CZ283530B6 - Modifikované polysacharidy, antigenní konjugát obsahující modifikovaný polysachararid a způsob jeho přípravy a gamaglobulinová frakce - Google Patents

Modifikované polysacharidy, antigenní konjugát obsahující modifikovaný polysachararid a způsob jeho přípravy a gamaglobulinová frakce Download PDF

Info

Publication number
CZ283530B6
CZ283530B6 CS906284A CS628490A CZ283530B6 CZ 283530 B6 CZ283530 B6 CZ 283530B6 CS 906284 A CS906284 A CS 906284A CS 628490 A CS628490 A CS 628490A CZ 283530 B6 CZ283530 B6 CZ 283530B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polysaccharide
group
groups
gbmp
modified
Prior art date
Application number
CS906284A
Other languages
English (en)
Inventor
Harold J. Jennings
Francis Michon
Original Assignee
National Research Council Of Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Research Council Of Canada filed Critical National Research Council Of Canada
Publication of CZ628490A3 publication Critical patent/CZ628490A3/cs
Publication of CZ283530B6 publication Critical patent/CZ283530B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K16/1232—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

Modifikovaný polysacharid skupiny B Neisseria meningitidis nebo modifikovaný kapsulární polysacharid Esterichia coli K1, který má N-acetylové skupiny kyseliny sialové přírodního polysacharidu nahrazeny acylovou skupinou se čtyřmi až osmi atomy uhlíku a jeho průměrná molekulová hmotnost je v rozmezí 10 000 až 50 000. Antigenní konjugát, který obsahuje modifikovaný polysacharid skupiny B Neisseria meningitidis, který má N-acetylové skupiny zbytku kyseliny sialové nahrazeny acylovou skupinou se čtyřmi až osmi atomy uhlíku, která je konjugována s imunologicky vhodným proteinem. Způsob přípravy tohoto antigenního konjugátu, zahrnující a) N-deacetylaci polysacharidu skupiny B Neisseria meningitidis nebo Esterichia coli K1; b) N-acylaci N-deacetylovaného polysacharidu ze stupně (a) za vzniku N-acylovaného polysacharidu; c) konjugaci N-acylovaného polysacharidu s imunologicky vhodným proteinovým nosičem za vzniku konjugátu. Dále je definována vakcína, která obsahuje antigenní konjugát a farmacŕ

Description

Tento vynález se týká chemicky modifikovaných polysacharidů Neisseria meningitidis skupiny B a modifikovaných kapsulámích polysacharidů Escherichia coli Kl. Rovněž se týká antigenního konjugátu a způsobu jeho přípravy, vakcíny obsahujícího antigenní konjugát a gamaglobulinové frakce k pasivní ochraně proti meningitidě.
Dosavadní stav techniky
Meningitida způsobovaná N. meningitidis skupiny B a E. coli_Kl zůstává velkým celosvětovým zdravotním problémem. Meningitida skupiny B se vyskytuje tak v endemických tak epidemických situacích. Způsobuje přibližně polovinu ze všech zaznamenaných případů meningokokových meningitid. Naproti tomu Kl-positivní E. coli jsou hlavní příčinou meningitidy novorozeňat. Běžně neexistuje žádná vakcína, která by byla komerčně dostupná, proti onemocnění způsobovanému meningokoky skupiny B a E. coli Kl. Je to z velké části proto, že meningokokový polysacharid skupiny B (GBMP) je u lidí pouze slabě imunogenní. Nedávno byly popsány některé případné vakcíny, které jsou založeny na komplexech GBMP s proteiny vnějších membrán, ale doposud neexistuje jasný důkaz, že jsou účinné u člověka.
V nedávné době byl vyvinut nový koncept vakcíny, která spočívá na konjugátu syntheticky modifikovaného (N-propionylovaného) polysacharidů skupiny B s proteinem (N-Pr-GBMPprotein). Tato vakcína vyvolává u myší vysoké titry IgG protilátek, které jsou nejen ochranné, ale také zkříženě reaktivní s nemodifikovaným GBMP (tj. N-acetyl-GBMP). Tento koncept je popsán a nárokován v US patentu č. 4727136, z 23. února 1988 (Harold J. Jennings a spol.).
Bylo naznačeno, že vakcína, která vyvolává zkříženě reaktivní protilátky, jako je popsáno například v US patentu č. 4727136, by mohla být úspěšná pouze tehdy, kdyby došlo ke zničení imunitní tolerance. Tato myšlenka se ukázala oprávněnou identifikací obvyklého epitopu sestávajícího z řetězce zbytků kyseliny sialové (minimálně 10 zbytků) a-(2-8)- navázaných jak v přírodním N-Ac-GBMP tak lidské i zvířecí tkáni (Jennings: Contrib. Microbiol. Immunol. 10, 151 až 165, Basilej 1989, Karger). Tyto polysialové řetězce fungují jako vývojové antigeny. Většina souvisí s plodovým stavem při adhesi embryonálních neutrálních buněk (Fiume a spol. : Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 482 (1983).). Tento antigen se po narození ztrácí (Friedlander a spol. : J. Cell Biol. 101. 412 (1985), kjeho expresi však dochází u dospělých lidí v průběhu regenerace onemocnělých svalů (Cashman a spol. : Ann. Neuron. 21, 481, (1987), v nádorových buňkách (Roth a spol. : Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 299 (1988), v buňkách přirozených zabíječů (NK) a v buňkách CD3+T (Husmann a spol. : Eur. J. Immunol., 19, 1761 (1989). I když ještě nebyly zjištěny důsledky zničení tolerance vůči těmto plodovým antigenům, obvykle se připouští, že vzhledem ke zkřížené, reakci by konjugát N-Pr-GBMP-protein byl přísně prozkoumán licenčními agenturami. To by vedlo ke značným výdajům a zpožděním vzhledem ke složitým pokusům, které jsou nutné pro prokázání bezpečnosti vakcíny před jejich schválením ke komerčním účelům.
Předmětem tohoto vy nálezu je vyvinout vakcínu, která by měla zvýšené imunogenní vlastnosti ve srovnání s imunogenními vlastnostmi komplexu N-Pr-GBMP-protein. Předmětem tohoto vynálezu je také získáni vakcíny, která vykazuje podstatně sníženou zkříženou reaktivitu s GBMP.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je modifikovaný polysacharid skupiny B Neisseria meningitidis, který má N-acetylové skupiny kyseliny sialové přírodního polysacharidu nahrazeny acylovou skupinou se čtyřmi až osmi atomy uhlíku a jeho průměrná molekulová hmotnost je v rozmezí 10 000 až 50 000.
Jiným předmětem tohoto vynálezu je modifikovaný kapsulámí polysacharid Escherichia coli Kl, který má N-acetylové skupiny zbytku kyseliny sialové přírodního polysacharidu nahrazeny acylovou skupinou se čtyřmi až osmi atomy uhlíku ajeho průměrná molekulová hmotnost je v rozmezí 10 000 až 50 000.
Acylová skupina se čtyřmi až osmi atomy uhlíku je s výhodou vybrána ze skupiny sestávající z butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové, hexanoylové, heptanoylové a oktanoylové skupiny, zejména je vybrána ze skupiny sestávající z butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové a hexanoylové skupiny. Nejvýhodněji je když acylovou skupinou je n-butanoylová skupina.
Rovněž je výhodné, když 27 až 100% N-acetylových skupin zbytku kyseliny sialové je nahrazeno C4 až Cg-acylovými skupinami.
Dalším výhodným provedením je když 90 až 100% N-acetylových skupin zbytku kyseliny sialové je nahrazeno C4 až Cg-acylovými skupinami.
Jiným předmětem vynálezu je antigenní konjugát, který obsahuje modifikovaný polysacharid skupiny B Neisseria meningitidis, který má N-acetylové skupiny zbytku kyseliny sialové nahrazeny acylovou skupinou se čtyřmi až osmi atomy uhlíku, která je konjugována s imunologicky vhodným proteinem.
Acylová skupina je přitom s výhodou vybrána ze skupiny sestávající z butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové, hexanoylové, heptanoylové a oktanoylové skupiny.
Protein je s výhodou vybrán ze skupiny sestávající ztoxoidu tetanu, toxoidu difterie, zkříženě reaktivního materiálu (CRM) a nosiče bakteriálního proteinu. CRM přitom znamená CRM^.
Rovněž je výhodné když protein je kovalentně navázán na polysacharid -CH2-NH-proteinovou vazbou.
Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy antigenního konjugátu obsahujícího modifikovaný polysacharid skupiny B Neisseria meningitidis nebo Escherichia coli Kl konjugovaný s imunologicky vhodným proteinem, kde N-acetylové skupiny zbytků kyseliny sialové polysacharidu jsou nahrazeny N-C4 až C8acylovými skupinami, kterého podstata spočívá v tom, že zahrnuje
a) N-deacetylaci polysacharidu skupiny B Neisseria meningitidis nebo Escherichia coli Kl;
b) N-acylaci N-deacetylovaného polysacharidu ze stupně (a) za vzniku N-acylovaného polysacharidu;
c) konjugaci N-acylovaného polysacharidu s imunologicky vhodným proteinovým nosičem za vzniku konjugátu.
,Acylová skupina je s výhodou vybrána ze skupiny zahrnující n-butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové, hexanoylové a oktanoylové skupiny, přičemž nejvýhodněji je když acylovou skupinou je butanoylová skupina.
-2CZ 283530 B6
Dalším předmětem vynálezu je vakcína, která obsahuje antigenní konjugát a farmaceuticky přijatelný injektovatelný nosič. Vakcína dále s výhodou obsahuje fýsiologicky přijatelný adjuvant.
Uvedený adjuvant je s výhodou vybrán ze skupiny sestávající z hydroxidu hlinitého, fosforečnanu hlinitého a síranu hlinitého.
Konečně posledním vynálezem je gamaglobulinová frakce, která je schopna pasivně chránit proti meningitidě způsobené Neisseria meningitidis skupiny B a Escherichia coli Kl, přičemž tato gamaglobulinová frakce je připravitelná imunizací savce vakcinou a následnou isolací gamaglobulinu z uvedeného savce.
Tato frakce se pak jednotlivci podává tak, že zajišťuje ochranu proti infekci způsobené shora uvedenými organismy, nebo že léčí nastupující infekci způsobenou shora uvedenými organismy. Bude výhodné, jestliže konjugáty imunogenní vakcíny podle tohoto vynálezu jsou zdrojem therapeutického antiséra ve světle jejich příznivé imunogenicity s minimální indukcí protilátek zkříženě reagujících sGBMP. Konjugáty podle vynálezu budou užitečné také pro získáváni monoklonálních protilátek a možná antidiotypových protilátek.
V našich nedávných pokusech jsme zjistili, že většina baktericidních a ochranných protilátek indukovaných konjugátem N-Pr-GBMP-protein shora popsaných (Jennings a spol.: USA patent č. 4 727 136) souvisí s protilátkami zkříženě reaktivními s GBMP. Ve skutečnosti většina ochranné aktivity je obsažena v populaci N-Pr-GBMP-specifických protilátek, která nereaguje zkříženě s GBMP. Předpokládá se tedy, že N-Pr-GBMP napodobuje jedinečný baktericidní epitop na povrchu meningokoků skupiny B.
Tento vynález je založen na objevu, že je možné synthetizovat chemicky modifikované GBMP, které napodobují baktericidní epitop a které ve své konjugované formě nejen vykazují zesílenou imunogenicitu, ale také se vyhýbají podstatné indukci protilátek, které zkříženě reagují s GBMP.
Podle tohoto vynálezu byly synthetizovány četné různě chemicky modifikované GBMP, jednotlivě zkonjugovány s proteinem, konjugáty byly injekčně podány myším a účinky byly srovnány s účinkem konjugátu proteinu s N-Pr-GBMP. Překvapivě bylo nalezeno, že konjugáty N-acyl(se čtyřmi až osmi atomy uhlíku)-GBMP s proteinem, např. butanoyl-, isobutanoyl-, pentanoyl-, isopentanoyl-, neopentanoyl-, hexanoyl-, heptanoyl- a oktanoyl-, zvláště pak Nbutanoyl (N-Bu)-GBMP s proteinem podstatně napodobují bakteriální epitop s podstatně sníženou indukcí zkříženě reaktivních protilátek.
Meningokokový polysacharid (skupiny B) se isoluje zN. meningitidis způsoby známými odborníkům. Podle jednoho z těchto způsobů se meningokoky skupiny B (kmen 9818) nechají růst při 37 °C ve fermentoru s 30 g dehydratovaného živného media Todd Hewitt (Difco Laboratories. Detroit. Michigan) v jednom litru destilované vody. Před růstem ve fermentoru se lyofilizovaný kmen nechal růst ve vysoké nádobce při 37 °C na deskách (objemové díly k objemovým dílům) s 5 % ovčím krevním agarem (Difco Laboratories. Detroit. Michigan). Bakterie se pak přenesou na 1,0 litru živného media Todd Hewit (jak shora uvedeno) v Erlenmayerově baňce, která se nechá třepat při 37 °C sedm hodin při 190 otáčkách za minutu. Toto inokulum se přenese do fermentoru. Po 16 hodinách růstu ve fermentoru se bakterie zabijí přidáním formalinu na konečnou koncentraci asi 0,75 %. Bakterie se pak odstraní kontinuálním odstřeďováním. Ze supematantu se isoluje meningokokový polysacharid skupiny B. Vyčistí se způsobem v podstatě podle Bundleho a spol. (J. Biol. Chem. 249, 4797 až 4801 (1974).) až na to, že se protein extrahuje mícháním roztoku surového polysacharidu s ochlazeným (na 4 °C) 90 % fenolem místo s horkým fenolem (50 až 60 °C). Tento postup zajišťuje, že se produkuje vysokomolekulámí forma GBMP.
-3 CZ 283530 B6
E. coli (018:Kl:H7) (NRCC 4283) se nechá růst při 37 °C ve fermentoru v destilované vodě, která obsahuje dehydratovanou infusi BHI (Brain-Heart Infusion; 37 g/litr. Difco Laboratories. Detroit. Michigan). Před růstem ve fermentoru se lyofilizovaný kmen nechal růst v 50 ml BHI roztoku (stejný jako výše) v Erlenmeyerově baňce, která se třepe při 37 °C sedm hodin při 200 otáčkách za minutu. Potom se vyrostlé buňky přenesou do 1,5 litru BHI (jako shora) a nechají se růst za stejných podmínek jak shora uvedeno sedm hodin. Inokulum se pak přenese do fermentoru.
Postupy, které se používají pro isolaci a čištění kapsulámího polysacharidu z E. coli Kl. byly identické s postupy shora popsanými při isolaci meningokokového polysacharidu skupiny B.
Shora popsané postupy isolace a čištění nejsou jedinými použitelnými postupy. Lze použít také jiné publikované postupy, například postupy popsané Watsonem a spol.: J. Immunol. 81, 331 (1958) a postupy ve shora uvedeném USA patentu č. 4 727 136.
Přírodní polysacharid se deacetyluje na atomu dusíku. V té části molekuly, která obsahuje zbytek kyseliny sialové, se tím získá reaktivní aminová skupina. Deacetylace na atomu dusíku se může provádět jakýmkoliv známým způsobem, například v bázickém vodném prostředí za zvýšených teplot, například asi 90 °C až 110°C, při pH asi 13 až 14. Vhodným bázickým vodným prostředím je vodný roztok hydroxidu alkalického kovu, například hydroxidu sodného při asi 2M koncentraci. Lze použít také vodný roztok hydrazinu. Stupeň deacetylace na atomu dusíku (Ndeacetylace) se může pohybovat od asi 30% do 100%, podle podmínek. Je výhodné, když dosáhne asi 90 až 100%. N-Deacetylovaný produkt se může isolovat Například ochlazením, neutralizací, vyčištěním a, jestliže je to žádoucí, lyofilizací.
Před N-decetylací má přírodní polysacharid průměrnou molekulovou hmotnost v oblasti asi 500 000 až 800 000. N-Deacetylací se získávají fragmenty polysacharidu s průměrnou molekulovou hmotností asi od 10 000 až 50 000.
Fragmenty polysacharadu, které jsou deacetylovány na atom dusíku, se pak znovu acylují na atomu dusíku. Získá se tak odpovídající N-acylovaný produkt. N-Acylace se provádí tak, že se N-deacetylovaný polysacharid rozpustí ve vodném prostředí o pH asi 7,5 až 9,0, potom se přidá příslušný acylanhydrid, rozpustnost se popřípadě zvýší přidáním alkoholu a směs se ochladí pod 10°C dokud není reakce ukončena. Reakční medium se pak vyčistí, jestliže je to žádoucí, například dialysou, a N-acylovaný produkt se isoluje, typicky lyofilizací Reakce je v podstatě ukončena během asi 10 až 20 hodin. Podle analytických měření, typicky měřením *HNMR spekter, probíhá N-acylace alespoň z 90%, pravděpodobně blízko 100%. N-Acylační reakce nevede k nějakým podstatným změnám molekulových hmot fragmentů.
Pro konjugaci je výhodné podle tohoto vynálezu vybrat N-acylovaný materiál s průměrnou molekulovou hmotou odpovídající asi 30 až 200 zbytků kyseliny sialové. Toho lze obvykle dosáhnout gelovou filtrací N-acylovaného GBMP na koloně s Ultragelem (obchodní značka) AcA 44 (velikost perliček 60 až 140 mikrometrů), eluce PBS. Lze použít také membránu, která dělí podle vhodných velikostí.
Podle tohoto vynálezu se po užívá N-acylovaný materiál s průměrnou molekulovou hmotou 10 000 až 40 000, například 10000 až 15 000. Tento materiál se získá spojením frakcí eluátu z kolony obsahující N-acylovaný GBMP materiál v rozmezí této průměrné molekulové hmoty. Ukázalo se, že N-acylovaný materiál o vyšší průměrné molekulové hmotě, například v oblasti 30 000 až 40 000, je rovněž použitelný podle tohoto vynálezu.
Vakcíny podle tohoto vynálezu se připravují tak, že se N-acylovaný polysacharid zkonjuguje s imunologicky vhodným nosným proteinem. Nosný protein sám je s výhodou imunogen. Mezi příklady vhodných nosných proteinů patří toxoid tetanu, toxoid difterie (záškrtu), zkříženě -4 CZ 283530 B6 reaktivní materiály (CRMs) , s výhodou CRM197, získaný od Sclavo Ltd., Siena. Itálie, a nosiče bakteriálních proteinů, například meningokokové proteiny vnější membrány.
Pro konjugaci modifikovaných polysacharidových fragmentů s nosným proteinem lze použít jakýkoliv způsob kcnjugace. Výhodný způsob je způsob popsaný v USA patentu č. 4 356 170, tj. zavedení koncových aldehydových skupin (oxidací cis-vicinálních hydroxylových skupin) do Nacylovaného polysacharidu a zkondenzováním aldehydových skupin s proteinovými aminovými skupinami reduktivní aminací. Polysacharid je pak navázán s proteinem prostřednictvím vazby -CHj-NH -protein.
Tomu je třeba rozumět tak, že konjugované vakcíny podle tohoto vynálezu nejsou omezeny na vakcíny, které jsou produkovány reduktivní aminací. Vakcíny tedy mohou být produkovány konjugaci N-acylovaného polysacharidu s nosným proteinem pomocí dihydrazitu kyseliny adipové jako spaceru, jak popsal Schheerson R. a spol.: Preparation. Characterization and Imunogenicity of Hsemophilus infuenza type b Polysacharide-Protein Conjugates vJ. Exp. Med. 1952, 381 až 476 (1980) a Laňce K.. Gordon v USA patentu č. 4 644 059. Může se používat také technologie binárního spaceru vyvinutá Merckem jak popisuje Marburg S. a spol.: Biomolecular Chemistry of Macromolecules: Synthesis of Bacterial Polysaccharide Conjugates with Neisseria meningitidis Membrane Protein v J. Amer. Chem. Soc. 108, 5282 až 5287 (1986) nebo metoda redukce konců, jak uvádí Anderson v USA patentu 4 673 574.
Výsledné konjugáty N-acylovaný polysacharid-protein nemají významné zkřížené vazby a jsou rozpustné ve vodných roztocích. Z tohoto důvodu jsou konjugáty podle vynálezu dobiými kandidáty pro použití jako vakcíny.
Výsledné konjugáty N-acylovaný polysacharid-protein podle tohoto vynálezu byly testovány in vitro testy na myších. Bylo ukázáno, že obvykle mají lepší imunogenní vlastnosti než Npropionyl-polysacharid. Navíc bylo pozorováno podstatné snížení tvorby zkříženě-reaktivních protilátek. Na základě toho, co zde bylo uvedeno, se předpokládá, že vakcíny podle tohoto vynálezu budou užitečné proti meningitidě způsobené organismem N. meningitidis skupiny B nebo E. coli K.1. Zvláště zajímavé jsou vakcíny pro ochranu dětí, které jsou vnímavé na bakteriální meningitidu.
Vakcíny podle vynálezu jsou typicky tvořeny dispergováním konjugátu v jakémkoliv vhodném farmaceuticky přijatelném nosiči, jako jsou například fysiologický solný roztok nebo jiné injektovatelné kapaliny. Vakcína se podává parenterálně, například subkutánně, intraperitoneálně nebo intramuskulámě. Ve vakcínách mohou být přítomna také obvyklá aditiva (pomocná činidla), například stabilizátory, jako je například laktosa nebo sorbitol, a adjuvanty, jako je například fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo síran hlinitý.
Vhodnou dávkou vakcíny pro děti je obvykle rozmezí od asi 5 do 25 pg nebo asi 1 až 10 pg na kg tělesné hmotnosti.
Příklady provedení vynálezu
Tento vynález je ilustrován následujícími neomezujícími příklady. Pro hodnocení byly připraveny konjugáty N-acetyl-, Ν-propionyl-, N-butanoyl-, Ν-isobutanoyl-, N-pentanoyl- a N-hexanoyl-GBMP s proteinem. Výsledky jsou diskutovány v příkladech.
Pro přípravu konjugátů byly použity následující materiály: anhydrid kyseliny propionové, anhydrid kyseliny butanové, anhydrid kyseliny isobutanové, anhydrid kyseliny pentanové a anhydrid kyseliny hexanové spolu s kyselinou kolominovou byly získány od firmy Sigma
-5CZ 283530 B6
Chemical Co., St. Louis. Mo. Jelikož kyselina kolominová je strukturně identická s meningokokovým polysacharidem skupiny B (GBMP), je na ni nadále odkazováno jako na GBMP. Toxoid tetanu (TT) byl získán z Institute Armand Frappier. Laval. Quebek; jeho monomemí forma, která je používána ve všech konjugacích, byla získána projitím shora uvedeného přípravku kolonou. Bio-Gel (obchodní značka) A 0,5 (0,074 až 0,038 mm) (1,6 x 90 cm) (Bio-Rad. Richmond. Ka.), ekvilibrováním aeluováním 0,01M fysiologickým solným roztokem (PBS) pufrovaným fosforečnanem (pH 7,4).
Příklad 1
N-Deacetylace GBMP
GBMP (sodná sůl, 1,0 g) se rozpustí v 5 ml 2M hydroxidu sodného. Přidá se tetrahydridoboritan sodný (150 mg). Roztok se zahřívá 6 hodin na 110 °C v teflonové nádobce (60 ml) se šroubovým uzávěrem. Tento postup je v podstatě popsán Haroldem J. Jenningsem a spol, v J. Immunol. 134, 2651 (1985) a v USA patentu 4 727 136. Ochlazený zředěný roztok se pak vyčerpávajícím způsobem dialyzuje proti destilované vodě při 4 °C a lyofilizuje se. Skutečnost, že byl získán Ndeacetylovaný GBMP, se zjistí na základě nepřítomnosti methylacetamidového signálu (singlet při 2,07 ppm) v ’H NMR spektru N-deacetylovaného GBMP.
Příklad 2
M-Acetylace GBMP
N-Deacetylovaný GBMP (1,09 g) se rozpustí v 50 ml 5 % vodného hydrogenuhličitanu sodného. K jednotlivým pěti podílům (10 ml shora uvedeného roztoku) se přidá buď anhydrid kyseliny propionové, butanové, isobutanové, pentanové nebo hexanové. Tato reakční činidla se přidají třikrát po 0,5 ml podílech během tří hodin za teploty místnosti, při čemž se pH roztoku udržuje na hodnotě 8,0 přidáváním 0,5 N hydroxidu sodného. S přidáním anhydridu se rovněž současně přidává methanol (0,5 ml), aby se zvýšila rozpustnost. Nakonec se roztoky míchají 16 hodin pri 4 °C, vyčerpávajícím způsobem se dialyzují proti destilované vodě při teplotě 4 °C a lyolizují se. Ve všech případech byly jednotlivé N-propionylovaný. N-butanoylovaný. N-isobutanoylovaný. N-pentanoylovaný a N-hexanoylovaný GBMP získány ve výtěžcích převyšujících 90%. Ve všech případech byla v podstatě úplná N-acetylace potvrzena zmizením signálu Ndeacetylovaného GBMP v 'H NMR spektru.
-6CZ 283530 B6
Příklad 3
Seřazení fragmentů různých N-acylovaných GBMP podle velikostí
Pro získání N-acylovaných GBMP materiálů o žádaných průměrných molekulových hmotách byla použita gelová filtrace na koloně (IBF) s Ultragelem (obchodní značka) AcA 44 (průměr perliček 60 až 140 pm). Frakce, které byly z kolony eluovány při KD 0,5 až KD 0,7 (měřeno FPLC, viz níže), byly spojeny, dialyzovány a lyofilizovány. Toto rozmezí hodnot KD odpovídá N-acylovanému GBMP s přibližně 30 až 50 zbytky kyseliny sialové (molekulová hmota 10 000 až 15 000, typická průměrná molekulová hmota 12 000). Frakce v oblasti KD 0,2 až 0,4, odpovídající fragmentům s průměrnou molekulovou hmotou v rozmezí od 30 000 do 40 000, byly také spojeny a zkonjugovány. Zajímavý je tedy N-acylovaný materiál, který se eluuje při K.Q v rozmezí od 0,2 do 0,7.
Příklad 4
Konjugáty polysacharidu
Koncové aldehydové skupiny byly zavedeny do N-acylovaného GBMP oxidací jodistanem (viz USA patent č. 4 356 170). Shora uvedené fragmenty N-acylovaného GBMP se oxidují v 0,lM vodném jodistanu sodném (NaIO4) (10 ml) dvě hodiny za teploty místnosti ve tmě. Nadbytek jodistanu se rozloží přidáním 1 ml ethylenglykolu a roztok se vyčerpávajícím způsobem dialyzuje při 4 °C, načež se lyofilizuje. Použití tetrahydridoboritanu sodného v N-deacetylačním procesu (vyjma GBMP) vede k převedení koncových redukujících skupin zbytků kyseliny sialové každého z N-acylovaných GBMP na zbytky otevřených polyolových řetězců. Tento typ zbytku je citlivý na jodistan (viz J. Immunol. 127, 1011 (1981) a USA patent č. 4 356 170, oboje Harold J. Jennings a spol.), což vede k zavedení aldehydových skupin do fragmentů N— acylovaného GBMP na obou koncích.
Oxidované fragmenty } 100 mg) se rozpustí v 0,lM hydrogenuhličitanu sodném (pH 8,1) (2 ml pufru). K tomuto roztoku se přidá TT (20 mg). Po přidání tetrahydridokyanboritanu sodného (40 mg) se roztok mírně míchá za teploty místnosti. Průběh konjugace se sleduje FPLC gelovou filtrací na koloně obsahující jako náplň Superosu (obchodní značka) 12 HR10/30 (Pharmacia), která se nechá probíhat isokraticky rychlostí 1 ml za minutu v pufru PBS při pH 7,2. Jak protein tak fragmenty N-acylovaného GBMP byly monitorovány při 214 nm. Fragmenty měly KD 0,6, TT měl KD 0,39 a konjugáty měly Kd 0,23. Konjugace byla úplná, když byl veškerý TT spotřebován, což lze stanovit na základě zmizení maxima v FPLC chromatogramu odpovídajícího složce s KD 0, 39. Ve většině případů byly konjugace ukončeny během dvou dnů, byly však nechány reagovat po celkovou reakční dobu čtyř dnů. Před filtrací na gelu se potenciální nezreagované skupiny (aldehydové skupiny) konečně zredukují působením tetrahydridoboritanu sodného (20 mg).
Konjugáty polysacharid-TT byly od fragmentů polysacharidu odděleny gelovou filtrací na koloně s náplní Bio Gel A, eluce PBS. Eluant obsahující konjugát byl dialyzován proti destilované vodě a lyofilizován. Konjugáty N-acylovaný GBMP-TT obsahovaly od 12 do 30 %, typicky 12 až 20%, kyseliny sialové (což bylo stanovováno resorcinolovým způsobem popsaným Swennerholmem L.: Quantitative Estimation of Sialic Acids., IK. A Colorimetric Resorcinol-Hydrochloric Acid Method. Biochim. Biophys. Acta 24, 604 (1957). To znamená, že molámí poměr polysacharidu k TT v konjugátech byl 2 až 3:1.
Příklad 5
Imunizace a imunoanalýzy: imunizační postupy
Dvacet bílých myší CFI. ve stáří 8 až 10 týdnů (samičky) se imunizuje intraperitoneálně (3krát ve 3-týdenních intervalech) N-acylovaným konjugátem GBMP-TT ve Freundově úplném adjuvantu (FCA) (Difco Detroit. Mi.). Každá imunizace obsahovala tolik konjugátu (10 až 12 pg), aby obsahoval 2 pg sialové kyseliny. Jedenáctý den po třetí injekci byly myši nechány vykrvácet. Sérum bylo použito pro následující testy.
Příklad 6
Imunizace a imunoanalýzy: analýza navázáním radioaktivního antigenu
Tato analýza se provádí modifikací Farrovy techniky s použitím GBMP označeného [3H] (Jennings H. J. a spol.: Determinant Specificities of the Groups B and C Polysaccharidesof Neisseria Meningitis. J. Immunol. 134, 2651 (1985).) nebo Pr-GBMP (Jennings H. J. a spol.: Unique Intermolecular Bactericidal Epitope involving the Momo-Sialo Polysaccharide Capsule on the Cell Surface of Group B Neisseria meningitis and E. coli Kl. J. Immunol. 142, 3585 až 3591 (1989).). Reakční směs pro analýzu navázáním radioaktivního antigenu byla získána smícháním 20 pl spojeného antisera ze skupiny dvaceti myší imunizovaných konjugátem N— acylovaný GBMP-TT, zředěného PBS na 100 pl, s GBMP označeným [3H] aN-Pr-GBMP označeným [3H] v 50 pl PBS v Eppendorfových polypropylenových mikroanalytických zkumavkách; po 16 hodinách inkubace při 4 °C se do zkumavek při 150 pl nasyceného (při 4 °C) síranu amonného (pH 7,0). Zkumavky se protřepou a nechají se stát při 4 °C 30 minut. Zkumavky se pak odstřeďují deset minut při 15 000 otáčkách za minutu. Ze zkumavek se odeberou dva podíly po 130 pl. Tyto podíly se smíchají se 2 ml vody a s xylenem obsahujícím scintilační činidlo (vodné scintilační činidlo ACS). Směsi se vyhodnotí kapalinovým scintilačním počítačem. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1
Navázání N-Ac-GBMP označeného [3H] na různá myší anti-N-acyl-GBMP-TT konjugátová sera
antiserum % navázání a
1 2 3 4
N-Pr-GBMP-T 41 40 39 12
N-Bu-GBMP-T 4 4 7 4
N-IsoBu-GBMP-TT 9 - - -
N-Pen-GBMP-TT 36 - - -
N-Hex-GBMP-TT 16 - - -
a Se spojeným antiserem z 20 imunizovaných myší byly provedeny čtyři vazebné experimenty.
Zkratky, které jsou použity v tabulce 1 a v dalších tabulkách, znamenají: N-Ac znamená Nacetyl-, N-Pr znamená Ν-propionyl-, N-Buznamená Ν-butanoyl-, N-isOBu znamená Nisobutanoyl-, N-Penznamená N-pentanoyla N-Hexznamená N-hexanoyl.
Čísla l, 2, 3 a 4 jsou výsledky čtyř opakovaných pokusů. Tabulka 1 zřetelně ukazuje, že N-AcGBMP (který nese stejný epitop jako podobný N-CAM) se váže na antiserum indukované NBu-GBMP, N-IsoBu-GBMP, N-Pen-GB a N-Hex-GBMP méně než na antiserum indukované
-8CZ 283530 B6
N-Pr-GBMP. Z toho lze odvodit, že N-Bu-, Ν-IsoBu-, N-Pena N-Hex-polysacharidové konjugázy poskytují méně zkříženě reaktivních protilátek nežN-Pr-konjugát.
Příklad 7
Kvantitativní srážecí analýza
Tyto pokusy se provádějí způsobem podle Kabata a Mayera: Immunochemistry, Charles C. Thomas. Springfield, str. 22 (1961). Jednotlivé podíly (100 μΐ) anti-N-acylGBMP-TT sera (zředěné 5krát PBS) se ve zkumavkách nechají zreagovat se zvyšujícími se koncentracemi Nacetyl-(kyselina kolaminová), Ν-propionyl-, N-butanoyl-, Ν-isobutanoyl-, N-pentanoyla Nhexanoyl-GBMP v celkovém objemu 200 /μΐ (upraveném přidáním PBS). Pro tyto pokusy byly použity frakce těchto derivátů o vyšší molekulové hmotě, které byly získány jako eluáty z kolony s Ultragelem AcA 44 (Ko 0,4 podle měření FPLC), která byla shora použita při dělení Nacylovaného GBMP na fragmenty podle velikostí. Zkumavky byly inkubovány čtyři dny při 4 °C s každodenním mícháním, odstřeďovány a množství proteinu protilátky bylo stanoveno způsobem podle Lowryho a spol.: Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem. 265, 1933 (1951). Výsledky jsou uvedeny v tabulce II.
Tabulka II
Srážení3 myšího anti-N—acyl-GBMP-TT sera pomocí různých N-acyl-GBMP jako srážecích antigenů
antiserum N-acyl-GBMP antigen
N-acetyl- N-propyl- N-butyl- N-hexyl- N-pentyl-
N-Pr-GBMP-TT 0,16 0,40 0,20 0,15 0,15
N-Bu-GBMP-TT 0,04 1,15 2,60 3,20 1,90
N-Pen-GBMP-TT 0,13 0,38 0,44 6,35 3,55
N-Hex-GBMP-TT 0,02 0,08 0,80 4,15 4,40
3 Maximum množství vysrážené protilátky vyjádřené jako mg/ml antisera.
Pokud jde o zkříženou reaktivitu, první sloupeček v Tabulce II ukazuje, že konjugáty N—Bu a N— Hex produkují velmi málo zkříženě reaktivních protilátek ve srovnání s konjugátem N-Pr-. Z tabulky lze vidět také to, že konjugát N-Pen produkuje méně zkříženě reaktivních protilátek než konjugát N-Pr.
Pokud se týká imunogenicity (v termínech homologní odpovědi), z tabulky 11 lze vidět, že konjugáty N-Bu(2,60), N-Pen(6,35) a N-Hex(4,40)-GBMP-TT jsou více imunogenní než NPr-GBMP analog (0,40).
Příklad 8
ELISA
Jamky mikrotitrovacích desek EIA (Flow Laboratories. Missisauga. Ontario. Kanada) se potáhnou 10 pg/ml roztoku konjugátu buď GBMP-, N-Pr-GBMP- nebo N-Bu-GBMP-BSA v PBS (100 μΐ na jamku). Desky se nechají 18 hodin při 4 °C a po potažení se promyjí 1% hovězím serumalbuminem v PBS deset minut za teploty místnosti (blokující stupeň). Jamky se pak naplní 100 μΐ seriálových lOonásobných zředění sera konjugátu anti-myššího-N-acyl
-9CZ 283530 B6
GBMP-TT v PBS. Desky se inkubují jednu hodinu za teploty místnosti. Po promytí SBT se desky inkubují jednu hodinu za teploty místnosti, a to s 50 μΐ příslušných zředění konjugátů značených kozí protimyší imunoglobulínovou peroxidasou. Obsah jamek se pak odebere a desky se promyjí pětkrát SBT. Do každé jamky se konečně přidá 50 μΐ substrátu tetramethylenová modř-peroxidasa (TMB) (Kirkegard and Perry Labpratories) a po 10 minutách se vyhodnotí spektrofotometrem Multiscan (Flow Laboratories. Mississauga. Ontario. Kanada). Výsledky jsou uvedeny níže v tabulce III.
Tabulka III
Titrace ELISA spojeného myšího anti-N-acyl-GBMP-TT konjugátového sera proti konjugátům N-acyl-GBMP-BSA
potahovací antigen titrya antisera
a. N-Pr-GBMPb a. N-Bu-GBMPb a. N-IsoBu-GBMPb
N-Ac-GBMP-BSA 7 800 1000 7 000
N-Pr-GBMP-BSA 40 000 39 000 9 800
N-Bu-GBMP-BSA 26 000 52 000 9 700
N-IsoBu-GBMP-BSA - - 25 000
a titr (GM) znamená reciproční zředění při 50 % maximální absorbance při 450 nm b N-acyl-specifické antiserum indukované v myších homologními konjugáty N-acyl-GBMPTT.
Pokud jde o zkříženou reaktivitu, z tabulky lze vidět, že konjugát N-Bu-GBMP-TT poskytuje méně zkříženě reaktivních protilátek vzhledem kN-Ac-GBMP (1000) než konjugát N-PrGBMP-TT (7800). Důvodem je to, že GBMP se na protilátku indukovanou konjugátem N-PrGBMP-TT váže méně než na protilátku indukovanou konjugátem N-Bu-GBMP-TT. Podobný komentář lze použít také na konjugát N-IsoBu-GBMP-TT.
Pokud se týká imunogenicity, konjugát N-Bu je více imunogenní než analog N-Pr, jak ukazují homologní vazebné titry 52 000 (N-Bu) a 40 000 (N-Pr).
Příklad 9
Radioaktivní analýza inhibice vazby
Ke 20 μΐ myšího anti-N-Pr-GBMP-TT konjugátového antisera se přidají zvýšené koncentrace N-acyl-GBMP inhibitoru o větších velikostech molekul v PBS (80 μΐ), množství postačující pro navázání 50 % [3H]-označeného N-Pr-GBMP v nepřítomnosti inhibitoru. Tyto zkumavky se inkubují jednu hodinu při 37 °C. Přidá se 50 μΙ [3H]-značeného N-Pr-GBMP v PBS. Po mírném míchání se zkumavky inkubují 16 hodin při 4 °C. Analýzy se provedou přesně stejným způsobem jak shora popsáno pro analýzu navázání radioaktivního antigenu. Procenta inhibice se vypočtou podle následujícího vzorce:
Procento inhibice = 100. [(počet impulsů za minutu s inhibitorem - počet impulsů za minutu bez inhibitoru)/počet impulsů za minutu s protilátkou - počet impulsů za minutu s inhibitorem).
Výsledky jsou uvedeny v tabulce IV.
- 10CZ 283530 B6
Tabulka IV
Inhibice navázání [3H]-označeného N-Pr-GBMP na myší konjugát anti-N-Pr-GBM-TT indukovaný protilátkami IgG2a IgG2b (A)a a IgGi (B)a
Inhibitorb A B
N-Ac-GBMP více než 50,0 více než 50,0
N-Pr-GBMP 0,6 0,3
N-Bu-GBMP 0,3 0,2
N-IsoBu-GBMP více než 50,0 -
N-Pen-GBM 2,3 2,5
N-Hex-GBMP 10,2 10,0
a Toto byly frakce myšího polyklonálního anti-N-Pr-GBMP-TT, sera popsaného Jenningsem a spol.: J. Immunol. 142. 3585 až 3591 (1989).
b Mikrogramy inhibitoru, které poskytují 50 % inhibici.
Baktericidní analýzy byly prováděny způsobem popsaným Jenningsem a spol.: J. Exp. Med. 165. 1207 až 1211 (1987). V těchto analýzách byl použit kmen B (M 986) Neisseria meningitidis. Výsledky jsou uvedeny v tabulce V.
Tabulka V
Navázání [3H]-značeného N-Pr-GBMP na sérum myšího anti-N-acyl-GBMP-TT konjugátu a baktericidní titry příslušného antisera
antiserum μΐ antisera3 baktericidní titrb
N-Pr-GBMP-TT 13 128
N-Bu-GBMP-TT 10 64
N-IsoBu-GBMP-TT NS 64
N-Pen-GBMP-TT 24 64
N-Hex-GBMP-TT více než 100 8
N-Ac-GBMP-TT více než 100 8
a mikrolitry antisera (pětinásobně zředěného PBS) požadované pro 50 % navázání b Pokud zřeďování: rozdíl jednoho zředění, například 128 versus 64, je v rámci experimentální chyby.
Tabulka IV ukazuje, že N-Bu-GBMP je stejně dobrý inhibitor jako N-Pr-GBMP při navázání N-Pr-GBMP na jeho vlastní homologní protilátky. Použití N-Bu-GBMP místo N-Pr-GBMP nevede tedy k žádné významné ztrátě vlastností vykazovaných N-Pr-GBMP. Tabulka V ukazuje, že N-Bu-GBMP se váže na protilátky indukované konjugátem N-Pr-GBMP-TT stejně dobře jako N-Pr-GBMP. Antisera indukovaná jak konjugáty N-Bu-GBMP-TT tak N-Pr-GBMP-TT poskytují podobné baktericidní titry. Tato skutečnost ukazuje na ekvivalenci N-Bu-GBMP, N IsoBu-GBMp aN-Pen-GBMP s N-Pr-GBMP v jejich schopnosti napodobovat baktericidní epitop na povrchu \ skupiny B.

Claims (25)

1. Modifikovaný polysacharid skupiny B Neisseria meningitidis, který má N-acetylové skupiny zbytku kyseliny sialové přírodního polysacharidu nahrazeny acylovou skupinou se čtyřmi až osmi atomy uhlíku a jeho průměrná molekulová hmotnost je v rozmezí 10 000 až 50 000.
2. Modifikovaný kapsulamí polysacharid Escherichia coli K.1, který má N-acetylové skupiny zbytku kyseliny sialové přírodního polysacharidu nahrazeny acylovou skupinou se čtyřmi až osmi atomy uhlíku a jeho průměrná molekulová hmotnost je v rozmezí 10 000 až 50 000.
3. Modifikovaný polysacharid podle nároku 1, kde acylová skupina se čtyřmi až osmi atomy uhlíku je vybrána ze skupiny sestávající z butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové, hexanoylové, heptanoylové a oktanoylové skupiny.
4. Modifikovaný polysacharid podle nároku 3, kde acylová skupina je vybrána ze skupiny sestávající z butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové a hexanoylové skupiny.
5. Modifikovaný polysacharid podle nároku 4, kde acylovou skupinou je n-butanoylová skupina.
6. Modifikovaný polysacharid podle nároku 2, kde acylová skupina se čtyřmi až osmi atomy uhlíku je vybrána ze skupiny sestávající z butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové, hexanoylové, heptanoylové a oktanoylové skupiny.
7. Modifikovaný polysacharid podle nároku 6, kde acylová skupina je vybrána ze skupiny sestávající z butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové a hexanoylové skupiny.
8. Modifikovaný polysacharid podle nároku 7, kde acylovou skupinou je n-butanoylová skupina.
9. Modifikovaný polysacharid podle nároku 1, kde 27 až 100 % N-acetylových skupin zbytku kyseliny sialové je nahrazeno C4 až Cg-acylovými skupinami.
10. Modifikovaný polysacharid podle nároku 2, kde 27 až 100 % N-acetylových skupin zbytku kyseliny sialové je nahrazeno C4 až Cg-acylovými skupinami.
11. Modifikovaný polysacharid podle nároku 1, kde 90 až 100 % N-acetylových skupin zbytku kyseliny sialové je nahrazeno C4 až Cg-acylovými skupinami.
12. Modifikovaný polysacharid podle nároku 2, kde 90 až 100 % N-acetylových skupin zbytku kyseliny sialové je nahrazeno C4 až Cg-acylovými skupinami.
13. Antigenní konjugát, který obsahuje modifikovaný polysacharid skupiny B Neisseria meningitidis, který má N-acetylové skupiny zbytku kyseliny sialové nahrazeny acylovou skupinou se čtyřmi až osmi atomy uhlíku, která je konjugována s imunologicky vhodným proteinem.
- 12CZ 283530 B6
14. Antigenní konjugát podle nároku 13, kde acylová skupina je vybrána ze skupiny sestávající z butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové, hexanoylové, heptanoylové a oktanoylové skupiny.
5
15. Antigenní konjugát podle nároku 14, kde acylová skupina je vybrána ze skupiny sestávající z butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové a hexanoylové skupiny.
16. Antigenní konjugát podle nároku 15, kde protein je vybrán ze skupiny sestávající z toxoidu tetanu, toxoidu difterie, zkříženě reaktivního materiálu (CRM) a nosiče bakteriálního proteinu.
17. Antigenní konjugát podle nároku 13, kde protein je kovalentně navázán a polysacharid -CHr-NH-proteinovou vazbou.
18. Antigenní konjugát podle nároku 16, kde CRM znamená CRM197.
19. Způsob přípravy antigenního konjugátu obsahujícího modifikovaný polysacharid skupiny B Neísseria meningitídis podle nároku 1 nebo Escherichia coli K1 podle nároku 2, konjugovaný s imunologicky vhodným proteinem, kde N-acetylové skupiny zbytků kyseliny sialové polysacharidu jsou nahrazeny N-C4 až Cg-acylovými skupinami, vyznačující se tím,
20 že zahrnuje
a) N-deacetylaci polysacharidu skupiny B Neísseria meningitídis nebo Escherichia coli Kl;
b) N-acylaci N-deacetylovaného polysacharidu ze stupně (a) za vzniku N-acylovaného polysacharidu;
c) konjugaci N-acylovaného polysacharidu s imunologicky vhodným proteinovým nosičem za 25 vzniku konjugátu.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že acylová skupina je vybrána ze skupiny zahrnující n-butanoylové, isobutanoylové, pentanoylové, hexanoylové a oktanoylové skupiny.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že acylovou skupinou je butanoylová skupina.
22. Vakcina, vyznačující se tím, že obsahuje antigenní konjugát podle nároku 15 35 a farmaceuticky přijatelný injektovatelný nosič.
23. Vakcína podle nároku 22, vyznačující se tím, že dále obsahuje fysiologicky přijatelný adjuvant.
40
24. Vakcína podle nároku 23, vyznačující se tím, že uvedený adjuvant je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxidu hlinitého, fosforečnanu hlinitého a síranu hlinitého.
25. Gamaglobulinová frakce, která je schopna pasivně chránit proti meningitidě způsobené Neísseria meningitídis skupiny B a Escherichia coli Kl, připravitelná imunizací savce vakcinou 45 podle nároku 22 a následnou isolací gamaglobulinu z uvedeného savce.
CS906284A 1989-12-14 1990-12-14 Modifikované polysacharidy, antigenní konjugát obsahující modifikovaný polysachararid a způsob jeho přípravy a gamaglobulinová frakce CZ283530B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44819589A 1989-12-14 1989-12-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ628490A3 CZ628490A3 (en) 1997-12-17
CZ283530B6 true CZ283530B6 (cs) 1998-04-15

Family

ID=23779371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS906284A CZ283530B6 (cs) 1989-12-14 1990-12-14 Modifikované polysacharidy, antigenní konjugát obsahující modifikovaný polysachararid a způsob jeho přípravy a gamaglobulinová frakce

Country Status (30)

Country Link
US (3) US5576002A (cs)
EP (1) EP0504202B1 (cs)
JP (1) JP2637845B2 (cs)
KR (1) KR0158436B1 (cs)
CN (4) CN1049223C (cs)
AR (1) AR243934A1 (cs)
AT (1) ATE121947T1 (cs)
AU (1) AU641715B2 (cs)
BR (1) BR9007917A (cs)
CA (1) CA2071811C (cs)
CZ (1) CZ283530B6 (cs)
DE (1) DE69019164T2 (cs)
DK (1) DK0504202T3 (cs)
ES (1) ES2071288T3 (cs)
FI (2) FI104539B (cs)
HR (1) HRP920872A2 (cs)
HU (2) HU218146B (cs)
IE (1) IE68414B1 (cs)
IL (1) IL96676A (cs)
IN (1) IN171747B (cs)
NO (2) NO305275B1 (cs)
NZ (1) NZ236471A (cs)
PH (1) PH30305A (cs)
PL (2) PL166659B1 (cs)
RO (1) RO111416B1 (cs)
RU (1) RU2105568C1 (cs)
SI (1) SI20008B (cs)
WO (1) WO1991008772A1 (cs)
YU (1) YU24391A (cs)
ZA (1) ZA9010065B (cs)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5648241A (en) * 1989-09-15 1997-07-15 The General Hospital Corporation Conjugate vaccine against group B streptococcus
HU218146B (hu) * 1989-12-14 2000-06-28 National Research Council Of Canada Továbbfejlesztett meningokokkusz-poliszacharid-konjugátum vakcina
ES2160601T3 (es) * 1992-09-24 2001-11-16 Brigham & Womens Hospital Vacunas de conjugado de polisacaridos de estreptococos del grupo b tipo ii y tipo v-proteina.
US6153406A (en) * 1993-07-23 2000-11-28 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane protein P2 from Haemophilus influenzae type B
US5439808A (en) * 1993-07-23 1995-08-08 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US5679654A (en) * 1994-09-02 1997-10-21 Brigham & Women's Hospital, Inc. Capsular polysaccharide immunomodulator
US5700787A (en) * 1994-09-02 1997-12-23 Brigham & Women's Hospital, Inc. Capsular polysaccharide immunomodulator
US5747287A (en) * 1995-04-28 1998-05-05 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US5811102A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 National Research Council Of Canada Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines
DK1090642T3 (da) * 1995-06-07 2008-09-22 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacciner omfattende et polysaccharidantigen-bæreprotein-konjugat og frit bæreprotein
US6284884B1 (en) 1995-06-07 2001-09-04 North American Vaccine, Inc. Antigenic group B streptococcus type II and type III polysaccharide fragments having a 2,5-anhydro-D-mannose terminal structure and conjugate vaccine thereof
ZA97248B (en) * 1996-01-18 1997-07-18 Rohm & Haas Method for identifying and quantifying polymers utilizing immunoassay techniques
DE69708318T3 (de) 1996-08-27 2006-11-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville Neisseria meningitidis serogruppe b glykokonjugate und verfahren zu deren verwendung
ATE252602T1 (de) 1996-08-27 2003-11-15 Chiron Corp Meningokokkus b-epitop ausbildende monoklonale antikoerper und deren verwendung zur herstellung von impfstoffzusammenstellungen
US6426074B1 (en) * 1997-03-19 2002-07-30 The Brigham And Women's Hospital Inc. Group B Streptococcus vaccine
EP0994723A1 (en) 1997-06-24 2000-04-26 Chiron Corporation Methods of immunizing adults using anti-meningococcal vaccine compositions
ES2319939T3 (es) 1997-08-27 2009-05-14 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Mimeticos moleculares de epitopos de meningococos b.
ES2346022T3 (es) 1997-12-23 2010-10-07 Baxter Healthcare S.A. Procedimiento para la extraccion y el aislamiento de polisacaridos capsulares bacterianos para su uso como vacunas o ligandos a proteinas como vacunas de conjugados.
JP2004505885A (ja) * 1998-08-19 2004-02-26 ノース　アメリカン　ワクチン，　インコーポレイテッド Ｎ−アクリロイル化ポリサッカリドを用いて産生されたワクチンとして有用な免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体
PL346645A1 (en) * 1998-08-19 2002-02-25 North American Vaccine IMMUNOGENIC β-PROPIONAMIDO-LINKED POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATE USEFUL AS A VACCINE PRODUCED USING AN N-ACRYLOYLATED POLYSACCHARIDE
US6436653B1 (en) 1998-12-15 2002-08-20 Exiqon A/S Method for introduction of reporter groups into bacterial lipopolysaccharide-derived carbohydrates and the subsequent coupling of such derivatives onto solid surfaces
US7083777B1 (en) * 1999-04-02 2006-08-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Immunomodulating polymers
US6518037B2 (en) * 1999-11-12 2003-02-11 University Of Iowa Research Foundation Two-component system that controls bacterial membrane synthesis
GB9928196D0 (en) * 1999-11-29 2000-01-26 Chiron Spa Combinations of B, C and other antigens
GB0011108D0 (en) * 2000-05-08 2000-06-28 Microscience Ltd Virulence gene and protein and their use
SV2003000753A (es) 2000-12-05 2003-06-16 Brigham & Womens Hospital Uso de polisacaridos zwitterionicos para la especifica modulacion del progreso inmunologico
DE60235155D1 (de) 2001-04-17 2010-03-11 Childrens Hosp Oak Res Inst Monoklonale antikörper gegen molekulare mimetika von meningokokken-b-epitopen
GB0115176D0 (en) * 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
GB0121591D0 (en) * 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
PT1777236T (pt) * 2002-03-26 2017-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sacáridos modificados possuindo estabilidade melhorada em água para utilização como um medicamento
BR0310042A (pt) * 2002-05-14 2005-04-05 Chiron Srl Vacinas de combinação mucosal para meningite bacteriana
RU2494758C2 (ru) * 2002-08-02 2013-10-10 ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. Нейссериальные вакцинные композиции, содержащие комбинацию антигенов
GB0227346D0 (en) * 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
AU2004227852B2 (en) * 2003-03-31 2010-01-14 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Zwitterionic immunomodulators for the treatment of asthma and allergy
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
RU2333223C2 (ru) * 2003-08-12 2008-09-10 Лайпоксен Текнолоджиз Лимитед Альдегидные производные сиаловой кислоты, способы их получения, конъюгаты альдегидных производных сиаловой кислоты и фармацевтическая композиция на их основе
CA2568982A1 (en) 2004-06-23 2006-01-05 Children's Hospital & Research Center At Oakland Polysaccharide derivatives and uses in induction of an immune response
US8148335B2 (en) 2004-06-23 2012-04-03 Children's Hospital & Research Center Oakland De-N-acetyl sialic acid antigens, antibodies thereto, and methods of use in cancer therapy
GB0428394D0 (en) * 2004-12-24 2005-02-02 Chiron Srl Saccharide conjugate vaccines
PE20110096A1 (es) 2005-06-27 2011-03-07 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica que comprende sacaridos de neisseria meningitidis conjugados a toxoide tetanico
US8206726B2 (en) 2006-02-06 2012-06-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Zwitterionic polysaccharides for promotion of immune system maturation and health
GB0611914D0 (en) 2006-06-15 2006-07-26 Teti Giuseppe Peptides that mimic non-human cross-reactive protective epitopes of the group Bmeningococcal capsulsar polysaccharide
EP1872791A1 (en) 2006-06-30 2008-01-02 Institut Pasteur Use of bacterial polysaccharides for biofilm inhibition
ES2621359T3 (es) * 2007-06-20 2017-07-03 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Polisacáridos modificados para vacunas conjugadas
US8815253B2 (en) 2007-12-07 2014-08-26 Novartis Ag Compositions for inducing immune responses
WO2010083477A2 (en) 2009-01-16 2010-07-22 University Of Maryland, Baltimore Broad spectrum vaccine against non-typhoidal salmonella
WO2013009945A1 (en) 2011-07-12 2013-01-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lipid-containing psa compositions, methods of isolation and methods of use thereof
EP2752403A1 (de) * 2013-01-08 2014-07-09 Sika Technology AG Amin für emissionsarme Epoxidharz-Produkte
WO2017031431A1 (en) 2015-08-19 2017-02-23 President And Fellows Of Harvard College Lipidated psa compositions and methods
CA3030974A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 President And Fellows Of Harvard College Glycolipid compositions and methods of use
CN110234658B (zh) * 2017-01-31 2024-03-12 辉瑞大药厂 脑膜炎奈瑟菌组合物及其使用方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) * 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4356170A (en) * 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4673574A (en) * 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4644059A (en) * 1982-07-06 1987-02-17 Connaught Laboratories, Inc. Haemophilus influenzae B polysaccharide-diptheria toxoid conjugate vaccine
US4619828A (en) * 1982-07-06 1986-10-28 Connaught Laboratories, Inc. Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines
US4496538A (en) * 1982-07-06 1985-01-29 Connaught Laboratories, Inc. Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine
US4695624A (en) * 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4727136A (en) * 1985-10-01 1988-02-23 Canadian Patents And Development Ltd. Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine
HU218146B (hu) * 1989-12-14 2000-06-28 National Research Council Of Canada Továbbfejlesztett meningokokkusz-poliszacharid-konjugátum vakcina

Also Published As

Publication number Publication date
SI20008A (sl) 2000-02-29
PL288271A1 (en) 1991-12-16
HU218146B (hu) 2000-06-28
US5683699A (en) 1997-11-04
CN1100656A (zh) 1995-03-29
RO111416B1 (ro) 1996-10-31
CN1036504C (zh) 1997-11-26
HUT64480A (en) 1994-01-28
US5902586A (en) 1999-05-11
DE69019164D1 (de) 1995-06-08
JPH05505392A (ja) 1993-08-12
ZA9010065B (en) 1992-02-26
CN1096516A (zh) 1994-12-21
PH30305A (en) 1997-02-20
DE69019164T2 (de) 1995-09-07
HRP920872A2 (en) 1997-06-30
NZ236471A (en) 1992-10-28
WO1991008772A1 (en) 1991-06-27
CN1055541A (zh) 1991-10-23
FI922737A0 (fi) 1992-06-12
US5576002A (en) 1996-11-19
CN1072506C (zh) 2001-10-10
DK0504202T3 (da) 1995-10-02
PL166659B1 (pl) 1995-06-30
JP2637845B2 (ja) 1997-08-06
CZ628490A3 (en) 1997-12-17
IL96676A0 (en) 1991-09-16
FI19991917L (fi) 1999-09-09
IE904513A1 (en) 1991-06-19
IL96676A (en) 1996-09-12
NO973311D0 (no) 1997-07-17
SI20008B (en) 2001-02-28
IN171747B (cs) 1992-12-26
NO922316L (no) 1992-08-14
CN1049223C (zh) 2000-02-09
ATE121947T1 (de) 1995-05-15
NO973311L (no) 1992-08-14
EP0504202A1 (en) 1992-09-23
NO922316D0 (no) 1992-06-12
CN1100428A (zh) 1995-03-22
IE68414B1 (en) 1996-06-12
BR9007917A (pt) 1992-10-20
NO307835B1 (no) 2000-06-05
HU9201966D0 (en) 1992-10-28
AR243934A1 (es) 1993-09-30
ES2071288T3 (es) 1995-06-16
AU641715B2 (en) 1993-09-30
CA2071811C (en) 2003-11-04
PL166035B1 (pl) 1995-03-31
KR0158436B1 (ko) 1998-12-01
FI104539B (fi) 2000-02-29
AU6898791A (en) 1991-07-18
CA2071811A1 (en) 1991-06-15
YU24391A (sh) 1995-12-04
CN1036522C (zh) 1997-11-26
RU2105568C1 (ru) 1998-02-27
NO305275B1 (no) 1999-05-03
EP0504202B1 (en) 1995-05-03
FI19991917A7 (fi) 1999-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ283530B6 (cs) Modifikované polysacharidy, antigenní konjugát obsahující modifikovaný polysachararid a způsob jeho přípravy a gamaglobulinová frakce
US7291343B2 (en) Enterococcus antigens and vaccines
US4727136A (en) Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine
JP4656728B2 (ja) ブドウ球菌抗原及びワクチン
BRPI0316018B1 (pt) vacina polissacarídica para infecções estafilocócicas
PL184125B1 (pl) Modyfikowany polisacharyd meningokokowy grupy B, skoniugowana cząsteczka, kompozycja szczepionki, surowica odpornościowa oraz zastosowanie skoniugowanej cząsteczki do wytwarzania szczepionki
JPH11507964A (ja) ２，５−アンヒドロ−ｄ−マンノース末端構造を持つ、抗原性グループｂ連鎖球菌▲ｉｉ▼型および▲ｉｉｉ▼型多糖断片とその複合ワクチン
KR20150003149A (ko) 합성 베타-1,6 글루코사민 올리고당에 관한 방법 및 조성물
US7595307B2 (en) Polysaccharide derivatives and uses in induction of an immune response
Moreno et al. Thymic-dependence and immune memory in mice vaccinated with meningococcal polysaccharide group B complexed to outer membrane protein
JPH01203317A (ja) 抗体およびそれを有効成分とする齲蝕予防剤の製造方法