CN104585651A - 一种标准化红枣提取物及其制备和分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种标准化红枣提取物及其制备和分析方法，20kg红枣，粉碎，用乙酸乙酯冷浸，料液比1∶3，每次冷浸时间48h，共冷浸2次；在40℃下减压浓缩，得浸膏约157g；冷浸过后的红枣，用60％乙醇水回流提取一次，提取时间2小时，用乙酸乙酯萃取2次，和冷浸的样品合并得167g，水层得浸膏200g。此外，本发明还公开了不同种红枣的提取工艺以及枣粉、香味枣粉的制备方法，及一种标准化的红枣提取物的分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种从水果中提取的化学活性成分及其制备和分析方法，具体，涉及一种标准化红枣提取物及其制备和分析方法。
背景技术
枣树属于鼠李科植物，原产于我国，在我国已有四千多年的种植历史。从资源总量分析来看，我国现有枣树栽培面积60多万公顷，枣的总产量达110多万吨，其中陕西、河北、河南、山东、山西5省的产量约占全国总产量的90％以上。红枣是我国第一大干果资源，目前，我国是商品枣的生产和出口贸易大国，种植面积和产量均居世界首位。随着人们保健意识的增强，工业化生产保健品食品是大势所趋，是人们对保健食品所具有的特殊疗效迫切需求的必然结果。因此大力开发研究红枣保健品有着广阔的市场前景和较高的经济效益及社会效益。虽然，除传统的干枣、蜜枣、熏枣、酒枣外，红枣的各种固体饮料、液体饮料，红枣保健食品等新产品不断出现。但是，红枣加工业总体技术含量较低，产品档次不高，技术设备落后，加工的精度、深度、综合利用程度较差，而且未能形成规模化生产。市场上的红枣产品较为单一，很难满足消费者的需求。这就大大影响了红枣资源优势向商品优势的转化和枣区经济的发展，以及产业结构的调整。据近十年资料统计，每年因雨水等灾害而腐烂损失的红枣数量占总产量的20％-30％。因此，在红枣规模化、示范化生产的同时，加强红枣深加工及其综合利用的研究，开发红枣新产品具有重要意义。
由于枣属植物广泛的生理活性，对其化学成分的研究引起了人们的关注。随着保健意识的增强，健康食品的销量逐渐攀升，用枣属植物制成的保健品也呈现广阔的市场空间。红枣中的营养成分包括有机营养成分(如粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、总糖等)、维生素(如VC、VP1、VB2、VP、VA、VE等)、矿质元素(P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn等)、生物活性成分(如有机酸、三萜类、黄酮类、腺苷、皂苷、生物碱类、甾醇、红枣多糖等)。红枣中的各类成分含量会因品种和产地不同而有差异。虽然市场上出现了一些红枣深加工产品，很好的延伸了陕西红枣产业链条，提高了产业效益，但是为在国内和国际市场中稳稳的占据一席之地，应该进一步研制开发出附加值更高的红枣新产品，从而提升陕北红枣品味和生产效益。
而目前存在的问题是，市场上的红枣产品都缺少质量标准化控制，尤其对于红枣提取物，更欠缺标准化功能成分的制备和分析方法。因此，需要有一种标准化红枣提取物的有效制备方法和分析方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种红枣提取物及其制备和分析方法。其具体技术方案为：
一种标准化红枣提取物的制备方法，包括以下步骤：20kg红枣，粉碎，用乙酸乙酯冷浸，料液比1∶3，每次冷浸时间48h，共冷浸2次；在40℃下减压浓缩，得浸膏约157g；冷浸过后的红枣，用60％乙醇水回流提取一次，提取时间2小时，用乙酸乙酯萃取2次，和冷浸的样品合并得167g，水层得浸膏200g；
浸膏167g，以200g硅胶拌样，400g硅胶装柱，进行硅胶柱层析，柱体积1.5L。用石油醚/丙酮做洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1，每个梯度收集两个柱体积。所得各馏分通过LCMS分析检测，合并为4个组分，分别命名为ZJM-EA-1(石油醚/丙酮50∶1)，ZJM-EA-5(石油醚/丙酮30∶1～10∶1)，ZJM-EA-7(石油醚/丙酮5∶1～1∶1)，ZJM-EA-11(石油醚/丙酮0∶1)。馏分ZJM-EA-5(石油醚/丙酮30∶1～10∶1)15g，通过Flash(ODS C18)中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法共分离得到8个化合物，ZJM-EA-5-F11-P1，ZJM-EA-5-F11-P2，ZJM-EA-5-F14-P1，ZJM-EA-5-F15-P1，ZJM-EA-5-F17-P2-2，ZJM-EA-5-F24-S8-P1H-1，ZJM-EA-5-F24-S8-P1-2。ZJM-EA-7(石油醚/丙酮5∶1～1∶1)9.8g，通过Flash(ODS C18)中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法得到11化合物，ZJM-EA-7-F4-2，ZJM-EA-7-F8-3，ZJM-EA-7-F9-2-P1，ZJM-EA-7-F12-1，ZJM-EA-7-F18-1B，ZJM-EA-7-F19-2，ZJM-EA-7-F19-3-P2-S，ZJM-EA-7-F19-4-S1，ZJM-EA-7-F19-4-S2，ZJM-EA-7-F20-3-P1，ZJM-EA-7-F20-3-P4。组分ZJM-EA-11(石油醚/丙酮0∶1)17g，通过Flash(ODS C18)中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法共分离得到7个化合物，ZJM-EA-11-F4-S13-P1，ZJM-EA-11-F4-S13-P3，ZJM-EA-11-F4-S13-P4(同ZJM-EA-7-F8-3)，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S1，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S2，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S3，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S4。ZJM-W约200g过D101大孔吸附树脂，得馏分ZJM-W-D0，ZJM-W-D30和ZJM-W-D100。馏分ZJM-W-D30，通过Flash(ODS C18)中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法共分离得到2个化合物，ZJM-W-D30-F6-6和ZJM-W-D30-F6-1-P1。
本发明所述方法制备的标准化红枣提取物，包括以下成分：
本发明所述标准化红枣提取物的分析方法，包括以下步骤：
步骤1各化合物标准品的配制：
1mg/mL标准溶液：用电子天平准确称取化合物1-27各5.0mg(精确至0.001g)，用2mL甲醇溶解，并定容至5.0mL容量瓶中，冷冻保存。
分别取50μL、200μL、400μL、600μL、800μL上述标准溶液至5.0mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀后配制成浓度为10mg/L、40mg/L、80mg/L、150mg/L、200mg/L的系列标准溶液。
分别进样10μL，以特定色谱条件进行HPLC分析。以峰面积Y对质量浓度C进行线性回归，得到回归方程和相关系数。
步骤2所测样品前处理：
准确称取不同种类红枣各10.0g，分别加入适量无水乙醇和水，70°超声提取2h，过滤。滤液真空浓缩后定容至10mL，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后备用。分别进样80μL，以特定色谱条件进行HPLC分析。
步骤3高效液相色谱条件：
色谱柱：Phenomenex Luna C-18(250mm×4.6mm 5um)
柱温：30℃
流动相：A(0.1％醋酸水溶液)-B(甲醇)
流速：1mL/min
进样量：10μL(标准品进样量)，80μL(样品进样量)
检测波长：254nm，320nm
步骤4各化合物标准曲线的绘制
得出所有标准品的线性范围为10-200mg/L(R2＞0.99)。
步骤5样品中含量测定
分别精密称取不同批次的红枣样品，按上述方法配置成溶液后按含量测定的HPLC方法进行测定，公式为：
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了红枣产品的质量标准化控制，尤以及红枣提取物标准化功能成分的制备和分析方法。
附图说明
图1为红枣中的三萜类化合物；
图2为红枣中的黄酮类化合物；
图3为红枣中的其他类化合物；
图4为红枣中标准品的结构式；
图5为红枣中标准品DZ1-DZ27的HPLC以及UV谱图；
图6为枣叶1-ETOH的HPLC谱图及其与标准品的对照(254nm)；
图7为枣叶1-ETOH的HPLC谱图及其与标准品的对照(320nm)；
图8为ZJM提取分离流程图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图和具体实例进一步阐述本发明。
1各化合物标准品的配制
1mg/mL标准溶液：用电子天平准确称取化合物1-27各5.0mg(精确至0.001g)，用2mL甲醇溶解，并定容至5.0mL容量瓶中，冷冻保存。
分别取50μL、200μL、400μL、600μL、800μL上述标准溶液至5.0mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀后配制成浓度为10mg/L、40mg/L、80mg/L、150mg/L、200mg/L的系列标准溶液。
分别进样10μL，以特定色谱条件进行HPLC分析。以峰面积Y对质量浓度C进行线性回归，得到回归方程和相关系数。
2所测样品前处理
准确称取不同种类红枣各10.0g，分别加入适量无水乙醇和水，70°超声提取2h，过滤。滤液真空浓缩后定容至10mL，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后备用。分别进样80μL，以特定色谱条件进行HPLC分析。
3高效液相色谱条件
色谱柱：Phenomenex Luna C-18(250mm×4.6mm 5um)
柱温：30℃
流动相：A(0.1％醋酸水溶液)-B(甲醇)
流速：1mL/min
进样量：10μL(标准品进样量)，80μL(样品进样量)
检测波长：254nm，320nm
4各化合物标准曲线的绘制
表1各化合物标准曲线
得出所有标品的线性范围为10-200mg/L(R2＞0.99)。
5样品中含量测定
分别精密称取不同批次的红枣样品，按上述方法配置成溶液后按含量测定的HPLC方法进行测定。结果见表2。
样品编号：
表2样品含量测定结果
注：提取率＝提取液中的固体含量/样品量.
6红枣提取及制备工艺
6.1不同种类红枣提取工艺
以新疆和田红枣为例。将新疆和田红枣去核后粉碎至小块状，准确称取两份，每份1Kg。分别用无水乙醇和水浸泡一天。过滤滤液，滤渣进行二次提取。两次提取液合并之后真空浓缩至浸膏。计算提取率，并进行HPLC分析。
其他红枣样品的提取工艺同于上。
表3样品提取率测定结果
6.2枣粉、香味枣粉的制备工艺及成分分析
取3Kg去核后的佳县狗头枣，分为3组(A组、B组、C组)，每组各1Kg。
A组：80℃，烘16h。粉碎。
B组：80℃，烘16h；120℃，再烘1h。待放凉后将其进行粉碎，得到干燥枣粉。
C组：80℃，烘16h；150℃，再烘0.5h。待放凉后将其进行粉碎，得到具有焦糊味的香味枣粉。
从A、B、C三组枣粉中准确称取各20.0g，分为两份，每份10.0g。分别加入适量无水乙醇和水，70°超声提取2h，过滤。滤液真空浓缩后定容至10mL，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后备用。计算提取率，并分别进样80μL，以特定色谱条件进行HPLC分析。
表4枣粉提取率测定结果
| No. | 提取率(w％) |
| A-EtOH | 9.28 |
| A-H2O | 40.80 |
| B-EtOH | 10.86 |
| B-H2O | 48.30 |
| C-EtOH | 11.22 |
| C-H2O | 50.65 |
红枣中化合物的结构式：红枣通过分离纯化共得到化合物27个，其中三萜类化合物9个，黄酮类3个，其他类15个。如图1-图3所示。
红枣中的标准品结构式如图4所示。
红枣中标准品的HPLC以及UV谱图如图5所示。
红枣中样品的HPLC谱图以及和标准品的对照如图6-图7所示。
红枣(ZJM)样品提取分离
1仪器及试剂
1.1检测用仪器
Agilent 1200LC/MS系统，包括以下部分：
G1322A Degasser
G1312A Bin pump
G1367B Hip-ALS
G1316A TCC
G1315D DAD
6110 Quadrupole MS
ChemStation工作站
Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪系统，包括以下部分：
DAU-20A3 Degasser
LC-20AD Pump
SPD-M20A DAD
SIL-20A Auto sample
CTO-20A Column oven
LcSolution工作站
1.2试剂
ZJM提取分离
在2012年8月到2013年4月期间，对红枣(ZJM)的化学成分进行了系统分离，采用硅胶柱层析、中压色谱柱层析、凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法共分离得到27个化合物，并鉴定了其结构。
一.提取
20kg红枣，粉碎，用乙酸乙酯冷浸，料液比1∶3，每次冷浸时间48h，共冷浸2次；在40℃下减压浓缩，得浸膏约157g；冷浸过后的红枣，用60％乙醇水回流提取一次，提取时间2小时，用乙酸乙酯萃取2次，和冷浸的样品合并得167g，水层得浸膏约200g。
二.分离
浸膏167g，以200g硅胶拌样，400g硅胶装柱，进行硅胶柱层析，柱体积1.5L。用石油醚/丙酮做洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1，每个梯度收集两个柱体积。所得各馏分通过LCMS分析检测，合并为4个组分，分别命名为ZJM-EA-1(石油醚/丙酮50∶1)，ZJM-EA-5(石油醚/丙酮30∶1～10∶1)，ZJM-EA-7(石油醚/丙酮5∶1～1∶1)，ZJM-EA-11(石油醚/丙酮0∶1)。馏分ZJM-EA-5(石油醚/丙酮30∶1～10∶1)15g，通过Flash(ODS C18)中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法共分离得到8个化合物，ZJM-EA-5-F11-P1，ZJM-EA-5-F11-P2，ZJM-EA-5-F14-P1，ZJM-EA-5-F15-P1，ZJM-EA-5-F17-P2-2，ZJM-EA-5-F24-S8-P1H-1，ZJM-EA-5-F24-S8-P1-2。ZJM-EA-7(石油醚/丙酮5∶1～1∶1)9.8g，通过Flash(ODS C18)中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法得到11化合物，ZJM-EA-7-F4-2，ZJM-EA-7-F8-3，ZJM-EA-7-F9-2-P1，ZJM-EA-7-F12-1，ZJM-EA-7-F18-1B，ZJM-EA-7-F19-2，ZJM-EA-7-F19-3-P2-S，ZJM-EA-7-F19-4-S1，ZJM-EA-7-F19-4-S2，ZJM-EA-7-F20-3-P1，ZJM-EA-7-F20-3-P4。组分ZJM-EA-11(石油醚/丙酮0∶1)17g，通过Flash(ODS C18)中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法共分离得到7个化合物，ZJM-EA-11-F4-S13-P1，ZJM-EA-11-F4-S13-P3，ZJM-EA-11-F4-S13-P4(同ZJM-EA-7-F8-3)，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S1，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S2，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S3，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S4。ZJM-W约200g过D101大孔吸附树脂，得馏分ZJM-W-D0，ZJM-W-D30和ZJM-W-D100。馏分ZJM-W-D30，通过Flash(ODS C18)中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法共分离得到2个化合物，ZJM-W-D30-F6-6和ZJM-W-D30-F6-1-P1。分离流程图如图8所示：
以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种标准化红枣提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：20kg红枣，粉碎，用乙酸乙酯冷浸，料液比1∶3，每次冷浸时间48h，共冷浸2次；在40℃下减压浓缩，得浸膏157g；冷浸过后的红枣，用60％乙醇水回流提取一次，提取时间2小时，用乙酸乙酯萃取2次，和冷浸的样品合并得167g，水层得浸膏200g；
浸膏167g，以200g硅胶拌样，400g硅胶装柱，进行硅胶柱层析，柱体积1.5L；用石油醚/丙酮做洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1，每个梯度收集两个柱体积；所得各馏分通过LCMS分析检测，合并为4个组分，分别命名为ZJM-EA-1石油醚/丙酮50∶1，ZJM-EA-5石油醚/丙酮30∶1～10∶1，ZJM-EA-7石油醚/丙酮5∶1～1∶1，ZJM-EA-11石油醚/丙酮0∶1；馏分ZJM-EA-5石油醚/丙酮30∶1～10∶115g，通过FlashODSC18中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法共分离得到8个化合物，ZJM-EA-5-F11-P1，ZJM-EA-5-F11-P2，ZJM-EA-5-F14-P1，ZJM-EA-5-F15-P1，ZJM-EA-5-F17-P2-2，ZJM-EA-5-F24-S8-P1H-1，ZJM-EA-5-F24-S8-P1-2；ZJM-EA-7石油醚/丙酮5∶1～1∶19.8g，通过FlashODS C18中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法得到11化合物，ZJM-EA-7-F4-2，ZJM-EA-7-F8-3，ZJM-EA-7-F9-2-P1，ZJM-EA-7-F12-1，ZJM-EA-7-F18-1B，ZJM-EA-7-F19-2，ZJM-EA-7-F19-3-P2-S，ZJM-EA-7-F19-4-S1，ZJM-EA-7-F19-4-S2，ZJM-EA-7-F20-3-P1，ZJM-EA-7-F20-3-P4；组分ZJM-EA-11石油醚/丙酮0∶117g，通过FlashODS C18中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法共分离得到7个化合物，ZJM-EA-11-F4-S13-P1，ZJM-EA-11-F4-S13-P3，ZJM-EA-11-F4-S13-P4同ZJM-EA-7-F8-3，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S1，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S2，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S3，ZJM-EA-11-F4-S15-P2-S4；ZJM-W200g过D101大孔吸附树脂，得馏分ZJM-W-D0，ZJM-W-D30和ZJM-W-D100；馏分ZJM-W-D30，通过FlashODS C18中压色谱柱层析，凝胶柱层析和制备液相色谱等分离方法共分离得到2个化合物，ZJM-W-D30-F6-6和ZJM-W-D30-F6-1-P1。
2.权利要求1所述方法制备的标准化红枣提取物，其特征在于，包括以下成分：
3.一种权利要求2所述标准化红枣提取物的分析方法，其特征在于，
包括以下步骤：
步骤1各化合物标准品的配制：
1mg/mL标准溶液：用电子天平准确称取化合物1-27各5.0mg(精确至0.001g)，用2mL甲醇溶解，并定容至5.0mL容量瓶中，冷冻保存；
分别取50μL、200μL、400μL、600μL、800μL上述标准溶液至5.0mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀后配制成浓度为10mg/L、40mg/L、80mg/L、150mg/L、200mg/L的系列标准溶液；
分别进样10μL，以特定色谱条件进行HPLC分析；以峰面积Y对质量浓度C进行线性回归，得到回归方程和相关系数；
步骤2所测样品前处理：
准确称取不同种类红枣各10.0g，分别加入适量无水乙醇和水，70°超声提取2h，过滤；滤液真空浓缩后定容至10mL，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后备用；分别进样80μL，以特定色谱条件进行HPLC分析；
步骤3高效液相色谱条件：
色谱柱：Phenomenex Luna C-18(250mm×4.6mm 5um)
柱温：30℃
流动相：A(0.1％醋酸水溶液)-B(甲醇)
流速：1mL/min
进样量：10μL(标准品进样量)，80μL(样品进样量)
检测波长：254nm，320nm
步骤4各化合物标准曲线的绘制
得出所有标准品的线性范围为10-200mg/L，其中，R2＞0.99；
步骤5样品中含量测定
分别精密称取不同批次的红枣样品，按上述方法配置成溶液后按含量测定的HPLC方法进行测定，公式为：
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