CN113698309B - 一种从牛肝菌中提取分离甜菜碱脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法，包括：步骤(1)、牛肝菌干燥后粉碎，得到牛肝菌粉末，以丙酮为提取试剂，浸泡过夜，过滤除去滤渣，得到丙酮提取液；丙酮提取液减压蒸馏除去溶剂，得到粗提物；步骤(2)、粗提物用水分散，依次加入石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物；步骤(3)、将乙酸乙酯萃取物用丙酮溶解，过氨基固相萃取柱，依次以己烷、氯仿、乙酸乙酯进行洗脱，分别收集己烷洗脱液、氯仿洗脱液、乙酸乙酯洗脱液；氯仿洗脱液、乙酸乙酯洗脱液进行减压浓缩，分别得到以DGTS和DGCC为主的氯仿洗脱物，以LDGTS和DGTS为主的乙酸乙酯洗脱物，甜菜碱脂纯度大于99％。
Description
技术领域
本发明属于提取分离领域，具体涉及一种从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法。
背景技术
甜菜碱脂是一类不含磷的甘油脂类，广泛存在于藻类、苔藓植物、真菌和一些简单的原生动物和光合细菌中。海藻中已知的甜菜碱脂有三种不同类型，分别为：1,2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸[1,2-diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N-trimethyl)homoserine,DGTS]、1,2-二酰基甘油-O-2'-(N,N,N-三甲基)-β-丙氨酸[1,2-diacylglyceryl-O-2'-(N,N,N-trimethyl)-β-alanine,DGTA]以及1,2-二酰基甘油-3-O-(羧羟甲基)胆碱[1,2-diacylglyceryl-3-O-(N-hydroxymethyl)choline,DGCC]。
甜菜碱脂可作为一种生物标记物，与微藻的生长和耐盐性有关。此外，有研究发现甜菜碱脂具有抗炎活性，可以作为潜在的抗炎剂来源，为医药、保健等产品的开发提供了新思路。
甜菜碱脂可以通过传统的脂质分析技术从藻类细胞或植物材料中提取。传统分离甜菜碱脂的方法有二维薄层色谱法，其溶剂体系经过了多次发展和改善，一般采用氯仿、甲醇等有机溶剂。该方法对甜菜碱脂的典型分离有过很多报道，但是操作繁琐，所得产物含量不高。
牛肝菌是伞菌目牛肝菌科大型真菌，因其肉质肥厚，极似牛肝而得名，中国牛肝菌种质资源非常丰富，主要分布在云、贵、滇、川、粤等地区，种类多达390种以上，其中199种是可食用的。牛肝菌不仅是名贵稀有的野生食用菌，具有很好的食用价值，同时也具有一定的药用功效，如增强免疫力、改善机体微循环等。牛肝菌中的主要化学成分有萜类、甾体、酚类、多糖和生物碱等，除此之外，还有大量的甜菜碱脂。由于牛肝菌成分复杂，其中甜菜碱脂的纯化就变得十分困难，而且从真菌中提取甜菜碱脂的报道较少。因此，亟需一种能够从真菌中提取分离得到高纯度甜菜碱脂，且操作简便的方法。
发明内容
分别对红腊菇(Laccaria laccata)、鸡枞(Termitomyces eurrhizus)、松茸(Tricholoma matsutake)、美味牛肝菌(Boletus edulis)、鸡油菌(Canthar-elluscibarius Fr.)、干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)、虎掌菌(Sarcodon aspratum)7种云南可食用真菌进行筛选，根据筛选结果并结合成本，确定牛肝菌中作为提取分离甜菜碱脂的原料。本发明的目的在于提供一种从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂、且操作简便的方法。
表1.真菌中甜菜碱脂含量
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法，包括以下步骤：
步骤(1)、牛肝菌干燥后粉碎，得到牛肝菌粉末，以丙酮为提取试剂，浸泡过夜，过滤除去滤渣，得到丙酮提取液；丙酮提取液减压蒸馏除去溶剂，得到粗提物；
步骤(2)、粗提物用水分散，依次加入石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物；
步骤(3)、将乙酸乙酯萃取物用丙酮溶解，过氨基固相萃取柱，依次以己烷、氯仿、乙酸乙酯进行洗脱，分别收集己烷洗脱液、氯仿洗脱液、乙酸乙酯洗脱液；氯仿洗脱液、乙酸乙酯洗脱液进行减压浓缩，分别得到以DGTS和DGCC为主的氯仿洗脱物，以LDGTS和DGTS为主的乙酸乙酯洗脱物。
步骤(1)中，所述的牛肝菌粉末与丙酮的质量体积比为1:40g/mL，即每500g牛肝菌粉末使用2000mL丙酮。
步骤(2)中，所述的粗提物与水的质量比为1:5～1:6；每次萃取时，石油醚与水的体积比为1:1～1:2；每次萃取时，乙酸乙酯与水的体积比为1:1～1:2。
具体的，往粗提物中加入水，均匀分散，加入石油醚进行萃取，上层为石油醚，下层为水相，将上层取出后继续加入石油醚，重复多次，直至萃取完全；合并石油醚萃取液，减压蒸馏回收溶剂，得到石油醚萃取物；石油醚萃取完全后，向水相中加入乙酸乙酯进行萃取，上层为乙酸乙酯，下层为水相，将上层取出后继续加入乙酸乙酯，重复多次，直至乙酸乙酯萃取完全；合并乙酸乙酯萃取液，减压蒸馏回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物。
步骤(3)中，所述的乙酸乙酯萃取物和丙酮的质量体积为1:30～1:40g/mL或kg/L。
氨基固相萃取柱在使用前，采用1柱容量丙酮进行活化。
所述的己烷的用量为8～8.5柱容量；所述的氯仿的用量为13～13.5柱容量；所述的乙酸乙酯的用量为24～25柱容量。
作为本发明所述的一种从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法的进一步优选技术方案，包括：采用高效液相色谱-质谱联用确定甜菜碱脂的种类和纯度；其中，高效液相色谱的条件为：C8色谱柱(Agilent,Eclipse Plus C8,5μm，4.6×250mm)，流动相为水和乙腈，流速为1mL/min，洗脱梯度如下：
本发明的有益效果：
本发明快捷且操作简便，以丙酮浸提牛肝菌中的甜菜碱脂，通过萃取除去部分小极性杂质，再通过氨基固相萃取柱分离得到甜菜碱脂，使用高效液相色谱-质谱验证甜菜碱脂的纯度：氯仿和乙酸乙酯洗脱物中检测到DGTS、DGCC和LDGTS，甜菜碱脂纯度大于99％。
附图说明
图1为本发明的操作流程图。
图2为氨基固相萃取柱洗脱所得各部分洗脱液浓缩后点板的结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
如图1所示，从牛肝菌中提取分离甜菜碱脂：
(1)、牛肝菌中的甜菜碱脂的粗提
牛肝菌干燥后的粉碎，得到牛肝菌粉末约1500g，按照每500g牛肝菌粉末使用2000mL丙酮加入6L丙酮，浸泡过夜，过滤，得到丙酮提取液；丙酮提取液减压蒸馏除去溶剂，得到粗提物约55g。
(2)、萃取
粗提物加入300mL水均匀分散，加入200mL石油醚进行萃取，上层为石油醚，下层为水相，将上层取出，进行减压蒸馏以回收溶剂；重复多次，直至石油醚萃取完全，得到石油醚萃取物约30g。石油醚萃取完全后，向水相中加入200mL乙酸乙酯进行萃取，上层为乙酸乙酯，下层为水相，将上层取出，进行减压蒸馏以回收溶剂；重复多次，直至乙酸乙酯萃取完全，得到乙酸乙酯萃取物约1g。
(3)、纯化
上样前，预先以6mL丙酮活化氨基固相萃取柱。
取0.06g乙酸乙酯萃取物，以2mL丙酮充分溶解，过氨基固相萃取柱(500mg/6mL，即装填500mg硅胶基质氨丙基键合相，柱容量为6mL)，依次以己烷50mL、氯仿80mL、乙酸乙酯150mL进行洗脱，每10mL洗脱液收集一次，硅胶板点样(展开剂为二氯甲烷:乙酸乙酯＝2:3V/V，磷钼酸显色)，点板结果显示：同一种溶剂洗脱的成分一样，根据点板结果进行合并，分别得到己烷洗脱液、氯仿洗脱液、乙酸乙酯洗脱液；己烷洗脱液、氯仿洗脱液、乙酸乙酯洗脱液分别进行减压浓缩除去溶剂，得到己烷洗脱物0.005g、氯仿洗脱物0.01g、乙酸乙酯洗脱物0.03g。
(4)、纯度检验
硅胶板(规格50mm×100mm，厚度0.2-0.25mm)点样，展开剂为二氯甲烷:乙酸乙酯＝2:3V/V，磷钼酸显色，使硅胶板上的化合物得以完全展开(图2)，显示己烷洗脱物基本不含甜菜碱脂。
将采用高效液相色谱-质谱联用检测氯仿洗脱物、乙酸乙酯洗脱物中甜菜碱脂的纯度：分别取氯仿洗脱物、乙酸乙酯洗脱物，用甲醇(色谱纯)溶解(氯仿洗脱物和甲醇的质量体积比为1:20g/mL，乙酸乙酯洗脱物和甲醇的质量体积比为1:20g/mL)，用0.22μm尼龙过滤器过滤，滤液通过液相色谱-质谱联用对其所含甜菜碱脂的种类和纯度进行分析。
高效液相色谱条件：C8色谱柱(Agilent,Eclipse Plus C8,5μm，4.6×250mm)，流动相为水和乙腈，流速为1mL/min，柱温为室温，进样量为2μL，洗脱梯度如表2。
表2.洗脱梯度程序
质谱分析条件：ESI源条件设置：喷雾电压(3.2Kv)、鞘气流速(8.4arb)、鞘气为N2(纯度＞95％；35a.u)，辅助气体为N2(纯度＞95％；10a.u)，毛细管温度：325℃，辅助气体加热温度：350℃，辅助气体流速：24.2arb，碰撞能：25/30/35eV，一级质谱扫描范围m/z介于200～1000之间，扫描模式：采用正负离子分开扫描。
高效液相色谱-质谱分析结果见表3、表4，可知，氯仿洗脱物中以DGTS和DGCC为主，乙酸乙酯洗脱物中以LDGTS和DGTS为主。
表3.氯仿洗脱物的高效液相色谱-质谱分析结果
表4.乙酸乙酯洗脱物的高效液相色谱-质谱分析结果
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所做的等效变化与修饰都应为本发明的技术。
Claims (7)
1.一种从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤(1)、牛肝菌干燥后粉碎，得到牛肝菌粉末，以丙酮为提取试剂，浸泡过夜，过滤除去滤渣，得到丙酮提取液；丙酮提取液减压蒸馏除去溶剂，得到粗提物；
步骤(2)、粗提物用水分散，依次加入石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物；
步骤(3)、将乙酸乙酯萃取物用丙酮溶解，过氨基固相萃取柱，依次以己烷、氯仿、乙酸乙酯进行洗脱，分别收集己烷洗脱液、氯仿洗脱液、乙酸乙酯洗脱液；氯仿洗脱液、乙酸乙酯洗脱液进行减压浓缩，分别得到以DGTS和DGCC为主的氯仿洗脱物，以LDGTS和DGTS为主的乙酸乙酯洗脱物。
2.根据权利要求1所述的从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的牛肝菌粉末与丙酮的质量体积比为1:40g/mL。
3.根据权利要求1所述的从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的粗提物与水的质量比为1:5～1:6；萃取时，石油醚与水的体积比为1:1～1:2；萃取时，乙酸乙酯与水的体积比为1:1～1:2。
4.根据权利要求1所述的从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法，其特征在于步骤(3)中，氨基固相萃取柱在使用前，采用1柱容量丙酮进行活化。
5.根据权利要求1所述的从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法，其特征在于其特征在于步骤(3)中，所述的乙酸乙酯萃取物和丙酮的质量体积为1:30～1:40g/mL或kg/L。
6.根据权利要求1所述的从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的己烷的用量为8～8.5柱容量；所述的氯仿的用量为13～13.5柱容量；所述的乙酸乙酯的用量为24～25柱容量。
7.根据权利要求1所述的从牛肝菌中提取分离高纯度甜菜碱脂的方法，其特征在于包括：采用高效液相色谱-质谱联用确定甜菜碱脂的种类和纯度；其中，高效液相色谱的条件为：C8色谱柱：Agilent,Eclipse Plus C8,5μm，4.6×250mm，流动相为水和乙腈，流速为1mL/min，洗脱梯度如下：
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