CN115417800A - 一种从红毛藻中分离纯化叶黄素的方法 - Google Patents

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陈晓晨
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郑明静
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朱艳冰
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Abstract

本发明公开了一种从红毛藻中分离纯化叶黄素的方法，其包括以下步骤：向红毛藻粉中加入乙醇，于常温浸提，共提取3次，抽滤，合并滤液，并减压浓缩成浸膏，得粗提物；以10倍体积的水混悬所述粗提物，用石油醚等体积比萃取三次后，再用三氯甲烷等体积比萃取三次，合并三氯甲烷萃取液后减压浓缩，得三氯甲烷相；向所述三氯甲烷相加入石油醚复溶，采用中压液相制备，50mL/min流速洗脱，以石油醚和含1％氨水的乙酸乙酯梯度洗脱，收集75％石油醚组份，去除溶剂，得叶黄素。由此可高效地制备叶黄素，所得叶黄素纯度高。

Description

一种从红毛藻中分离纯化叶黄素的方法
技术领域
本发明涉及生物制剂的技术领域，具体涉及一种从红毛藻中分离纯化叶黄素的方法。
背景技术
红毛藻(Bangiafusco-purpurea)又名红毛菜，属红藻门，红毛菜目，红毛藻属，是一种具有重要商业价值的可食用红藻，具有抗氧化、抑菌、抗癌、降血糖及治疗肥胖等生理活性和药用功能，深受我国南部沿海地区以及东南亚地区的消费者喜爱。而关于红毛藻中活性成分的研究较少。
叶黄素是一种天然无害的类胡萝卜素，能有效的清除氧自由基，具有抗氧化、抗肿瘤等作用，对心血管疾病以及预防老年性光斑变性具有一定疗效。叶黄素的制备方法目前主要有有机溶剂浸提法和超临界CO2萃取法，但生产纯度仅可达60％。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出一种从红毛藻中分离纯化叶黄素的方法。该方法高效的分离纯化出叶黄素，所得叶黄素纯度高，可达到93％。
为了实现上述目的，本发明的实施例在一方面提出了一种从红毛藻中分离纯化叶黄素的方法，其包括以下步骤：
(1)向红毛藻粉中加入无水乙醇，于常温浸提，共提取3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩成浸膏，得粗提物；
(2)以10倍体积的水混悬所述粗提物，用石油醚等体积比萃取三次后，再用三氯甲烷等体积比萃取三次，合并三氯甲烷萃取液后减压浓缩，得三氯甲烷相；
(3)向所述三氯甲烷相加入石油醚复溶，采用中压液相制备，50mL/min流速洗脱，以石油醚和含1％氨水的乙酸乙酯梯度洗脱，收集75％石油醚组份，去除溶剂，得叶黄素。
根据本发明实施例的一种从红毛藻中分离纯化叶黄素的方法，通过粗提物的提取、石油醚萃取、三氯甲烷萃取、中压液相制备可高效地制备叶黄素，所得叶黄素纯度高，可达到93％。
可选地，在步骤(1)中，所述红毛藻粉与所述乙醇的料液比为1:10kg/L。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例的叶黄素紫外全波长扫描结果；
图2为根据本发明实施例的叶黄素的TLC分析；
图3为根据本发明实施例的叶黄素的HPLC分析
图4为根据本发明实施例的叶黄素的1H NMR分析；
图5为根据本发明实施例的叶黄素的13C NMR分析；
图6为根据本发明实施例的叶黄素的质谱分析。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1从红毛藻中分离纯化叶黄素
粗提物的提取：取红毛藻干粉1kg，加入10L无水乙醇，于室温浸提2天，共提取3次，抽滤，合并滤液，并减压浓缩成浸膏，得粗提物42.87g。
萃取：以10倍体积的水混悬上述的粗提物，用石油醚等体积比萃取三次，再用三氯甲烷等体积比萃取三次，合并三氯甲烷萃取液后减压浓缩，得三氯甲烷相5.81g。
中压液相制备：称取三氯甲烷相提取物100mg，加入少量石油醚溶解，置于超声波清洗器中超声处理使其充分溶解。使用快速制备色谱仪(配备10g Biotage
Figure BDA0003800872990000021
Cartridge KP-Sil色谱柱)进行分离。流动相S1：石油醚；流动相S2：含1％氨水的乙酸乙酯，线性梯度洗脱条件如下：0-3CV，100％S1；4-6CV，90％S1；7-14CV，75％S1；15-17CV，50％S1；18-20CV，100％S2。收集75％石油醚组份，去除溶剂，得化合物1。
化合物1分析：
上述获得的化合物1紫外全波长扫描结果如图1所示，取少量化合物1溶于甲醇，以甲醇为空白液进行全波长扫描(200-800nm)。从图中可以看出，化合物S8最大吸收波长在440nm，推测为类胡萝卜素类化合物。
化合物1的TLC分析如图2所示，采用高效薄层层析板，在石油醚：乙酸乙酯＝3：1(v/v)的展开剂中展开，5％硫酸乙醇显色。结果中，A为显色前，B为显色后，显示化合物1纯品呈现单一斑点，说明分离所得化合物1纯度很高。
对化合物1进行高效液相色谱(HPLC)分析，所述高效液相色谱分析条件为：检测波长：440nm；流动相为乙腈/水体系：0-10min，乙腈35％-75％；11-30min，乙腈75％-100％；31-50min，乙腈100％-100％；流速0.5mL/min；色谱柱Symmetry C18(3.9×150mm,5μm)，waters；HPLC分析如图3所示，该图谱只显示一个主峰，其中38.101min为化合物1，使用峰面积归一法得其纯度为93％。
将化合物1溶于氘代氯仿(CDCl3)中，使用Bruker AV 500核磁共振仪对样品进行1HNMR(图4)，13C NMR(图5)分析。样品溶于质谱级乙腈中，使用WATERS XEVO G2-XS UPLC-Q-TOF，ESI+模式进行质谱分析(图6)。结果如下：HR ESI-Q-TOF m/z 568.4266M+,569.4311[M+H]+；1H(500MHz,CDCl3,δ,ppm,J/Hz):0.84–0.85(4H,s),0.99–1.01(3H,s),1.06–1.08(6H,s),1.31–1.51(3H,m),1.61–1.64(4H,s),1.73–1.74(4H,s),1.75–1.79(1H,s),1.81–1.87(1H,dd,J＝13.2,5.9Hz),1.87–1.92(3H,s),1.92–1.99(8H,s),1.99–2.08(1H,m),2.23–2.46(2H,dd,J＝16.7,6.2Hz),3.96–4.06(1H,m),4.20–4.29(1H,s),5.32–5.48(2H,ddd,J＝27.7,16.3,12.0Hz),5.51–5.58(1H,s),6.08–6.20(5H,m),6.31–6.41(2H,m),6.53–6.72(4H,m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ138.5,138.0,137.8,137.6,136.5,136.5,135.7,132.6,131.3,130.8,130.1,130.0,128.7,126.2,125.6,124.9,124.8,124.5,65.9,65.1,55.0,48.4,44.6,42.6,37.1,34.0,31.9,30.3 29.7,29.5,29.4,28.7,24.3,22.9,22.7,21.6,14.1,13.1,12.8,12.8。确定分离所得化合物1为叶黄素(C40H56O2)。
综上，根据本发明实施例的一种从红毛藻中分离纯化叶黄素的方法，通过粗提物的提取、石油醚萃取、三氯甲烷萃取、中压液相制备可高效地制备叶黄素，所得叶黄素纯度高。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.一种从红毛藻中分离纯化叶黄素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向红毛藻粉中加入无水乙醇，于常温浸提，共提取3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩成浸膏，得粗提物；
(2)以10倍体积的水混悬所述粗提物，用石油醚等体积比萃取三次后，再用三氯甲烷等体积比萃取三次，合并三氯甲烷萃取液后减压浓缩，得三氯甲烷相；
(3)向所述三氯甲烷相加入石油醚复溶，采用中压液相制备，50mL/min流速洗脱，以石油醚和含1％氨水的乙酸乙酯梯度洗脱，收集75％石油醚组份，去除溶剂，得叶黄素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述红毛藻粉与所述无水乙醇的料液比为1:10kg/L。
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