CN111537627A - 杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药分析评价领域，具体涉及一种杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法。本发明利用HPLC‑UV‑DPPH法同时筛选、定量杨梅叶中黄酮类抗氧化提取物以及评价其抗氧化能力。脱脂后的杨梅叶经盐酸‑无水乙醇提取粗提液进行反相HPLC梯度洗脱法分离并定量，对流出液中具有抗氧化活性的成分与DPPH·反应被分离检测；根据检测得到的与DPPH·反应后的成分是否出现负峰，筛选具有抗氧化活性的成分。本发明无须繁琐的分离纯化过程，可快速对杨梅叶提取物的抗氧化成分进行定量和活性评价，提取物成分更具体，成分活性更明确；方法更快速防样品氧化降解，为快速评价杨梅叶这类可能含有易氧化降解的中药提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及中药分析评价领域，具体涉及一种杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法。
背景技术
杨梅是杨梅科杨梅属的常绿小乔木，拥有可观的经济价值。杨梅叶中富含黄酮、有机酸、多糖等多种生物活性成分，具有降血糖、肝脏保护、抗氧化、抗菌等作用。研究表明，杨梅叶中主要抗氧化活性成分为黄酮类成分，主要有杨梅苷、杨梅素、槲皮素、山奈酚等，是天然抗氧化剂的良好来源。但杨梅叶的抗氧化提取物不稳定，现有的文献对抗氧化提取物的成分不明确，各组分的抗氧化贡献不清楚，现代药学趋势需要对提取物进行快速在线评价和定量检测。因此，从杨梅叶提取物中快速、在线、高通量筛选抗氧化活性成分，特别是含量较低的活性成分具有重要的意义。目前杨梅叶中黄酮类成分的抗氧化活性成分的筛选研究尚停留在总提取物、总黄酮或杨梅苷、槲皮素等个别化合物层面上，未见以在线筛选的方法一次性分离及评价杨梅叶中的多个抗氧化活性成分的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快速、有效的杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种中药材杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法，所述的方法包括以下步骤：
（1）将杨梅叶烘干、粉碎、过筛后脱脂得脱脂杨梅叶细粉，脱脂杨梅叶细粉中加入盐酸乙醇溶液，超声提取数次后合并提取液抽滤浓缩，得到杨梅叶粗提液；
（2）对步骤（1）中得到的杨梅叶粗提液放入检测波长为254 nm的高效液相色谱仪中进行测定，得到高效液相色谱图，计算峰面积；
（3）经由高压输液泵使DPPH·甲醇溶液与步骤（2）中反相HPLC测定后的流出液与混合，经过反应线圈后进入检测波长为517 nm的紫外检测器内进行第二维测试，计算出现的峰面积；
（4）对比步骤（2）和步骤（3）中的色谱峰面积的变化，判断杨梅叶中是否含有抗氧化活性成分。
判断杨梅叶中是否含有抗氧化活性成分的标准为：杨梅叶粗提液中如有抗氧化活性物质，则与DPPH·甲醇溶液反应后，步骤（3）中紫外检测器处的响应值降低，相应的色谱峰为负值，无抗氧化活性的物质无负峰出现。
进一步地，本发明步骤（1）所述脱脂杨梅叶细粉与盐酸乙醇溶液的用量比为1g：10~20 mL，所述的盐酸乙醇溶液中盐酸的浓度为1.0~1.4 mol·L-1。
步骤（2）中所述高效液相色谱仪的色谱条件包括：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，柱温25~40℃，流速0.4~1.0 mL·min -1。
步骤（2）中梯度洗脱方式为：0~30 min，20%流动相A，80%流动相B；30~32 min，20%~30% A，80~70%流动相B；32~45 min，30% A，70%流动相B；均为体积百分比。
步骤（2）中所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，柱长150 ~ 300 mm，填料粒径3~5 μm。
步骤（3）中所述的DPPH·甲醇溶液的浓度为0.2 ~2 mg·L -1。
步骤（3）中所述的反应线圈的原材料为聚醚醚酮的管状材料，内径为0.25 mm，管长为500~1000 cm，反应线圈内流速为0.2~0.4 mL·min-1。
进一步优选的，在某一具体实施例中还提供了一种同时定量检测杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分含量的方法，具体包括：将杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分对应的标准品配置成系列浓度的溶液，在与步骤（2）中相同的色谱条件下，分别测定不同浓度的标准品对应的色谱图，以质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线计算待测杨梅叶粗提液中各抗氧化成分的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明构建一种更为高效的杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分在线评价及定量检测方法，利用HPLC-UV-DPPH法同时筛选、定量杨梅叶中黄酮类抗氧化提取物以及评价其抗氧化能力。脱脂后的杨梅叶经盐酸-无水乙醇提取粗提液进行反相HPLC梯度洗脱法分离并定量，对流出液中具有抗氧化活性的成分与DPPH·反应被分离检测；根据检测得到的与DPPH·反应后的成分是否出现负峰，筛选具有抗氧化活性的成分。本发明无须繁琐的分离纯化过程，可快速对杨梅叶提取物的抗氧化成分进行定量和活性评价，提取物成分更具体，成分活性更明确；方法更快速防样品氧化降解，为快速评价杨梅叶这类可能含有易氧化降解的中药提供了新的思路。
附图说明
图1是HPLC反应后和第二维中的色谱对比图；图中A是第一维反应后的色谱图；
图2是杨梅叶中抗氧化成分及VC和Trolox对DPPH自由基的清除能力曲线图。
具体实施方式
以下将结合说明书附图及具体实施方式，对本发明的技术方案及优点做出更加详细的解释和说明。应当理解的是，说明书、具体实施方式及说明书附图中所呈现的内容，仅仅为了更加清楚地说明本发明的技术方案及其优点，并不对本发明的保护范围构成限制。
实施例1
本发明中的方法采用高效液相色谱仪（HPLC）进行测定，实施例中的高效液相色谱仪为LC-10AT VP型高效液相色谱仪，该色谱仪配有SPD-10A型二极管阵列检测器、N2000型色谱数据工作站等。
采摘的新鲜杨梅叶经反复清洗、烘干后粉碎，过180 μm筛，得杨梅叶粉末。称取杨梅叶粉末10 g放入圆底烧瓶中，加入10倍体积的石油醚，利用索氏提取器，55℃进行脱脂，待毛细管处石油醚澄清无色时，停止回流，取出杨梅叶细粉在通风橱中自然阴干一晚上，放入烘箱烘干，得脱脂杨梅叶细粉。称取脱脂杨梅叶细粉0.6 g，置于锥形瓶中，加入12 mL盐酸乙醇溶液（含 1.2 mol·L-1的盐酸），于功率100 W、频率40 kHz 超声条件下提取 2 次，每次提取40 min。室温冷却，滤过，合并滤液，减压蒸干后用分析级无水乙醇溶解并转移至10 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，得杨梅叶粗提液。
分别精密称取10 mg槲皮素标准品、杨梅素标准品、杨梅苷标准品、山奈酚标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，即得质量浓度为1 mg/mL的四个黄酮化合物标准品溶液。利用紫外分光光度计在波长200~400 nm内对四种黄酮化合物的标准品溶液进行紫外光谱全扫描，结果显示，杨梅苷、杨梅素、槲皮素及山奈酚在波长254 nm和360 nm处均有良好吸收。由于杨梅素、杨梅苷、槲皮素在360 nm处的吸收强度小于254 nm处，兼顾三者的灵敏度确定杨梅叶粗提液的检测波长为254 nm。基于槲皮素品、杨梅素、杨梅苷、山奈酚的化学结构中均含有酚羟基，具有一定的弱酸性，故在流动相中加入适量磷酸以改善峰形和分离效果。将得到的杨梅叶粗提液注入LC-10AT VP型高效液相色谱仪中进行第一维检测。杨梅叶粗提液在色谱柱上达到分离，得到色谱峰正信号，给出各个组分信息。高效液相色谱仪色谱的条件如下：采用Shimadzu VP-ODS C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，柱温30℃；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱方式为：0~30 min，20%流动相A，80%流动相B；30~32 min，20%~30% A，80~70%流动相B；32~45 min，30%A，70%流动相B；流速0.8 mL·min -1；检测波长为254 nm。
由高压输液泵将浓度为2 mg·L -1的2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）甲醇溶液(购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)和第一维检测后的杨梅叶粗提液混合后经过由聚醚醚酮（PEEK）（615 cm）制成的反应线圈（615 cm×0.25 mm i.d.，流速为0.4 mL·min-1）充分反应后在SPD-20A 型紫外检测器进行第二维检测，紫外检测器的检测波长为517 nm。第二维中，杨梅叶粗提液中如有抗氧化活性物质，则与DPPH·溶液反应后，SPD-20A 型紫外检测器处的响应值降低，相应的色谱峰为负值，无抗氧化活性的物质无负峰出现。对比第一维、第二维高效液相色谱图中峰面积的变化。
图1是HPLC反应后和第二维中的色谱对比图；图中A是第一维反应后的色谱图，B是第二维反应后的色谱图。由图1可见，杨梅叶粗提液经DPPH-HPLC分析有明显4个倒峰出现（反应时间约为180 s，即前后两个色谱图的保留值相差约3 min），经与各黄酮化合物对照品保留值相比，筛选出杨梅叶粗提液中主要的抗氧化黄酮类成分应为杨梅苷、杨梅素、槲皮素、山奈酚。根据倒峰的峰面积可进行各成分抗氧化贡献度的测评。
实施例2
为了进一步对杨梅叶粗提液中四种黄酮类化合物的含量进行定量检测，将实施例1中制备的槲皮素标准品溶液、杨梅素标准品溶液、杨梅苷标准品溶液、山奈酚标准品溶液按10:2:1:1的比例混合配制标准品混合对照液。分别精密量取混合对照溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。各浓度分别吸取20 μL，在与实施例1中第一维相同高效色谱检测条件下，分别测定不同浓度的混合对照液所对应的色谱图，以各混合对照液质量浓度X (mg/mL) 为横坐标，峰面积Y（A）为纵坐标绘制标准曲线，建立线性方程对抗氧化成分进行定量。上述四种抗氧化成分的回归方程分别为：杨梅苷Y=3619531X-1307.356 (R²=0.9993)，杨梅素Y=2433527X-14072.00 (R²=0.9990)，槲皮素Y=1890813X-1272.906 (R²=0.9992)，山奈酚Y=4763985X-2611.206 (R²=0.9991)。经上述线性回归方程计算得实施例1中制备的杨梅叶粗提液中黄酮组分的含量为槲皮素0.5903mg·g-1、杨梅素3.1995 mg·g-1、杨梅苷0.2900 mg·g-1、山奈酚0.0926 mg·g-1，表明杨梅叶中杨梅素的含量最高，山奈酚的含量较少。
实施例3
采摘的新鲜杨梅叶经反复清洗、烘干后粉碎，过200 μm筛，得杨梅叶粉末，取10 g杨梅叶粉末放入圆底烧瓶中，加入12倍体积的石油醚，利用索氏提取器，55 ℃进行脱脂，待毛细管处石油醚澄清无色时，停止回流，取出杨梅叶细粉在通风橱中自然阴干一晚上，放入烘箱烘干，得脱脂杨梅叶细粉。称取脱脂杨梅叶细粉0.6 g，置于锥形瓶中，加入6 mL盐酸乙醇溶液（含1.0 mol·L-1的盐酸），于功率100 W、频率40 kHz 超声条件下提取 2 次，每次提取60min。室温冷却，滤过，合并滤液，减压蒸干后用分析级无水乙醇溶解并转移至10 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，过微孔滤膜，得杨梅叶粗提液。
将得到的杨梅叶粗提液注入LC-10AT VP型高效液相色谱仪中进行第一维检测。第一维中，杨梅叶粗提液在色谱柱上分离，在SPD-10A型二极管阵列检测器得到色谱峰正信号，给出各个组分信息；第一维中高效液相色谱仪色谱的条件如下：采用Shimadzu VP-ODSC18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）色谱柱，柱温40℃；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱方式为：0~30 min，20%流动相A，80%流动相B；30~32 min，20%~30% A，80~70%流动相B；32~45 min，30% A，70%流动相B；流速0.4mL·min -1；检测波长为254nm。
用高压输液泵将浓度为0.2 mg·L -1的2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）甲醇溶液和第一维检测后的杨梅叶粗提液混合后经由聚醚醚酮（PEEK）制成的500 cm长的反应线圈（内径0.25 mm i.d.，流速为0.4 mL·min-1）送到SPD-20A 型紫外检测器进行第二维检测，紫外检测器的检测波长为517 nm。第二维中，杨梅叶粗提液中如有抗氧化活性物质，则与DPPH·溶液反应后，SPD-20A 型紫外检测器处的响应值降低，相应的色谱峰为负值，无抗氧化活性的物质无负峰出现。根据倒峰的峰面积进行各成分抗氧化贡献度的测评。
实施例4
采摘的新鲜杨梅叶经反复清洗、烘干后粉碎，过240 μm筛，得杨梅叶粉末，取10 g杨梅叶粉末放入圆底烧瓶中，加入8倍体积的石油醚，利用索氏提取器，55 ℃进行脱脂，待毛细管处石油醚澄清无色时，停止回流，取出杨梅叶细粉在通风橱中自然阴干一晚上，放入烘箱烘干，得脱脂杨梅叶细粉。称取脱脂杨梅叶细粉0.6 g，置于锥形瓶中，加入9mL盐酸乙醇溶液（含1.4 mol·L-1的盐酸），于功率100 W、频率40 kHz 超声条件下提取 2 次，每次提取60min。室温冷却，滤过，合并滤液，减压蒸干后用分析级无水乙醇溶解并转移至10 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，过微孔滤膜，得杨梅叶粗提液。
将得到的杨梅叶粗提液注入LC-10AT VP型高效液相色谱仪中进行第一维检测。第一维中，杨梅叶粗提液在色谱柱上分离，在SPD-10A型二极管阵列检测器得到色谱峰正信号，给出各个组分信息；第一维中高效液相色谱仪色谱的条件如下：采用Shimadzu VP-ODSC18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）色谱柱，柱温25 ℃；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱方式为：0~30 min，20%流动相A，80%流动相B；30~32 min，20%~30% A，80~70%流动相B；32~45 min，30% A，70%流动相B；流速1.0 mL·min -1；检测波长为254 nm。
用高压输液泵将浓度为0.2 mg·L -1的2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）甲醇溶液和第一维检测后的杨梅叶粗提液混合后经由聚醚醚酮（PEEK）制成的1000 cm长的反应线圈（内径0.25 mm i.d.，流速为0.2 mL·min-1）送到SPD-20A 型紫外检测器进行第二维检测，紫外检测器的检测波长为517 nm。第二维中，杨梅叶粗提液中如有抗氧化活性物质，则与DPPH·溶液反应后，SPD-20A 型紫外检测器处的响应值降低，相应的色谱峰为负值，无抗氧化活性的物质无负峰出现。根据倒峰的峰面积进行各成分抗氧化贡献度的测评。
实施例5
本实施例以杨梅叶中抗氧化成分杨梅苷、杨梅素、槲皮素、山奈酚与L-抗坏血酸（VC）、水溶性维生素E (Trolox)为阳性对照验证对DPPH自由基的清除能力。
精确称量20 mgDPPH·置于250 mL的容量瓶中，用甲醇定容得200 μmol·L-1 的DPPH·甲醇溶液。取不同浓度（10、20、30、40、50、80、100、150 μg·mL-1）的待测样品溶液50μL分别加入200 μmol·L-1 的DPPH·甲醇溶液150 μL，分别设置待测样本的对照和空白；对照中待测样品溶液用50 μL甲醇代替，空白中DPPH·溶液用150 μL甲醇代替；充分振荡混匀，避光反应30 min，517 nm处测其吸光值，自由基清除率计算公式为：DPPH自由基清除率（%）=[1-（A样本-A空白）/A对照]×100%。图2是杨梅叶中抗氧化成分及VC和Trolox对DPPH自由基的清除能力曲线图。由图2可见，在所测浓度范围内，杨梅苷、杨梅素、槲皮素、山奈酚均显示有较强的清除DPPH自由基的作用，且在10~50 μg·mL-1范围内具有较明显的浓度依赖关系，即所有被测组分的DPPH·清除能力都随样品浓度的增加而增强。利用GraphPad数学分析软件，测得各个物质的具体IC50值，槲皮素、杨梅素、杨梅苷、山奈酚、L-抗坏血酸（VC）、水溶性维生素E (Trolox) 的IC50分别为：17.42 μg/mL、20.22 μg/mL、30.44 μg/mL、26.23 μg/mL、21.40 μg/mL、41.68 μg/mL。结果表明槲皮素和杨梅素对DPPH自由基的清除效应比L-抗坏血酸高，自由基清除效果较好，杨梅叶中的四种抗氧化成分均具有比Trolox更强的抑制DPPH·的作用。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种中药杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将杨梅叶烘干、粉碎、过筛后脱脂得脱脂杨梅叶细粉，脱脂杨梅叶细粉中加入盐酸乙醇溶液，超声提取数次后合并提取液抽滤浓缩，得到杨梅叶粗提液；
（2）对步骤（1）中得到的杨梅叶粗提液放入检测波长为254 nm的高效液相色谱仪中进行反相HPLC测定，得到高效液相色谱图；
（3）经由高压输液泵使DPPH·甲醇溶液与步骤（2）中反相HPLC测定后的流出液与混合，经过反应线圈后进入检测波长为517 nm的紫外检测器内进行第二维测试，计算出现的峰面积；
（4）对比步骤（2）和步骤（3）中的色谱峰面积的变化，判断杨梅叶中是否含有抗氧化活性成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述脱脂杨梅叶细粉与盐酸乙醇溶液的用量比为1g：10~20mL，所述的盐酸乙醇溶液中盐酸的浓度为1.0~1.4 mol·L-1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述高效液相色谱仪的色谱条件包括：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，柱温25~40 ℃，流速0.4~1.0 mL·min -1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中梯度洗脱方式为：0~30 min，20%流动相A，80%流动相B；30~32 min，20%~30% A，80~70%流动相B；32~45 min，30% A，70%流动相B；均为体积百分比。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，柱长150 ~ 300 mm，填料粒径3~5 μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的DPPH·甲醇溶液的浓度为0.2 ~2 mg·L -1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的反应线圈的原材料为聚醚醚酮的管状材料，内径为0.25 mm，管长为500~1000 cm，反应线圈内流速为0.2~0.4 mL·min-1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，判断杨梅叶中是否含有抗氧化活性成分的标准为：杨梅叶粗提液中如有抗氧化活性物质，则与DPPH·甲醇溶液反应后，步骤（3）中紫外检测器处的响应值降低，相应的色谱峰为负值，无抗氧化活性的物质无负峰出现。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还可以定量检测杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分含量，具体包括：将杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分对应的标准品配置成系列浓度的溶液，在与步骤（2）中相同的色谱条件下，分别测定不同浓度的标准品对应的色谱图，以质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线计算待测杨梅叶粗提液中各抗氧化成分的含量。
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