CN114577958A - 一种单糖的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种单糖的分析方法。具体地，本发明提供一种用于测定单糖的HPLC方法。本发明所述的方法能够同时对多种单糖进行定性和定量测定。

Description

一种单糖的分析方法
技术领域
本发明涉及医药和生物技术领域，具体涉及一种单糖的分析方法。
背景技术
糖类物质根据功能基团的不同，可分为醛糖、酮糖、糖醇和糖醛酸四大类；依据糖的还原氧化特性，又可以分成还原性糖和非还原性糖，醛糖属于还原性糖，酮糖属于非还原性糖；根据糖残基数目的多少，糖类物质又可分为单糖、寡糖和多糖。单糖可以依照其碳数的不同分为丙糖、丁糖、戊糖、己糖和庚糖，常见的单糖有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等。寡糖是由少数(2～6个)单糖缩合形成的聚合物，低聚糖通常是指20个以下的单糖缩合形成的聚合物，而多糖则由多单糖分子缩合、失水而成的。
现有技术中的菲林法、二硝基水杨酸法等化学分析方法以及电泳法、光度法等，由于无法对体系中的各种单糖进行预先分离，所以得到的只是单糖的总和。
由于单糖的极性较强，结构相近，且缺乏光学活性，因此，现有技术的单糖分析方法往往只是对一种单糖进行分析测定，在需要同时分析多种单糖的情况下例如用于糖的结构研究或对医药质控，对各个单糖进行单独分析效率低下，无法满足工业化需求。此外，现有的对多个单糖进行同时分离和测定的方法存在许多缺点，例如单糖无法实现与基线的有效分离，单糖的分离度低，各个单糖的标准曲线较差，检出限和灵敏度低等等，从而难以有效的对多个单糖同时分离和测定，进而限制了对多种单糖的结构研究、定性定量和医药质控等等。
因此，本领域需要开发一种能够同时对多种单糖进行测定的方法。
发明内容
本发明的目在提供一种能够同时对多种单糖进行测定的HPLC方法。
本发明第一方面提供一种用于测定单糖的HPLC方法，所述的方法包括步骤：
(1)通过高效液相对样品中的单糖进行测定；
所述的高效液相的色谱条件为：
色谱柱：反相色谱柱；
流动相：流动相A和流动相B，所述的流动相A包括乙腈；所述的流动相B包括柠檬酸盐缓冲液和四氢呋喃的混合液；和
流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为：
Figure BDA0003491632790000021
其中，(v/v％)是指占流动相的体积分数，其中，0-25min时，流动相A(v/v％)的体积分数保持为1％，流动相B的体积分数保持为99％；25-30min时，流动相A(v/v％)的体积分数为从1％匀速上升到7％，流动相B(v/v％)的体积分数为从99％匀速下降到93％；30-56min时，流动相A(v/v％)的体积分数为从7％匀速下降到1％，流动相B(v/v％)的体积分数为从93％匀速上升到99％。
在另一优选例中，所述的方法为定量和/或定性方法。
在另一优选例中，所述的方法为体外方法。
在另一优选例中，所述的方法为非诊断性和非治疗性方法。
在另一优选例中，所述样品为水性样品。
在另一优选例中，所述样品为水溶液。
在另一优选例中，所述样品包括单糖。
在另一优选例中，所述样品包括单糖水溶液。
在另一优选例中，所述的单糖水溶液包括单糖和水。
在另一优选例中，所述的样品包括单糖衍生物水溶液。
在另一优选例中，所述的单糖衍生物水溶液包括单糖衍生物和水。
在另一优选例中，所述的单糖包括葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖和2-脱氧-D-核糖中的一种或多种。
在另一优选例中，所述葡萄糖醛酸包括D-葡萄糖醛酸。
在另一优选例中，所述半乳糖醛酸包括D-半乳糖醛酸。
在另一优选例中，所述半乳糖包括D-半乳糖。
在另一优选例中，所述葡萄糖包括D-葡萄糖。
在另一优选例中，所述阿拉伯糖包括L-阿拉伯糖。
在另一优选例中，所述核糖包括D-核糖。
在另一优选例中，所述岩藻糖包括D-岩藻糖。
在另一优选例中，所述鼠李糖包括L-鼠李糖。
在另一优选例中，所述的流动相B中，柠檬酸盐缓冲液与四氢呋喃体积比为(80-95)：(5-20)，较佳地(85-93)：(8-15)，更佳地(86-90)：(10-14)，更佳地(87-89)：(11-13)，最佳地88:12。
在另一优选例中，所述的流动相B中，柠檬酸盐缓冲液的pH为3-7，较佳地，4.0-6.0，更佳地4.5-5.5，更佳地4.8-5.2，最佳地5.0。
在另一优选例中，所述的柠檬酸盐缓冲液的浓度为0.02-1.0M，较佳地0.02-0.5M，更佳地0.05-0.3M，更佳地0.05-0.2M，更佳地0.05-0.15M，更佳地0.08-0.12M，更佳地0.1M。
在另一优选例中，所述的柠檬酸盐缓冲液通过以下方法制备：
将0.05-0.15M柠檬酸水溶液和0.05-0.15M柠檬酸钠水溶液按照体积比为7.8-8.6:11-13进行混合制备而得。
在另一优选例中，所述的柠檬酸盐缓冲液通过以下方法制备：
将0.08-0.12M柠檬酸水溶液和0.08-0.12M柠檬酸钠水溶液按照体积比为8-8.4:11.5-12.3进行混合制备而得。
在另一优选例中，所述的柠檬酸盐缓冲液通过以下方法制备：
将0.1M柠檬酸水溶液和0.1M柠檬酸钠水溶液按照体积比为8.2:11.8进行混合制备而得。
在另一优选例中，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：
色谱柱温度：25-35℃，较佳地28-32℃，更佳地30℃；和/或
流动相(流动相A+流动相B)流速：0.2-3mL/min，较佳地0.5-1.5mL/min，更佳地0.6-1.0mL/min，最佳地0.8mL/min。
在另一优选例中，所述的反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
在另一优选例中，所述的反相色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。
在另一优选例中，所述的HPLC的检测器为紫外检测器。
在另一优选例中，所述的紫外检测器的检测波长为300-310nm，较佳地305nm。
在另一优选例中，所述的进样体积为5-20μl。
在另一优选例中，所述的样品用纯化水稀释后进样。
在另一优选例中，所述的步骤(1)包括：先用衍生化试剂对样品中的单糖进行衍生化，得到含有衍生化的单糖的样品后，然后进样HPLC，从而测定单糖。
在另一优选例中，所述的衍生化试剂包括氰基硼氢钠、4-氨基苯甲酸乙酯、硼酸、醋酸和甲醇。
在另一优选例中，所述的衍生化试剂包括0.1-4重量份氰基硼氢钠、0.4-9重量份4-氨基苯甲酸乙酯、0.1-2重量份硼酸、2-15重量份醋酸和40-50重量份甲醇。
在另一优选例中，所述的衍生化试剂包括0.15-3.14重量份氰基硼氢钠、0.4-8.26重量份4-氨基苯甲酸乙酯、0.15-1.6重量份硼酸、2.1-10.5重量份醋酸和40-50重量份甲醇。
在另一优选例中，所述的衍生化试剂包括0.35-0.55重量份氰基硼氢钠、1.0-2.0重量份4-氨基苯甲酸乙酯、0.2-0.6重量份硼酸、2-6重量份醋酸和40-50重量份甲醇。
在另一优选例中，所述的衍生化试剂包括0.40-0.45重量份氰基硼氢钠、1.2-1.6重量份4-氨基苯甲酸乙酯、0.3-0.5重量份硼酸、3-5重量份醋酸和40-50重量份甲醇。
在另一优选例中，所述的衍生化试剂包括0.43重量份氰基硼氢钠、1.4重量份4-氨基苯甲酸乙酯、0.4重量份硼酸、4重量份醋酸和40-50重量份甲醇。
在另一优选例中，所述的衍生化试剂包括0.40-0.45g氰基硼氢钠、1.2-1.6g 4-氨基苯甲酸乙酯、0.3-0.5g硼酸、3-5ml醋酸和40-50ml甲醇。
在另一优选例中，所述的衍生化试剂包括0.43g氰基硼氢钠、1.4g 4-氨基苯甲酸乙酯、0.4g硼酸、4ml醋酸和46ml甲醇。
在另一优选例中，所述的醋酸包括冰醋酸。
在另一优选例中，所述的衍生化试剂的pH为2-5.7，较佳地2-4，更佳地3-4。
在另一优选例中，所述的衍生化试剂通过以下方法制备：
取氰基硼氢钠0.43g、4-氨基苯甲酸乙酯1.4g和硼酸0.4g置50ml容量瓶中，加甲醇适量使溶解，再加冰醋酸4ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到衍生化试剂。
在另一优选例中，所述的用衍生化试剂对样品中的单糖进行衍生化包括步骤：
将衍生化试剂与样品中的单糖混合反应后，向反应液中加入二氯甲烷混合，离心取上清液，得到衍生化的单糖样品。
在另一优选例中，衍生化的单糖样品用纯化水稀释后进样HPLC。
在另一优选例中，所述反应的温度为60-100℃，较佳地78-82℃。
在另一优选例中，所述反应的时间为20-100min，较佳地58-62min，较佳地25-35min，例如30min、60min、或90min。
在另一优选例中，所述的步骤(1)包括：
将样品置10ml容量瓶中，加衍生化试剂2ml，摇匀，80℃水浴加热30分钟，冷却到室温，用水稀释至刻度，摇匀，然后，精密量取2ml，加二氯甲烷2ml，充分振摇，在3000转/min离心条件离心5min，精密量取上清液1ml，加流动相A或纯化水1ml，进样HPLC。
在另一优选例中，精密量取上清液1ml，用微孔滤膜过滤后，加流动相A或纯化水1ml，进样HPLC。
在另一优选例中，所述的微孔滤膜的孔径大小为0.10-0.80μm，例如0.22μm或0.45μm。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明提供一种单糖的分析方法，在单糖进行衍生化后，通过HPLC能够同时对多种单糖(例如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖和2-脱氧-D-核糖中的一种或多种)同时进行测定，分离度高，具有良好的标准曲线，可用于多种单糖同时准确定量测定，且各个单糖的检出限低，具有优异的灵敏度，符合现行版药典定量测定要求，从而对糖的结构研究、单糖的定性定量和对医药质控具有重要价值。
附图说明
图1为实施例1的系统适用性试验的HPLC图。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，“HPLC”是指高效液相色谱法。
在本发明中，应当理解的是，所述的流动相流速为流动相A和流动相B的流速之和。
方法
本发明提供一种用于测定单糖的HPLC方法，所述的方法包括步骤：
所述的方法包括步骤：
(1)通过高效液相对样品中的单糖进行测定；
所述的高效液相的色谱条件为：
色谱柱：反相色谱柱；
流动相：流动相A和流动相B，所述的流动相A包括乙腈；所述的流动相B包括柠檬酸盐缓冲液和四氢呋喃的混合液；和
流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为：
Figure BDA0003491632790000061
其中，(v/v％)是指占流动相的体积分数，其中，0-25min时，流动相A(v/v％)的体积分数保持为1％，流动相B的体积分数保持为99％；25-30min时，流动相A(v/v％)的体积分数为从1％匀速上升到7％，流动相B(v/v％)的体积分数为从99％匀速下降到93％；30-56min时，流动相A(v/v％)的体积分数为从7％匀速下降到1％，流动相B(v/v％)的体积分数为从93％匀速上升到99％。
本发明所述的方法可以是定量和/或定性方法、体外方法、非诊断性和非治疗性方法。
具体地，本发明所述的用于测定单糖的HPLC方法如上述本发明第一方面所述。
本发明的主要技术效果包括：
本发明提供一种单糖的分析方法，在单糖进行衍生化后，通过HPLC能够同时对多种单糖(如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖和2-脱氧-D-核糖)同时进行测定，分离度高，具有良好的标准曲线，可用于多种单糖同时准确定量测定，且各个单糖的检出限低，具有优异的灵敏度，符合现行版药典定量测定要求，从而对糖的结构研究、单糖的定性定量和对医药质控具有重要价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1多种单糖的测定
HPLC(高效液相色谱法)同时测定多种单糖，方法如下：
1.试剂和溶液的配制
1.1衍生化试剂的制备
取氰基硼氢钠0.43g、4-氨基苯甲酸乙酯1.4g和硼酸0.4g置50ml容量瓶中，加甲醇适量使溶解，再加冰醋酸4ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到衍生化试剂。
1.2.供试品贮备液的制备
称取D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖标准品各20mg，一起加入到10ml容量瓶中，加甲醇-水(10：90)使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml容量瓶中，用甲醇-水(10：90)稀释至刻度，摇匀，制得供试品贮备液。
1.3.系统适用性贮备液的制备
取L-阿拉伯糖标准品200mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加水适量使溶解，精密加入供试品贮备液1ml，用水稀释至刻度，摇匀，得到系统适用性贮备液。
1.4.供试品溶液的制备
精密量取供试品贮备液2ml，置10ml容量瓶中，加衍生化试剂2ml，摇匀，80℃水浴加热30分钟，冷却到室温，用水稀释至刻度，摇匀，然后，精密量取2ml，加二氯甲烷2ml，充分振摇，在3000转/min离心条件离心5min，精密量取上清液1ml，加纯化水A1ml，摇匀，得到供试品溶液。
1.5.系统适用性溶液的制备
精密量取系统适用性贮备液2ml，置10ml容量瓶中，加衍生化试剂2ml，摇匀，80℃水浴加热30分钟，冷却到室温，用水稀释至刻度，摇匀，然后，精密量取2ml，加二氯甲烷2ml，充分振摇，在3000转/min离心条件离心5min，精密量取上清液1ml，加纯化水1ml，摇匀，得到系统适用性溶液。
1.6.空白溶液的制备
量取2ml水，置10ml容量瓶中，加衍生化试剂2ml，摇匀，80℃水浴加热30分钟，冷却到室温，用水稀释至刻度，摇匀，然后，精密量取2ml，加二氯甲烷2ml，充分振摇，在3000转/min离心条件离心5min，精密量取上清液1ml，加纯化水1ml，摇匀，得到空白溶液。
2.HPLC色谱条件
高效液相色谱(HPLC)仪：LC-2030Plus，日本岛津；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(C18)为填料，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：流动相A+流动相B，其中，流动相A为乙腈；流动相B为0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)和四氢呋喃的混合液，柠檬酸盐缓冲液与四氢呋喃的体积比为88:12；
0.1M柠檬酸盐缓冲液的配制方法如下：将0.1M柠檬酸水溶液和0.1M柠檬酸钠水溶液按照体积比为8.2:11.8进行混合制备而得。
流动相洗脱：按下表1进行梯度洗脱：
Figure BDA0003491632790000081
其中，(v/v％)是指占流动相的体积分数，其中，0-25min时，流动相A(v/v％)的体积分数保持为1％，流动相B的体积分数保持为99％；25-30min时，流动相A(v/v％)的体积分数为从1％匀速上升到7％，流动相B(v/v％)的体积分数为从99％匀速下降到93％；30-56min时，流动相A(v/v％)的体积分数为从7％匀速下降到1％，流动相B(v/v％)的体积分数为从93％匀速上升到99％；
流动相流速：0.8ml/min；
检测器：紫外检测器(UV)；
检测波长：305nm；
柱温：30℃；
进样体积：10μl。
3.系统适用性试验
取系统适用性溶液注入到高效液相色谱(HPLC)仪，得到的HPLC图如图1所示：
根据图1计算的各个单糖的分离度如表2所示。
峰号 保留时间 化合物名 分离度
1 14.33 D-葡萄糖醛酸
2 15.416 D-半乳糖醛酸 1.881
3 21.716 D-葡萄糖 9.588
4 22.791 D-半乳糖 1.587
6 26.775 L-阿拉伯糖 1.623
7 28.788 D-核糖 2.371
8 32.947 D-岩藻糖 5.737
9 34.819 L-鼠李糖 3.221
10 38.076 2-脱氧-D-核糖 5.303
从图1和表2中可以看出，D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖能够与基线分离，且彼此之间具有优异的分离度(＞1.5)，因此，HPLC方法能够同时测定D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖。
4.加样回收率试验
单标溶液分别精密称取20mg的D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、鼠李糖、岩藻糖和2-脱氧-D-核糖于10m量瓶中，用10％甲醇稀释至刻度制得2.0mg/ml的单标溶液。
混标溶液分别精密量取2.0mg/ml的单标溶液0.5ml于同一10ml量瓶中，用水稀释至刻度制得100mg/L的混标溶液，再用水稀释成5.0mg/L混标溶液。
加标溶液精密称取L-阿拉伯糖20mg共10份，分别置于10ml容量瓶中。取9份样品平均分成三组，各组分别加入2ml和4ml的5.0mg/L混标溶液，加水定容至刻度，得到加标溶液；另取1份样品直接用水定容至刻度作为对照品溶液。
衍生化反应精密量取上述混标溶液、加标溶液和对照品溶液各2ml，置于10ml量瓶中，加衍生化试剂2ml后摇匀，80℃水浴反应30分钟,冷却到室温，用水稀释至刻度，摇匀，然后，精密量取2ml，加二氯甲烷2ml，充分振摇，在3000转/min离心条件离心5min，精密量取上清液1ml，加纯化水1ml，摇匀制得待测溶液，取10ul进行液相检测。
表3加样回收率的的检测结果
Figure BDA0003491632790000101
测定浓度＝加标溶液浓度-对照品溶液浓度；加标溶液和对照品溶液检测峰面积代入标准曲线，得到浓度值。其中，加标1.0mg/L是按0.05％单杂限度的100％添加，加标2.0mg/L是按0.05％单杂限度的200％添加。
从表3可以看出，HPLC同时测定D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖具有优异的加样回收率，从而能够同时准确定量测定葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖的含量。
5.检出限试验
将D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖标准品各20mg，一起加入到10ml容量瓶中，加水定容，得到各个单糖浓度分别为2.0mg/ml的标准溶液，然后依次不断稀释成不同浓度的标准混合溶液。
量取各个不同浓度的标准混合溶液2ml，置10ml容量瓶中，加衍生化试剂2ml，摇匀，80℃水浴加热30分钟，冷却到室温，用水稀释至刻度，摇匀，然后，精密量取2ml，加二氯甲烷2ml，充分振摇，在3000转/min离心条件离心5min，精密量取上清液1ml，加纯化水1ml，摇匀，得到检出限溶液，将检出限溶液进样HPLC，测定各个单糖的检出限(3倍信噪比，n＝3)。
检出限的检测结果如表4所示。
表4检出限的检测结果
Figure BDA0003491632790000111
从表4可以看出，HPLC同时测定D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖的检出限低，灵敏度高。
6.定量限试验
将D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖标准品各20mg，一起加入到10ml容量瓶中，加水定容，得到各个单糖浓度分别为2.0mg/ml的标准溶液，然后依次不断稀释成不同浓度的标准混合溶液。
量取各个不同浓度的标准混合溶液2ml，置10ml容量瓶中，加衍生化试剂2ml，摇匀，80℃水浴加热30分钟，冷却到室温，用水稀释至刻度，摇匀，然后，精密量取2ml，加二氯甲烷2ml，充分振摇，在3000转/min离心条件离心5min，精密量取上清液1ml，加纯化水1ml，摇匀，得到定量限溶液，将定量限溶液进样HPLC，测定各个单糖的定量限(10倍信噪比，n＝3)。
定量限的检测结果如表5所示。
表5定量限的检测结果
Figure BDA0003491632790000121
从表5可以看出，HPLC同时测定D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖的定量限低，即D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖在低含量可用于定量测定。
7.标准曲线试验
将D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖标准品各20mg，一起加入到10ml容量瓶中，加水定容，得到各个单糖浓度分别为2.0mg/ml的标准溶液，依次稀释后，分别得到各个单糖浓度分别为0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L、10mg/L的标准混合溶液。
分别量取各个单糖浓度分别为0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L、10mg/L的标准混合溶液2ml，置10ml容量瓶中，加衍生化试剂2ml，摇匀，80℃水浴加热30分钟，冷却到室温，用水稀释至刻度，摇匀，然后，精密量取2ml，加二氯甲烷2ml，充分振摇，在3000转/min离心条件离心5min，精密量取上清液1ml，加纯化水1ml，摇匀，得到待测标准溶液，将待测标准溶液进样HPLC，测定各个单糖的不同浓度下的峰面积，绘制标准曲线。
各个单糖标准曲线的检测结果如表6所示。
表6各个单糖标准曲线的检测结果
有关物质 回归方程 相关系数R<sup>2</sup>
D-葡萄糖醛酸 Y＝7640.33X-135.350 0.99986
D-半乳糖醛酸 Y＝5938.80X-100.698 0.99986
D-葡萄糖 Y＝10013.9X-179.802 0.99996
D-半乳糖 Y＝10607.2X+8.64512 0.99996
L-阿拉伯糖 Y＝11998.9X+6859.15 0.99853
D-核糖 Y＝11709.2X-291.609 0.99994
D-岩藻糖 Y＝10395.7X+174.244 0.99988
L-鼠李糖 Y＝8993.48X-1160.764 0.99996
2-脱氧-D-核糖 Y＝9290.92X-587.040 0.99987
其中，Y代表HPLC峰面积，X代表单糖浓度(mg/L)
从表6中可以看出，HPLC同时测定D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-核糖、L-阿拉伯糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖具有优异的标准曲线，能够同时用于D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-核糖、L-阿拉伯糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖和2-脱氧-D-核糖的准确定量测定。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于测定单糖的HPLC方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)通过高效液相对样品中的单糖进行测定；
所述的高效液相的色谱条件为：
色谱柱：反相色谱柱；
流动相：流动相A和流动相B，所述的流动相A包括乙腈；所述的流动相B包括柠檬酸盐缓冲液和四氢呋喃的混合液；和
流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为：
Figure FDA0003491632780000011
其中，(v/v％)是指占流动相的体积分数，其中，0-25min时，流动相A(v/v％)的体积分数保持为1％，流动相B的体积分数保持为99％；25-30min时，流动相A(v/v％)的体积分数为从1％匀速上升到7％，流动相B(v/v％)的体积分数为从99％匀速下降到93％；30-56min时，流动相A(v/v％)的体积分数为从7％匀速下降到1％，流动相B(v/v％)的体积分数为从93％匀速上升到99％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为定量和/或定性方法。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单糖包括葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖和2-脱氧-D-核糖中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖醛酸包括D-葡萄糖醛酸；
所述半乳糖醛酸包括D-半乳糖醛酸；
所述半乳糖包括D-半乳糖；
所述葡萄糖包括D-葡萄糖；
所述阿拉伯糖包括L-阿拉伯糖；
所述核糖包括D-核糖；
所述岩藻糖包括D-岩藻糖；和/或
所述鼠李糖包括L-鼠李糖。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相B中，柠檬酸盐缓冲液与四氢呋喃体积比为(80-95)∶(5-20)，较佳地(85-93)∶(8-15)，更佳地(86-90)∶(10-14)，更佳地(87-89)∶(11-13)，最佳地88∶12。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相B中，柠檬酸盐缓冲液的pH为3-7，较佳地4.0-6.0，更佳地4.5-5.5，更佳地4.8-5.2，最佳地5.0。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：
色谱柱温度：25-35℃，较佳地28-32℃，更佳地30℃；和/或
流动相(流动相A+流动相B)流速：0.2-3mL/min，较佳地0.5-1.5mL/min，更佳地0.6-1.0mL/min，最佳地0.8mL/min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)包括：先用衍生化试剂对样品中的单糖进行衍生化，得到含有衍生化的单糖的样品后，然后进样HPLC，从而测定单糖。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的衍生化试剂包括0.1-4重量份氰基硼氢钠、0.4-9重量份4-氨基苯甲酸乙酯、0.1-2重量份硼酸、2-15重量份醋酸和40-50重量份甲醇。
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