CN108152387A - 一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法 - Google Patents

一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法 Download PDF

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杨慧
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刘成江
李宇辉
鲁立良
郭安民
张强
雷用东
宋方圆
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Abstract

本发明公开了一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法，该方法包括以下步骤：步骤1、定量工作曲线；步骤2、色谱条件；步骤3、质谱条件。本发明建立了测定环磷酸腺苷的高效液相色谱串联质谱法方法，该方法具有分析时间短、分离度好、灵敏度高、抗基质干扰能力强、操作简便的特点。另外，高效液相色谱串联质谱法能够提供化合物母离子和子离子的精确分子量信息，可以推断出分子式，非常适用于化合物的结构解析和辨别。为后期研究机体内环磷酸腺苷的含量提供了科学的研究分析方法。

Description

一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法
技术领域
本发明属于化学技术领域，涉及一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法。
背景技术
环磷酸腺苷自被发现以后，全世界有上千个实验室都在研究这一神奇的分子。科学家们发现，地球上绝大多数的生物物种中都含有环磷酸腺苷这种物质，但是和其他信号物质一样，其含量非常微小，难以提取，只能从动物肝脏中提取极微量的环磷酸腺苷。以前，市场上只有用于静脉注射的化学合成的药用级环磷酸腺苷产品，产量小，其价格远远高于黄金的价格。1979年和1984年两位日本科学家发现中国独有的枣果中含有丰富的环磷酸腺苷，是一般动植物材料中含量的数万倍，这一发现为科学家们研究天然环磷酸腺苷的提取指引了新的方向。
环磷酸腺苷相对分子质量只有329.21，在有些机体内的含量极低，为pmol/L级别，用常规的化学分析方法无法测定。目前现行的环磷酸腺苷检测方法包括纸色谱法、薄层色谱法、蛋白结合分析法、放射免疫分析法、高效液相色谱法和ELISA检测试剂盒等方法来测定。其中，纸色谱法、薄层色谱法、蛋白结合分析法、放射免疫分析法等方法操作繁琐且时间长、灵敏度低；高效液相色谱法抗基质干扰能力差；ELISA检测试剂盒价格昂贵，使用受限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法。
其具体技术方案为：
一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法，包括以下步骤：
步骤1、定量工作曲线
取cAMP的对照品适量，精密称定，加超纯水配制成1.00mg/mL的混合储备液，于4℃保存；使用时用超纯水稀释，配制成cAMP质量浓度为0.010、1.00、10.00、50.00、100.0、500.0、1000.0ng/mL的混合对照品溶液；
步骤2、色谱条件
ZORBAX SB-Aq C18色谱柱(3.5um，4.6mm x 150mm)，柱温为20-40℃，以水-乙腈(40：60-40:50)为流动相，流速为0.5-0.7mL/min，进样量4-6uL。
步骤3、质谱条件
采用ESI(电喷雾离子源)，正离子检测，雾化气(N2)压力设为0.27-0.29MPa；干燥气(N2)的流速设为9-11L/min，干燥气(N2)的温度设为340-360℃。多反应监测(MRM)模式监测反应质荷比为(m/z)：330.10-136.00。碎裂电压为130-150V；碰撞能量为24-26V。
进一步，步骤2中，以水-乙腈40：60为流动相,柱温为30℃，流速为0.6mL/min，进样量5uL。
进一步，步骤3中，雾化气(N2)压力设为0.28MPa；干燥气(N2)的流速设为10L/min，干燥气(N2)的温度设为350℃，碎裂电压为140V；碰撞能量为25V。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明建立了测定环磷酸腺苷的高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)方法，该方法具有分析时间短、分离度好、灵敏度高、抗基质干扰能力强、操作简便的特点。另外，高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)能够提供化合物母离子和子离子的精确分子量信息，可以推断出分子式，非常适用于化合物的结构解析和辨别。为后期研究机体内环磷酸腺苷的含量提供了科学的研究分析方法。
附图说明
图1是环磷酸腺苷的总离子流图；
图2是红枣空白样品中添加环磷酸腺苷的总离子流图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法，包括以下步骤：
步骤1、定量工作曲线
取cAMP的对照品适量，精密称定，加超纯水配制成1.00mg/mL的混合储备液，于4℃保存；使用时用超纯水稀释，配制成cAMP质量浓度为0.010、1.00、10.00、50.00、100.0、500.0、1000.0ng/mL的混合对照品溶液；
步骤2、色谱条件
规格为3.5um，4.6mm x 150mm的ZORBAX SB-Aq C18色谱柱，柱温为20℃，以水-乙腈40：60为流动相，流速为0.5mL/min，进样量4uL；
步骤3、质谱条件
采用ESI，正离子检测，雾化气N2压力设为0.27MPa；干燥气N2的流速设为9L/min，干燥气N2的温度设为340℃；多反应监测模式监测反应质荷比为m/z：330.10-136.00；碎裂电压为130V；碰撞能量为24V。
实施例2
一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法，包括以下步骤：
步骤1、定量工作曲线
取cAMP的对照品适量，精密称定，加超纯水配制成1.00mg/mL的混合储备液，于4℃保存；使用时用超纯水稀释，配制成cAMP质量浓度为0.010、1.00、10.00、50.00、100.0、500.0、1000.0ng/mL的混合对照品溶液；
步骤2、色谱条件
规格为3.5um，4.6mm x 150mm的ZORBAX SB-Aq C18色谱柱，柱温为30℃，以水-乙腈40：55为流动相，流速为0.6mL/min，进样量5uL；
步骤3、质谱条件
采用ESI，正离子检测，雾化气N2压力设为0.28MPa；干燥气N2的流速设为10L/min，干燥气N2的温度设为350℃；多反应监测模式监测反应质荷比为m/z：330.10-136.00；碎裂电压为140V；碰撞能量为25V。
实施例3
一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法，包括以下步骤：
步骤1、定量工作曲线
取cAMP的对照品适量，精密称定，加超纯水配制成1.00mg/mL的混合储备液，于4℃保存；使用时用超纯水稀释，配制成cAMP质量浓度为0.010、1.00、10.00、50.00、100.0、500.0、1000.0ng/mL的混合对照品溶液；
步骤2、色谱条件
规格为3.5um，4.6mm x 150mm的ZORBAX SB-Aq C18色谱柱，柱温为40℃，以水-乙腈40：50为流动相，流速为0.7mL/min，进样量6uL；
步骤3、质谱条件
采用ESI，正离子检测，雾化气N2压力设为0.29MPa；干燥气N2的流速设为11L/min，干燥气N2的温度设为360℃；多反应监测模式监测反应质荷比为m/z：330.10-136.00；碎裂电压为150V；碰撞能量为26V。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种红枣中环磷酸腺苷的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、定量工作曲线
取cAMP的对照品适量，精密称定，加超纯水配制成1.00mg/mL的混合储备液，于4℃保存；使用时用超纯水稀释，配制成cAMP质量浓度为0.010、1.00、10.00、50.00、100.0、500.0、1000.0ng/mL的混合对照品溶液；
步骤2、色谱条件
规格为3.5um，4.6mmx150mm的ZORBAX SB-Aq C18色谱柱，柱温为20-40℃，以水-乙腈40：60-40:50为流动相，流速为0.5-0.7mL/min，进样量4-6uL；
步骤3、质谱条件
采用ESI，正离子检测，雾化气N2压力设为0.27-0.29MPa；干燥气N2的流速设为9-11L/min，干燥气N2的温度设为340-360℃；多反应监测模式监测反应质荷比为m/z：330.10-136.00；碎裂电压为130-150V；碰撞能量为24-26V。
2.根据权利要求1所述的红枣中环磷酸腺苷的分析方法，其特征在于，步骤2中，以水-乙腈40：60为流动相,柱温为30℃，流速为0.6mL/min，进样量5uL。
3.根据权利要求1所述的红枣中环磷酸腺苷的分析方法，其特征在于，步骤3中，雾化气N2压力设为0.28MPa；干燥气N2的流速设为10L/min，干燥气N2的温度设为350℃，碎裂电压为140V；碰撞能量为25V。
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