CN115728403A - 一种左卡尼汀中对映异构体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种应用于药物检测领域中的一种左卡尼汀中对映异构体的检测方法，该方法采用大环糖肽型手性色谱柱；采用三乙胺水溶液与甲醇的体积比为10‑20:90‑80的流动相；该方法具有专属性好，灵敏度高，不需要衍生化处理，检测成本低，操作简便，耐用性、检测限等均能符合要求，适用范围广等特点。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种左卡尼汀中对映异构体的检测方法。
背景技术
左卡尼汀是食物的组成成份，广泛存在于自然界中，山羊肉中含量最高，约为2.1g/kg，而植物性食物中含量极少甚至没有，被认为是类维生素的营养素。人体本身也能合成左卡尼汀，成人体内约有20克左卡尼汀，主要分布于心肌、骨骼肌中。左卡尼汀是哺乳动物能量代谢中必需的体内天然物质，其主要功能是促进脂类代谢。它既能将长链脂肪酸带进线粒体基质，并促进其氧化分解，为细胞提供能量，又能将线粒体内产生的短链脂酰基输出。本品的补充可缓解其因体内缺乏引起的脂肪代谢紊乱、骨骼肌和心肌等组织的功能障碍。左卡尼汀适用于慢性肾衰长期血透病人因继发左卡尼汀缺乏产生的一系列并发症状，临床表现如心肌病、骨骼肌病、心律失常、高脂血症，以及低血压和透析中肌痉挛等，在临床上得到了广泛的应用。
左卡尼汀结构中存在一个手性中心，所以只存在一个对映异构体，即左卡尼汀对映异构体。据文献报道，左卡尼汀对映异构体对左卡尼汀乙酰转移酶和左卡尼汀脂肪酰转移酶有竞争性抑制作用，因此考虑到用药的安全性，需要严格控制左卡尼汀原料药和制剂产品中左卡尼汀对映异构体的含量。
左卡尼汀法定标准中只有《美国药典》(USP43)对左卡尼汀对映异构体进行了控制，控制限度为≤0.2％，该方法中左卡尼汀需衍生化处理后用HPLC分析，但衍生化试剂成本较高，且不易得，因此有必要对检测左卡尼汀中左卡尼汀对映异构体含量的方法进行更深入地研究，得到一个不需要衍生化试剂且灵敏度能够满足左卡尼汀对映异构体≤0.2％控制限度要求的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种左卡尼汀中对映异构体的检测方法。该方法可对左卡尼汀原料药和制剂产品中的左卡尼汀对映异构体的含量进行测定，其具有专属性好，灵敏度高，可以满足左卡尼汀对映异构体≤0.2％的控制限度要求的特点，同时，如果左卡尼汀产品中同时存在杂质A、盐酸、酒石酸等也不会对左卡尼汀对映异构体的含量测定结果造成影响。杂质A的结构如下：
本发明的目的是这样实现的：
一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：大环糖肽型手性色谱柱
流动相：三乙胺水溶液与甲醇的体积比为10-20:90-80；
(2)系统适用性溶液的制备：
(3)供试品溶液的制备：
(4)对照溶液或对照品溶液的制备：
(5)测定方法：
取系统适用性溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为左卡尼汀峰、左卡尼汀对映异构体峰；所述左卡尼汀对映异构体峰与左卡尼汀峰的分离度应不小于1.5；精密量取供试品溶液与对照溶液或对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的色谱图中如有左卡尼汀对映异构体峰，可通过主成分自身对照法或外标法以峰面积计算左卡尼汀对映异构体的含量。
所述色谱柱的固定相为太古霉素苷元键合固定相；所述色谱柱选自AstecCHIROBIOTIC TAG色谱柱；所述左卡尼汀产品选自左卡尼汀原料药、左卡尼汀制剂中的一种；所述左卡尼汀制剂选自左卡尼汀注射液、左卡尼汀口服液、左卡尼汀片中的一种；所述左卡尼汀注射液中含有辅料盐酸；所述左卡尼汀口服液中含有辅料酒石酸；所述可通过主成分自身对照法或外标法以峰面积计算左卡尼汀对映异构体含量，其左卡尼汀对映异构体含量不得过0.2％。
所述三乙胺水溶液与甲醇的体积比为13-17:87-83；所述色谱条件还包括：检测器：紫外检测器，检测波长：200-215nm；流速：0.6-1.2ml/min；柱温：25-35℃；色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；所述三乙胺水溶液中三乙胺的体积含量为0.05-0.25％，所述三乙胺水溶液为用稀醋酸调节pH至5.8-6.5的溶液；所述出峰顺序依次为左卡尼汀峰、左卡尼汀对映异构体峰、杂质A峰；所述左卡尼汀对映异构体峰与杂质A峰的分离度应不小于1.5；所述系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液或对照品溶液的进样量为10-30μl。
所述三乙胺水溶液与甲醇的体积比为15:85；所述检测波长：205或210nm；所述流速：0.8-1.0ml/min；所述柱温：30℃；所述三乙胺水溶液中三乙胺的体积含量为0.1-0.2％，所述三乙胺水溶液为用稀醋酸调节pH至6.0-6.2的溶液；所述稀醋酸的体积含量为3-10％；所述稀醋酸的配制方法为冰醋酸30-100ml加水稀释至1000ml。
所述系统适用性溶液的制备方法为：取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品，精密称定，用流动相定量稀释，作为系统适用性溶液；
所述供试品溶液的制备方法为：取所述左卡尼汀产品至容量瓶中，加流动相溶解并稀释，作为供试品溶液；
所述对照溶液的制备方法为：精密量取供试品溶液至容量瓶中，用流动相稀释，作为对照溶液；
所述对照品溶液的制备方法为：精密称取左卡尼汀对映异构体对照品，置于容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
所述系统适用性溶液的制备方法为：取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品、杂质A对照品，精密称定，用流动相定量稀释，作为系统适用性溶液。
所述系统适用性溶液的制备方法为：取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品，精密称定，用流动相定量稀释制成每1ml中含24mg左卡尼汀、0.048mg左卡尼汀对映异构体的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液；
所述供试品溶液的制备方法为：取所述左卡尼汀产品至25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释，作为供试品溶液，每1ml含左卡尼汀24mg；
所述对照溶液的制备方法为：精密量取供试品溶液至100ml容量瓶中，用流动相稀释，作为对照溶液，每1ml含左卡尼汀0.048mg；
所述对照品溶液的制备方法为：精密称取12mg左卡尼汀对映异构体对照品，置于250ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
所述系统适用性溶液的制备方法为：取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品、杂质A对照品，精密称定，用流动相定量稀释制成每1ml中含24mg左卡尼汀、0.048mg左卡尼汀对映异构体、0.072mg杂质A的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液。
一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：Astec CHIROBIOTICTM TAG手性色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；
流动相：体积含量0.2％的三乙胺水溶液用稀醋酸调节pH至6.2：甲醇＝15:85，体积比；
稀醋酸：取冰醋酸60ml，加水稀释至1000ml；
检测器：紫外检测器；
检测波长：210nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：30℃；
(2)系统适用性溶液的制备：
取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品、杂质A对照品适量，精密称定，用流动相定量稀释制成每1ml中含24mg左卡尼汀、0.048mg左卡尼汀对映异构体、0.072mg杂质A的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液；
(3)供试品溶液的制备：
取左卡尼汀产品至25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释，作为供试品溶液，每1ml含左卡尼汀24mg；
所述左卡尼汀产品选自左卡尼汀原料药、左卡尼汀制剂中的一种；所述左卡尼汀制剂选自左卡尼汀注射液、左卡尼汀口服液、左卡尼汀片中的一种；所述左卡尼汀口服液中含有辅料酒石酸；所述左卡尼汀注射液中含有辅料盐酸；
(4)对照溶液的制备：
精密量取供试品溶液0.2ml至100ml容量瓶中，用流动相稀释，作为对照溶液，每1ml含左卡尼汀0.048mg；
(5)测定方法：
取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为左卡尼汀峰、左卡尼汀对映异构体峰、杂质A峰；左卡尼汀对映异构体峰与左卡尼汀峰的分离度应不小于1.5，左卡尼汀对映异构体峰与杂质A峰的分离度应不小于1.5；精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有左卡尼汀对映异构体峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积，左卡尼汀对映异构体含量不得过0.2％；
(6)计算左卡尼汀对映异构体的含量
计算公式：
一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)色谱条件
液相色谱仪：Agilent 1260
色谱柱：Astec CHIROBIOTIC TAG，250mm×4.6mm，5μm
检测器：紫外检测器，检测波长：205nm
柱温：30℃
流速：1.0ml/min
进样量：20ul
运行时间：25min
(2)溶液制备
流动相的制备：精密吸取三乙胺0.3ml，加水300ml，用稀醋酸调pH＝6.0，加甲醇1700ml，摇匀；
稀醋酸的制备：取冰醋酸60ml，加水稀释至1000ml，即得；
空白溶液：流动相；
供试品：左卡尼汀产品，所述左卡尼汀产品选自左卡尼汀原料药、左卡尼汀制剂中的一种；所述左卡尼汀制剂选自左卡尼汀注射液、左卡尼汀口服液、左卡尼汀片中的一种；所述左卡尼汀口服液中含有辅料酒石酸；所述左卡尼汀注射液中含有辅料盐酸；
供试品溶液的制备：取含0.24g左卡尼汀的供试品于流动相中，并用流动相稀释至10ml，摇匀；
对照品溶液的制备：精密称取12mg左卡尼汀对映异构体对照品，置于250ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；
系统适用性溶液的制备：精密称取左卡尼汀对照品0.24g，置于10ml容量瓶中，用对照溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；
(3)测定方法：精密量取系统性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序为左卡尼汀、左卡尼汀对映异构体，左卡尼汀与左卡尼汀对映异构体的分离度应大于1.5；精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，左卡尼汀对映异构体含量不得过0.2％；
式中：
Ws-左卡尼汀对映异构体对照品的质量，g；
As-对照品溶液中左卡尼汀对映异构体的峰面积；
A供-供试液中左卡尼汀对映异构体的峰面积；
W供-供试品的质量，g；
P-左卡尼汀对映异构体对照品的纯度，％。
本发明的要点在于建立了一种左卡尼汀中对映异构体的检测方法，该方法采用大环糖肽型手性色谱柱(太古霉素苷元键合固定相)，结合HPLC主成分自身对照法或外标法定量检测左卡尼汀对映异构体含量，同时适用于左卡尼汀原料药及相关制剂产品中左卡尼汀对映异构体的检测，相关制剂产品包括左卡尼汀注射液、左卡尼汀口服液、左卡尼汀片等。通过对各制剂产品的分析方法进行专属性验证，发现产品中的辅料均不干扰左卡尼汀对映异构体的测定(其中，左卡尼汀口服液的辅料酒石酸在图谱中有一倒峰，可通过延长运行时间将其洗脱出来，左卡尼汀注射液中的盐酸也不干扰左卡尼汀对映异构体的测定)。该检测方法与现有技术相比，具有专属性好，灵敏度高，不需要衍生化处理，检测成本低，操作简便，耐用性、检测限等均能符合要求，可以满足左卡尼汀对映异构体≤0.2％的控制限度要求；另外，该方法同时也能对左卡尼汀有关物质杂质A进行定量分析，通过外标法计算杂质A的含量，与有关物质方法中杂质A的含量进行数据对比，发现无明显差异，可降低检测成本，节约检测时间。
附图说明
图1是实施例一空白溶剂的高效液相色谱图
图2是实施例一系统适用性溶液的高效液相色谱图
图3是实施例一左卡尼汀对映异构体对照品溶液的高效液相色谱图
图4是实施例一左卡尼汀供试品溶液的高效液相色谱图
图5是实施例一左卡尼汀对照溶液的高效液相色谱图
图6是实施例一左卡尼汀注射液供试品溶液的高效液相色谱图
图7是实施例一左卡尼汀注射液对照溶液的高效液相色谱图
图8是实施例一左卡尼汀口服液供试品溶液的高效液相色谱图
图9是实施例一左卡尼汀口服液对照溶液的高效液相色谱图
图10是实施例一左卡尼汀片供试品溶液的高效液相色谱图
图11是实施例一左卡尼汀片对照溶液的高效液相色谱图
图12是实施例二空白溶剂的高效液相色谱图
图13是实施例二系统适用性溶液的高效液相色谱图
图14是实施例二左卡尼汀对映异构体对照品溶液的高效液相色谱图
图15是实施例二左卡尼汀供试品溶液的高效液相色谱图
图16是实施例二左卡尼汀原料药供试品溶液重复性的高效液相色谱图
图17是实施例二左卡尼汀原料药供试品溶液重复性的高效液相色谱图
图18是实施例二左卡尼汀原料药供试品溶液重复性的高效液相色谱图
图19是实施例二左卡尼汀原料药供试品溶液重复性的高效液相色谱图
图20是实施例二左卡尼汀原料药供试品溶液重复性的高效液相色谱图
图21是实施例二左卡尼汀原料药供试品溶液的高效液相色谱图
具体实施方式
以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
实施例一
1、左卡尼汀注射液中左卡尼汀对映异构体的测定：
(1)色谱条件：
色谱柱：Astec CHIROBIOTICTM TAG手性色谱柱(大环糖肽型手性色谱柱，太古霉素苷元键合固定相)，250mm×4.6mm，5μm；
流动相：0.2％(V/V)三乙胺水溶液(用稀醋酸调节pH至6.2)-甲醇(15:85，体积比)；
稀醋酸：取冰醋酸60ml，加水稀释至1000ml；
所述流动相采用等度洗脱的方式；
检测器：紫外检测器(UV)；
检测波长：210nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：30℃；
(2)系统适用性溶液的制备：
取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品、杂质A对照品适量，精密称定，用流动相定量稀释制成每1ml中含24mg左卡尼汀、0.048mg左卡尼汀对映异构体、0.072mg杂质A的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液；
(3)供试品溶液的制备：
精密量取左卡尼汀注射液1.5ml至25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释，作为供试品溶液(每1ml含左卡尼汀24mg)；
(4)对照溶液的制备：
精密量取供试品溶液0.2ml至100ml容量瓶中，用流动相稀释，作为对照溶液(每1ml含左卡尼汀0.048mg)；
(5)测定方法：
取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为左卡尼汀峰、左卡尼汀对映异构体峰、杂质A峰；左卡尼汀对映异构体峰与左卡尼汀峰的分离度应不小于1.5，左卡尼汀对映异构体峰与杂质A峰的分离度应不小于1.5；精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有左卡尼汀对映异构体峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积，左卡尼汀对映异构体含量不得过0.2％。。
(6)计算左卡尼汀对映异构体的含量
计算公式：
计算结果：
注：左卡尼汀注射液中含有辅料盐酸，但试验发现，盐酸的存在并不干扰对映异构体的测定；
2、左卡尼汀口服液中左卡尼汀对映异构体的测定：
(1)色谱条件：
色谱柱：Astec CHIROBIOTICTM TAG手性色谱柱(大环糖肽型手性色谱柱，太古霉素苷元键合固定相)；250mm×4.6mm，5μm；
流动相：0.2％(V/V)三乙胺水溶液(用稀醋酸调节pH至6.2)-甲醇(15:85，体积比)；
稀醋酸：取冰醋酸60ml，加水稀释至1000ml；
所述流动相采用等度洗脱的方式；
检测器：UV；
检测波长：210nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：30℃；
(2)系统适用性溶液的制备：
取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品、杂质A对照品适量，精密称定，用流动相定量稀释制成每1ml中含24mg左卡尼汀、0.048mg左卡尼汀对映异构体、0.072mg杂质A的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液；
(3)供试品溶液的制备：
精密量取左卡尼汀口服液0.8ml至10ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释，作为供试品溶液(每1ml含左卡尼汀24mg)；
(4)对照溶液的制备：
精密量取供试品溶液0.2ml至100ml容量瓶中，用流动相稀释，作为对照溶液(每1ml含左卡尼汀0.048mg)；
(5)测定方法：
精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有左卡尼汀对映异构体峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积，左卡尼汀对映异构体含量不得过0.2％。。
(6)计算左卡尼汀对映异构体的含量
计算公式：
计算结果：
注：左卡尼汀口服液的辅料酒石酸在图谱中有一倒峰，可通过延长运行时间将其洗脱出来。
3、左卡尼汀片中左卡尼汀对映异构体的测定：
(1)色谱条件：
色谱柱：Astec CHIROBIOTICTM TAG手性色谱柱(大环糖肽型手性色谱柱，太古霉素苷元键合固定相)；250mm×4.6mm，5μm；
流动相：0.2％(V/V)三乙胺水溶液(用稀醋酸调节pH至6.2)-甲醇(15:85，体积比)；
稀醋酸：取冰醋酸60ml，加水稀释至1000ml；
所述流动相采用等度洗脱的方式；
检测器：UV；
检测波长：210nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：30℃；
(2)系统适用性溶液的制备：
取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品、杂质A对照品适量，精密称定，用流动相定量稀释制成每1ml中含24mg左卡尼汀、0.048mg左卡尼汀对映异构体、0.072mg杂质A的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液；
(3)供试品溶液的制备：
精密量取左卡尼汀片1.1g至25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释，过滤，取续滤液作为供试品溶液(每1ml含左卡尼汀24mg)；
(4)对照溶液的制备：
精密量取供试品溶液0.2ml至100ml容量瓶中，用流动相稀释，作为对照溶液(每1ml含左卡尼汀0.048mg)；
(5)测定方法：
精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有左卡尼汀对映异构体峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积，左卡尼汀对映异构体含量不得过0.2％。。
(6)计算左卡尼汀对映异构体的含量
计算公式：
计算结果：
4、流动相的选择
选择三乙胺水溶液(醋酸调节pH至6.2)—乙腈、三乙胺水溶液(醋酸调节pH至6.2)—甲醇两种流动相体系。三乙胺水溶液(醋酸调节pH至6.2)--乙腈体系时，无法将各组分完全分离；三乙胺水溶液(醋酸调节pH至6.2)—甲醇体系，由于甲醇分子的质子性，在保证检测灵敏度的同时，能够将左卡尼汀、左卡尼汀对映异构体、杂质A完全分离，分离度符合要求，定量限回收率符合规定。因此，选择三乙胺水溶液(醋酸调节pH至6.2)—甲醇体系作为流动相。
优选的流动相配比：0.2％(V/V)三乙胺水溶液(用稀醋酸调节pH至6.2)-甲醇(15:85，体积比)；(注：实施例一中如无特别说明，均使用此流动相)稀醋酸：取冰醋酸60ml，加水稀释至1000ml。
5、方法学的建立
(1)系统适用性试验
①系统分离度试验
精密称取左卡尼汀、左卡尼汀对映异构体、杂质A适量，加流动相溶解并稀释，作为系统适用性溶液；取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，谱图显示各组分的分离度均符合要求。
表1：左卡尼汀、左卡尼汀对映异构体、杂质A的出峰时间
②系统重复性试验
取左卡尼汀对映异构体对照品适量，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml约含0.048mg的溶液作为对照品溶液；精密量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，连续五次进样的RSD以左卡尼汀对映异构体峰面积计不大于5％。结果见表2-4。
表2系统重复性试验结果
| 进样次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | RSD(％) |
| 峰面积 | 22360 | 23459 | 23707 | 23155 | 22914 | 23119 | 2.2 |
(2)专属性试验
空白溶剂干扰试验
取溶剂流动相，注入液相色谱仪，记录其色谱图，谱图显示溶剂在左卡尼汀、左卡尼汀对映异构体、杂质A色谱峰处均无色谱峰出现，对左卡尼汀对映异构体测定无干扰。结果见图1。
(3)精密度
①重复性试验
取左卡尼汀原料药(01718020011批)0.24g，按左卡尼汀对映异构体测定方法连续测定6次，记录色谱图，计算平均值及RSD值，RSD小于10％。测定结果见表3。
表3左卡尼汀对映异构体重复性试验结果
②中间精密度
取本品(01718020011批)0.24g，由不同实验人员，使用不同仪器，按左卡尼汀对映异构体项下测定方法测定6次，计算左卡尼汀对映异构体含量及RSD值。测定结果见表4。
表4左卡尼汀对映异构体中间精密度试验结果
(4)检测限和定量限
①左卡尼汀检测限和定量限
取左卡尼汀对照品加流动相溶解并稀释制成一系列不同浓度的稀溶液，各量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，S/N≈3时，根据进样浓度计算检测限为6.93μg/ml，进样量138.6ng；S/N≈10时，根据进样浓度计算定量限为13.86μg/ml，进样量277.2ng。测定结果见表5。
表5左卡尼汀检测限、定量限试验结果
②左卡尼汀对映异构体检测限和定量限
取左卡尼汀对照品加流动相溶解并稀释制成一系列不同浓度的稀溶液，各量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，S/N≈3时，根据进样浓度计算检测限为6.92μg/ml，进样量138.4ng；S/N≈10时，根据进样浓度计算定量限为14.52μg/ml，进样量290.4ng。测定结果见表6。
表6左卡尼汀对映异构体检测限、定量限试验结果
(5)线性及范围
取左卡尼汀对映异构体适量，精密称定，制备左卡尼汀对映异构体定量限～限度200％(限度为≤0.2％)范围的一系列溶液，进样测定，结果表明，左卡尼汀对映异构体在14.52μg/ml—96.82μg/ml(相当于主成分的0.06％-0.4％)浓度范围内呈线性。
取左卡尼汀对照品适量，精密称定，制备左卡尼汀定量限～限度200％(限度为≤0.2％)范围的一系列溶液，进样测定，结果表明，左卡尼汀在13.86μg/ml—98.99μg/ml(相当于主成分的0.06％-0.4％)浓度范围内呈线性。
(6)准确度-回收率试验
选取左卡尼汀对映异构体定量限～限度200％浓度范围内进行准确度验证。精密称取左卡尼汀原料药(01718020011批)约6g，置于50ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液储备液，精密移取上述供试品溶液储备液2ml共21份，分别置于10ml容量瓶中；其中三份用流动相稀释至刻度，作为不加标的供试品溶液；取左卡尼汀对映异构体对照品约12mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液储备液；分别量取对照品溶液储备液0.3ml、0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml各3份置于装有本品的10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为左卡尼汀对映异构体的回收率试验溶液，按左卡尼汀对映异构体测定项下方法测定，计算左卡尼汀对映异构体的回收率及相对标准偏差，测定结果见表7。
表7左卡尼汀对映异构体回收率试验结果
(7)耐用性试验
①溶液的稳定性考察
精密称定左卡尼汀0.24g，置于10ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液，在室温下放置0-24小时，精密量取20μl注入液相色谱仪，测定左卡尼汀对映异构体峰面积，结果表明供试品溶液在24小时内稳定。
表8：溶液的稳定性考察结果
②不同色谱柱的考察
选择同一品牌不同编号的两根Astec CHIROBIOTICTM TAG手性色谱柱，对左卡尼汀对映异构体进行测定，测定结果一致，同一品牌不同编号色谱柱对检测结果无影响。
表9：不同色谱柱的考察结果
③不同流速
取左卡尼汀原料药(01718020011批)0.24g，加流动相溶解并稀释至10ml容量瓶中，作为供试品溶液；适当改变流动相流速(0.8±0.1ml/min)，对供试品溶液进行测定，结果见表10。
表10不同流动相流速左卡尼汀对映异构体的测定结果
结果表明：适当改变流动相流速(0.8±0.1ml/min)，对样品测定结果基本无影响。
④不同色谱柱温度
取左卡尼汀原料药(01718020011批)0.24g，加流动相溶解并稀释至10ml容量瓶中，作为供试品溶液；适当改变色谱柱温度(30±2℃)，对供试品溶液进行测定，结果见表11。
表11不同色谱柱温度左卡尼汀对映异构体的测定结果
结果表明：适当改变色谱柱温度(30±2℃)，对样品测定结果基本无影响。
⑤不同流动相比例
取左卡尼汀原料药(01718020011批)0.24g，加流动相溶解并稀释至10ml容量瓶中，作为供试品溶液；适当改变流动相比例(15±2：85±2)，对供试品溶液进行测定，结果见表12。
表12不同流动相比例左卡尼汀对映异构体的测定结果
结果表明：适当改变流动相比例(15±2：85±2)，对样品测定结果基本无影响。
⑥不同流动相pH
取左卡尼汀原料药(01718020011批)0.24g，加流动相溶解并稀释至10ml容量瓶中，作为供试品溶液；适当改变流动相pH(6.2±0.2)，对供试品溶液进行测定，结果见表13。
表13不同流动相pH左卡尼汀对映异构体的测定结果
结果表明：适当改变流动相pH(6.2±0.2)，对样品测定结果基本无影响。
附图8中，保留时间9.954分钟为左卡尼汀峰，保留时间15.838分钟为杂质A峰；附图9中，保留时间11.434分钟为左卡尼汀峰；附图11中，保留时间11.973分钟为左卡尼汀峰；附图3中对照品溶液的配制方法为：精密量取左卡尼汀对映异构体对照品4.8mg，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；
实施例二
左卡尼汀原料药中左卡尼汀对映异构体的测定
1、检测方法
(1)色谱条件
液相色谱仪：Agilent 1260
色谱柱：Astec CHIROBIOTIC TAG，250mm×4.6mm，5μm
检测器：紫外检测器(UV)，检测波长：205nm
柱温：30℃
流速：1.0ml/min
进样量：20μl
运行时间：25min
(2)溶液制备
流动相的制备：精密吸取三乙胺0.3ml，加水300ml，用稀醋酸调pH＝6.0，加甲醇1700ml，摇匀。
稀醋酸的制备：取冰醋酸60ml，加水稀释至1000ml，即得。
空白溶液：流动相。
供试品：左卡尼汀原料药
供试品溶液：精密称取0.24g供试品于流动相中，并用流动相稀释至10ml，摇匀。
对照品溶液：精密称取12mg左卡尼汀对映异构体对照品，置于250ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液：精密称取左卡尼汀对照品0.24g，置于10ml容量瓶中，用对照溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
(3)测定方法：精密量取系统性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序为左卡尼汀、左卡尼汀对映异构体，左卡尼汀与左卡尼汀对映异构体的分离度应大于1.5。精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，左卡尼汀对映异构体含量不得过0.2％。
式中：
Ws-左卡尼汀对映异构体对照品的质量，g。
As-对照品溶液中左卡尼汀对映异构体的峰面积。
A供-供试品溶液中左卡尼汀对映异构体的峰面积。
W供-供试品的质量，g。
P-左卡尼汀对映异构体对照品的纯度，％。
2、验证过程
(1)验证方法
①色谱条件检测器：UV检测波长：205nm柱温：30℃进样量：20μl流速：1.0ml/min色谱柱：Astec CHIROBIOTIC TAG，250mm×4.6mm，5μm。
②溶液制备
流动相的配制：精密吸取三乙胺0.3ml，加水300ml，用稀醋酸调pH＝6.0，加甲醇1700ml，摇匀。(稀醋酸的配制：取冰醋酸60ml，加水稀释至1000ml，即得)
空白溶液：流动相。
供试品：左卡尼汀原料药
供试品溶液：精密称取约0.24g供试品置10ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密称取约12mg左卡尼汀对映异构体对照品，置250ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液：精密称取供试品约0.24g，置10ml容量瓶中，用对照溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
准确度溶液：
对照品溶液贮备液：精密称取左卡尼汀对映异构体12.64mg置25ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
120％回收率样品溶液：精密称取供试品0.24g至10ml容量瓶中，精密加入1.2ml对照品溶液贮备液，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
100％回收率样品溶液：精密称取供试品0.24g至10ml容量瓶中，精密加入1.0ml对照品溶液贮备液，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
50％回收率样品溶液：精密称取供试品0.24g至10ml容量瓶中，精密加入0.5ml对照品溶液贮备液，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
定量限回收率样品溶液：精密吸取5.5ml 100％回收率样品溶液置50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀作为左卡尼汀对映异构体定量限溶液。准确称取0.24g供试品置10ml容量瓶中，用上述左卡尼汀对映异构体定量限溶液溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
③供试品测定
| 检验项目 | 左卡尼汀对映异构体含量 |
| DY0171900279 | 0.0375％ |
| DY0171900280 | 0.0588％ |
| DY0171900281 | 0.0295％ |
| 01719060008 | 0.0350％ |
| 01719060009 | 0.0150％ |
| 01719060010 | 0.0161％ |
④计算公式
式中：
Ws-左卡尼汀对映异构体对照品的质量，g。
As-对照品溶液中左卡尼汀对映异构体的峰面积。
A供-供试品溶液中左卡尼汀对映异构体的峰面积。
W供-供试品的质量，g。
P-左卡尼汀对映异构体对照品的纯度，％。
(2)具体验证结果
①系统适用性
1.1.1待仪器稳定后，进20μl对照溶液注入色谱仪，平行进样6次，记录色谱图，计算RSD≤2.0％。
②专属性
进空白溶液、对照品溶液、系统适用性溶液，记录图谱。
由系统性溶液获得的图谱中，左卡尼汀与左卡尼汀对映异构体的分离度应≥1.5。
③精密度
重复性：
随机抽取一批供试品(批号：DY0171900279)，制备6份供试品溶液，测定左卡尼汀对映异构体含量，结果如下：
中间精密度：
不同的检验员、色谱柱，检测同一批样品(批号：DY0171900279)，测定左卡尼汀对映异构体含量，结果如下：
④检测限、定量限
目标处噪音：进样流动相为空白，调整仪器了灵敏度，连续进样3次，记录在左卡尼汀对映异构体出峰时间范围内(左卡尼汀对映异构体峰半峰宽5倍)的仪器噪音水平，计算平均噪声。
检测限：
精密称取左卡尼汀对映异构体11.18mg置25ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液贮备液。精密吸取1.0ml对照品溶液贮备液置10ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，作为100％对照品溶液。再精密吸取此液0.5ml置10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀作为左卡尼汀对映异构体检测限溶液。重复进左卡尼汀对映异构体检测限溶液六次，RSD应≤15％。
左卡尼汀对映异构体检测浓度：2.1868μg/ml
左卡尼汀对映异构体检测限：0.0091％
定量限：
精密吸取1.1ml的100％对照品溶液置10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀作为左卡尼汀对映异构体定量限溶液，重复进左卡尼汀对映异构体定量限溶液六次，RSD应≤15％。
左卡尼汀对映异构体定量浓度：4.8110μg/ml
左卡尼汀对映异构体定量限：0.0200％
⑤线性
精密吸取0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml的对照品溶液贮备液分别置10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为50％、80％、100％、120％标准溶液。分别进上述溶液与左卡尼汀对映异构体定量限溶液，每个溶液进样3次，计算平均峰面积。以样品浓度对相应平均峰面积做回归曲线，计算回归方程及相应的线性回归系数。
⑥准确度
制备含左卡尼汀对映异构体为LOQ、50％、100％、120％四种浓度的溶液。选择一批样品(批号：DY0171900279)定量称样15份，其中3份作为空白，其余12份分别加入120％回收率样品溶液、100％回收率样品溶液、50％回收率样品溶液、定量限回收率样品溶液，每种浓度的溶液平行加入三份样品中，进样。
⑦耐用性
分别调整pH(±0.2)、流速(±50％)、柱温(±2℃)、更换色谱柱检测同一批样品(批号DY0171900279)结果如下：
⑧溶液稳定性
将制备好的样品溶液(批号：DY0171900279)按下列间隔点进行进样，计算左卡尼汀对映异构体。检验结果如下：
说明：附图1至21中，异构体、右旋异构体均为左卡尼汀对映异构体。
附图13中，保留时间11.954分钟为杂质A峰；附图15中，保留时间11.978分钟为杂质A峰；附图16中，保留时间12.002分钟为杂质A峰；附图17中，保留时间12.005分钟为杂质A峰；附图18中，保留时间12.025分钟为杂质A峰；附图19中，保留时间12.024分钟为杂质A峰；附图20中，保留时间12.040分钟为杂质A峰；附图21中，保留时间12.029分钟为杂质A峰。
Claims (10)
1.一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：大环糖肽型手性色谱柱
流动相：三乙胺水溶液与甲醇的体积比为10-20:90-80；
(2)系统适用性溶液的制备：
(3)供试品溶液的制备：
(4)对照溶液或对照品溶液的制备：
(5)测定方法：
取系统适用性溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为左卡尼汀峰、左卡尼汀对映异构体峰；所述左卡尼汀对映异构体峰与左卡尼汀峰的分离度应不小于1.5；精密量取供试品溶液与对照溶液或对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的色谱图中如有左卡尼汀对映异构体峰，可通过主成分自身对照法或外标法以峰面积计算左卡尼汀对映异构体的含量。
2.根据权利要求1所述的一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述色谱柱的固定相为太古霉素苷元键合固定相；所述色谱柱选自Astec CHIROBIOTIC TAG色谱柱；所述左卡尼汀产品选自左卡尼汀原料药、左卡尼汀制剂中的一种；所述左卡尼汀制剂选自左卡尼汀注射液、左卡尼汀口服液、左卡尼汀片中的一种；所述左卡尼汀注射液中含有辅料盐酸；所述左卡尼汀口服液中含有辅料酒石酸；所述可通过主成分自身对照法或外标法以峰面积计算左卡尼汀对映异构体含量，其左卡尼汀对映异构体含量不得过0.2％。
3.根据权利要求1所述的一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述三乙胺水溶液与甲醇的体积比为13-17:87-83；所述色谱条件还包括：检测器：紫外检测器，检测波长：200-215nm；流速：0.6-1.2ml/min；柱温：25-35℃；色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；所述三乙胺水溶液中三乙胺的体积含量为0.05-0.25％，所述三乙胺水溶液为用稀醋酸调节pH至5.8-6.5的溶液；所述出峰顺序依次为左卡尼汀峰、左卡尼汀对映异构体峰、杂质A峰；所述左卡尼汀对映异构体峰与杂质A峰的分离度应不小于1.5；所述系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液或对照品溶液的进样量为10-30μl。
4.根据权利要求3所述的一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述三乙胺水溶液与甲醇的体积比为15:85；所述检测波长：205或210nm；所述流速：0.8-1.0ml/min；所述柱温：30℃；所述三乙胺水溶液中三乙胺的体积含量为0.1-0.2％，所述三乙胺水溶液为用稀醋酸调节pH至6.0-6.2的溶液；所述稀醋酸的体积含量为3-10％；所述稀醋酸的配制方法为冰醋酸30-100ml加水稀释至1000ml。
5.根据权利要求1所述的一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述系统适用性溶液的制备方法为：取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品，精密称定，用流动相定量稀释，作为系统适用性溶液；
所述供试品溶液的制备方法为：取所述左卡尼汀产品至容量瓶中，加流动相溶解并稀释，作为供试品溶液；
所述对照溶液的制备方法为：精密量取供试品溶液至容量瓶中，用流动相稀释，作为对照溶液；
所述对照品溶液的制备方法为：精密称取左卡尼汀对映异构体对照品，置于容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
6.根据权利要求5所述的一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述系统适用性溶液的制备方法为：取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品、杂质A对照品，精密称定，用流动相定量稀释，作为系统适用性溶液。
7.根据权利要求5所述的一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于：
所述系统适用性溶液的制备方法为：取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品，精密称定，用流动相定量稀释制成每1ml中含24mg左卡尼汀、0.048mg左卡尼汀对映异构体的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液；
所述供试品溶液的制备方法为：取所述左卡尼汀产品至25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释，作为供试品溶液，每1ml含左卡尼汀24mg；
所述对照溶液的制备方法为：精密量取供试品溶液至100ml容量瓶中，用流动相稀释，作为对照溶液，每1ml含左卡尼汀0.048mg；
所述对照品溶液的制备方法为：精密称取12mg左卡尼汀对映异构体对照品，置于250ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
8.根据权利要求6所述的一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于：
所述系统适用性溶液的制备方法为：取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品、杂质A对照品，精密称定，用流动相定量稀释制成每1ml中含24mg左卡尼汀、0.048mg左卡尼汀对映异构体、0.072mg杂质A的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液。
9.一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：Astec CHIROBIOTICTM TAG手性色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；
流动相：体积含量0.2％的三乙胺水溶液用稀醋酸调节pH至6.2：甲醇＝15:85，体积比；
稀醋酸：取冰醋酸60ml，加水稀释至1000ml；
检测器：紫外检测器；
检测波长：210nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：30℃；
(2)系统适用性溶液的制备：
取左卡尼汀对照品、左卡尼汀对映异构体对照品、杂质A对照品适量，精密称定，用流动相定量稀释制成每1ml中含24mg左卡尼汀、0.048mg左卡尼汀对映异构体、0.072mg杂质A的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液；
(3)供试品溶液的制备：
取左卡尼汀产品至25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释，作为供试品溶液，每1ml含左卡尼汀24mg；
所述左卡尼汀产品选自左卡尼汀原料药、左卡尼汀制剂中的一种；所述左卡尼汀制剂选自左卡尼汀注射液、左卡尼汀口服液、左卡尼汀片中的一种；所述左卡尼汀口服液中含有辅料酒石酸；所述左卡尼汀注射液中含有辅料盐酸；
(4)对照溶液的制备：
精密量取供试品溶液0.2ml至100ml容量瓶中，用流动相稀释，作为对照溶液，每1ml含左卡尼汀0.048mg；
(5)测定方法：
取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为左卡尼汀峰、左卡尼汀对映异构体峰、杂质A峰；左卡尼汀对映异构体峰与左卡尼汀峰的分离度应不小于1.5，左卡尼汀对映异构体峰与杂质A峰的分离度应不小于1.5；精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有左卡尼汀对映异构体峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积，左卡尼汀对映异构体含量不得过0.2％；
(6)计算左卡尼汀对映异构体的含量
计算公式：
10.一种左卡尼汀产品中左卡尼汀对映异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤：
(1)色谱条件
液相色谱仪：Agilent 1260
色谱柱：Astec CHIROBIOTIC TAG，250mm×4.6mm，5μm
检测器：紫外检测器，检测波长：205nm
柱温：30℃
流速：1.0ml/min
进样量：20ul
运行时间：25min
(2)溶液制备
流动相的制备：精密吸取三乙胺0.3ml，加水300ml，用稀醋酸调pH＝6.0，加甲醇1700ml，摇匀；
稀醋酸的制备：取冰醋酸60ml，加水稀释至1000ml，即得；
空白溶液：流动相；
供试品：左卡尼汀产品，所述左卡尼汀产品选自左卡尼汀原料药、左卡尼汀制剂中的一种；所述左卡尼汀制剂选自左卡尼汀注射液、左卡尼汀口服液、左卡尼汀片中的一种；所述左卡尼汀口服液中含有辅料酒石酸；所述左卡尼汀注射液中含有辅料盐酸；
供试品溶液的制备：取含0.24g左卡尼汀的供试品于流动相中，并用流动相稀释至10ml，摇匀；
对照品溶液的制备：精密称取12mg左卡尼汀对映异构体对照品，置于250ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；
系统适用性溶液的制备：精密称取左卡尼汀对照品0.24g，置于10ml容量瓶中，用对照溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；
(3)测定方法：精密量取系统性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序为左卡尼汀、左卡尼汀对映异构体，左卡尼汀与左卡尼汀对映异构体的分离度应大于1.5；精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，左卡尼汀对映异构体含量不得过0.2％；
式中：
Ws-左卡尼汀对映异构体对照品的质量，g；
As-对照品溶液中左卡尼汀对映异构体的峰面积；
A供-供试液中左卡尼汀对映异构体的峰面积；
W供-供试品的质量，g；
P-左卡尼汀对映异构体对照品的纯度，％。
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