CN112834663A - 一种肉苁蓉多糖中单糖的综合分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肉苁蓉多糖中单糖的综合分析方法，采用柱前衍生化高效液相色谱法与离子色谱法相结合的方法，解决了果糖不能被衍生化试剂标记的问题，可以同时测定半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖以及葡萄糖醛酸这11种单糖，联合测定11种单糖的含量信息。测定多糖中单糖的组成，此方法的研究对研究多糖中单糖的组成具有很好的参考价值，对多糖一级结构和构效活性的研究有一定的基础意义，具有推广应用的价值。

Description

一种肉苁蓉多糖中单糖的综合分析方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种肉苁蓉多糖中单糖的综合分析方法。
背景技术
肉苁蓉属植物为列当科多年生草本寄生植物，始载于《神农本草经》，我国有5种，主要分布于内蒙古、新疆、甘肃和宁夏等地2015年版《中华人民共和国药典》规定，肉苁蓉来源于肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma或管花肉苁蓉C.tubulosa(Schenk)Wight。肉苁蓉具有多种生物活性，在我国已有2000多年的药用历史，在历代补益性中药处方中出现率占第1位。肉苁蓉多糖是肉苁蓉属植物最重要的活性成分之一，具有调节免疫活性、抗衰老、抗肿瘤等作用。且多糖的生物活性与多糖的单糖组成及相对分子质量紧密相关。因此，对多糖中单糖组成的分析也逐渐成为一个至关重要的环节。在研究多糖结构与组分时，必须对多糖进行水解，通过分离纯化，用适宜的分析方法测定单糖含量，以获得相应单糖的组成信息。目前文献报道常用的测定单糖含量的方法有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳检测法(CE)以及离子色谱法(IC)等。每种方法都有优点、不足之处，有一定的适用范围，在单糖的含量测定时单一方法不能很好的满足需要时，应考虑多种方法联合应用。其中高效液相色谱法测定单糖种类最多，最为常用。此外，单糖的种类主要为戊糖和己糖，因大部分单糖紫外吸收很弱，不能利用光吸收的方法进行直接检测，需将糖类进行衍生化处理，使其带有发光基团，增强检测信号，使检测灵敏度提高。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化方法操作简便、灵敏度高、反应条件条件温和，被广泛应用于定性与定量分析中。本发明采用柱前衍生化高效液相色谱法与离子色谱法联用的技术，联合测定11种单糖的含量信息。测定多糖中单糖的组成，对多糖一级结构和构效活性的研究有一定的基础意义。
发明内容
本发明的目的是要提供一种肉苁蓉多糖中单糖的综合分析方法。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
包括肉苁蓉多糖水解及单糖衍生化方法和肉苁蓉多糖中单糖的含量测定方法，所述肉苁蓉多糖水解及单糖衍生化方法包括以下步骤：
S1.1：取肉苁蓉多糖粉末加水配置成多糖溶液，加入等体积的浓度的三氟乙酸，置于恒温烘箱中水解；
S1.2：水解完成后，将甲醇加入到水解产物中并在水浴上蒸干；
S1.3：重复步骤S1.2四次；
S1.4：将干燥好的水解产物在溶于水中，取水解产物置于具塞试管中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液混合均匀，烘箱中反应，取出放置冷却至室温；
S1.5：加入HCL溶液中和NaOH，加纯水，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层；
S1.6：重复步骤S1.5萃取2次以除去多余的PMP，最后水相用微孔滤膜过滤后即得肉苁蓉单糖衍生化溶液；
所述肉苁蓉多糖中单糖的含量测定方法包括柱前衍生化高效液相色谱法和离子色谱法，所述柱前衍生化高效液相色谱法包括以下步骤：
S2.1：色谱条件的选择：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，C18色谱柱；流动相的选择：选用乙腈-磷酸二氢钾缓冲溶液的流动相系统，峰纯度及分离度满足实验要求的半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸以及岩藻糖；
S2.2：试验溶液的制备：包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备和空白溶液的制备；
对照品溶液的制备：分别取半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸以及岩藻糖加适量的水溶解制成混合对照溶液，取混合对照溶液置于具塞试管中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液混合均匀，烘箱中反应，取出放置冷却至室温，加入HCL溶液中和NaOH，加纯水，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取以除去多余的PMP，最后水相用微孔滤膜过滤后即得；
供试品溶液的制备：取肉苁蓉多糖粉末，加水配置成多糖溶液，加入等体积的三氟乙酸，置于恒温烘箱中水解，甲醇加入到水解产物中并在水浴上蒸干，重复操作将干燥好的水解产物在溶于水中，取水解产物置于具塞试管中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液混合均匀，烘箱中反应，取出放置冷却至室温，加入HCL溶液中和NaOH，加纯水，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取以除去多余的PMP，最后水相用微孔滤膜过滤后即得；
空白溶液的制备：取纯化水置于具塞试管中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液混合均匀，烘箱中反应，取出放置冷却至室温，加入HCL溶液中和NaOH，加纯水，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取以除去多余的PMP，最后水相用微孔滤膜过滤后即得；
S2.3：峰纯度检查：精密吸取S2.2项下的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，以二极管阵列检测器对被测成分进行纯度验证；
S2.4：专属性考察：精密吸取空白溶剂，混合对照品溶液，供试品溶注入液相色谱仪，供试品溶液中葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖醛酸色谱峰保留时间与混合对照品一致，且在相同时间空白溶剂无吸收。表明该含量测定方法专属性好，空白溶剂无干扰；
所述离子色谱法包括以下步骤：
S3.1：色谱条件的选择：色谱柱：用PA20保护柱，PA20分析柱；流动相的选择：选用饮用水、NaOH、醋酸钠为淋洗液进行梯度洗脱，分别考察不同洗脱梯度对分离度以及纯度的影响；
S3.2：试验溶液的制备：
对照品溶液的制备：
分别取阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖以及葡萄糖醛酸加适量的水溶解制成混合对照溶液，过微孔滤膜后即得；
供试品溶液的制备：
取肉苁蓉多糖粉末加水配置成多糖溶液，加入等体积的浓度的三氟乙酸，置于恒温烘箱中水解，水解完成后，为了去除样品中残留的三氟乙酸，将甲醇加入到水解产物中并在水浴上蒸干，重复操作四次，将干燥好的水解产物在溶于水中，取水解产物置于容量瓶中，用水稀释，过微孔滤膜后即得；
空白溶液的制备：取纯化水，过微孔滤膜后即得；
S3.3：专属性考察：精密吸取空白溶剂，混合对照品溶液，供试品溶液注入离子色谱仪，供试品溶液中阿拉伯糖与葡萄糖醛酸色谱峰保留时间与混合对照品一致，且在相同时间空白溶剂无吸收，表明该含量测定方法专属性好，空白溶剂无干扰。
本发明的有益效果是：
本发明是一种肉苁蓉多糖中单糖的综合分析方法，与现有技术相比，本发明采用柱前衍生化高效液相色谱法与离子色谱法相结合的方法，解决了果糖不能被衍生化试剂标记的问题，可以同时测定半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖以及葡萄糖醛酸这11种单糖，此方法的研究对研究多糖中单糖的组成具有很好的参考价值。
附图说明
图1是本发明多糖水解温度的考察曲线图；
图2是本发明多糖水解时间的考察曲线图；
图3是本发明单糖衍生化温度的考察曲线图；
图4是本发明单糖衍生化时间的考察曲线图；
图5是本发明对照品光谱图；
图6是本发明的空白溶剂色谱图(1.PMP衍生化试剂)；
图7是本发明的混合对照品色谱图(1.PMP衍生化试剂 2.甘露糖 3.鼠李糖 4.半乳糖醛酸 5.葡萄糖 6.半乳糖 7.岩藻糖)；
图8是本发明的供试品溶液色谱图(1.PMP衍生化试剂 2.甘露糖 3.鼠李糖 4.半乳糖醛酸 5.葡萄糖 6.半乳糖)；
图9是本发明的空白溶液色谱图(1.杂质干扰)；
图10是本发明的混合对照品溶液色谱图(1.阿拉伯糖 2.木糖 3.果糖 4.核糖 5.杂质干扰 6.葡萄糖醛酸)；
图11是本发明的供试品溶液色谱图(1.阿拉伯糖 2.杂志干扰 3.葡萄糖醛酸)。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
1仪器试药及样品：
肉苁蓉多糖(自制)
Thermo Ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司)、二极管阵列检测器；Thermo ICS-5000型离子色谱仪配有安培检测器(Au为工作电极，Ag/Agcl为参比电极)、糖标准四电位波形(美国戴安公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AE100型万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ME5型百万分之一天平(德国赛多利斯公司)；TDL-5A型离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)，PB-10型PH计(北京赛多利斯科学仪器有限公司)
鼠李糖(批号：111683-201502)、葡萄糖醛酸(批号：140648-201804)、阿拉伯糖(批号：1506-200202)、木糖(批号：11508-201605)、核糖(批号：140668-201302)、果糖(批号：111504-201703)、岩藻糖(批号：112014-201902)、甘露糖(批号：140651-201504)、葡萄糖(批号：110833-201205)、半乳糖(批号：100226-201506)、半乳糖醛酸(批号：111646-201702)，均购买于中国食品药品检定研究院
三氟乙酸(国药集团化学试剂有限公司)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(国药集团化学试剂有限公司)、95％乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)、屈臣氏饮用水
2实验方法与结果：
2.1肉苁蓉多糖的水解以及单糖衍生化(参照文献报道，拟定试验)
取肉苁蓉多糖粉末(过5号筛)20mg，加水配置成10mg/mL左右的多糖溶液，加入等体积的浓度为4mol/L的三氟乙酸，置于恒温烘箱中110℃水解4小时。水解完成后，为了去除样品中残留的三氟乙酸，将1mL甲醇加入到水解产物中并在水浴上蒸干，重复操作四次。将干燥好的水解产物在溶于4mL水中，取1mL水解产物置于具塞试管中，加入2ml 0.3mol/L的NaOH溶液，2ml 0.5mol/L的PMP甲醇溶液混合均匀，70℃烘箱中反应100min，取出放置冷却至室温，加入0.3mol/L的HCL溶液2ml中和NaOH，加纯水至10ml，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取2次以除去多余的PMP，最后水相用0.45μm微孔滤膜过滤后即得。
2.2单因素考察：
在肉苁蓉多糖浓度为10mg/mL、酸为三氟乙酸、加甲醇水浴蒸干、三氯甲烷萃取三次为提取条件下，分别考察水解温度(80℃、90℃、100℃、110℃、120℃)、水解时间(1h、2h、4h、6h、8h)、衍生化温度(50℃、60℃、70℃、80℃、85℃)、衍生化时间(30min、50min、70min、85min、100min)对单糖含量的影响，按2.2项操作得单糖。
2.2.1多糖水解温度的考察：
在80℃～120℃的考察范围内，单糖的含量(以葡萄糖为例，下同)先增大后减小，在110℃时达到最大值。多糖的水解实质是破坏糖苷键的过程，反应温度过低糖苷键破坏不完全，温度过高易使糖类焦糖化，故肉苁蓉多糖的最佳水解温度为110℃。结果见图1。
2.2.2多糖水解时间的考察：
在水解温度确定为110℃的条件下，对水解时间在1h～8h的范围内进行考察，随着反应时间的延长，单糖的含量逐渐增多，当水解时间为6h时达到最大，由于反应时间过短会导致水解不完全，单糖含量降低，最终选用6h为水解时间。结果见图2。
2.2.3单糖衍生化温度的考察：
在衍生化温度为50℃～85℃的考察范围内，单糖的含量随着温度的升高而变化，当温度升高至70℃时，单糖的含量达到最大值，随后升高温度含量降低，故选择70℃作为衍生化反应的最适温度。结果见图3。
2.2.4单糖衍生化时间的考察：
当衍生化温度确定为70℃时，对衍生化时间进行考察，在30min～100min考察范围内，单糖的含量与反应时间呈正相关，当反应进行到85min时，衍生化反应进行完全，故选择85min为衍生化反应的最适时间。结果见图4。
通过对单因素的考察试验，最终确定测定的参数如下：取肉苁蓉多糖粉末(过5号筛)20mg，加水配置成10mg/mL左右的多糖溶液，加入等体积的浓度为4mol/L的三氟乙酸，置于恒温烘箱中110℃水解6小时。水解完成后，为了去除样品中残留的三氟乙酸，将1mL甲醇加入到水解产物中并在水浴上蒸干，重复操作四次。将干燥好的水解产物在溶于4mL水中，取1mL水解产物置于具塞试管中，加入2ml 0.3mol/L的NaOH溶液，2ml 0.5mol/L的PMP甲醇溶液混合均匀，70℃烘箱中反应85min，取出放置冷却至室温，加入0.3mol/L的HCL溶液2ml中和NaOH，加纯化水至10ml，然后再加入等体积的三氯甲烷萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取2次以除去多余的PMP，最后水相用0.45μm微孔滤膜过滤后即得。
2.3肉苁蓉多糖中单糖的含量测定：
2.3.1柱前衍生化高效液相色谱法：
2.3.1.1色谱条件的选择：
(1)色谱柱：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，本实验研究用Diamonsil C18 250×4.6mm 5μm柱。
(2)流动相的选择：
本实验选用乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液PH 6.85(18∶82)的流动相系统，半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸以及岩藻糖峰纯度及分离度理想，能够满足实验要求。
(3)检测波长的选择：
通过二极管阵列检测器对混合对照品自190nm～800nm进行光谱扫描，6种对照品在200nm处与250nm处吸收峰最强，但考虑到乙腈在200nm处有吸收干扰，故选择测定波长为250nm。见图5。
(4)其它参数：
柱温为30℃，流速为1.0mL·min-1，进样量为20μL，检测时间65min。
2.3.1.2试验溶液的制备：
(1)对照品溶液的制备：
分别取半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸以及岩藻糖加适量的水溶解制成混合对照溶液，取1mL混合对照溶液置于具塞试管中，加入2mL0.3mol/L的NaOH溶液，2ml 0.5mol/L的PMP甲醇溶液混合均匀，70℃烘箱中反应85min，取出放置10min冷却至室温，加入0.3mol/L的HCL溶液2mL中和NaOH，加纯化水至10mL，然后再加入等体积的三氯甲烷萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取2次以除去多余的PMP，最后水相用0.45μm微孔滤膜过滤后即得。
(2)供试品溶液的制备：
取肉苁蓉多糖粉末(过5号筛)20mg，加水配置成10mg/mL左右的多糖溶液，加入等体积的浓度为4mol/L的三氟乙酸，置于恒温烘箱中110℃水解6h。水解完成后，为了去除样品中残留的三氟乙酸，将1mL甲醇加入到水解产物中并在水浴上蒸干，重复操作四次。将干燥好的水解产物在溶于4mL水中，取1mL水解产物置于具塞试管中，加入2mL 0.3mol/L的NaOH溶液，2mL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液混合均匀，70℃烘箱中反应85min，取出放置10min冷却至室温，加入0.3mol/L的HCL溶液2mL中和NaOH，加纯化水至10mL，然后再加入等体积的三氯甲烷萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取2次以除去多余的PMP，最后水相用0.45μm微孔滤膜过滤后即得。
(3)空白溶液的制备：
取1mL纯化水置于具塞试管中，加入2mL 0.3mol/L的NaOH溶液，2mL0.5mol/L的PMP甲醇溶液混合均匀，70℃烘箱中反应85min，取出放置10min冷却至室温，加入0.3mol/L的HCL溶液2mL中和NaOH，加纯水至10mL，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取2次以除去多余的PMP，最后水相用0.45μm微孔滤膜过滤后即得。
2.3.1.3峰纯度检查：
精密吸取2.3.1.2项下的对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，以二极管阵列检测器对被测成分进行纯度验证，结果显示对照品及供试品溶液中各目标成分峰的匹配度表明被测样品中各成分为单一成分。
2.3.1.4专属性考察：
精密吸取空白溶剂，混合对照品溶液，供试品溶液各20μl注入液相色谱仪。供试品溶液中葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖醛酸色谱峰保留时间与混合对照品一致，且在相同时间空白溶剂无吸收。表明该含量测定方法专属性好，空白溶剂无干扰。见图6、7、8。
2.3.2离子色谱法：
2.3.2.1色谱条件的选择：
(1)色谱柱：
色谱柱：本实验研究用CarboPac PA 20保护柱(50mm×3mm)，CarboPac PA 20分析柱(150mm×3mm)
(2)流动相的选择：
本实验选用A：屈臣氏饮用水；B：250mmoL/L NaOH；C：250mmoL/L的醋酸钠；D：700mmoL/L NaOH为淋洗液进行梯度洗脱，分别考察了不同洗脱梯度对分离度以及纯度的影响。见下表1、2、3。
表1洗脱梯度1
时间(min) B(％) C(％) D(％)
0.000 6.0 0.0 0.0
3.000 6.0 0.0 0.0
3.100 0.0 0.0 9.0
15.000 0.0 0.0 9.0
15.100 5.0 20.0 0.0
25.000 10.0 80.0 0.0
25.100 100.0 0.0 0.0
32.000 100.0 0.0 0.0
32.100 6.0 0.0 0.0
37.000 6.0 0.0 0.0
表2洗脱梯度2
Figure BSA0000232870300000111
Figure BSA0000232870300000121
表3洗脱梯度3
时间(min) B(％) C(％) D(％)
0.000 13.5 0.0 0.0
10.000 13.5 0.0 0.0
10.100 0.0 0.0 9.0
15.000 0.0 0.0 9.0
15.100 5.0 20.0 0.0
25.000 10.0 80.0 0.0
25.100 100.0 0.0 0.0
32.000 100.0 0.0 0.0
32.100 13.5 0.0 0.0
37.000 13.5 0.0 0.0
结果显示，洗脱梯度1与洗脱梯度2进行洗脱时，核糖与果糖分离度未能达到要求，以梯度3为条件时，葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖、果糖以及核糖峰纯度及分离度理想，能够满足实验要求，故选择洗脱梯度3进行梯度洗脱。
(3)其它参数：
柱温为30℃，流速为0.4mL·min-1，进样量为10μL。
2.3.2.2试验溶液的制备：
(1)对照品溶液的制备：
分别取阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖以及葡萄糖醛酸加适量的水溶解制成混合对照溶液，过0.22μm微孔滤膜后即得。
(2)供试品溶液的制备：
取肉苁蓉多糖粉末(过5号筛)20mg，加水配置成10mg/mL左右的多糖溶液，加入等体积的浓度为4mol/L的三氟乙酸，置于恒温烘箱中110℃水解6h。水解完成后，为了去除样品中残留的三氟乙酸，将1mL甲醇加入到水解产物中并在水浴上蒸干，重复操作四次。将干燥好的水解产物在溶于4mL水中，取1mL水解产物置于10mL容量瓶中，用水稀释至刻度，过0.22μm微孔滤膜后即得。
(3)空白溶液的制备：
取1mL屈臣氏饮用水，过0.22μm微孔滤膜后即得。
2.3.2.3专属性考察：
精密吸取空白溶剂，混合对照品溶液，供试品溶液各10μl注入离子色谱仪。供试品溶液中阿拉伯糖与葡萄糖醛酸色谱峰保留时间与混合对照品一致，且在相同时间空白溶剂无吸收。表明该含量测定方法专属性好，空白溶剂无干扰。见图9、10、11。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种肉苁蓉多糖中单糖的综合分析方法，其特征在于：包括肉苁蓉多糖水解及单糖的衍生化方法和肉苁蓉多糖中单糖的含量测定方法，所述肉苁蓉多糖水解及单糖衍生化的方法包括以下步骤：
S1.1：取肉苁蓉多糖粉末加水配置成多糖溶液，加入等体积的浓度的三氟乙酸，置于恒温烘箱中水解；
S1.2：水解完成后，将甲醇加入到水解产物中并在水浴上蒸干；
S1.3：重复步骤S1.2四次；
S1.4：将干燥好的水解产物在溶于水中，取水解产物置于具塞试管中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液混合均匀，烘箱中反应，取出放置冷却至室温；
S1.5：加入HCL溶液中和NaOH，加纯水，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层；
S1.6：重复步骤S1.5萃取2次以除去多余的PMP，最后水相用微孔滤膜过滤后即得肉苁蓉单糖衍生化溶液；
所述肉苁蓉多糖中单糖的含量测定方法包括柱前衍生化高效液相色谱法和离子色谱法，所述柱前衍生化高效液相色谱法包括以下步骤：
S2.1：色谱条件的选择：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，C18色谱柱；流动相的选择：选用乙腈-磷酸二氢钾缓冲溶液的流动相系统，峰纯度及分离度满足实验要求的半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸以及岩藻糖；
S2.2：试验溶液的制备：包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备和空白溶液的制备；
对照品溶液的制备：分别取半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸以及岩藻糖加适量的水溶解制成混合对照溶液，取混合对照溶液置于具塞试管中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液混合均匀，烘箱中反应，取出放置冷却至室温，加入HCL溶液中和NaOH，加纯水，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取以除去多余的PMP，最后水相用微孔滤膜过滤后即得；
供试品溶液的制备：取肉苁蓉多糖粉末，加水配置成多糖溶液，加入等体积的三氟乙酸，置于恒温烘箱中水解，甲醇加入到水解产物中并在水浴上蒸干，重复操作将干燥好的水解产物溶于水中，取水解产物置于具塞试管中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液混合均匀，烘箱中反应，取出放置冷却至室温，加入HCL溶液中和NaOH，加纯水，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取以除去多余的PMP，最后水相用微孔滤膜过滤后即得；
空白溶液的制备：取纯化水置于具塞试管中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液混合均匀，烘箱中反应，取出放置冷却至室温，加入HCL溶液中和NaOH，加纯水，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取以除去多余的PMP，最后水相用微孔滤膜过滤后即得；
S2.3：峰纯度检查：精密吸取S2.2项下的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，以二极管阵列检测器对被测成分进行纯度验证；
S2.4：专属性考察：精密吸取空白溶剂，混合对照品溶液，供试品溶液注入液相色谱仪，供试品溶液中葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖醛酸色谱峰保留时间与混合对照品一致，且在相同时间空白溶剂无吸收。表明该含量测定方法专属性好，空白溶剂无干扰；
所述离子色谱法包括以下步骤：
S3.1：色谱条件的选择：色谱柱：用PA 20保护柱，PA 20分析柱；流动相的选择：选用饮用水、NaOH、醋酸钠为淋洗液进行梯度洗脱，分别考察不同洗脱梯度对分离度以及纯度的影响；
S3.2：试验溶液的制备：
对照品溶液的制备：
分别取阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖以及葡萄糖醛酸加适量的水溶解制成混合对照溶液，过微孔滤膜后即得；
供试品溶液的制备：
取肉苁蓉多糖粉末加水配置成多糖溶液，加入等体积的浓度的三氟乙酸，置于恒温烘箱中水解，水解完成后，为了去除样品中残留的三氟乙酸，将甲醇加入到水解产物中并在水浴上蒸干，重复操作四次，将干燥好的水解产物溶于水中，取水解产物置于容量瓶中，用水稀释，过微孔滤膜后即得；
空白溶液的制备：取纯化水，过微孔滤膜后即得；
S3.3：专属性考察：精密吸取空白溶剂，混合对照品溶液，供试品溶液注入离子色谱仪，供试品溶液中阿拉伯糖与葡萄糖醛酸色谱峰保留时间与混合对照品一致，且在相同时间空白溶剂无吸收，表明该含量测定方法专属性好，空白溶剂无干扰。
2.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖中单糖的分析方法，其特征在于：所述步骤S1.1中，肉苁蓉多糖粉末20mg并过5号筛，加水配置成的多糖溶液为10mg/mL，三氟乙酸为4mol/L，烘箱温度为110℃，水解6小时；
所述步骤S1.2中，甲醇加入量为1mL；
所述步骤S1.4中，将干燥好的水解产物在溶于4mL水中，取1mL水解产物置于具塞试管中，加入2ml 0.3mol/L的NaOH溶液，2ml 0.5mol/L的PMP甲醇溶液混合均匀，70℃烘箱中反应85min，取出放置冷却至室温；
所述步骤S1.5中，加入0.3mol/L的HCL溶液2ml中和NaOH，加纯水至10ml；
所述步骤S1.6中，微孔滤膜为0.45μm。
3.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖中单糖的分析方法，其特征在于：所述步骤S2.1中，Diamonsil C18 250×4.6mm 5μm色谱柱；流动相的选择：选用乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液PH 6.85(18∶82)的流动相系统；检测波长的选择：选择测定波长为250nm，其它参数：柱温为30℃，流速为1.0mL·min-1，进样量为20μL，检测时间65min；
步骤S2.2中，对照品溶液的制备：混合对照溶液为1mL，加入NaOH溶液为2mL 0.3mol/L，PMP甲醇溶液为2ml 0.5mol/L，烘箱温度70℃中反应85min，取出放置10min冷却至室温，加入0.3mol/L的HCL溶液2mL中和NaOH，加纯水至10mL，重复萃取2次以除去多余的PMP，最后水相用0.45μm微孔滤膜过滤后即得；
供试品溶液的制备：取肉苁蓉多糖粉末20mg并过5号筛，加水配置成10mg/mL的多糖溶液，加入等体积的浓度为4mol/L的三氟乙酸，置于恒温烘箱中110℃水解6h，水解完成后，甲醇加入量为1mL，重复操作四次，将干燥好的水解产物在溶于4mL水中，取1mL水解产物置于具塞试管中，加入2mL 0.3mol/L的NaOH溶液，2mL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液混合均匀，70℃烘箱中反应85min，取出放置10min冷却至室温，加入0.3mol/L的HCL溶液2mL中和NaOH，加纯水至10mL，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取2次以除去多余的PMP，最后水相用0.45μm微孔滤膜过滤后即得；
空白溶液的制备：取1mL纯化水置于具塞试管中，加入2mL 0.3mol/L的NaOH溶液，2mL0.5mol/L的PMP甲醇溶液混合均匀，70℃烘箱中反应85min，取出放置10min冷却至室温，加入0.3mol/L的HCL溶液2mL中和NaOH，加纯水至10mL，然后再加入等体积的三氯甲烷溶液萃取，振摇，静置，弃去三氯甲烷层，继续重复萃取2次以除去多余的PMP，最后水相用0.45μm微孔滤膜过滤后即得；
步骤S2.3中，精密吸取S2.2项下的对照品溶液和供试品溶液各20μl；
步骤S2.4中，精密吸取空白溶剂，混合对照品溶液，供试品溶液各20μl注入液相色谱仪。
4.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖中单糖的分析方法，其特征在于：步骤S3.1中，色谱柱：用50mm×3mm的CarboPac PA 20保护柱，150mm×3mm的CarboPac PA 20分析柱；流动相的选择：选用A：饮用水；B：250mmoL/L NaOH；C：250mmoL/L的醋酸钠；D：700mmoL/L NaOH为淋洗液进行梯度洗脱，其它参数：柱温为30℃，流速为0.4mL·min-1，进样量为10μL；
步骤S3.2中，微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜；
供试品溶液的制备：
取肉苁蓉多糖粉末20mg并过5号筛，加水配置成10mg/mL的多糖溶液，加入等体积的浓度为4mol/L的三氟乙酸，置于恒温烘箱中110℃水解6h，甲醇加入量为1mL干燥好的水解产物在溶于4mL水中，取1mL水解产物置于10mL容量瓶中，用水稀释，过0.22μm微孔滤膜后即得；
空白溶液的制备：取1mL纯化水，过0.22μm微孔滤膜后即得；
步骤S3.3中，供试品溶液各10μl注入离子色谱仪。
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