CN110763799B - 同时检测血液中喹硫平和n-脱烷基喹硫平含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了同时检测血液中喹硫平和N‑脱烷基喹硫平含量的方法。配制至少三个含已知浓度的喹硫平标准品和N‑脱烷基喹硫平标准品的标准工作液；将标准工作液、内标工作液和空白血液样本混合，进行样本前处理得到标准溶液；利用高效液相色谱仪分别检测各个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图；根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到标准曲线方程；将内标工作液和经处理待检测血液而得到的血液样本混合，进行同样的样本前处理得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程，计算血液样本中喹硫平和N‑脱烷基喹硫平的含量。本发明能够同时检测血液中喹硫平和N‑脱烷基喹硫平的含量。

Description

同时检测血液中喹硫平和N-脱烷基喹硫平含量的方法
技术领域
本发明涉及临床化学技术领域，特别涉及同时检测血液中喹硫平和N-脱烷基喹硫平含量的方法。
背景技术
精神分裂症是由一组症状群所组成的临床综合征，是多因素的疾病。尽管目前对其病因的认识尚不很明确，但个体心理的易感素质和外部社会环境的不良因素对疾病的发生发展的作用，已被大家所共识。无论是易感素质还是外部不良因素，都可能通过内在生物学因素共同作用而导致疾病的发生，不同患者其发病的因素可能以某一方面较为重要。
喹硫平是一种新型的吩噻嗪类抗精神病药，可阻滞中枢多巴胺(Dopamine)的D1、D2受体和5-羟色胺受体(hydroxytryptamine，5-HT)5-HT2、5-HT1等多种受体而起作用，临床上对双相情感障碍和重度抑郁症(MDD)均有效，是一种被广泛用于治疗精神分裂症的一线非典型抗精神病药物和二线抗抑郁药。但该药对α1-肾上腺素受体同样有高亲和力，有阻断α1-肾上腺素受体作用，可能出现直立性低血压、头晕等副作用，需要做好患者监护。
目前已有测定血液中喹硫平含量的方法。由于其代谢物同样具有药理活性，同样会影响治疗效果，故检测其活性代谢物很有必要。因此，有必要提出能够同时检测血液中喹硫平及其代谢物N-脱烷基喹硫平含量的方法。
发明内容
本发明提供了同时检测血液中喹硫平和N-脱烷基喹硫平含量的方法，能够同时检测血液中喹硫平和N-脱烷基喹硫平的含量。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供了同时检测血液中喹硫平和N-脱烷基喹硫平含量的方法，包括：
配制至少三个标准工作液，其中，标准工作液中含有浓度已知的喹硫平标准品和N-脱烷基喹硫平标准品，不同标准工作液中同一标准品的浓度不同；
将一定量的标准工作液、内标工作液和空白血液样本混合，进行样本前处理，得到标准溶液，其中，内标工作液中含有浓度已知的内标物；
利用高效液相色谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图；
根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到喹硫平的标准曲线方程和N-脱烷基喹硫平的标准曲线方程；
将一定量的内标工作液和血液样本混合，进行同样的样本前处理，得到待测样本，其中，血液样本经处理待检测血液而得到；
利用高效液相色谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图；
根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算血液样本中喹硫平和N-脱烷基喹硫平的含量；
其中，所述进行样本前处理包括：将混合液涡旋混匀，加入碱液，涡旋混匀；加入萃取剂，涡旋混匀，离心得到上清液；移取上清液，吹干后加入复溶液，涡旋混匀，离心得到上清液。
优选地，所述碱液包括氢氧化钠溶液。
优选地，将混合液在转速为2500-3000rpm下涡旋混匀1-2min；
加入0.8-1.2mol/L的氢氧化钠溶液70-130μL，在转速为2500-3000rpm下涡旋混匀1-2min；
加入800-1200μL萃取剂，在转速为2500-3000rpm下涡旋混匀4-6min后，再在10000-15000rpm的转速下离心3-7min，得到上清液；
移取700-1000μL上清液于离心管中，在常温下用氮气吹干；
向上清吹干的离心管中加入130-170μL复溶液，在2500-3000rpm转速下涡旋混匀2-4min后，再在10000-15000rpm的转速下离心4-6min，得到上清液。
优选地，所述检测条件包括：Waters Xbridge C18色谱柱，色谱柱的长度为150mm、内径为2.1mm、填料粒径为3.5μm。
优选地，所述检测条件包括：柱温为50-60℃，流动相A为含浓度为80-120mmol/L的乙酸铵、体积比为0.15-0.25％的甲酸、体积比为0.15-0.25％的三乙胺的水，流动相B为乙腈，流速为0.2-0.4mL/min，进样量为20-40μL，分析时间为9-10min。
优选地，所述检测条件包括：单柱双泵洗脱模式；
双泵切换方式为：在6.8min从分析泵切换为清洁泵，在7.8min从清洁泵切换为分析泵；
洗脱方式为：流动相A和流动相B的体积比，在6.8-7.8min之外的其他洗脱时间范围内为69-71％：31-29％。
优选地，所述高效液相色谱仪中的紫外检测器为DAD-3000检测器，检测波长为315-325nm，采集频率为5Hz，带宽为4nm。
优选地，所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER1/16 0.5M。
优选地，内标物为吡非尼酮。
优选地，所述标准工作液中，喹硫平标准品的浓度为1000-32000ng/mL，N-脱烷基喹硫平标准品的浓度为1000-32000ng/mL，稀释液为甲醇。
本发明提供了同时检测血液中喹硫平和N-脱烷基喹硫平含量的方法。配制至少三个含已知浓度的喹硫平标准品和N-脱烷基喹硫平标准品的标准工作液；将标准工作液、内标工作液和空白血液样本混合，进行样本前处理得到标准溶液；利用高效液相色谱仪分别检测各个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图；根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到标准曲线方程；将内标工作液和经处理待检测血液而得到的血液样本混合，进行同样的样本前处理得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程，计算血液样本中喹硫平和N-脱烷基喹硫平的含量。本发明能够同时检测血液中喹硫平和N-脱烷基喹硫平的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的喹硫平的化学结构式；
图2是本发明一实施例提供的N-脱烷基喹硫平的化学结构式；
图3是本发明一实施例提供的样本前处理不包括加碱步骤时的色谱图和样本前处理包括加碱步骤时的色谱图的对比示意图；
图4是本发明一实施例提供的一种同时检测血液中喹硫平和N-脱烷基喹硫平含量的方法的流程图；
图5是本发明一实施例提供的一标准溶液中喹硫平标准品、N-脱烷基喹硫平标准品及内标物的色谱图；
图6是本发明一实施例提供的一待测样本中喹硫平、N-脱烷基喹硫平及内标物的色谱图；
图7是本发明一实施例提供的喹硫平的线性关系图；
图8是本发明一实施例提供的N-脱烷基喹硫平的线性关系图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参考图1及图2，图1示出了喹硫平的化学结构式，图2示出了N-脱烷基喹硫平的化学结构式。
经研究发现，原型(即喹硫平)、原型的代谢物(即N-脱烷基喹硫平)及内标物在血液样本前处理过程中的萃取率不同。举例来说，以吡非尼酮为内标物时，萃取率的试验结果如下述表1所示。
表1
内标物 代谢物 原型
未作前处理时标准溶液中物质的峰面积 2.1439 0.0641 0.0605
作前处理时标准溶液中物质的峰面积 1.2538 0.0417 0.055
萃取率 58.5％ 65.1％ 90.9％
表1中，未作前处理，即标准工作液、内标工作液，通过稀释直接配制得到标准溶液并上样分析。作前处理，即标准工作液、内标工作液加空白血后，进行与血液样本前处理相同的前处理操作后，得到标准溶液并上样分析。
请参考表1，未作前处理时内标物的峰面积为2.1439，而作前处理时内标物的峰面积为1.2538，可见，前处理过程对内标物的萃取有一定影响，萃取率为58.5％。
请参考表1，未作前处理时代谢物的峰面积为0.0641，而作前处理时内标物的峰面积为0.0417，可见，前处理过程对代谢物的萃取有一定影响，萃取率为65.1％。
请参考表1，未作前处理时原型的峰面积为0.0605，而作前处理时内标物的峰面积为0.055，可见，前处理过程对原型的萃取有一定影响，萃取率为90.9％。
可以看出，前处理过程中，内标物的萃取率与代谢物的萃取率，以及内标物的萃取率与原型的萃取率，均不同且相差较大。因此，为校正因原型、代谢物与内标物的萃取率不一致而带来的定值误差，获取标准曲线可采用加血前处理的方式，使得根据标准工作液制备标准溶液的前处理过程，与根据血液样本制备待测样本的前处理过程相同，以保证检测准确率。
此外，在试验研究过程中，发现作样本前处理时，若萃取前不存在加碱步骤，对样本中杂质的去除效果略差，而若萃取前存在加碱步骤，则能够有效去除样本中的杂质，具体实验结果请参考图3。
图3中，上侧的色谱图为未加碱时所得的色谱图，下侧的色谱图为加碱时所得的色谱图。请参考图3，上侧色谱图中，在2-4min之间可识别到4个色谱峰，在本发明实施例中，前三个色谱峰为杂质峰，而第4个色谱峰为目标峰。而在下侧色谱图中，在2-4min之间仅识别到目标峰，无杂质峰。
基于上述内容，通过分析认为萃取前作加碱处理，能够有效去除样本中的杂质，故在样本前处理过程中，优选在萃取前作加碱处理。通常情况下，上述碱液可以为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液等。
基于上述内容，如图4所示，本发明实施例提供了同时检测血液中喹硫平和N-脱烷基喹硫平含量的方法，可以包括以下步骤：
步骤401：配制至少三个标准工作液，其中，标准工作液中含有浓度已知的喹硫平标准品和N-脱烷基喹硫平标准品，不同标准工作液中同一标准品的浓度不同。
步骤402：将一定量的标准工作液、内标工作液和空白血液样本混合，进行样本前处理，得到标准溶液，其中，内标工作液中含有浓度已知的内标物，所述进行样本前处理包括：将混合液涡旋混匀，加入碱液，涡旋混匀；加入萃取剂，涡旋混匀，离心得到上清液；移取上清液，吹干后加入复溶液，涡旋混匀，离心得到上清液。
详细地，标准工作液经样本前处理所得到的上清液，即为标准溶液，血液样本经样本前处理所得到的上清液，即为待测样本。
详细地，空白血液样本通常可以为不含喹硫平、N-脱烷基喹硫平和内标物的血清或血浆，该空白血液样本的喹硫平、N-脱烷基喹硫平和内标物的含量检测结果，通常应为未检出。
步骤403：利用高效液相色谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图。
步骤404：根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到喹硫平的标准曲线方程和N-脱烷基喹硫平的标准曲线方程。
步骤405：将一定量的内标工作液和血液样本混合，进行同样的样本前处理，得到待测样本，其中，血液样本经处理待检测血液而得到。
步骤406：利用高效液相色谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图。
步骤407：根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算血液样本中喹硫平和N-脱烷基喹硫平的含量。
本发明实施例用内标法来检测血液样本中喹硫平及N-脱烷基喹硫平的含量，以避免因前处理过程操作失误而引起的定值偏差，故可保证检测准确率。
本发明实施例中，在萃取操作之前可加入碱液以去除样本中的杂质，从而可提高实际样本检测的准确度。
通常情况下，标准曲线方程的建立至少需要三个坐标点，以保证所建立方程的准确性，故需配制至少三个标准溶液，从而可以根据各个标准溶液检测所得到的色谱图，拟合出喹硫平的标准曲线方程和N-脱烷基喹硫平的标准曲线方程。
详细地，以喹硫平为例，拟合得到的喹硫平的标准曲线方程通常可以为y＝k×x+b。其中，x、y这两个变量，分别可以为各个标准溶液的色谱图中，喹硫平的标准品与内标物的峰面积比值，以及，各个标准溶液中，喹硫平的标准品与内标物的浓度比值。如此，根据待测样本的色谱图中，喹硫平与内标物的峰面积比值，以及待测样本中内标物的浓度，代入标准曲线方程即可计算出待测样本中喹硫平的浓度，从而得到血液样本中喹硫平的含量。当然，这一实现方式同样适用于N-脱烷基喹硫平。
本发明实施例中，血液样本通常可以为血清或血浆，经处理待检测血液而得到。采样到待检测血液后，即可作相应处理以得到血液样本。比如，取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，即得到上述血液样本。血清或血浆样本可置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。
得到血液样本后，经同样的前处理得到待测样本，在相同检测条件下检测待测样本以得到其色谱图。如上所述，基于该色谱图和拟合得到的标准曲线方程，即可得到血液样本中喹硫平及N-脱烷基喹硫平的含量。
综上所述，本发明实施例提供的这一检测血液中喹硫平及N-脱烷基喹硫平含量的方法，是将内标法与高效液相色谱法相结合，并通过相同的前处理过程来处理标准工作液和血液样本，使干扰因素大大减少，且定量准确、重现性好、特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，且成本低，分析时间短，有利于大通量血液样本的检测。
优选地，在本发明一个实施例中，上述碱液为氢氧化钠溶液时，将混合液在转速为2500-3000rpm下涡旋混匀1-2min；加入0.8-1.2mol/L的氢氧化钠溶液70-130μL，在转速为2500-3000rpm下涡旋混匀1-2min；加入800-1200μL萃取剂，在转速为2500-3000rpm下涡旋混匀4-6min后，再在10000-15000rpm的转速下离心3-7min，得到上清液；移取700-1000μL上清液于离心管中，在常温下用氮气吹干；向上清吹干的离心管中加入130-170μL复溶液，在2500-3000rpm转速下涡旋混匀2-4min后，再在10000-15000rpm的转速下离心4-6min，得到上清液。
举例来说，涡旋转速的取值可以为2500、2600、2700、2800、2900或3000；A1中涡旋时间的取值可以为1、1.2、1.5、1.7或2；氢氧化钠溶液的浓度的取值可以为0.8、0.9、1.0、1.1或1.2；氢氧化钠溶液用量的取值可以为70、90、100、110或130；A2中涡旋时间的取值可以为1、1.2、1.5、1.7或2；萃取剂用量的取值可以为800、900、1000、1100或1200；A3中涡旋时间的取值可以为4、4.5、5、5.5或6；离心转速的取值可以为10000、11000、12000、13000、14000或15000；A3中离心时间的取值可以为3、4、5、6或7；A4中上清液用量的取值可以为700、80、900或1000；复溶液用量的取值可以为130、140、150、160或170；A5中涡旋时间的取值可以为2、2.5、3、3.5或4；A5中离心时间的取值可以为4、4.5、5、5.5或6。
优选地，上述萃取剂可以为正己烷和甲基叔丁基醚的混合液，正己烷的体积比为10-20％。比如，正己烷的体积比的取值可以为10、12、15、17或20。使用该萃取剂时，可以在保证目标物萃取率较高的前提下，减少杂质的萃取。目标物即可以为原型、代谢物和内标物。
优选地，上述复溶液可以为40-60％的甲醇水溶液。举例来说，复溶液中，甲醇的百分含量可以为40％、45％、50％、55％或60％。
本发明实施例采用内标法来检测血液样本中喹硫平和N-脱烷基喹硫平的含量，可以使用如上所述的前处理方式，该前处理方法操作简单，能够避免操作带来的误差，从而能够更准确的定量。此外，由于前处理方法较为简单，故利于本发明实施例的推广应用。
基于上述内容，在本发明一个实施例中，标准工作液的用量为10μL、内标工作液的用量为10μL，空白血液样本的用量为150-250μL，三者混合后作样本前处理。举例来说，空白血液样本用量的取值可以为150、170、200、220或250。
基于上述内容，在本发明一个实施例中，内标工作液的用量为10μL，血液样本的用量为150-250μL，两者混合后作样本前处理。举例来说，血液样本用量的取值可以为150、170、200、220或250。
在本发明一个实施例中，所述检测条件包括：Waters Xbridge C18色谱柱，色谱柱的长度为150mm、内径为2.1mm、填料粒径为3.5μm。
在本发明一个实施例中，所述检测条件包括：柱温为50-60℃，流动相A为含浓度为80-120mmol/L的乙酸铵、体积比为0.15-0.25％的甲酸、体积比为0.15-0.25％的三乙胺的水，流动相B为乙腈，流速为0.2-0.4mL/min，进样量为20-40μL，分析时间为9-10min。
举例来说，柱温的取值可以为50、52、54、56、58或60；流动相A中，乙酸铵浓度的取值可以为80、90、100、110或120，甲酸及三乙胺的体积比的取值均可以为0.15、0.17、0.20、0.22或0.25；流速的取值可以为0.2、0.25、0.3、0.35或0.4；进样量的取值可以为20、25、30、35或40；分析时间的取值可以为9、9.2、9.4、9.6、9.8或10。
本发明实施例中，基于上述检测条件，分析时间可在9.5min左右，分析时间短，分析效率提高。
在本发明一个实施例中，在整个分析时间的目标物分析阶段，流动相A和流动相B的体积比为69-71％：31-29％。举例来说，流动相A和流动相B的体积比可以为69:31、69.5:30.5、70:30、70.5:29.5或71:29。
详细地，待分析的目标物包括原型、代谢物和内标物。
基于上述内容，在本发明一个实施例中，所述检测条件包括：单柱双泵洗脱模式；
双泵切换方式为：在6.8min从分析泵切换为清洁泵，在7.8min从清洁泵切换为分析泵；
洗脱方式为：流动相A和流动相B的体积比，在6.8-7.8min之外的其他洗脱时间范围内为69-71％：31-29％。
本发明实施例中，在6.8-7.8min这段时间，是清洁泵流动相进入色谱柱，以清洗色谱柱，在6.8min之前及7.8min之后的这段时间，是分析泵流动相进入色谱柱，以进行目标物分析。如此，对于分析泵流动相，流动相A和流动相B的体积比为69-71％：31-29％。在本发明一个实施例中，对于清洁泵流动相，流动相A和流动相B的体积比可以为40:60。
与单泵梯度洗脱模式相比，单柱双泵洗脱模式能在单柱的条件下，最大程度减少分析时间。与此同时，能在一定程度上减少有机试剂的使用量。
因此，本发明实施例可以缩短分析时间，提高检测通量，减少有机溶剂用量。
在本发明一个实施例中，所述高效液相色谱仪中的紫外检测器为DAD-3000检测器，检测波长为315-325nm，采集频率为5Hz，带宽为4nm。举例来说，检测波长的取值可以为315、320或325。
在本发明一个实施例中，所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSI COLPRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。
在本发明一个实施例中，内标物为吡非尼酮。
详细地，吡非尼酮是一种治疗特发性肺纤维化的药物。同使用功效相近的精神类药物作为内标相比，选用吡非尼酮作为内标具有很大的优势，可以避免联合用药给分析带来的相互干扰。且特发性肺纤维化是一种罕见病，发病发率相对低，进一步避免了联合用药的可能性。
此外，基于如上所述的检测条件，吡非尼酮在该分析条件下，可在喹硫平及N-脱烷基喹硫平之前出峰，且无基质中杂质干扰，能有效缩短分析时间。
基于上述内容，在本发明一个实施例中，所述标准工作液中，喹硫平标准品的浓度为1000-32000ng/mL，N-脱烷基喹硫平标准品的浓度为1000-32000ng/mL，稀释液为甲醇。
详细地，可以结合检测的人群、待检测血液的用量，以及人体内喹硫平及N-脱烷基喹硫平的大致含量范围，来设定相应线性范围，以保证大部分的临床样本检测结果落在可报告范围内。
比如，优选地，上述至少三个标准工作液中，喹硫平标准品的浓度及N-脱烷基喹硫平标准品的浓度，均可以为1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、4000ng/mL、8000ng/mL、16000ng/mL、32000ng/mL中的至少三个。优选地，标准工作液的个数为7个。
综上所述，本发明实施例提供的这一检测血液中喹硫平及N-脱烷基喹硫平含量的方法，是将内标法与高效液相色谱法相结合，使干扰因素大大减少，且定量准确、重现性好、特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，且成本低，分析时间短，有利于大通量血液样本的检测。
本发明实施例不仅检测了药物的原型，还同时检测了其活性代谢物，如此，可以利用本发明实施例提供的检测方法，在临床治疗中对患者体内的喹硫平及其代谢物N-脱烷基喹硫平的含量进行监测，为喹硫平及其代谢物N-脱烷基喹硫平的个性化给药、减少毒副反应的发生提供实验基础，从而更加利于指导患者用药。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。
实施例1
本发明实施例用于获取标准曲线方程。
1.1标准储备液的配制
标准储备液：精密移取100μg/mL的喹硫平标准品中间液和100μg/mL的N-脱烷基喹硫平标准品中间液各320μL，置于1.5mL离心管，用甲醇进行稀释，得到标准储备液。所得标准储备液中喹硫平标准品及N-脱烷基喹硫平标准品的浓度均为32000ng/mL。
1.2内标储备液的配制
内标储备液：精确称取吡非尼酮标准品5mg于5mL容量瓶，用甲醇溶解，并定容至5mL，得到内标储备液。
1.3检测用仪器
赛默飞U3000高效液相色谱仪。
1.4检测条件
1.4.1色谱柱
Waters Xbridge C18色谱柱，色谱柱的长度为150mm、内径为2.1mm、填料粒径为3.5μm。
1.4.2流动相
流动相A：含浓度为100mmol/L的乙酸铵、体积比为0.2％的甲酸、体积比为0.2％的三乙胺的水。
流动相B：乙腈。
1.4.3洗脱方式
单柱双泵洗脱模式。
双泵切换方式如下述表2所示。在0-6.8min及7.8-9.5min内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；在6.8-7.8min内，流动相A和流动相B的体积比为40:60。
表2
序号 时间/min ValveLeft
1 {初始时间} 10_1
2 6.800 1_2
3 7.800 10_1
表2中，10_1标识分析泵，1_2标识从分析泵切换为清洁泵。
清洁泵的控制如下述表3所示。
表3
Figure BDA0002296668080000131
分析泵的控制如下述表4所示。
表4
Figure BDA0002296668080000141
1.4.4其他
分析时间为9.5min；柱温为55℃；进样量为30μL；流速为0.3mL/min。
1.4.5检测器
紫外检测器是DAD-3000检测器，其检测波长为320nm，采集频率为5Hz，带宽为4nm。
1.4.6在线过滤器
在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。
1.5标准工作液的配制
标准工作液：取适量标准储备液，用甲醇进行稀释，配制成喹硫平标准品及N-脱烷基喹硫平标准品的浓度，均分别为1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、4000ng/mL、8000ng/mL、16000ng/mL、32000ng/mL的标准工作液，并在-80℃条件下保存。
可见，七个标准工作液中，喹硫平标准品及N-脱烷基喹硫平标准品的浓度不同且依次递增。
1.6内标工作液的配制
内标工作液：取适量内标储备液，用50％的甲醇水溶液进行稀释，得到吡非尼酮浓度为5μg/mL的内标工作液，内标工作液-80℃条件下保存。
1.7标准溶液的配制
用移液器分别移取10μL标准工作液、10μL内标工作液和190μL空白血清或血浆，分别置于1.5mL离心管中，在转速为2800rpm下涡旋混匀1min后，加入1mol/L NaOH溶液100μL，并在转速为2800rpm下涡旋混匀1min后，加入1000μL正己烷和甲基叔丁基醚的混合液(正己烷：甲基叔丁基醚为15：85)，并在转速为2800rpm下涡旋混匀5min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取900μL上清液放入另一支1.5mL离心管中，在常温下用N2缓慢吹干，向吹干的离心管中加入150μL 50％的甲醇水溶液(甲醇：水为50:50)，然后在2800rpm转速下涡旋混匀3min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，取上清液作为待检测的标准溶液。
如此，针对七个标准工作液，可以得到七个标准溶液。
1.8检测标准溶液，生成标准曲线方程
得到各个标准溶液后，即可利用高效液相色谱仪对七个标准溶液分别进行检测，对应得到各个标准溶液的色谱图。
请参考图5，图5示出了一标准溶液中喹硫平标准品、N-脱烷基喹硫平及内标物(即吡非尼酮标准品)的色谱图。
以喹硫平为例，从标准溶液的色谱图中，可以得到喹硫平标准品的色谱峰面积和吡非尼酮标准品的色谱峰面积，然后结合各个标准溶液中喹硫平标准品和吡非尼酮标准品的已知浓度，即可得到喹硫平的标准曲线方程。同理，可以得到N-脱烷基喹硫平的标准曲线方程。
请参考图7，图7示出了得到的喹硫平线性关系图，根据线性关系图，可以得到喹硫平的标准曲线方程：Y＝0.1812×X+0.4987，相关系数R2＝0.99717，Y为喹硫平与内标的浓度比，X为喹硫平与内标的面积比。
可以看出，喹硫平在50-1600ng/mL线性范围内相关系数R2＞0.9900，表示线性关系良好，基于该标准曲线方程来计算血液样本中喹硫平的含量时，准确性高，误差小。
请参考图8，图8示出了得到的N-脱烷基喹硫平线性关系图，根据线性关系图，可以得到N-脱烷基喹硫平的标准曲线方程：Y＝0.1561×X-1.4076，相关系数R2＝0.99782，Y为N-脱烷基喹硫平与内标的浓度比，X为N-脱烷基喹硫平与内标的面积比。
可以看出，N-脱烷基喹硫平在50-1600ng/mL线性范围内相关系数R2＞0.9900，表示线性关系良好，基于该标准曲线方程来计算血液样本中N-脱烷基喹硫平的含量时，准确性高，误差小。
得到标准曲线方程后，即可对血液样本作前处理，以得到待测样本，进而在相同检测条件下，对待测样本进行检测，结合得到的各个标准曲线方程，即可得到血液样本中喹硫平及N-脱烷基喹硫平的含量。
实施例2
本发明实施例用于检测静脉血中喹硫平及N-脱烷基喹硫平的含量。
2.1获取血液样本
血液样本经处理至少5mL待检测血液而得到。得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。
2.2血液样本前处理
用移液枪移取10μL内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入200μL血液样本，在转速为2800rpm下涡旋混匀1min后，加入1mol/L NaOH溶液100μL，并在转速为2800rpm下涡旋混匀1min后，加入1000μL正己烷和甲基叔丁基醚的混合液(正己烷：甲基叔丁基醚为15：85)，并在转速为2800rpm下涡旋混匀5min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取900μL上清液放入另一支1.5mL离心管中，在常温下用N2缓慢吹干，向吹干的离心管中加入150μL 50％的甲醇水溶液(甲醇：水为50:50)，然后在2800rpm转速下涡旋混匀3min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，取上清液作为待检测的标准溶液。
2.3待测样本检测
在实施例1的检测条件下，使用同一高效液相色谱仪对待测样本进行检测，得到待测样本的色谱图。
请参考图6，图6示出了待测样本中喹硫平、N-脱烷基喹硫平及内标物(即吡非尼酮标准品)的色谱图。
请参考图5和图6，待测样本中喹硫平的保留时间与标准溶液中喹硫平标准品的保留时间相一致，待测样本中N-脱烷基喹硫平的保留时间与标准溶液中N-脱烷基喹硫平标准品的保留时间相一致，以吡非尼酮为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜、特异性强、准确度和灵敏度高。
此外，上面提到，为规避因原型萃取率、代谢物萃取率与内标萃取率不一致所带来的定值偏差，标准工作液和血液样本会进行相同的前处理过程，使得经相同前处理后，标准溶液及待测样本的色谱图中通常均只有原型、代谢物及内标的色谱峰，色谱柱洗脱阶段的溶剂峰也基本一致，未发现其他明显的杂质。基于此，也说明了上述前处理方法比较合理，未引入基质中的其他物质。
2.4待测样本中喹硫平及N-脱烷基喹硫平含量的计算
根据待测样本的色谱图中，喹硫平、N-脱烷基喹硫平和内标物的色谱峰面积，以及待测样本中内标物的已知浓度，代入上述2个标准曲线方程，即可计算出待测样本中喹硫平及N-脱烷基喹硫平的含量。
实施例3
本发明实施例用于测定定量限和检测限。
选择适当浓度的标准溶液，用空白血液做不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的血液样本稀释液，并按实施例2中的血液样本前处理方式及测定条件，对这些血液样本稀释液进行测定。
经检测发现，喹硫平的检测限和定量限如下所示：
(1)检测限(LOD)：5.0ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：7.5ng/mL。
经检测发现，N-脱烷基喹硫平的检测限和定量限如下所示：
(1)检测限(LOD)：5.0ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：7.5ng/mL。
由本实施例可知，喹硫平的检测限可低至5.0ng/mL，定量限可低至7.5ng/mL，N-脱烷基喹硫平的检测限可低至5.0ng/mL，定量限可低至7.5ng/mL，灵敏度高，可以提高低浓度样本的平行性，增强准确度。
由于灵敏度高，故本发明实施例对待检测血液的样本量的要求会更加的宽泛，从而提高样本检测的整体准确度。此外，本发明实施例对喹硫平及N-脱烷基喹硫平含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。
实施例4
本发明实施例用于测定回收率和精密度。
取标准工作液，配制成高、中、低3种浓度，进行加样回收率和精密度实验，按实施例2中的检测方法进行测定，分析测定3批次，喹硫平及N-脱烷基喹硫平的回收率和精密度如表6所示。
表6
Figure BDA0002296668080000181
可以看出，喹硫平及N-脱烷基喹硫平在低、中、高的3个添加水平范围内，平均回收率为96.1％～98.4％，重现性良好，加样回收率良好，精密度为1.6％～2.5％，检测结果的准确度较高，可消除系统误差。
对比例1
HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，公开号为CN109142593A。
一、检测对象
对比例1可检测血液中喹硫平的含量，但未检测血液中N-脱烷基喹硫平的含量。而本发明实施例可同时检测血液中喹硫平及N-脱烷基喹硫平的含量。
对比例1仅检测了药物原型的血药浓度，而根据神经精神药理学治疗药物血药监测共识指南描述，其代谢物也具有药理活性，同样会影响治疗效果。本发明实施例不仅检测了药物的原型，还同时检测了其活性代谢物，如此，可以利用本发明实施例提供的检测方法，在临床治疗中对患者体内的喹硫平及其代谢物N-脱烷基喹硫平的含量进行监测，为喹硫平及其代谢物N-脱烷基喹硫平的个性化给药、减少毒副反应的发生提供实验基础，从而更加利于指导患者用药。
二、样本前处理
(1)对比例1中，样本前处理过程中，在萃取前未执行加碱操作。而本发明实施例中，样本前处理过程中，在萃取前执行加碱操作。
与对比例1相比，由于在萃取前执行加碱操作，故本发明实施例能够有效去除样本中的杂质，从而提高检测准确率。
(2)对比例1中，前处理过程包括在线前处理和离线前处理两步，而本发明实施例只有一步前处理，简化了前处理过程。
对比例1中，因为在线前处理的缘故，故其虽采用双泵，但是色谱柱上的分析过程均用分析泵完成，使得分析时间偏长。而本发明实施例不存在这一问题。
三、分析时间
对比例1中，以染料木素为内标物，内标物在2.6-3.0min间出峰，喹硫平在4.2-4.6min间出峰，分析时间为11.5min。而本发明实施例中，以吡非尼酮为内标物，内标物在2.9min左右出峰，N-脱烷基喹硫平在4.1min左右出峰，喹硫平在5.9min左右出峰，分析时间为9.5min。
可见，本发明实施例的分析时间明显缩短，极大地提高了分析效率，有利于大通量血液样本的检测。
四、检测限、定量限、回收率及精密度
对比例1中，对血液中的喹硫平含量进行检测，喹硫平在50-3000ng/mL线性范围内呈线性，检测限未显示，定量限为50ng/mL，低点回收率为94.18-100.13％，中点回收率为102.4-102.6％，高点回收率为92.95-94.35％，低点精密度为4.27％，中点精密度为3.33％，高点精密度为5.62％。
而本发明实施例中，喹硫平在50-1600ng/mL线性范围内呈线性，检测限为5.0ng/mL，定量限为7.5ng/mL，N-脱烷基喹硫平在50-1600ng/mL线性范围内呈线性，检测限为5.0ng/mL，定量限为7.5ng/mL，平均回收率为96.1％～98.4％，精密度(RSD)为1.6％～2.5％。
可以看出，对于喹硫平来说，本发明实施例的检测限、定量限及精密度，均优于对比例1，回收率与对比例1基本一致。对于N-脱烷基喹硫平来说，本发明实施例的检测限、定量限、回收率及精密度均较佳。
因此，本发明实施例的检测限和定量限更低，检测方法的灵敏度更高，回收率及精密度好，使得对样本量的要求可以更加的宽泛，样本检测的整体准确度更高。
综上所述，与对比例1相比，本发明实施例提供的血液中喹硫平及N-脱烷基喹硫平含量的检测方法，具有样本前处理简单、分析时间短、内标选取合理、检测灵敏度高、回收率和精密度好、检测准确率高、检测成本低等优点，利于大量样本的检测，故在临床检测领域更具优势。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.同时检测血液中喹硫平和N-脱烷基喹硫平含量的方法，其特征在于，包括：
配制至少三个标准工作液，其中，标准工作液中含有浓度已知的喹硫平标准品和N-脱烷基喹硫平标准品，不同标准工作液中同一标准品的浓度不同；
将一定量的标准工作液、内标工作液和空白血液样本混合，进行样本前处理，得到标准溶液，其中，内标工作液中含有浓度已知的内标物，内标物为吡非尼酮；
利用高效液相色谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图；
根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到喹硫平的标准曲线方程和N-脱烷基喹硫平的标准曲线方程；
将一定量的内标工作液和血液样本混合，进行同样的样本前处理，得到待测样本，其中，血液样本经处理待检测血液而得到；
利用高效液相色谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图，所述检测条件包括：Waters Xbridge C18色谱柱，色谱柱的长度为150mm、内径为2.1mm、填料粒径为3.5μm，检测波长为315-325nm，单柱双泵洗脱模式，柱温为50-60℃，流动相A为含浓度为80-120mmol/L的乙酸铵、体积比为0.15-0.25%的甲酸、体积比为0.15-0.25%的三乙胺的水，流动相B为乙腈，流速为0.2-0.4mL/min，进样量为20-40μL，分析时间为9-10min；在6.8min从分析泵切换为清洁泵，在7.8min从清洁泵切换为分析泵；洗脱方式为：流动相A和流动相B的体积比，在6.8-7.8min之外的其他洗脱时间范围内为69-71%：31-29%；
根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算血液样本中喹硫平和N-脱烷基喹硫平的含量；
其中，所述进行样本前处理包括：将混合液涡旋混匀，加入碱液，涡旋混匀；加入萃取剂，所述萃取剂为正己烷和甲基叔丁基醚的混合液，正己烷：甲基叔丁基醚为15：85，涡旋混匀，离心得到上清液；移取上清液，吹干后加入复溶液，涡旋混匀，离心得到上清液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述碱液包括氢氧化钠溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
将混合液在转速为2500-3000rpm下涡旋混匀1-2min；
加入0.8-1.2mol/L的氢氧化钠溶液70-130μL，在转速为2500-3000rpm下涡旋混匀1-2min；
加入800-1200μL萃取剂，在转速为2500-3000rpm下涡旋混匀4-6min后，再在10000-15000rpm的转速下离心3-7min，得到上清液；
移取700-1000μL上清液于离心管中，在常温下用氮气吹干；
向上清吹干的离心管中加入130-170µL复溶液，在2500-3000rpm转速下涡旋混匀2-4min后，再在10000-15000rpm的转速下离心4-6min，得到上清液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述高效液相色谱仪中的紫外检测器为DAD-3000检测器，采集频率为5Hz，带宽为4nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。
6.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于，
所述标准工作液中，喹硫平标准品的浓度为1000-32000ng/mL，N-脱烷基喹硫平标准品的浓度为1000-32000ng/mL，稀释液为甲醇。
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