CN107854498A - 一种利用rp‑hplc‑dad监测的沙棘叶黄酮的精准提取技术 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种沙棘叶黄酮的精准提取技术，以沙棘叶为提取对象，采用乙醇水回流提取工艺对黄酮有效成分进行提取，并通过RP‑HPLC‑DAD同时监测沙棘黄酮提取物中的6种黄酮主要成分。方法通过正交试验优化，提取方法精准有效，成本低、安全、操作简便、无污染，可用于高质量沙棘叶黄酮的工业化提取。

Description

一种利用RP-HPLC-DAD监测的沙棘叶黄酮的精准提取技术
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种沙棘叶黄酮的精准提取技术。
背景技术
沙棘为胡颓子科酸刺属的灌木或小乔木，别名醋柳，具有多种营养保健作用，可作为营养食品、药物和护肤品。沙棘黄酮是沙棘中的重要活性物质，具有抗心血管疾病、降血糖、抗氧化、抗菌、消炎等作用。1977年起沙棘被列入了《中华人民共和国药典》，并明确了沙棘果中黄酮的检测方法。除了沙棘果之外，沙棘叶、沙棘籽和沙棘的其他部位也富含多种黄酮有效成分，具有相当的药用价值。深入开发沙棘叶的经济价值，尤其是其药用价值，需要对沙棘叶的药用成分进行更为精准有效的提取分析。
现有的沙棘叶黄酮提取技术多直接采用或借鉴沙棘果渣的黄酮提取技术，以醇提、水提或超声提取为主，提取过程以总黄酮为单一指标进行考察，监测结果过于笼统，精准度不够，导致开发的提取方法效率低下。且缺乏相应的分类黄酮成分分析研究，未实现精准提取，不能有效阐述产品质量。与此同时，沙棘种植广泛，沙棘叶资源丰富，开发前景广阔，作为药食同源的材料，沙棘叶的开发潜力巨大。因此，亟需开发一种简单、高效、精准的沙棘叶黄酮提取技术。
本发明针对以上问题，利用RP-HPLC-DAD为检测方法，以儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素为精准监测对象，以其精确提取率总和为考察指标，开发沙棘叶黄酮的精准提取技术，方法稳定性高、适用范围广，可广泛推广于工业生产应用。
发明内容
本发明的目的在于突破现有提取方法中的技术缺陷，提供一种具有普适性的沙棘叶黄酮精准提取技术。
技术方案：如本发明所述的一种沙棘叶黄酮提取技术，其特征在于，包含如下具体步骤：
(1)将采集的沙棘叶干燥后粉碎过筛。
(2)将粉碎后的沙棘叶加入石油醚中进行脱脂。
(3)将脱脂后残渣挥干石油醚，加入乙醇-水溶液回流提取。
(4)合并续滤液，冻干，得沙棘叶黄酮粗提物。
(5)制备供试品溶液，利用RP-HPLC-DAD监测6种黄酮苷元含量。
优选的，步骤(2)中脱脂条件为8倍量石油醚(沸程60～90％)70℃下搅拌回流2h；
优选的，步骤(3)中乙醇水溶液回流提取的工艺为：50％-70％的乙醇，提取时间为1-2h，提取次数为1-3次，料液比为1:8-1:24；
优选的，步骤(5)中色谱柱选用SHIMADZU C18柱(150mm×2.1mm，5μm)；磷酸浓度0.4％，流动相以甲醇：水(体积比)为60:40，流速1.0mL/min，柱温40℃，进样量20μL。
更优选地，提取沙棘叶黄酮乙醇浓度为70％，提取时间为2h，提取次数为3次，提取料液比为1:16；
更优选地，色谱检测波长：儿茶素为208nm，芦丁为257nm，杨梅素为373nm，槲皮素为371nm，山柰酚为367nm，异鼠李素为371nm。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过乙醇浓度、提取时间、提取次数、料液比进行正交试验，对结果进行极差分析和方差分析，得到最佳的提取条件。
(2)本发明制得的黄酮苷元提取率和精确度都较高高，对于指导大规模的工业化生产可提供有效参考。
附图说明
图1为本发明检测黄酮混合标准品的分析谱图
图2为本发明检测沙棘叶黄酮提取物的分析谱图
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将进一步通过实例进行表述。
本发明所使用的试剂均从市场上购得。
实施例1：
本实施例为一种RP-HPLC-DAD监测下的沙棘叶黄酮的精准提取方法，其特征在于，沙棘叶黄酮提取工艺步骤包括：
(1)准确称取沙棘粉末，烘干，加8倍量的石油醚搅拌回流脱脂，抽滤，弃滤液；
(2)脱脂后的沙棘叶渣加入乙醇水溶液进行热回流提取，所述回流提取的工艺为：50％-70％的乙醇，提取时间为1-2h，提取次数为1-3次，料液比为1:8-1:24；
(3)合并续滤液，冻干，得沙棘叶黄酮粗提物。
其特征还在于，沙棘叶黄酮的RP-HPLC-DAD含量测定及方法学验证步骤包括：
(1)供试品溶液制备
称取沙棘叶粗提物粉末，先后加入等体积甲醇和20％盐酸溶液，氮气保护下加热回流1h，待溶液冷却至室温后过滤，用甲醇稀释得供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备
分别精密称取儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品，混合均匀后，用甲醇逐级稀释，并以HCl调至样品pH值，得系列浓度的混合对照品溶液。
(3)色谱条件
色谱柱为SHIMADZU C18柱(150mm×2.1mm，5μm)；流动相A：甲醇，B：水(含0.4％磷酸)，A：B＝60:40(v/v)，采用等度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温40℃；进样量为20μl。
(4)精密度考察
取沙棘叶粉末10g，精密称定，提取黄酮粗品，制备供试品溶液，重复进样6次，记录各成分的峰面积，并计算含量。测得结果表明，各成分含量的检测结果RSD值均小于1.77％，表明方法精密度良好。
(5)稳定性试验
取同一供试品溶液，每隔2h进样，进行色谱分析，结果表明，各成分含量检测结果RSD值小于1.51％，显示方法稳定。
(6)重复性试验
取同批沙棘叶黄酮粉末6份，制备供试品溶液，重复进样，检测各成分含量。结果表明，6种黄酮苷元的含量测定结果稳定，RSD值小于1.83％。
(7)工作曲线绘制
将系列浓度的混合对照品溶液进行色谱检测，建立各黄酮的标准工作曲线，得6种黄酮的相关线性方程，各黄酮标准曲线的相关系数(r)均高于0.9995，线性关系良好。
(8)样品含量测定
将正交试验所得样品进行色谱检测，并依据所得的工作曲线，计算6种黄酮苷元的含量。
其特征还在于，沙棘叶黄酮提取工艺正交优化，包括如下步骤：
(1)以脱脂后的沙棘叶为样本，采用正交试验法，选择乙醇浓度、提取时间、提取次数、料液比为考察因素，以6种黄酮苷元的提取率为考察指标，各设3水平，采用L9(34)设计正交试验(表1)。通过正交设计助手II 3.1软件，对6种黄酮的精确含量总和进行分析，获得最优提取条件。
表1正交试验水平表
(2)正交试验结果
表2沙棘叶正交试验结果
由直观分析结果可见，乙醇浓度因素各水平影响大小顺序为A3＞A1＞A2，提取时间因素各水平影响大小顺序为B3＞B1＞B2，提取次数因素各水平影响大小顺序为C3＞C2＞C1，料液比因素各水平影响大小顺序为D2＞D3＞D1，最佳提取条件为A3B3C3D2。以儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山柰酚和异鼠李素6种黄酮苷元精确总量为指标，沙棘叶最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为70％，提取时间为2h，提取次数为3次，料液比为1：16。
表3沙棘叶正交试验结果方差分析
注：F0.05(2，2)＝19；F0.01(2，2)＝99；f＝2
方差分析表显示各因素作用主次为A＞B＞C＞D，即乙醇浓度＞提取时间＞提取次数＞料液比。因素A，B，C，D对结果均有极显著差异(P＜0.01)，A为提取工艺的主要影响水平，因素D的影响最小。
(3)验证试验结果
取同批沙棘叶粉末3份，每份100g，以正交试验所得的优化条件，开展工艺验证试验。结果显示：沙棘叶黄酮粗品平均得率为56.4‰。验证结果显示，优化条件后，黄酮的提取率明显高于现有提取方法，且结果稳定可靠。
表6沙棘叶黄酮提取最优条件验证
最后应说明的是：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行改进和修饰，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，也应落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种以RP-HPLC-DAD监测的沙棘叶黄酮的精准提取方法，所述的6种主要黄酮成分为儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素，其特征在于，包括如下步骤：
(1)准确称取沙棘叶粉末，烘干，加石油醚脱脂，抽滤，弃滤液；
(2)脱脂后的沙棘叶渣加入乙醇水溶液加热回流提取，所述回流提取的工艺为：50％-70％的乙醇，提取时间为1-2h，提取次数为1-3次，料液比为1:8-1:24；合并续滤液，冻干，得沙棘叶黄酮粗提物。
(3)制备供试品溶液，以RP-HPLC-DAD测定不同提取条件下6种黄酮苷元含量。
2.根据权利要求1所述的沙棘叶黄酮提取方法，其特征在于，石油醚(沸程60～90％)取6-10倍量，在60-80℃下搅拌回流1-2h，抽滤，弃滤液。
3.根据权利要求1所述的沙棘叶黄酮提取方法，其特征在于，提取沙棘叶黄酮乙醇浓度为60-80％。
4.根据权利要求1所述的沙棘叶黄酮提取方法，其特征在于，沙棘叶黄酮的提取时间为1.5-2h。
5.根据权利要求1所述的沙棘叶黄酮提取方法，其特征在于，提取沙棘叶黄酮的次数为2-3次。
6.根据权利要求1所述的沙棘叶黄酮提取方法，其特征在于，提取沙棘叶黄酮的料液比为1:15-17。
7.根据权利要求1所述的供试品溶液的制备方法，其特征在于，将沙棘叶黄酮提取物溶于甲醇中，并加入等体积盐酸溶液，加热回流。
8.根据权利要求1所述的供试品溶液的制备方法，其特征在于，回流过程使用氮气保护，80-90℃下加热回流1-1.5h。
9.根据权利要求1所述的RP-HPLC-DAD的检测方法，其特征在于，色谱柱选用C18柱；磷酸浓度0.4％，流动相以甲醇：水(体积比)为1-1.5:1，流速1.0-1.5mL/min，柱温35-40℃，进样量20μL。
10.根据权利要求1所述的RP-HPLC-DAD的检测方法，其特征在于，色谱检测波长：儿茶素为208nm，芦丁为257nm，杨梅素为373nm，槲皮素为371nm，山奈酚为367nm，异鼠李素为371nm。
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