CN112697727A - 一种测定复方氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种测定复方氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸含量的方法,步骤为:精密量取复方氨基酸注射液,加水稀释并定容,得供试品储备液;精密量取供试品储备液,加水稀释并定容,摇匀,得供试品溶液;精密称取盐酸半胱氨酸对照品,加水溶解稀释,摇匀,得盐酸半胱氨酸储备液;精密量取盐酸半胱氨酸储备液,然后加入供试品储备液,再加水稀释并定容,摇匀,即得对照品溶液;精密量取相同体积的对照品溶液和供试品溶液,向对照品溶液和供试品溶液中均加入冰醋酸和酸性茚三酮溶液,摇匀后,水浴加热,加热完成后放置在冰水浴中冷却,再加入乙醇,测定对照品和供试品的吸光度值;计算供试品测得浓度,根据供试品测得浓度计算得到盐酸半胱氨酸的含量。
Description
技术领域
本发明涉及药物质量检测技术领域,尤其涉及一种测定复方氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸含量的方法。
背景技术
复方氨基酸注射液(18AA-V)是由18种氨基酸配制而成的灭菌水溶液,主要用于营养不良、低蛋白血症及改善手术后病人的营养状况。复方氨基酸注射液的飞速发展使得临床危重患者得到良好的肠外营养支持,保证了机体的正氮平衡,促进了蛋白质的合成。
复方氨基酸注射液中含有半胱氨酸,半胱氨酸是生物体内常见的氨基酸,也是人体必需的氨基酸之一。
目前检索发现,2020版《中国药典》记载的复方氨基酸注射液中半胱氨酸的检测运用的是氨基酸分析仪,其他用于测定盐酸半胱氨酸的方法一般采用柱前衍生反相高效液相色谱。
经文献检索,成都大学杨蕾等人发布了复方氨基酸注射液(18AA-V)中盐酸半胱氨酸的含量检测,优化了比色法检验复方氨基酸注射液(18AA-V)中盐酸半胱氨酸的含量测定试验条件,从行业检测水平发展情况表明,比色法无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围都不如紫外-分光光度法,在实践过程中,发现比色法并不能有效消除衍生试剂茚三酮对检测结果的干扰,且实验过程中,需配制多个对照品溶液,步骤繁琐,增加了实验人员的工作量。
因此,有必要提供一种科学、有效的测定复方氨基酸注射液(18AA-V)中盐酸半胱氨酸含量的方法。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种测定复方氨基酸注射液(18AA-V)中盐酸半胱氨酸含量的方法,该方法简单有效、快速、准确、重复性好,既可以消除衍生试剂茚三酮的干扰,又能减轻劳动强度。
本发明提供一种测定复方氨基酸注射液(18AA-V)中盐酸半胱氨酸含量的方法,包括以下步骤:
S1,制备供试品储备液:精密量取复方氨基酸注射液适量,加水稀释并定容,摇匀,即得供试品储备液;
S2,制备供试品溶液:精密量取步骤S1的供试品储备液适量,加水稀释并定容,摇匀,即得供试品溶液;
S3,制备盐酸半胱氨酸储备液:精密称取盐酸半胱氨酸对照品适量,加水溶解稀释,摇匀,得到盐酸半胱氨酸储备液;
S4,制备对照品溶液:精密量取步骤S3的盐酸半胱氨酸储备液适量,然后加入相同体积的步骤S1的供试品储备液,再加水稀释并定容,摇匀,即得对照品溶液;
S5,测定:精密量取相同体积的对照品溶液和供试品溶液,向对照品溶液和供试品溶液中均加入冰醋酸和酸性茚三酮溶液,摇匀后,水浴加热,加热完成后放置在冰水浴中冷却,再加入乙醇,利用紫外-可见分光光度计测定对照品溶液和供试品溶液的吸光度值;酸性茚三酮溶液的制备过程为:称取茚三酮,加入冰醋酸与盐酸,超声溶解,即得;
S6,计算盐酸半胱氨酸的含量:先利用对照品溶液和供试品溶液的吸光度值计算得到供试品测得浓度,然后根据供试品测得浓度计算得到盐酸半胱氨酸的含量。
进一步地,步骤S1中,盐酸半胱氨酸储备液的浓度为0.7mg/mL。
进一步地,步骤S5中,水浴加热的温度为85-95℃,水浴加热的时间为4.5-5.5min,测定波长为554-564nm。
进一步地,步骤S6中,供试品测得浓度的计算公式为:
式中,C供试品表示供试品测得浓度,μg/mL;C加标表示加标浓度,加标浓度的计算公式为:Cc表示盐酸半胱氨酸储备液的浓度,mg/mL,n表示供试品储备液稀释为供试品溶液的稀释倍数;A对照品表示对照品溶液的吸光度值;A供试品表示供试品溶液的吸光度值。
进一步地,步骤S6中,盐酸半胱氨酸的含量的计算公式为:
式中,mC表示盐酸半胱氨酸的含量,%,n′表示复方氨基酸注射液(18AA-V)稀释为供试品储备液的稀释倍数。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是:
1)与采用氨基酸分析仪的方法相比,本发明提供的方法采用紫外-分光光度法(中国药典2020年版四部通则0401)对复方氨基酸注射液(18AA-V)中盐酸半胱氨酸进行测定,该法对设备要求不高,操作简单,专属性和准确度较佳,且检测成本低,更加适用于常规的盐酸半胱氨酸的检测;
2)与比色法检验复方氨基酸注射液(18AA-V)中盐酸半胱氨酸的含量测定方法相比,本发明提供的方法优化了样品配制过程,向盐酸半胱氨酸储备液中加入供试品储备液得到对照品溶液,进一步增加了结果准确性,对茚三酮的耐用性更好,消除了衍生试剂茚三酮对检测过程中盐酸半胱氨酸含量测定的干扰。
附图说明
图1是空白溶液水的紫外吸收光谱图。
图2是对照品溶液的紫外吸收光谱图。
图3是供试品溶液的紫外吸收光谱图。
图4是盐酸半胱氨酸的线性图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
实施例1:
本发明的实施例1提供了一种利用紫外-分光光度法测定复方氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸含量的方法,包括以下步骤:
步骤S1,制备供试品储备液:精密量取5mL复方氨基酸注射液(18AA-V)(来自武汉久安药业有限公司试制样品)加入10mL量瓶A中,加水稀释至10mL,摇匀,即得供试品储备液;
步骤S2,制备供试品溶液:精密量取1mL步骤S1的供试品储备液加入10mL量瓶B中,加水稀释至10mL,摇匀,即得供试品溶液;
步骤S3,制备盐酸半胱氨酸储备液:精密称取35mg盐酸半胱氨酸对照品(来自SIGMA)加入50mL量瓶中,加水稀释至50mL,摇匀,得到浓度为0.7mg/mL的盐酸半胱氨酸储备液;
步骤S4,制备对照品溶液:精密量取1mL步骤S3的盐酸半胱氨酸储备液加入10mL量瓶C中,然后精密量取1mL步骤S1的供试品储备液加入该10mL量瓶C中,再加水稀释至10mL,摇匀,即得对照品溶液;
步骤S5,测定:精密量取2mL对照品溶液加入样品瓶A中,精密量取2mL供试品溶液加入样品瓶B中,精密量取2mL水加入样品瓶C中,向样品瓶A、样品瓶B和样品瓶C中均加入2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液(酸性茚三酮溶液的制备过程为:称取茚三酮1.5g,加冰醋酸36mL与盐酸24mL,超声溶解,即得),摇匀后,90℃水浴加热5min,加热完成后立即放置在冰水浴中冷却,冷却10min后,向样品瓶A、样品瓶B、样品瓶C中分别加入20mL乙醇,摇匀,利用紫外-可见分光光度计在559nm下测定样品瓶A内溶液、样品瓶B内溶液、样品瓶C内溶液的吸光度,测定在2min内完成,即得到对照品溶液和供试品溶液的吸光度值;空白溶液水的紫外吸收光谱图见图1,对照品溶液的紫外吸收光谱图见图2,供试品溶液的紫外吸收光谱图见图3;
步骤S6,计算盐酸半胱氨酸的含量:先利用对照品溶液和供试品溶液的吸光度值计算得到供试品测得浓度,然后根据供试品测得浓度计算得到盐酸半胱氨酸的含量;供试品测得浓度的计算公式为:
式中,C供试品表示供试品测得浓度,μg/mL;C加标表示加标浓度,加标浓度的计算公式为:Cc表示盐酸半胱氨酸储备液的浓度,mg/mL,表示供试品储备液稀释为供试品溶液的稀释倍数,实施例1中,n的值为10;A对照品表示对照品溶液的吸光度值;A供试品表示供试品溶液的吸光度值;
盐酸半胱氨酸的含量的计算公式为:
下面结合分析试验对上述实施例1提供的检测方法进行分析验证。
一、精密度试验
按照实施例1中步骤S1-S2的方法制备1份供试品溶液,利用紫外-可见分光光度计在559nm下测定吸光度值,连续6次进样,测量结果见表1。
表1:进样精密度测定结果
由表1可知,对样品连续进样6次,含量RSD为0.22%,说明进样精密度良好。
二、线性试验
按照实施例1中步骤S3的方法制备得到浓度为0.7mg/mL的盐酸半胱氨酸储备液,量取盐酸半胱氨酸储备液1.5mL、2mL、3mL、4.5mL、6mL分别置于五个10mL量瓶中,分别加水稀释至10mL,摇匀,然后从该五个量瓶中分别精密量取出1mL溶液置五个10mL量瓶中,再分别向五个量瓶中精密加入1mL实施例1中步骤S1制得的供试品储备液,加水定容至10mL,摇匀,得到稀释50%~200%各系列浓度的溶液,利用紫外-分光光度计在559nm下测定不同盐酸半胱氨酸浓度的溶液的吸光度值,进样各一次,以添加的盐酸半胱氨酸浓度(μg/ml)及其吸光度值作线性方程,结果见图4和表2。
表2:盐酸半胱氨酸-线性测定结果
由表2可知,盐酸半胱氨酸在浓度10.569μg/ml~42.276μg/ml范围内,相关系数r=0.9997,线性关系良好。
三、重复性实验
按照实施例1中步骤S1-S2的方法平行制备6份供试品溶液,再按照实施例1中步骤S3-S6利用紫外-可见分光光度计在559nm下测定6份供试品溶液的吸光度值,并计算盐酸半胱氨酸的含量,再以盐酸半胱氨酸的含量计算RSD%,应不大于2.0%。结果如表3所示。
表3:盐酸半胱氨酸-重复性
由表3可知,对同批次样品,平行制备6份样品,含量RSD为0.31%,重复性良好。
四、准确度实验
按照实施例1中步骤S3的方法制备盐酸半胱氨酸储备液,然后精密量取盐酸半胱氨酸储备液2mL、3mL、4.5mL分别置于三个10mL量瓶中,加水稀释至10mL,摇匀,然后从该三个10mL量瓶中分别精密量取出1mL溶液置于10mL量瓶中,再分别精密加入1mL实施例1中步骤S1制得的供试品贮备液,加水定容至10mL,摇匀,每个浓度平行制备3份,不同浓度的样品分别标记为准确度1、准确度2、准确度3。利用紫外-可见分光光度计在559nm下测定吸光度值,各进样1次,计算回收率,回收率的计算公式为:式中,R表示回收率,m测得表示盐酸半胱氨酸测得量,m加入表示盐酸半胱氨酸加入量。
回收率的计算结果见表4。
表4:盐酸半胱氨酸含量-准确度测得结果
由表4可知,盐酸半胱氨酸的六份回收率溶液的平均回收率为99.80%,RSD值为2.43%,符合要求,该方法准确度良好。
五、耐用性试验
按照实施例1中的步骤S1-S6,改变步骤S5中的水浴温度、水浴时间、测定波长和茚三酮的购买厂家,其中,改变水浴温度为85℃、95℃时,其他试验条件与实施例1相同;改变水浴时间为4.5min、5.5min时,其他试验条件与实施例1相同;改变测定波长为554nm、564nm时,其他试验条件与实施例1相同;改变茚三酮分别购自郑州阿尔法和国药集团时,其他试验条件与实施例1相同;考察调整试验条件后对盐酸半胱氨酸含量的影响,结果如表5所示。
表5:耐用性考察结果
由表5可知,盐酸半胱氨酸含量的RSD≤5.0%,符合要求,水浴时间、水浴温度、检测波长、同厂家的茚三酮溶液条件的微小变化对盐酸半胱氨酸含量的测定影响不大,该方法耐用性良好。
对比例1:
对比例1为按照比色法测定盐酸半胱氨酸的含量,具体步骤如下:
精密称取盐酸半胱氨酸对照品35mg置50mL量瓶中,加水溶解并稀释至50mL,摇匀,得到浓度约为0.7mg/mL的盐酸半胱氨酸储备液;精密量取盐酸半胱氨酸储备液2mL、3mL、4mL置25mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,分别作为对照品溶液(1)、对照品溶液(2)和对照品溶液(3);
精密量取5mL复方氨基酸注射液18AA-V(来自武汉久安药业有限公司试制样品,批次为19041011-1)置25mL量瓶中,加水稀释至25mL,摇匀,作为供试品溶液;
精密量取对照品溶液(1)、对照品溶液(2)和对照品溶液(3)各1mL置25mL具塞试管中,加入冰醋酸及酸性茚三酮溶液(酸性茚三酮溶液的制备过程为:称取茚三酮1.5g,加冰醋酸36mL与盐酸24mL,超声溶解,即得)各2mL,摇匀,90℃水浴加热5min,立即放冷至室温。加入乙醇20mL,摇匀。以水1mL同样操作作为空白溶液,利用紫外-可见分光光度计在559nm下测定各溶液吸光度值。以吸光度对盐酸半胱氨酸的浓度进行线性回归,得回归方程,相关系数不得低于0.999。精密量取供试品溶液1mL,同法操作,按标准曲线法计算,即得到盐酸半胱氨酸的含量。
分别选用三家不同厂家(阿拉丁、阿尔法、国药集团)的茚三酮按照上述对比例1的步骤和实施例1的步骤对复方氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸进行测定,结果见表6。
表6:实施例1和对比例1的测定结果
从表6可知,按照实施例1的测定方法,使用不同厂家的茚三酮对测定盐酸半胱氨酸含量的结果影响不大,差异较小;而按照对比例1的测定方法,使用不同厂家的茚三酮对测定盐酸半胱氨酸含量的结果影响明显,差异较大,说明本实施例1提供的方法对茚三酮的耐用性较好。
在不冲突的情况下,本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种测定复方氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸含量的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,制备供试品储备液:精密量取复方氨基酸注射液,加水稀释并定容,摇匀,即得供试品储备液;
S2,制备供试品溶液:精密量取步骤S1的供试品储备液,加水稀释并定容,摇匀,即得供试品溶液;
S3,制备盐酸半胱氨酸储备液:精密称取盐酸半胱氨酸对照品,加水溶解稀释,摇匀,得到盐酸半胱氨酸储备液;
S4,制备对照品溶液:精密量取步骤S3的盐酸半胱氨酸储备液,然后加入相同体积的步骤S1的供试品储备液,再加水稀释并定容,摇匀,即得对照品溶液;
S5,测定:精密量取相同体积的对照品溶液和供试品溶液,向对照品溶液和供试品溶液中均加入冰醋酸和酸性茚三酮溶液,摇匀后,水浴加热,加热完成后放置在冰水浴中冷却,再加入乙醇,利用紫外-可见分光光度计测定对照品溶液和供试品溶液的吸光度值;
S6,计算盐酸半胱氨酸的含量:利用对照品溶液和供试品溶液的吸光度值计算得到供试品测得浓度,然后根据供试品测得浓度计算得到盐酸半胱氨酸的含量。
2.根据权利要求1所述的测定复方氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸含量的方法,其特征在于,步骤S1中,盐酸半胱氨酸储备液的浓度为0.7mg/mL。
3.根据权利要求1所述的测定复方氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸含量的方法,其特征在于,步骤S5中,水浴加热的温度为85-95℃,水浴加热的时间为4.5-5.5min,测定波长为554-564nm。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210423 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |