CN105636608A - 免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物及其快速高产的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及显示出显著高抗体效价的免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物。载体蛋白质获自革兰氏阳性菌的组，多糖片段获自革兰氏阴性菌的组，优选地获自流感嗜血杆菌(Haemophilus？influenzae)血清型b(Hib)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria？meningitidis)血清组A和C(MenA和MenC)。本发明还涉及制备所述多糖-蛋白质缀合物的快速且高产的方法，其中采用还原胺化化学使衍生化的载体蛋白质与最佳长度的经切割和解聚的多糖片段反应以获得多糖-蛋白质缀合物。本发明还涉及使多糖片段化成用于缀合的最佳长度的化学方法。

Description

免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物及其快速高产的制备方法
技术领域
本发明涉及免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物以及获得所述多糖-蛋白质缀合物的快速高产的缀合方法。更特别地，本发明提供了使用用于产生增强免疫原性的优化多糖链长度来开发的多糖蛋白质缀合物疫苗。本发明还涉及用于使多糖与载体蛋白质缀合的具有提高的产率和更高的免疫原性的还原胺化快速方法。
背景技术
疫苗接种(免疫接种)是引发免疫应答的方式。疫苗接种的方法包括向活的实体施用疫苗，这继而激活人体的自然免疫系统。疫苗包含小剂量的抗原，其为减弱的病原体或死病原体(例如细菌或病毒或病原体结构的一部分)的制备物，其在施用后刺激抗体产生或针对病原体的细胞免疫。
在免疫学上，可将抗原分类为T细胞依赖性(TD)抗原或T-细胞非依赖性(TI)抗原。蛋白质和肽通常是TD抗原并且需要来自辅助T淋巴细胞的刺激以便引发免疫应答，并且由于记忆B和T淋巴细胞的形成而诱导持久的免疫应答。与此相反，TI抗原刺激B细胞增殖和分化成分泌抗体的效应细胞，无需T细胞的帮助并且不形成记忆B和T淋巴细胞。大多数这些T细胞依赖性抗原是刺激产生低亲和力抗体的微生物多糖。
在革兰氏阴性菌中，在细菌荚膜中存在的多糖是显示出差的免疫原性的重要毒力因子。缀合物疫苗是微生物多糖(polysaccharide，PS)抗原与载体蛋白质(carrierprotein，CP)偶联的产物，从而将T细胞非依赖性免疫应答转变成T细胞依赖性免疫应答。使用缀合物疫苗来免疫婴儿和儿童以抵抗包含荚膜多糖的细菌引起的侵入性疾病。抗原性荚膜多糖与载体蛋白质的偶联产生高度免疫原性的缀合物。
碳水化合物-蛋白质缀合物在基础研究中被广泛使用并且作为多种细菌疫苗中的免疫原。已经付出了巨大的努力来开发用于构建这些缀合物的简单且可靠的方法。虽然通过还原胺化进行直接偶联是有有吸引力的方法，但其同样具有许多缺点。通过还原胺化的现有缀合方法是耗时且低产率的方法，同时如此得到的缀合物显示出较低的免疫原性。
多糖-蛋白质缀合物的免疫学性能是长度依赖的，可能需要优化多个表位也是一个公认的事实(Costantino等，1999)。还已知较小多糖片段的选择性末端基团活化方法以一致的再现性产生了很好地限定了缀合物疫苗。较大尺寸的多糖分子可具有空间上隐藏的表位，然而较小的片段在缀合后将具有暴露于免疫系统的最大表位。
已经开发了用于制备较小的多糖片段的数种方法，包括多糖的解聚。在现有技术中已充分地描述了多糖的解聚。例如，Laferriere等，2011年的文章“ExperimentaldesigntooptimizeanHaemophilusinfluenzaetypebconjugatevaccinemadewithhydrazide-derivatizedtetanustoxoid”对其进行了详细的描述。一个主要的缺点是该方法花费很长的时间(32小时以上)，并具有约15％的缀合物产率。Anderson等，1986年也描述了使用较小尺寸的多糖用于与白喉类毒素缀合，并发现由20个重复单元的Hib-PRP制成的缀合物比由8个重复单元制成的那些具有更强的免疫原性。他们的方法也花费很长的时间，即超过5天。
本发明通过提供用于使多糖与载体蛋白质缀合的具有提高的产率和更高的免疫原性的还原胺化的快速方法克服了现有技术的缺点。本发明的方法需要较短的缀合时间。本发明还提供了通过向免疫系统更好地暴露抗原表位的免疫原性增强的小尺寸多糖。
发明目的
因此，本发明的主要目的是提供免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物。
本发明的另一个目的是提供用于多糖片段化的化学方法。
本发明的另一个目的是提供用于流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)b型(Hib)的免疫原性增强的较低分子量(LowerMolecularWeight，LMW)多糖蛋白质缀合物疫苗。
本发明的另一个目的是提供用于脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)血清组A和C(MenA和MenC)的免疫原性增强的较高分子量(HigherMolecularWeight，HMW)多糖蛋白质缀合物疫苗。
本发明的另一个目的是提供获得具有较短缀合时间和更高缀合物产率的多糖-蛋白质缀合物的快速方法。
发明内容
因此，本发明提供了免疫原性增强的多糖-蛋白缀合物和获得所述多糖-蛋白质缀合物及其疫苗的快速高产率缀合方法。
本发明提供了优化分子量的多糖-蛋白质缀合物，其中多糖被片段化成分子量在100±40kD的范围内，更优选地具有约100kD的平均分子量。
本发明还提供了制备Hib多糖-蛋白质缀合物的优化的低分子量多糖，其中多糖片段被片段化为分子量在12±6kD的范围内，更优选地具有约10kd的平均分子量。
本发明还公开了用于将Hib荚膜多糖(即PRP(聚核糖基-核糖醇-磷酸))化学分解为12±6kD的尺寸的具有较低多分散性且具有可再现性结果的方法。
本发明还公开了用于将天然荚膜多糖(例如但不限于MenA和MenC)化学分解为100±40kD的尺寸的方法，其示出了可再现结果的低多分散性。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了多糖的化学降解，其中将所述多糖样品与偏高碘酸钠(sodium-metaperiodate)放在一起保持预定的时间并在凝胶过滤柱上直接脱盐。
纯化所述的多糖样品并对纯化的多糖进行分析测定用以评估物理化学性质，包括PS含量、唾液酸含量、磷含量、蛋白质杂质、核酸杂质、内毒素、同一性以及水分含量。分析纯化的多糖的总含量并通过产生醛基进行衍生化。
本发明还提供了多糖-蛋白质缀合物，其中可在较小的多糖片段上进行选择性的末端基团活化。对于Hib多糖和脑膜炎球菌血清组，典型的多糖被氧化剂(例如偏高碘酸盐/酯(metaperiodate))分别片段化为约10kD和100kD的较小质量，并使用还原胺化化学将其与衍生化的载体蛋白质缀合。
载体蛋白质是破伤风类毒素、CRM197或其他合适的载体蛋白质，其被激活并分析蛋白质含量和活化度(degreeofactivation)。在催化试剂的存在下，使用一水合肼作为接头将肼基团与载体蛋白质连接。所述催化试剂的非限制性实例是EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)。
缀合步骤包括衍生化的多糖与衍生化的载体蛋白质(例如破伤风类毒素)的缀合。进一步纯化多糖-蛋白质缀合物并分析蛋白质含量与多糖含量之比、游离多糖、尺寸分布和效力。
本发明还进行了对多糖-蛋白质缀合物的物理化学分析的分析。在实验的每个阶段，即，对于初始多糖样品、活化的糖、载体蛋白质、批量缀合物(bulkconjugate)和最终的疫苗进行该分析。
对于Hib，用所产生的缀合物对大鼠进行免疫，对于MenA/MenC对小鼠进行免疫，并且对血清抗体进行滴定以评估免疫潜力。对于Hib和MenA/MenC，通过间接的IgG-ELISA确定抗体效价(titer)，并且MenA和MenC缀合物的血清杀菌测定等于或高于用参考疫苗获得的那些。因此该方法成本效益好且耗时较少。
本发明最重要的成果是使用优化分子量的各多糖在远远更短的时间和更好的缀合产率下使所产生的缀合物获得更好的免疫原性。
附图简述
图1描绘了还原胺化方法的示意图。
图2描绘了使用如通过RI检测器所监测到的在TSK4000-5000PWXL柱上获得的解聚且活化的HibPRP的高效液相色谱系统(SEC-HPLC)图谱的尺寸排阻色谱。
图3a和3b描绘了如通过RI检测器所监测到的在TSK4000-5000PWXL柱上活化的MenA和MenC多糖的SEC-HPLC洗脱图谱。
图4描绘了通过UV检测器所监测到的在TSK4000-5000PWXL柱上HibPRP-TT缀合物在SEC-HPLC图谱中的位移。
图5描绘了PRP-TT缀合物的SDS-PAGE分析。样品泳道含有以下：泳道1-蛋白质分子量标准，泳道2-低分子量的PRP-TT缀合物，泳道3-高分子量的PRP-TT缀合物，以及泳道4-天然TT。
图6描绘了通过UV检测器监测到的TSK4000-5000PWXL柱上MenA-TT缀合物和MenC-TT缀合物的SEC-HPLC图谱的位移，与游离的破伤风类毒素进行了比较。
图7描绘了在抑制ELISA中，MenC-TT缀合物的抗体抑制百分比的图示。
图8描绘了在第0、28和42天3次给药后，通过ELISA测定大鼠中的Hib缀合物免疫原性来确定血清IgG效价。在第0、28、42、49和70天以不同的剂量水平以及用不同尺寸的HibPS来评估抗体效价。
图9描绘了通过ELISA测定小鼠中的脑膜炎球菌血清组A缀合物免疫原性来确定血清抗MenAIgG效价。
图10描绘了通过ELISA测定小鼠中的脑膜炎球菌血清组C缀合物免疫原性来确定血清抗MenCIgG效价。
图11描绘了通过血清杀菌测定小鼠中的脑膜炎球菌血清组C缀合物的免疫原性来确定抗MenC血清功能性抗体效价。
具有举例说明和实施例的发明详述
大多数蛋白含有来自C末端官能团和天冬氨酸以及谷氨酸侧链的大量羧酸基团。这些基团易于被亲核化合物修饰以产生稳定的酰亚胺产物。而亲核官能团易于与醛基反应，但其不会自发地与羧酸盐/酯或羧酸基团反应。首先必须用其他化合物活化羧酸基团以使其对亲核试剂发生反应。在本发明中，在水溶液中用水溶性交联剂处理所述蛋白质以使羧基与胺缀合。所述交联剂的一个非限制性实例是碳二亚胺EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)。交联剂与可用的羧酸盐/酯基团反应形成高度反应性的中间体酯。该活性酯物质进一步与亲核试剂(例如酰肼)反应以产生具有延伸的末端酰肼基键的稳定酰亚胺产物(图1)。
进行了若干实验以得到用酰肼分子充分标记的TT，即为了实现衍生化的载体蛋白质(例如破伤风类毒素)的期望活化度。在这种情况下，在活化反应期间施加多种浓度的交联剂。此外，观察到高度酰肼活化的TT(TT-H)倾向于在反应混合物中沉淀，这导致活化的TT的产率较低。为了解决这种情况，在孵育期间观察反应混合物，如果观察到沉淀则淬灭反应。这是由于TT等电点的改变，其通常在6.2至6.5之间。等电点提高到碱性侧的原因是TT分子上酰肼的装载，这最终导致蛋白质在较低pH下沉淀。
在SEC-HPLC上检查活化的TT以确保除去未反应的肼和得知经修饰TT的图谱。用该方法实现了超过40的活化度(每个TT分子的酰肼数)，这对于在TT分子上充分装载活化的多糖是足够的。
碳水化合物和含有多糖的其他生物分子(例如糖蛋白)可以在其糖残基上进行特定地修饰以产生反应性甲酰基官能团。甲酰基官能团是相对无反应性的并被氧化以转化为胺反应性醛。高碘酸盐/酯(periodate)氧化是将糖残基的羟基转化成胺反应性醛的优选途径。高碘酸盐/酯切割具有邻近羟基的碳-碳键，氧化-OH基团以形成高度反应性的醛。末端顺式-乙二醇导致损失一个碳原子成为甲醛并在前者的2号碳原子上产生醛基(图1)。通过高碘酸盐/酯进行高碘酸盐/酯氧化。高碘酸盐/酯的一个非限制性实例是偏高碘酸钠。在氧化反应期间不同浓度的高碘酸盐/酯对于所修饰的糖残基产生一些特异性。使用更高浓度的高碘酸盐/酯进行多糖的氧化导致切割相邻的含羟基的碳-碳键，从而导致糖开环以及产生小尺寸的多糖片段。
在解聚/活化反应期间改变反应参数以获得期望尺寸的多糖片段和期望的活化度。改变的反应参数包括高碘酸盐/酯浓度、将高碘酸盐/酯暴露于多糖的不同时间段。高碘酸盐/酯的浓度影响如实施例3中对于Hib和实施例4对于MenA和MenC所示的反应混合物中多糖与高碘酸盐/酯的摩尔比。
对来自革兰氏阴性菌的组(包括但不限于：流感嗜血杆菌b(Hib)、脑膜炎奈瑟菌血清组A和C(MenA和MenC))的多糖进行切割以获得低分子量的多糖片段。对于MenA和MenC，获得了在100±40kD范围内的较低分子量多糖片段，平均分子量为100kD，而在Hib的情况下，多糖片段被切割为分子量在12±6kD的范围内，平均分子量为10kD。
在缀合步骤期间，包含醛的多糖片段与肼标记的蛋白质反应以形成席夫碱(Schiffbase)。席夫碱是在水溶液中易于通过水解逆转的相对不稳定的键。在碱性pH值时提高了席夫碱的形成，但是除非被还原成仲胺键或叔胺键，否则他们仍然不是完全稳定的。可使用许多还原剂将席夫碱转化成烷基胺键。一旦被还原，该键是高度稳定的。通过使用对席夫碱结构具有特异性的还原剂最有助于进行还原胺化，并且这将不会影响原来的醛基。这样的还原剂的非限制性实例包括具有强还原力的硼氢化钠或氰基硼氢化钠，其将未反应的醛快速地转换成非反应性的羟基，有效地去除它们以免进一步参与缀合过程(图1)。通过SEC-HPLC分析监测缀合过程在活化的TT或多糖的保留时间内与缀合物相比的变化。
表征了纯化的PS-TT缀合物的多糖含量、蛋白质含量和非缀合的游离多糖。进行了用于测试这样获得多糖-TT缀合物的抗原性和免疫原性的研究。
实施例1：对于Hib-TT缀合物，用肼衍生化载体蛋白质(TT)
使用50kDMWCOamicon过滤器将100mg的批量TT用含有0.2MNaCl，pH6.5的0.1MMES缓冲液进行渗滤。将2.0ml的0.4M浓度的肼溶液(来自milliQ水(MQW)中5M肼的储备液)与13.6ml的MES缓冲液混合。使用5N的HCl将溶液的pH调节至～6.5。向其中添加0.48ml的EDC溶液以使EDC的最终浓度达到30mM(来自MQW中1.5M的储备液)。向该溶液中添加2.0ml经渗滤的TT，并将反应混合物的最终体积调节至24.08ml。将反应混合物在室温下搅拌4.0小时。孵育后，通过5NNaOH将溶液的pH值提高至～9.0来淬灭反应。使用50kDMWCOamicon过滤器将溶液用30mMNaCl、3mMNa2CO3，pH～10.5进行渗滤。至少进行6次缓冲液洗涤以确保完全除去未反应的肼。将经渗滤的活化TT溶液浓缩至1.5ml。在SEC-HPLC上分析活化的TT以确保除去未反应的肼。通过TNBS测定来分析活化TT的肼标记。通过Lowry测定来确定活化的TT的蛋白质含量。用肼标记的TT表示为通过用酰肼的摩尔数除以存在的蛋白质的摩尔数计算的活化度(表1)。
实施例2：对于Men类-TT(MenA-TT和MenC-TT)缀合物，用肼衍生化载体蛋白质(TT)
以实施例1中用于Hib-TT缀合物制备物相同的方式活化破伤风类毒素。在SEC-HPLC上检查活化的TT以确保除去未反应的肼并且得知经修饰的TT的图谱。用该方法实现了50±5的活化度(每个TT分子的酰肼数目)(表1)，这对于在TT分子上充分加载活化的多糖是足够的。将肼活化的TT(TT-H)存储在-20℃，pH～10.5，直至进一步使用。
表1.不同批次的TT的衍生化以产生活性酰肼基团
实施例3：通过氧化使HibPRP解聚并活化
将100mg的HibPRP溶解于1000μl的MQW中。就2000μl体积的反应混合物而言，计算PRP单体的摩尔数为～136mM，并且以368.2道尔顿作为PRP单体的分子量。制备在MQW中的200mM的高碘酸钠(sodiumperiodate)储备液。将1摩尔的PRP与0.5摩尔的高碘酸钠反应。然后将反应混合物置于黑暗下在2℃至8℃下孵育7至15分钟。孵育后，用sephadexG-25柱纯化反应混合物。在这之前，先用1/5×的0.15MMES、0.2MNaCl，pH6.5平衡柱。向其中添加2.5ml样品用于脱盐并用1/5×的0.15MNaCl、0.2MNaCl、pH6.5进行洗脱。或者可在PD10柱上直接纯化PS。使用旋转仪(rotavac)将活化多糖的洗脱馏分浓缩至500μl。通过SEC-HPLC分析活化多糖的浓缩溶液的尺寸(图2)，通过苔黑酚测定(orcinolassay)分析PRP含量，以及通过BCA测定分析醛摩尔数。将多糖的活化表示为通过用多糖中存在的单体的摩尔数除以偏高碘酸钠氧化后生成的醛的摩尔数来计算的活化度(表2)。天然的和活化的HibPRP的SEC-HPLC图谱表明，在活化后，多糖片段(≈10KD)的分子量低于天然PRP，表明了PRP的降解。图2中峰向右的位移表明了天然多糖的解聚。
使用串联的GPC柱通过HPLC-SEC分析将较高kD的天然多糖的尺寸与较低kD的活化多糖或多糖片段区分开来(图2)。产生了6至18kD分子大小的活化多糖片段，平均活化度约每个醛基4至6个糖重复单元。将活化的多糖储存在-20℃。
表2：HibPRP活化
实施例4：通过氧化将MenA和MenC多糖解聚并活化
对于MenA，将天然多糖在0.2摩尔过量的偏高碘酸钠(NaIO4)中在25℃下反应4小时。对于MenC，将天然的多糖在0.2摩尔过量的NaIO4中在25℃下反应约15分钟。根据多糖的初始尺寸，可改变样品与样品间的时间或摩尔比。通过来自GEAmersham的PD10柱或者在用含有0.2MNaCl，pH6.5的0.15MMES缓冲液平衡的SephadexG-25柱上将过量的盐直接进行脱盐。因为在该过程中样品变得稀释，在旋转蒸发仪上样品被浓缩至约期望的约10mg/ml的最终浓度。对于MenAPS通过磷测定法，对于MenCPS通过间苯二酚-盐酸法确定所得活化多糖的浓度。使用葡萄糖作为参考通过BCA测定来确定所得的多糖的醛含量。将多糖的衍生化表示为活化度，即，每个醛基的糖重复数目，活化度是通过用多糖中存在的单体的摩尔数除以偏高碘酸钠氧化之后产生的醛的摩尔数进行计算的。在用蒸发技术除去水后将活化的多糖以干粉储存，所述蒸发技术选自但不限于旋转蒸发器或冻干。相对于冻干优选旋转蒸发器，原因是其是浓缩和干燥产物而没有任何产物分解的快速方法。
发现MenA多糖的平均活化度(degreeofactivation，DOA)为约70至90个糖重复单元/醛基(表3，图3a)；而发现活化的MenC多糖的平均单位活化度为30至40(表4，图3b)。图3a和图3b分别显示了当样品在TSK凝胶G5000PWXL+G4000PWXL柱系列上于0.1M的NaNO3中在pH7.2下以1.0ml/分钟的流量洗脱时，活化的MenA和MenC多糖的HPLC-SEC的洗脱图谱。高碘酸盐/酯氧化的MenA与MenC多糖的SEC-HPLC洗脱图谱示出了峰向右位移，表明天然多糖的解聚。
表3：MenA多糖的衍生化以产生醛官能团
表4：MenCPS的衍生化以产生醛官能团
实施例5：活化的HibPRP和衍生化的TT的缀合反应。
将活化的含酰肼TT在含有0.2MNaCl，pH6.5的0.15MMES缓冲液中进行渗滤。将活化的含醛HibPRP溶解在含有0.2MNaCl，pH6.5的0.15MMES缓冲液中。对于多糖的缀合，以1∶0.5w/w至1∶0.75w/w的比例混合活化的PRP和活化的TT。向反应混合物中添加相对于TT量之1至1.5当量的氰基硼氢化钠。将反应混合物在22±2℃下孵育3至14小时，并用硼氢化钠处理1至2小时。以活化PS中初始醛含量的至少10倍摩尔当量的比例接纳硼氢化钠。通过50kDMWCOAmicon过滤器用含有0.2MNaCl，pH6.5的0.15MMES缓冲液(50-60倍体积)进行渗滤，纯化≈10kD分子量的PS-TT缀合物。
改变与缀合物相比活化TT或PS的保留时间，通过SEC-HPLC分析监测缀合的过程。缀合物的HPLC-SEC图谱描绘了缀合反应在3小时内达到最大化。因此，可在14至22小时内实现从活化步骤至最终纯化的缀合物的总缀合时间。天然的和活化的TT与PRP-TT缀合物的SEC-HPLC图谱(图4)表明在活化后，活化TT的尺寸与天然TT保持相同，表明很少或没有聚集发生。另一方面，高碘酸盐/酯活化的90至100kD的Hib多糖和≈10kD的多糖片段的分子量低于天然的PS，表明多糖的降解。缀合后，出现高分子量峰，表明形成了HibPRP-TT缀合物(图4)。
PRP-TT缀合物的SDS-PAGE分析还表明活化的TT成功地与活化的高分子量和低分子量的PRP偶联。使用Laemmli的不连续凝胶/缓冲系统进行缀合物的SDS-PAGE。浓缩层(stackinglayer)含有4％的聚丙烯酰胺并且分离层含有6％的聚丙烯酰胺。在装载5μg的每种蛋白质样品的Tris-甘氨酸-SDS运行缓冲液中，使用具有200V电压的电泳室进行电泳运行。电泳运行后，用考马斯亮蓝染料对凝胶进行染色(图5)。
实施例6：活化的MenA或MenC与衍生化TT的缀合反应
活化的含酰肼的TT用含有0.2MNaCl，pH6.5的0.15MMES缓冲液进行渗滤。对于MenA和MenC两者，将活化的PS溶解于含有0.2MNaCl，pH6.5的0.15MMES缓冲液中。对于MenAPS的缀合，以1∶1.5的摩尔比混合活化的MenA多糖和衍生化的TT，而对于MenCPS的缀合，以1∶2的摩尔比混合活化的MenC多糖和衍生化的TT。向反应混合物中添加相对于所述TT量之1.5w/w当量的氰基硼氢化钠。将反应混合物在25℃下孵育3小时至过夜，在这之后，通过添加相对于醛摩尔数10倍摩尔过量的硼氢化钠将反应淬灭，并将所述反应在25℃下孵育1至2小时。缀合物的HPLC-SEC谱描绘了缀合反应在三个小时内达到最大化。可在14至22小时内实现从活化步骤至最终纯化的缀合物的总缀合时间。通过40％至60％的硫酸铵沉淀纯化MenAPS-TT和MenCPS-TT缀合物以除去未缀合的PS，并进一步渗滤并储存在0.15MMES、0.2MNaCl，pH6.5中。通过SEC-HPLC将MenA-TT和MenC-TT缀合物图谱与TT进行比较。优化活化的PRP与活化的TT的混合比以获得向载体蛋白质上装载期望的PRP。在反应的过程中，在SEC-HPLC上检查缀合物。观察到，与天然的TT相比，缀合物示出了峰的位移，这表明在TT分子上多糖的装载。(图6)。
实施例7：HibPRP-TT缀合物的表征：
通过Lowry测定分析纯化的缀合物的蛋白质含量以及通过苔黑酚测定分析PRP含量。使用脱氧胆酸钠沉淀来评估缀合物中游离的多糖。在MQW中制备1％w/v的脱氧胆酸钠溶液。用1NHCl将溶液的pH调节至～6.8。向900μl的缀合物样品中添加80μl的1％w/v的脱氧胆酸钠溶液。将反应混合物在2℃至8℃下保持30分钟。向其中添加50μl的1NHCl，并将样品在6000×g下离心15分钟。收集上清液并通过苔黑酚测定评估游离多糖含量。
本发明的方法产生可再现的结果和最佳产率。纯化后，分析这些缀合物总的PRP含量和游离的PRP含量以及蛋白质含量。获得的PRP与蛋白质之比在0.26至0.36的范围内。还发现游离的多糖的百分比低于10％(表5)。
表5：PRP与蛋白质之比和各批次PRP-TT缀合物的缀合产率％
实施例8：MenA/MenC-TT缀合物的表征
表征了纯化的MenAPS-TT和MenC-TT缀合物的多糖含量、蛋白质含量和非缀合的游离多糖。通过脱氧胆酸钠沉淀法测定纯化的缀合物中的非缀合的多糖。向900μl的缀合物样品中添加80μlpH6.8的1％w/v的脱氧胆酸钠溶液，并将反应混合物在2℃至8℃下保持30分钟。向反应混合物中添加50μl的1NHCl，然后在6000g下离心15分钟。收集上清液并通过磷测定分析MenA-TT缀合物的总的多糖含量，并通过间苯二酚-盐酸法分析MenC-TT缀合物的总的多糖含量。通过脱氧胆酸盐沉淀检测到的游离多糖的量除以缀合物中定量的多糖的总量来计算未缀合的多糖的百分比。通过Lowry测定来确定缀合物的蛋白质含量并在数学上计算糖与蛋白质之比。
表6总结了纯化的缀合物的表征数据。这些缀合物的PS与蛋白质之比从0.34至0.51(wt/wt)变化，且最高的游离PS保持接近10％(wt/wt)。表6.多糖与蛋白质之比以及多个批次MenA-TT和MenC-TT缀合物的缀合产率％
通过缀合接纳的总的活化多糖与纯化的缀合物中多糖的最终含量来计算缀合产率。在这两种类型的缀合物(即MenA和MenC缀合物)中实现了非常高的产率。对于MenA实现了高于25％或以上范围的缀合产率，且对于MenC实现了30％或以上范围的缀合产率。
实施例9：HibPRP-TT缀合物的免疫原性
用所有的测试样本以不同剂量水平来免疫接种动物组以诱导与阴性对照相比显著的免疫应答。在第28天和第42天2次加强免疫后，在49天可见最高的IgG应答。
将制备的HibPRP-TT缀合物以不同的剂量水平(1μg和0.5μg)以及市售的经批准的Hib缀合物疫苗以1μg剂量水平对Spraguedawley大鼠(5-8周龄)进行免疫接种。根据动物的体重将其随机分组，每组各10只动物。在实验的第0、28和42天，每只动物通过单次注射皮下施用200μl的各Hib-PRP缀合物。从每只动物的眶后血管丛抽取约300μl至800μL的血液，之后在第0天(预出血)、28、42天施用测试剂量以及在最后收集的当天(第49天)抽取最大可能的血液量。收集血清并储存在-20℃或以下直到通过ELISA分析样品。在最终的采血后将所有的动物处死。
从用经批准的Hib缀合物疫苗免疫和内部的缀合物免疫接种的大鼠中获得了通过汇集血清而制备的质量控制的血清。质量控制血清表示为包含5000EU/ml的任意的抗HibIgG浓度，其被用来产生标准的ELISA曲线以推断受试动物血清中的IgG值(EU/ml)。使用Combistat软件计算针对标准值的每只动物的IgG效价值。然后为每种制剂计算几何平均IgG效价(表7)。在研究中的一项中，直到第70天且以不同剂量水平和不同尺寸的HibPS来评估IgG效价(图8)。
表7：在第49天IgG效价的几何平均值(+，-95％置信区间)
通过ELISA进行的免疫原性研究表明，与载剂对照相比，所测试的所述HibPRP-TT缀合物显示出抗体效价的显著的成倍提高。另外，与更高分子量的参考疫苗相比，PS-TT缀合物产生同等或更高的抗体效价。另外，与经批准的疫苗相比，在0.5μg的较低剂量水平下，四个研究中三个具有同等的或更好的应答(表7)。因此，本发明的较低kD的Hib缀合疫苗比经批准的比较物具有同等至更强的免疫原性。
实施例10：MenC-TT缀合物的抗原性
通过用针对来自参考源的每种类型的血清中和MenC抗原的体外分析证实了MenC多糖-TT缀合物的抗原性。将仅含有参考抗血清且无抗原的对照与受试样品进行了比较。通过ELISA将通过每种抗原抑制血清的程度与没有抗原的对照进行了比较。
用在含有0.1％v/v的Brij35和5％FBS的磷酸缓冲盐水中稀释的10μg/mL的不同的抗原(未缀合的MenC多糖和MenC多糖-TT缀合物)将抗脑膜炎奈瑟菌血清组C的8000倍稀释的兔抗血清(BactonDickinson；222281)在37℃下在96孔微量滴定板(板A)中孵育1小时。单独的板(板B)包被有MenC多糖和甲基化人血清白蛋白(m-HSA)的混合物，在2℃至8℃下过夜培养后，随后用5％FBS封闭。向该板B中添加来自板A的连续稀释的抗血清-抗原混合物，并在37℃下孵育1小时。用含有0.1％的Brij35的磷酸缓冲盐水(pH7.4)洗涤平板。然后将该板在25℃下在PBS、0.1％Brij35和5％FBS中用过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体孵育60分钟。将该板再次洗涤，并在25℃下用在乙酸钠缓冲液中的100μl过氧化物酶底物，即3，3’，5，5’-四甲基联苯胺-H2O2孵育10分钟。通过添加50μl的2MH2SO4终止该反应。在Tecan微板读数器上记录A450。MenCPS-TT缀合物显著地中和的抗PS抗体(图7)。与缀合的PS相比，未缀合的游离MenCPS显示更低的抑制。
对于Hib和MenA多糖-TT缀合物的血清抑制ELISA，使用类似的方法以及抗乙型流感嗜血杆菌b型和脑膜炎奈瑟菌血清组A的兔抗血清(BD；222301)和未缀合的PS和PS-TT缀合物作为抗原。
实施例11：MenA和MenC缀合物的免疫原性
在第0、14和28天用在生理盐水中配制的1μg的MenA和MenC缀合的PS抗原单独和组合地对5至9周的6只雌性BALB/c小鼠的组进行免疫接种(表9)。通过皮下途径施用200μl疫苗稀释液进行所有的免疫接种。单独的生理盐水用于阴性对照组，经批准的疫苗用于阳性对照组。在第14、28和35天收集血清。通过ELISA评估特异性的抗PS的IgG抗体效价。
通过向每孔添加在pH7.4的PBS缓冲液中的100μl的5μg/mlPS和m-HSA用MenAPS(用于测试MenA缀合物)和MenCPS(用于测试MenC缀合物)包被96孔板(NuncMaxisorp)。将板在4℃下孵育过夜，然后用PBS缓冲液(在PBS中0.1％Brij35，pH7.4)洗涤三次，并用200μl在FBS缓冲液中(在PBS中0.1％Brij35，pH7.4)5％的FBS溶液在37℃下将每孔封闭1小时。每次孵育步骤之后进行三次PBS缓冲液洗涤。在PBS缓冲液(在PBS中0.1％Brij35，5％FBS，pH7.4)中稀释参考血清和受试血清样品，转移到经包被封闭的板中(200μl)，并连续稀释两倍，接着在4℃下过夜孵育。然后每孔添加100μl的1∶1000稀释的过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG，并在25℃下静置1小时。向每孔添加100μl的底物，即3，3’，5，5’-四甲基联苯胺-H2O2用于彩色显影。在25℃下显影10分钟后，通过添加50μl的2MH2SO4终止反应，在Tecan微板读数器上在450nm处测量光密度。
在两次加强免疫后，在第35天实现针对MenA缀合物的最大IgG效价。观察到对于MenA，与阴性对照相比，经批准的MenACYW-DT缀合物疫苗中效价值的提高为约120倍，对于MenA-TT缀合物为330倍并且对于组合的MenA-TT缀合物为220倍。(表8)
表8：在第0、14和28天给药的小鼠模型中，对于MenA制剂，通过ELISA的IgG效价的几何平均值(+，-95％置信区间)(图9)。
在两次加强免疫后，在第35天实现针对MenC缀合物的最大IgG效价。观察到对于MenC，与载剂对照相比，经批准的疫苗中效价值的提高为约10倍，对于MenC-TT缀合物为322倍并且对于组合的MenC-TT缀合物为250倍(表9)。
表9：在第0、14和28天给药的小鼠模型中，对于MenC制剂，通过ELISA的IgG效价的几何平均值(+，-95％置信区间)(图10)
发现对于MenA和MenC缀合物两者而言，如通过ELISA测定的，在第14天和28天的IgG效价值的整体趋势与第35天应答的趋势相似。实施例12：MenC缀合物的血清杀菌测定(SBA)
将来自属于一组小鼠的等体积的各血清样品汇集在一起以制备用于通过血清杀菌测定进行测试的一组血清库。如下进行测定：
将脑膜炎奈瑟菌血清组C的靶菌株进行划线(streak)以得到单菌落分离物，并在37℃下在绵羊血琼脂平板上用5％的CO2孵育过夜(16至24小时)。通过在另一个绵羊血琼脂板的整个表面上铺展细胞(～50CFU)将菌株传代培养，然后在37℃下用5％的CO2孵育4小时。将细菌重悬于～5mL的杀菌缓冲液中。取出1mL混悬液，并在650nm波长处测量吸光度。将混悬液OD650调节至0.1，并以1∶2500的稀释度进行稀释。将血清连续稀释2倍并在对照孔中添加测定缓冲液。
向每个孔中添加10μl的细菌工作溶液。向所有的失活补体对照孔中添加10μl热灭活的(在56℃保持30分钟)补体并向含有血清的孔和活化补体对照孔中添加10μl的所述灭活的补体。摇动平板并将平板在37℃，无CO2下孵育1小时。
孵育后，在倾斜的血琼脂板上将来自每孔的10μl进行点样。将所有的琼脂板在37℃下用5％CO2孵育过夜。在板的各点样处对菌落数进行计数。认为与补体对照相比显示≥50％细菌杀伤的最高血清稀释度是血清样品的SBA效价。
SBA数据显示了在2周间隔的3次给药后来自载剂免疫接种的阴性应答，而经批准的缀合物疫苗表现出功能性抗体效价的提高(图11)。与表明疫苗在小鼠模型中体内有效的经批准疫苗对照相比，所测试的疫苗制剂显示出显著高的SBA效价。
用于MenA的SBA测试的类似类型的方案通过将脑膜炎奈瑟球菌血清组A进行划线来进行。

Claims (19)

1.免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物，其包含载体蛋白质、多糖片段，其中
-所述载体蛋白质获自革兰氏阳性菌，优选但不限于破伤风类毒素(TT)和CRM197，
-所述多糖片段获自革兰氏阴性菌的组，所述革兰氏阴性菌包括但不限于：流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)血清型b(Hib)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)血清组A和C(MenA和MenC)。
2.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中所述多糖是Hib、MenA或MenC荚膜多糖。
3.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中游离多糖的百分比低于10％，并且活化多糖与活化TT之比为：
-对于HibPRP-TT缀合物，在0.2至0.5(wt/wt)的范围内，更优选0.25至0.35(wt/wt)，
-对于MenA-TT缀合物和MenC-TT缀合物，在0.2至0.8(wt/wt)的范围内，更优选0.3至0.7(wt/wt)。
4.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中所述多糖-蛋白质缀合物在0.5μg至1μg的剂量下显示出显著高的抗体效价。
5.制备如权利要求1所述多糖-蛋白质缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在交联剂的存在下，通过使至少一种载体蛋白质与至少一种亲核试剂反应来使所述载体蛋白质衍生化，其中所述载体蛋白质获自革兰氏阳性菌，优选地选自破伤风类毒素和CRM197；
(b)通过使至少一种高分子量多糖与至少一种氧化剂反应来切割所述多糖并使其解聚以产生经切割且活化的较小尺寸的多糖片段，其中所述高分子量多糖获自革兰氏阴性菌的组，所述革兰氏阴性菌包括但不限于流感嗜血杆菌b型(HibPRP)、脑膜炎奈瑟菌血清组A(MenA)和脑膜炎奈瑟菌血清组C(MenC)；
(c)采用还原胺化化学使步骤(a)的所述衍生化的载体蛋白质与步骤(b)的所述活化的多糖片段进行缀合反应以得到多糖-蛋白质缀合物；
其中，
-所述缀合反应从多糖的活化阶段直到所述缀合物的最终纯化花费14至22小时的短缀合时间，
-所述方法产生更高产率的多糖-蛋白质缀合物，
-所述多糖-蛋白质缀合物显示出显著高的抗体效价，所述抗体包括功能性抗体。
6.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中所述交联剂是促进羧基与胺交联的化学交联试剂，在EDC存在下，所述交联剂优选为一水合肼。
7.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中所述亲核试剂选自还原剂的组，优选为肼。
8.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中所述衍生化的破伤风类毒素的活化度为50±5。
9.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中所述氧化剂选自高碘酸盐/酯的组，优选为高碘酸钠或偏高碘酸钠。
10.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中
-所述经切割且活化的HibPRP片段的分子量在12±6kD的范围内，平均活化度为每3至15个糖重复单元有一个醛基，
-所述经切割且活化的MenA多糖的分子量为100±40kD，平均活化度为每40至120个糖重复单元有一个醛基，以及
-所述经切割且活化的MenC多糖的分子量为100±40kD，平均活化度为每20至80糖重复单元有一个醛基。
11.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中在至少一种还原剂的存在下，所述衍生化的载体蛋白质与所述活化的多糖片段缀合以获得高度稳定的低分子量PS-TT缀合物。
12.如权利要求11所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中所述还原剂选自对席夫碱结构具有特异性的组，例如硼氢化钠或氰基硼氢化钠。
13.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中在纯化的缀合物中活化的多糖与衍生化的TT之比在以下范围内：
-对于HibPRP-TT缀合物，为0.2至0.5(wt/wt)，且优选0.25至0.35(wt/wt)，
-对于MenA-TT缀合物和MenC-TT缀合物，为0.2至0.8(wt/wt)，且优选0.3至0.7(wt/wt)。
14.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中使用还原胺化化学的所述缀合百分比产率为：
-对于HibPRP-TT缀合物为16％至25％，
-对于MenC-TT缀合物为30％至50％，以及
-对于MenA-TT缀合物为20％至30％。
15.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中在大鼠模型中HibPRP-TT缀合物的剂量在0.5μg至1μg的范围内。
16.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中在小鼠模型中MenAPS-TT缀合物和MenCPS-TT缀合物的剂量在0.5μg至1μg的范围内。
17.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中与载剂对照抗体效价相比，对于1μg剂量，HibPRP多糖-蛋白质缀合物的抗体效价高至60倍，并且对于0.5μg剂量高至50倍。
18.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中与载剂对照相比，IgG效价值的提高为：
-对于MenA-TT缀合物为330倍，以及
-对于组合的MenA-TT+MenC-TT缀合物为220倍；
-对于MenC-TT缀合物为322倍，以及
-对于组合的MenA-TT+MenC-TT缀合物为250倍。
19.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中：与载剂对照或经批准的比较疫苗相比，受试MenC-TT或MenC-TT+MenA-TT缀合物疫苗的MenC血清杀菌测定(SBA)效价显著地高。
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