CN113024419A - 一种氧化三甲胺和甜菜碱的提取和检测方法 - Google Patents

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李彤
贺明帅
王跃飞
柴欣
张鹏
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Abstract

本发明提供了一种氧化三甲胺和甜菜碱的提取和检测方法，采用选择性固相萃取柱(SPE柱)分离氧化三甲胺和甜菜碱与葡萄糖、牛磺酸等中性或酸性代谢物进行样品制备，基于核磁共振技术(1H‑NMR)对生物和食物中氧化三甲胺和甜菜碱进行含量测定，检测方法具有简便易行、稳定性好、精密度高、重现性好、专属性强等特点，在全面检测生物和食物中的氧化三甲胺和甜菜碱及预防心脑血管疾病具有广阔的应用前景。

Description

一种氧化三甲胺和甜菜碱的提取和检测方法
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其是涉及一种氧化三甲胺和甜菜碱的提取和检测方法。
背景技术
氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide,TMAO)是三甲胺(TMA)的氧化产物，人体中的胆碱、左旋肉碱和甜菜碱等生物碱在肠道菌类的作用下转化为TMA，其中鸡蛋、牛奶、肝脏、家禽和鱼类等被认为是胆碱和甜菜碱的主要饮食来源。TMA在肠道中被有效吸收，并于肝脏中在黄素单加氧酶3(FMO3)的作用下转化为TMAO，后经肾脏代谢随尿液排出。高水平的TMAO与多种慢性疾病具有临床相关性，包括炎症、动脉粥样硬化、心血管疾病、代谢综合征和神经系统疾病。此外，膳食甜菜碱被发现与非裔美国人参与者的冠心病事件有关。因此，有必要建立一种准确、高效的测定TMAO和甜菜碱的方法。
关于生物和食物样品中TMAO和甜菜碱的定量方法已有报道，但有一定的局限性。例如，基于液相色谱-串联质谱(LC-MS)测定血浆中的TMAO和甜菜碱需要同位素标记标准物(TMAO-d9和甜菜碱-d11)，其价格昂贵。质子核磁共振(1H NMR)技术对于微量的生物样品检测限低、灵敏度高，而且具有可回收性。然而，生物和食物样品通常含有各种代谢物，1H-NMR谱中葡萄糖和牛磺酸的质子信号与TMAO和甜菜碱的质子信号在δ3.25-3.30的区间内有重叠。尽管TMAO信号可以通过调节pH值从葡萄糖中分离出来，但牛磺酸信号的干扰仍然存在。因此，有必要在核磁共振分析前对样品处理条件进行优化，以同时定量检测TMAO和甜菜碱。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种氧化三甲胺和甜菜碱的提取方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种基于上述氧化三甲胺和甜菜碱提取方法的氧化三甲胺和甜菜碱的检测方法。
本发明采用的技术方案是：
一种氧化三甲胺和甜菜碱的提取方法，采用固相萃取柱(SPE柱)进行样品制备，具体步骤为：取对照品溶液和样品溶液过SPE小柱(HyperSepTM Retain CX)分3个梯度洗脱，分别为2％甲酸水、甲醇、5％氨水甲醇溶液，每个梯度洗脱两个柱体积，收集5％氨水甲醇梯度的洗脱液，即得。
一种基于上述氧化三甲胺和甜菜碱提取方法的氧化三甲胺和甜菜碱的检测方法，将5％氨水甲醇梯度的洗脱液氮吹后加500μL含有0.03mM TSP-d4的D2O复溶，将所述供试品溶液转移至5mm核磁管中，直接基于核磁共振技术(1H-NMR)对生物和食物中氧化三甲胺和甜菜碱进行含量测定，具体步骤为：
(1)样品检测
将核磁管置于核磁共振仪中，采用Noesygppr1d脉冲序列进行测定：扫描(NS)32次，空扫描(DS)4次，脉冲宽度(P1)为9.23μs，采集时间(AQ)为3.41s，弛豫延迟(D1)为13s，谱宽(SWH)为9615Hz；采用MestReNova软件对得到的1H-NMR指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、定标，并对其信号进行归属；
(2)含量测定
按照上述方法制备获得5％氨水甲醇梯度的洗脱液，按照步骤(1)所述实验条件进行图谱采集，建立氧化三甲胺和甜菜碱的标准曲线并进行方法学验证，根据样品中氧化三甲胺和甜菜碱的积分面积计算其含量。
优选的，上述氧化三甲胺和甜菜碱的检测方法，所述步骤(1)中氧化三甲胺和甜菜碱的信号进行归属如下：
Figure BDA0002926460750000031
优选的，上述氧化三甲胺和甜菜碱的检测方法，所述步骤(2)中氧化三甲胺和甜菜碱所对应的标准曲线分别为y＝30.66x-0.3023和y＝29.38x-0.4606，其中x为峰面积，y为浓度(μM)。
本发明的有益效果是：
所述氧化三甲胺和甜菜碱的提取和检测方法，采用选择性固相萃取柱(SPE柱)分离氧化三甲胺和甜菜碱与葡萄糖、牛磺酸等中性或酸性代谢物进行样品制备，基于核磁共振技术(1H-NMR)对生物和食物中氧化三甲胺和甜菜碱进行含量测定，检测方法具有简便易行、稳定性好、精密度高、重现性好、专属性强等特点，在全面检测生物和食物中的氧化三甲胺和甜菜碱及预防心脑血管疾病具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为生物样品和标准溶液的1H-NMR谱，(A)在δ0至8.0ppm范围内生物样品的光谱；(B)在δ3.1至3.9ppm范围内生物样品的放大光谱；(C)在δ0至8.0ppm范围内标准溶液的光谱；(D)在δ3.1至3.9ppm范围内标准溶液的放大光谱；(E)在δ0至8.0ppm标准溶液经选择性固相萃取柱处理后的最终洗脱液的光谱；(F)在δ3.1至3.9ppm范围内标准溶液经选择性固相萃取柱处理后的最终洗脱液的放大光谱。
图2为不同样品中氧化三甲胺和甜菜碱的含量测定结果。(A)小鼠生物样品中氧化三甲胺浓度(n＝3或5)；(B)大鼠生物样品中氧化三甲胺浓度(n＝8)；(C)食物样品中氧化三甲胺含量(n＝9)；(D)小鼠生物样品中甜菜碱含量(n＝3或5)；(E)大鼠生物样品中甜菜碱含量(n＝8)；(F)食物样品中甜菜碱含量(n＝9)。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
实施例1
对照品溶液1H-NMR谱的建立
1.1仪器与试药
超导核磁共振波谱仪(Bruker 600MHz，德国Bruker公司),5mm标准核磁样品管(美国NORELL公司)，十万分之一电子天平(AX-205，瑞士Mettler-Toledo公司)，SPE固相萃取小柱(HyperSep Retain CX60mg 3mL，ThermoFisher Scientiffic)。
氧化三甲胺(纯度≥98％，货号S25980，上海源叶生物科技有限公司)，甜菜碱(纯度≥98％，上海源业生物科技有限公司)，氧化氘(D2O，氘代度>99.9％，Cambridge IsotopeLabortories；Cambridge,FL,USA)，3-(三甲基硅基)-丙酸-2,2,3,3-d4酸钠盐(TSP，氘代度>98％，Cambridge Isotope Labortories，Cambridge,FL，USA)，色谱级甲醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO,USA)。
1.2样品制备
精密称取适量氧化三甲胺和甜菜碱标准品，溶解于1mL水中，即得标准溶液。SPE小柱(HyperSep Retain CX)先用2mL甲醇活化，然后用2mL2％甲酸水预处理。将标准溶液置于SPE柱上，分别用2％甲酸水溶液、甲醇和5％氨水甲醇溶液依次洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，收集5％氨水甲醇梯度的洗脱液，氮气下干燥，在含有0.03mM TSP-d4的500μL D2O中复溶，即得对照品溶液，将所述对照品溶液可转移至5mm核磁管中，直接用1H-NMR测试。
1.3 1H-NMR图谱的测定及分析
将核磁管置于核磁共振仪中，采用Noesygppr1d脉冲序列进行测定。扫描(NS)32次，空扫描(DS)4次，脉冲宽度(P1)为9.23μs，采集时间(AQ)为3.41s，弛豫延迟(D1)为13s，谱宽(SWH)为9615Hz。采用MestReNova软件对得到的1H-NMR指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、定标，并对其信号进行归属。
1.4方法学考察
线性关系考察：精密称取氧化三甲胺和甜菜碱对照品，用甲醇溶解后逐级稀释，氧化三甲胺分别配制成5.21μM、52.1μM、0.521mM、5.21mM和52.1mM，甜菜碱分别配制成20.6μM、0.206mM、2.06mM、20.6mM和206.0mM，再分别取适量装入核磁管中，按“1.3”项下条件采集图谱，以对照品摩尔浓度(μM)为横坐标(y)，定量峰的面积为纵坐标(x)进行线性回归。
精密度试验：取对照品溶液，按上述1H-NMR测试条件下连续测定6次，记录积分面积，计算RSD值。
重复性试验：取对照品适量，共6份，按“1.2”项下方法制备样品溶液，按上述1H-NMR测试条件进行测定，记录积分面积，计算RSD值。
稳定性试验：取同一对照品溶液分别在0，2，4，8，12，18，24h进样测定，记录积分面积，计算RSD值。
加样回收率试验：取对照品溶液适量，精密加入氧化三甲胺标准品适量，计算回收率。
线性回归方程分别为y＝30.66x-0.3023，R2＝1(氧化三甲胺)和y＝29.38x-0.4606，R2＝1(甜菜碱)，结果表明，氧化三甲胺在5.21μM至52.1mM，甜菜碱在20.60μM至206.0mM范围内，与定量峰面积线性关系良好。该方法最低检测限(LOD)为1.00μM(氧化三甲胺)及1.52μM(甜菜碱)，最低定量限(LOQ)为3.02μM(氧化三甲胺)及4.60μM(甜菜碱)。通过加样回收率验证该方法的准确性，回收率均符合要求。
与液质联用方法比较，两种方法无显著性差异。
实验结果见表1。
表1定量核磁方法学考察
Figure BDA0002926460750000071
实施例2
小鼠血清样品的测定
1.1仪器与试药
超导核磁共振波谱仪(Bruker 600MHz，德国Bruker公司),5mm标准核磁样品管(美国NORELL公司)，十万分之一电子天平(AX-205，瑞士Mettler-Toledo公司)，SPE固相萃取小柱(HyperSep Retain CX 60mg 3mL，ThermoFisher Scientiffic)。
氧化三甲胺(纯度≥98％，货号S25980，上海源叶生物科技有限公司)，甜菜碱(纯度≥98％，上海源业生物科技有限公司)，氧化氘(D2O，氘代度>99.9％，Cambridge IsotopeLabortories；Cambridge,FL,USA)，3-(三甲基硅基)-丙酸-2,2,3,3-d4酸钠盐(TSP，氘代度>98％，Cambridge Isotope Labortories，Cambridge,FL，USA)，色谱级甲醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO,USA)。
1.2动物
所有动物程序和试验均按照国家法规和天津中医药大学实验动物中心的地方指南进行。C57BL/6J雌雄小鼠(6周龄)购自北京维通利华实验动物科技有限公司(中国北京)。所有动物都保持在控制温度(23±2℃)，光照/暗照时间为12小时，并在一周内随意接受标准的食物和水。将小鼠随机分为对照组和氧化三甲胺喂养组，包括雄性对照组(M-C，注射生理盐水，n＝5)、雄性模型组(M-M，注射0.2mg/mL氧化三甲胺水溶液，n＝5)、雌性对照组(F-C，注射生理盐水，n＝3)和雌性模型组(F-M，注射0.2mg/mL氧化三甲胺水溶液，n＝3)。氧化三甲胺剂量为2mg/kg/d，持续干预7天。取材前禁食一夜，第二天采集血样，在无抗凝剂的情况下放在冰上20分钟，然后在4℃、5000rpm下离心10分钟。血清样品在液氮中快速冷冻，然后在-80℃下储存以供分析。
1.3样品制备
精密量取200μL小鼠血清样品，过SPE小柱(HyperSep Retain CX)分3个梯度洗脱(2％甲酸水、甲醇、5％氨水甲醇溶液)，每个梯度洗脱两个柱体积，收集5％氨水甲醇梯度的洗脱液，氮吹后加含有0.03mM TSP-d4的500μL D2O复溶，得供试品溶液，将所述供试品溶液可转移至5mm核磁管中，直接用1H-NMR测试。
1.4样品检测
将核磁管置于核磁共振仪中，采用Noesygppr1d脉冲序列进行测定。扫描(NS)32次，空扫描(DS)4次，脉冲宽度(P1)为9.23μs，采集时间(AQ)为3.41s，弛豫延迟(D1)为13s，谱宽(SWH)为9615Hz。采用MestReNova软件对得到的1H-NMR指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、定标，并对其信号进行归属。
1.5小鼠血清中氧化三甲胺和甜菜碱的含量测定
按照“1.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.4”项下条件进行测定。记录样品1HNMR图谱，计算含量。结果见表2。
表2小鼠血清样品含量测定
分组 氧化三甲胺(μM/L) 甜菜碱(μM/L)
F-C 18.0100±1.8100 30.6300±2.0810
F-M 30.7100±2.4520 28.9900±2.3840
M-C 6.0390±0.5881 21.8200±1.8620
M-M 8.9100±0.8222 32.0300±2.4000
实施例3
大鼠血清样品的测定
1.1仪器与试药
超导核磁共振波谱仪(Bruker 600MHz，德国Bruker公司),5mm标准核磁样品管(美国NORELL公司)，十万分之一电子天平(AX-205，瑞士Mettler-Toledo公司)，SPE固相萃取小柱(HyperSep Retain CX60mg 3mL，ThermoFisher Scientiffic)。
氧化三甲胺(纯度≥98％，货号S25980，上海源叶生物科技有限公司)，甜菜碱(纯度≥98％，上海源业生物科技有限公司)，氧化氘(D2O，氘代度>99.9％，Cambridge IsotopeLabortories；Cambridge,FL,USA)，3-(三甲基硅基)-丙酸-2,2,3,3-d4酸钠盐(TSP，氘代度>98％，Cambridge Isotope Labortories，Cambridge,FL，USA)，色谱级甲醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO,USA)。
1.2动物
所有动物程序和试验均按照国家法规和天津中医药大学实验动物中心的地方指南进行。雄性Wistar大鼠(6-8周龄)购自国家食品药品监督管理局(中国北京)。所有动物都保持在控制温度(23±2℃)，光照/暗照时间为12小时，并在一周内随意接受标准的食物和水。将大鼠随机分为两组，每组8只，其中对照组(C)给予水，模型组(M)随意给予15％果糖水(W/V)，饲养周期为8周。取材前禁食一夜，第二天采集血样，在无抗凝剂的情况下放在冰上20分钟，然后在4℃、5000rpm下离心10分钟。血清样品在液氮中快速冷冻，然后在-80℃下储存以供分析。
1.3样品制备
精密量取200μL大鼠血清样品，过SPE小柱(HyperSep Retain CX)分3个梯度洗脱(2％甲酸水、甲醇、5％氨水甲醇溶液)，每个梯度洗脱两个柱体积，收集5％氨水甲醇梯度的洗脱液，氮吹后加含有0.03mM TSP-d4的500μL D2O复溶，得供试品溶液，将所述供试品溶液可转移至5mm核磁管中，直接用1H-NMR测试。
1.4样品检测
将核磁管置于核磁共振仪中，采用Noesygppr1d脉冲序列进行测定。扫描(NS)32次，空扫描(DS)4次，脉冲宽度(P1)为9.23μs，采集时间(AQ)为3.41s，弛豫延迟(D1)为13s，谱宽(SWH)为9615Hz。采用MestReNova软件对得到的1H-NMR指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、定标，并对其信号进行归属。
1.5大鼠血清中氧化三甲胺和甜菜碱的含量测定
按照“1.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.4”项下条件进行测定。记录样品1HNMR图谱，计算含量。结果见表3。
表3大鼠血清样品含量测定
分组 氧化三甲胺(μM/L) 甜菜碱(μM/L)
C 6.4440±0.1168 36.1600±8.7870
M 7.3340±0.1584 41.9600±10.6500
实施例4
食物样品的测定
1.1仪器与试药
超导核磁共振波谱仪(Bruker 600MHz，德国Bruker公司),5mm标准核磁样品管(美国NORELL公司)，十万分之一电子天平(AX-205，瑞士Mettler-Toledo公司)，SPE固相萃取小柱(HyperSep Retain CX60mg 3mL，ThermoFisher Scientiffic)。
氧化三甲胺(纯度≥98％，货号S25980，上海源叶生物科技有限公司)，甜菜碱(纯度≥98％，上海源业生物科技有限公司)，氧化氘(D2O，氘代度>99.9％，Cambridge IsotopeLabortories；Cambridge,FL,USA)，3-(三甲基硅基)-丙酸-2,2,3,3-d4酸钠盐(TSP，氘代度>98％，Cambridge Isotope Labortories，Cambridge,FL，USA)，色谱级甲醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO,USA)。鸡蛋、带鱼肉、牛奶和猪肉样品购买于当地超市。
1.2样品制备
精密称取100mg食物样品加入800μL预冷甲醇/水(2:1)并在冰上均匀化。在4℃下，16000rpm离心10min后得上清液。将食物样品的上清液置于SPE柱上，用2％甲酸水溶液、甲醇和5％氨水甲醇溶液依次洗脱,每个梯度洗脱两个柱体积，收集5％氨水甲醇梯度的洗脱液，氮吹后加含有0.03mM TSP-d4的500μL D2O复溶，得供试品溶液，将所述供试品溶液可转移至5mm核磁管中，直接用1H-NMR测试。
1.3样品检测
将核磁管置于核磁共振仪中，采用Noesygppr1d脉冲序列进行测定。扫描(NS)32次，空扫描(DS)4次，脉冲宽度(P1)为9.23μs，采集时间(AQ)为3.41s，弛豫延迟(D1)为13s，谱宽(SWH)为9615Hz。采用MestReNova软件对得到的1H-NMR指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、定标，并对其信号进行归属。
1.4食物样品中氧化三甲胺和甜菜碱的含量测定
按照“1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3”项下条件进行测定。记录样品1HNMR图谱，计算含量。结果见表4。
表4食物样品含量测定
类型 氧化三甲胺(mg/g) 甜菜碱(mg/g)
鸡蛋 0.0033±0.0004 0.0115±0.0015
鱼类 1.0450±0.0156 0.0575±0.0028
牛奶 / 0.0042±0.0008
猪肉 / 0.0322±0.0032
综上，上述生物和食物中氧化三甲胺和甜菜碱的制备和检测方法，由于1H NMR谱中葡萄糖和牛磺酸的质子信号与氧化三甲胺和甜菜碱的质子信号在δ3.25-3.30的区间内有重叠，故采用SPE柱分别用2％甲酸水、甲醇和5％氨水甲醇溶液进行洗脱，从而消除干扰信号以同时定量氧化三甲胺和甜菜碱。本发明所述方法可以有效解决生物和食物样品中氧化三甲胺和甜菜碱的定量分析问题，所述方法简便易行、稳定性好、精密度高、重现性好、专属性强，在全面检测生物和食物中的氧化三甲胺和甜菜碱及预防心脑血管疾病具有广阔的应用前景。
以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种氧化三甲胺和甜菜碱的提取方法，其特征在于：采用固相萃取柱SPE柱进行样品制备，具体步骤为：取对照品溶液和样品溶液过SPE小柱分3个梯度洗脱，分别为2％甲酸水、甲醇、5％氨水甲醇溶液，每个梯度洗脱两个柱体积，收集5％氨水甲醇梯度的洗脱液，即得。
2.一种基于权利要求1所述氧化三甲胺和甜菜碱提取方法的氧化三甲胺和甜菜碱的检测方法，其特征在于：将5％氨水甲醇梯度的洗脱液氮吹后加500μL含有0.03mM TSP-d4的D2O复溶，将供试品溶液转移至5mm核磁管中，直接基于核磁共振技术对生物和食物中氧化三甲胺和甜菜碱进行含量测定，具体步骤为：
(1)样品检测
将核磁管置于核磁共振仪中，采用Noesygppr1d脉冲序列进行测定：扫描32次，空扫描4次，脉冲宽度为9.23μs，采集时间为3.41s，弛豫延迟为13s，谱宽为9615Hz；采用MestReNova软件对得到的1H-NMR指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、定标，并对其信号进行归属；
(2)含量测定
按照上述方法制备获得5％氨水甲醇梯度的洗脱液，按照步骤(1)的实验条件进行图谱采集，建立氧化三甲胺和甜菜碱的标准曲线并进行方法学验证，根据样品中氧化三甲胺和甜菜碱的积分面积计算其含量。
3.根据权利要求2所述的氧化三甲胺和甜菜碱的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中氧化三甲胺和甜菜碱的信号进行归属如下：
编号 化合物 <sup>1</sup>H(δ) 归属依据 1 氧化三甲胺 3.29(9H,s) <sup>1</sup>H 2 甜菜碱 3.28(9H,s)3.92(2H,s) <sup>1</sup>H
。
4.根据权利要求2所述的氧化三甲胺和甜菜碱的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中氧化三甲胺和甜菜碱所对应的标准曲线分别为y＝30.66x-0.3023和y＝29.38x-0.4606，其中x为峰面积，y为浓度μM。
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