溶剂，室温振荡提取20-30min，离心，取上清液过0.45μm滤膜，得滤液； 

(2)取上述滤液按比例加入0.02mol/L 9-羟基呫吨衍生剂和1.5mol/L盐酸，在酸性条件下衍生，室温条件下避光反应20-30min； 

(3)衍生后的样液经高效液相色谱分离，荧光检测器检测，外标法定量。 

2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述加入有机溶剂为无水乙醇。 

3.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所用的0.02mol/L9-羟基呫吨衍生剂采用无水乙醇为溶剂配制。 

4.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，衍生反应比例按体积比为：试样提取液∶0.02mol/L 9-羟基呫吨衍生剂∶1.5mol/L盐酸为10∶2∶1-20∶2∶1。 

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