DE602004009314T2 - Polysialinsäurederivate - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polysialsäure-Derivate, die zur Konjugation an Arzneimittel, Proteine und Peptide oder für Arzneimittelzufuhrsysteme, wie Liposomen mit Sulfhydrylgruppen geeignet sind, und auch konjugierte Produktverfahren zur Synthese der Derivate und der Konjugate und neue synthetische Zwischenprodukte.
  • Die verlängerte Anwesenheit von Arzneimitteln im Gefäßsystem oder bei der extravaskulären Verwendung ist häufig eine Voraussetzung für ihren optimalen Einsatz. Zum Beispiel werden viele Antibiotika und Zytostatika ebenso wie eine Vielzahl von therapeutischen Peptiden und Proteinen und Liposomen vorzeitig und bevor wirksame Konzentrationen in Zielgeweben erreicht werden können aus dem Kreislauf entfernt. Die Halbwertszeiten einer Reihe von kurzlebigen Proteinen (z.B. Enzymen, Zytokinen usw.) sind erhöht worden, indem sie an niedrigmolekulares Poly(ethylenglycol) konjugiert wurden. Es scheint, dass PEG-Moleküle die Kreislaufzeit von Proteinen und Teilchen durch Bilden einer Wolke um ihre Oberfläche und somit sterisches Verhindern einer Wechselwirkung mit Faktoren, die für ihre Clearance verantwortlich sind, verlängern. PEG ist aber nicht biologisch abbaubar und die intrazelluläre Anreicherung von PEG-ylierten Proteinen kann insbesondere bei chronischer Verwendung unerwünscht sein [Bendele, A., Seely, J. Richey, C., Sennello, G., Shopp, G., Renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol conjugated Proteins, Toxicological sciences, 42 (1998) 152–157; Convers, C.D., Lejeune, L., Shum, K., Gilbert, C., Shorr, R.G.L., Physiological effect of polyethylene glycol conjugation an stroma-free bovine hemoglobin in the conscious dog after partial exchange transfusion, Artificial Organ, 21 (1997) 369–378].
  • Wir haben die Konjugation eines Polysaccharids umfassend 2→8- und/oder 2→9-(z.B. alternierend 2→8- und 2→9-)verknüpften Sialsäure-Einheiten konjugiert an Proteine zur Erhöhung ihrer Halbwertszeit, zur Verringerung ihrer Immunogenität/Antigenität oder zur Erhöhung der Stabilität einer Vielzahl von Proteinen beschrieben. In WO 92/22331 werden Polysialsäuren mit einem Modell-Arzneimittel umgesetzt und wird die Verlängerung der Halbwertszeit in dem Kreislauf von Mäusen nachgewiesen. in Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1964 bis 1969 und in Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 16 (1999) 203 bis 215 beschreiben Gregoriadis et al. die Konjugation von Polysialsäuren an Asparaginase und Katalase und zeigen, dass die Clearance-Raten aus dem Kreislauf verringert waren, wobei die Enzymaktivität beibehalten wurde. Wir haben auch Insulin polysialyliert (Biochim. Biophys. Acta 1622 (2003) 42–49) und gezeigt, dass es aktiv ist. Wir haben auch Interferon polysialyliert (AAPS Annual Meeting 2002, Toronto, Kanada, M1056). Wir haben auch Antikörper-Fragment Fab polysialyliert (Epenetos, A. et al., Proceedings of ASCO (Clinical Pharmacy) 21 (2002) 2186).
  • In allen diesen Veröffentlichungen wird Polysialsäure reaktionsfähig gemacht, indem eine Aldehydgruppe am nicht reduzierenden Ende durch Oxidation der 7,8-Vicinaldiol-Gruppe mit Natriumperiodat erzeugt wird. Die Aldehydgruppe wurde dann mit primären Amingruppen an Proteinen umgesetzt, wobei allgemein angenommen wurde, dass es sich um epsilon-Aminogruppen von Lysineinheiten des Proteins oder N-endständige Amingruppen handelte. Die Reaktion bildet eine Schiff-Base, die durch Cyanoborhydrid zu einem sekundären Amin reduziert wird.
  • In WO-A-01/87922 schlagen wir auch vor, dass die Derivatisierung mit anderen Molekülen in Anwesenheit eines Denaturierungsmittels durchgeführt werden könnte, um erhöhte Derivatisierungsgrade zu erreichen. Beispiele für andere Derivatisierungsmittel sind Polyethylenglycol-Verbindungen. Aktivierte PEG-Verbindungen wie Tresyl-PEG und Succinimidylsuccinatester von PEG wurden genannt. In den Beispielen wurden mit Succinimidylsuccinat aktiviertes PEG eingesetzt, von dem angenommen wird, dass es mit Amingruppen reagiert.
  • PEG-Derivate mit funktionellen Gruppen zur Kupplung an Thiolgruppen sind im Handel erhältlich. Bei den funktionellen Gruppen kann es sich um Maleimid-, Vinylsulfon-, Iodacetamid- oder Orthopyridyldisulfid-Gruppen handeln. Da diese Reagenzien spezifisch mit Cysteinen reagieren und da Proteine weniger Cysteine auf ihren Oberflächen als Lysingruppen aufweisen, ist die Derivatisierung regulierbarer. In Abwesenheit eines freien Cysteins in einem natürlichen Protein können außerdem ein oder mehrere freie Cysteine durch Genmanipulation addiert werden. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass eine ortsspezifische Derivatisierung in Bereichen auf dem Protein ermöglicht wird, was den Verlust an biologischer Aktivität minimiert.
  • Es ist festgestellt worden, dass PEG-ylierte Proteine Anti-PEG-Antikörper erzeugen, -welche die Verweilzeit des Konjugats im Blutkreislauf auch beeinflussen könnten (Cheng, T., Wu, M., Wu, P., Chern, J., Roffer, SR., Accelerated clearance of polyethylene glycol modified Proteins by anti-polyethylene glycol IgM. Bioconjugate chemistry, 10 (1999) 520–528). Trotz der etablierten Tradition von PEG als parenteral verabreichtes, an Therapeutika konjugiertes Polymer ist ein besseres Verständnis seiner Immunotoxizität, Pharmakologie und seines Metabolismus erforderlich (Hunter, A.C.; Moghimi, S.M., Therapeutic synthetic polymers: a game of Russian Roulette. Drug Discovery Today, 7 (2002) 998–1001; Brocchini, S., Polymers in medicine: a game of chess. Drug Discovery Today, 8, (2003) 111–112).
  • Eine Modifizierung durch Polysialsäure zur Abzielung auf Thiol (Sulfhydryl)-Gruppen wäre zweckmäßig. Es wäre auch wünschenswert, die Wirksamkeit der Derivatisierung durch Sialsäure zu erhöhen, wobei die in unserem vorstehend genannten Stand der Technik beschriebenen Verfahren hohe Überschüsse an aktiver Polysialsäure erfordern. Es wäre auch zweckmäßig, den Einsatz von Cyanoborhydrid zu vermeiden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine neue Verbindung bereitgestellt, die umfasst ein Polysaccharid mit mindestens zwei Sialsäure-Einheiten, die miteinander 2,8- oder 2,9-verknüpft sind, und mit einer Gruppe, die mit einer oder jeder von einer Sialsäure-Einheit abgeleiteten endständigen Einheit verknüpft ist, die eine funktionelle Gruppe ausgewählt aus N-Maleimid-Gruppen, Vinylsulfon-Gruppen, N-Iodacetamid-Gruppen und Orthopyridyldisulfid-Gruppen beinhaltet.
  • Die endständige Einheit, an welche die Gruppe verknüpft ist, kann an dem nicht reduzierenden Ende der Polysialsäure oder am reduzierenden Ende der Polysialsäure sein. Allgemein ist die endständige Sialsäure-Einheit einer vorhergehenden chemischen Reaktion unterworfen worden, um nützliche funktionelle Gruppen zu erzeugen, an die ein Maleimid-Gruppen enthaltendes Reagenz verknüpft werden kann. Wir haben festgestellt, dass es zweckmäßig ist, die in unseren früheren Veröffentlichungen offenbarte Chemie zu verwenden, in der als vorausgehender Schritt eine Aldehydgruppe erzeugt wird, um die funktionelle Gruppe zu bilden, über welche die Maleimidgruppe verknüpft werden kann.
  • In unseren früheren vorstehend genannten Veröffentlichungen ist es die nicht reduzierende endständige Einheit, die durch Oxidation der 7,8-vicinal-Diol-Gruppe mit Natriumperiodat unter Bildung der Kohlenstoff 7-Aldehyd-Verbindung in eine Aldehydgruppe umgewandelt wird. Dies ist eine zweckmäßige Reaktion für die vorliegende Erfindung.
  • Als eine Alternative ist es möglich, die Aldehydgruppe an der reduzierenden endständigen Einheit bereitzustellen. In diesem Fall ist es bevorzugt (aber nicht wesentlich), einen vorausgehenden Schritt durchzuführen, bei dem das nicht reduzierende Ende durch vorausgehende Oxidations- und Reduktionsschritte deaktiviert wird. Ein erster Reduktionsschritt wandelt die Ketaleinheit am reduzierenden Ende in eine reduzierte ringgeöffnete Form mit vicinalen Diolen um. Die vicinalen Diole werden anschließend mit Natriumperiodat oxidiert, um eine Aldehydgruppe am Kohlenstoffatom zu bilden, das vorher den 7-Kohlenstoff der reduzierenden endständigen Einheit bildete. Wenn das nicht reduzierende endständige Glycosyl (gewöhnlich Sialsäure) nicht durch einen vorausgehenden Oxidationsschritt deaktiviert wird, wird die endständige Einheit gleichzeitig aktiviert.
  • In der Erfindung kann die Gruppe, welche die funktionelle Gruppe beinhaltet, direkt an der Polysialsäure-Einheit verknüpft sein oder sie kann zweckmäßiger über eine difunktionelle organische Gruppe, wie eine Alkandiylgruppe, eine Arylengruppe oder eine Oligo(alkylenoxy)alkan-Gruppe oder alternativ eine Oligopeptidyl-Gruppe, verknüpft sein. Die Verknüpfung an die Polysialsäure (von der Verknüpfungsgruppe oder der Gruppe mit der funktionellen Gruppe) kann ein sekundäres Amin, ein Hydrazon, ein Alkylhydrazin, ein Ester oder eine Peptidylgruppe sein. Die Gruppe kann durch Reaktion eines Polysialsäure-Substrats mit einem heterobifunktionellen Reagenz erzeugt werden. Das Verfahren bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung.
  • Reagenzien, die zur Einführung der ausgewählten funktionellen Gruppen geeignet sind, sind im Handel erhältlich. Eine Verbindung, die eine Maleimidgruppe an eine Amingruppe ohne Einführung einer zusätzlichen Verknüpfungs gruppe einführt, ist N-Methoxycarbonylmaleimid. Im allgemeinen beinhalten die Reagenzien eine zweite funktionelle Gruppe zur Reaktion mit einer Gruppe an der Polysialsäure, wobei es sich um die vorstehend beschriebene Aldehydgruppe oder eine Amingruppe handeln kann. Geeignete zweite funktionelle Gruppen beinhalten N-Hydroxysuccinimidester und ihre Sulfosuccinimid-Analoga und Hydrazide. Die Verbindung ist bevorzugt ein N-Maleimidalkansäurehydrazid oder ein N-Maleimidarylalkansäurehydrazid, d.h. eine Verbindung mit der allgemeinen Formel X-R-Y, worin:
    • X eine N-Maleimid-, N-Iodacetamid-, S-Vinylsulfonyl- oder S-Orthopyridyldisulfid-Gruppe ist,
    • R eine Alkandiyl-, Arylen- oder Aralkylenalkarylen-, Alkylenoxaalkylen- oder Alkylenoligooxaalkylen- oder Alkyloligopeptidylalkyl-Gruppe ist; und
    • Y eine Hydrazid-, Amin- oder N-Hydroxysuccinimid-Gruppe ist.
  • Vorzugsweise ist R C1-6-Alkandiyl, C2-3-Alkyloxa-C2-3-alkylen, C2-3-Alkyloligo(oxa-C2-3-alkylen) oder C2-6-Alkylenphenyl.
  • X ist bevorzugt N-Maleimid oder Orthopyridyldisulfid. Y ist vorzugsweise ein Hydrazid oder ein Hydroxylsuccinimid.
  • Verbindungen, die mit einer Aldehydgruppe umgesetzt werden können und die eine Verknüpfungsgruppe beinhalten und eine Maleimidgruppe einführen, beinhalten N-[β-Maleimidpropionsäure]hydrazid und 4-(4-N-Maleimidphenyl)buttersäurehydrazid. Die Hydrazidgruppe reagiert mit dem Aldehyd unter Bildung einer stabilen Hydrazongruppe. Eine geeignete heterobifunktionelle Verbindung, die eine Oligo(ethylenoxy)ethylen-Gruppe beinhaltet, ist eine Verbindung umfassend eine Polyethylenglycol(poly(ethylenoxy))-Gruppe an einem Ende mit einer N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Gruppe und der funktionellen Gruppe am anderen Ende. Die NHS-Gruppe reagiert mit Amingruppen unter Bildung stabiler Amidverknüpfungen. Heterobifunktionelle Polyethylenglycole mit NHS an einem Ende und entweder Vinylsulfon oder Maleimid am anderen Ende sind erhältlich. Andere Beispiele von heterobifunktionellen Reagenzien beinhalten 3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid, N-Succinimidyl-3-[2-pyridyldithio]propionat, Succinimidyl-H-[N-maleimidmethyl]cyclohexan-1-carboxylat), m-Maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, N-Succinimidyl-[4-iodacetyl]aminobenzoat, N-[gamma-Maleimidbutyryl oxy]succinimidester, N-[epsilon-Maleimidcaproyloxy]succinimidester und N-Succinimidyliodacetat. Andere Reagenzien sind von Pierce Biotechnology and Shearwater Corporation (auf Basis von Polyethylenglycol) erhältlich.
  • Sialsäuren (auch als Nonulosonsäuren bekannt) sind Mitglieder einer Familie von Amino enthaltenden Zuckern enthaltend 9 oder mehr Kohlenstoffatome. Die wichtigste der Sialsäuren ist N-Acetylneuraminsäure (auch als 5-(Acetylamino)-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galactononulosonsäure, Lactaminsäure und O-Sialsäure bekannt), welche die folgende Formel aufweist:
    Figure 00060001
  • Polysialsäuren können 2→8 oder 2→9 verknüpft sein, gewöhnlich in der α-Konfiguration. In manchen Polysialsäuren sind die Verknüpfungen alternierend 2→8 und 2→9. Die Erfindung ist auch von Nutzen für heteropolymere Polysaccharide umfassend Glycosyleinheiten, die von Sialsäure-Einheiten verschieden sind.
  • Es wird im allgemeinen festgestellt, dass Polysialsäuren nicht toxisch und im wesentlichen nicht immunogen sind. Ferner sind die Einheiten des biologischen Abbaus, Sialsäure, nicht als toxisch bekannt und in der Tat werden Sialsäuren weit verbreitet in Tierproteinen und -zellen, einschließlich Blutzellen und zirkulierenden Proteinen, gefunden.
  • Polysaccharid-Verbindungen, die viele Sialsäure-Einheiten enthalten, sind Polysaccharide, die von Escherichia coli, Moraxella nonliquifaciens, Pasteurella aeroginosis und Neisseria meningitidis oder Derivaten davon gebildet werden. Beispielsweise umfasst Colominsäure, die (durch Hydrolyse zur Verkürzung der Kettenlängen) von E. coli KI abgeleitet ist, α-2→8-verknüpfte Sialsäure-Einheiten. Polysaccharid aus dem E. coli K92-Stamm umfasst alternierend 2→8- und 2→9- verknüpfte Sialsäure-Einheiten. Polysaccharid C von N. meningitidis-Gruppe C weist 2→9-verknüpfte Sialsäure-Einheiten auf.
  • Eine Gruppe von Polysaccharid-Verbindungen, von denen festgestellt wurde, dass sie von besonderem Nutzen in der Erfindung sind, sind Gruppe B Polysaccharide. Diese Verbindungen werden von N. meningitidis, M. nonliquifaciens, P. aeroginosis A2 und E. coli K1 produziert. Diese Verbindungen umfassen ein Polysaccharid-Komponente umfassend Sialsäure-Reste und eine Phospholipid-Komponente. Die Sialsäure-Reste sind (2→8)-α-verknüpft, das natürlich vorkommende Polymer besteht aus etwa 200 Resten. Es scheint, dass einige der Glycolipidmoleküle, insbesondere die hochmolekularen Verbindungen, ein kovalent gebundenes Phospholipid an dem reduzierenden Ende der Polysaccharid-Komponente aufweisen.
  • Es ist bevorzugt, dass die Bakterien, von denen die Polysaccharid-Verbindung abgeleitet ist, aus Gründen der Bequemlichkeit während der Produktion nicht pathogen ist. Es ist daher besonders zweckmäßig, dass das Polysaccharid von einem nicht pathogenen Stamm von E. coli, wie E. coli K92 oder bevorzugt K1, das nicht immunogen ist, abgeleitet ist. E. coli K92- und K1-Isolate sind wohlbekannt und jeder derartige Typ von solchen Stämmen kann als Quelle des geeignetes Polysaccharids verwendet werden. Die Polysialsäure sollte bevorzugt mindestens 2, bevorzugt mindestens 5, bevorzugter mindestens 10, z.B. mehr als 50 Sialsäure-Einheiten aufweisen.
  • Gemäß der Erfindung wird auch ein Konjugat von einem Protein und dem neuen aktivierten Polysaccharid bereitgestellt. Die neue Verbindung umfasst ein Protein mit mindestens einer Cystein-Einheit und, verknüpft über eine Thioetherbindung an die Seitenkette einer Cystein-Einheit, eine Polysialsäure über eine Gruppe, die mit einer oder beiden endständigen Einheiten der Polysialsäure verbunden ist.
  • Wenn das Polysialsäure-Derivat eine N-Maleimid-Gruppe war, beinhaltet die Gruppe eine N-Succinimidyl-Gruppe, wobei der Thioester am α-Kohlenstoffatom verknüpft ist. Die Gruppe umfasst bevorzugt auch ein sekundäres Amin, ein Hydrazon oder eine Amidbindung.
  • In der Erfindung wird auch ein neues Verfahren bereitgestellt, bei dem ein Polysaccharid mit mindestens zwei Sialsäure-Einheiten, die miteinander 2,8- oder 2,9-verknüpft sind und umfassend mindestens eine endständige Einheit, die von einer Sialsäure-Einheit, bevorzugt einer Polysialsäure, abgeleitet ist, mit einem heterobifunktionellen Reagenz mit einer ersten funktionellen Gruppe zur Reaktion mit Sulfhydrylgruppen und einer zweiten funktionellen Gruppe, die sich von der ersten Gruppe unterscheidet, umgesetzt wird, wodurch die zweite funktionelle Gruppe mit einer endständigen Einheit der Polysialsäure reagiert, um damit eine kovalente Bindung zu bilden und eine funktionelle Polysialsäure zu bilden, die in der Lage ist, mit einer Thiolgruppen-funktionellen Polysialsäure zu reagieren.
  • In einer Ausführungsform ist die zweite funktionelle Gruppe eine nukleophile Gruppe, bevorzugt Hydrazin. Dies ist von besonderem Nutzen, wenn die Polysialsäure eine Aldehydgruppe in der endständigen Einheit umfasst, deren Carbonylgruppe durch die nukleophile Gruppe angegriffen wird.
  • In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens ist die zweite funktionelle Gruppe elektrophil, wie ein N-Alkoxycarbonylimid, wie N-Hydroxysuccinimidester oder Sulfosuccinimidester, oder Carbodiimid. Die endständige Gruppe ist in solchen Fällen bevorzugt nukleophil, wie Amin.
  • In dem Verfahren ist es bevorzugt, dass das Reagenz eine bifunktionelle organische Gruppe umfasst, welche die erste und zweite funktionelle Gruppe verknüpft. Die bifunktionelle organische Gruppe wird bevorzugt ausgewählt aus einer C2-18-Alkandiylgruppe, einer Arylengruppe, einer Oligopeptid- und einer Oligo(alkoxy)alkyl-Gruppe.
  • Beispiele für geeignete Reagenzien sind oben angegeben.
  • Es ist am zweckmäßigsten, dass das Verfahren einen anschließenden Schritt beinhaltet, in dem die funktionelle Polysialsäure mit einem Polypeptid oder einem Protein mit mindestens einer freien und ungeschützten Cys-Einheit umgesetzt wird, wodurch die funktionelle Gruppe eine Thioetherverknüpfung mit der Thiolgruppe einer Cys-Einheit bildet, um polysialyliertes Polypeptid oder Protein zu bilden. Das Verfahren ist besonders geeignet, wenn das Protein eine einzelne Cys-Einheit enthält, wodurch eine Stellen-regulierte Derivatisierung erreicht wird.
  • Die Erfindung wird in den beigefügten Beispielen erläutert. BEISPIEL 1
    Figure 00090001
  • 1.1 Synthese
  • Es wurden folgende drei separate Herstellungen durchgeführt:
  • Colominsäurealdehyd (CAD), das gemäß WO-A-9222331 hergestellt wurde (100 mg, 4,4 × 10–6 mol), wurde in 500 μl 0,1 M Natriumacetat gelöst, dazu wurden 5 Moläquivalente von N-[β-Maleimidpropionsäure]hydrazid (6,5 mg, 2,2 × 10–6 mol) hinzugegeben. Diese Mischung wurde dann wirbelvermischt und mit Folie umwickelt und 2 h bei 37°C auf einem Kreiselmischer inkubiert. Das Polymer wurde dann durch Zugabe von 2 Volumen (1,0 ml) Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren (13.000 U/min, 2 min) in einer Tischmikrozentrifuge gesammelt. Die überstehende Lösung wurde verworfen und das Pellet in 500 μl 0,1 M Acetat gelöst. Dieses Verfahren wurde weitere zweimal wiederholt und das schließliche Pellet in entionisiertem Wasser gelöst und über Nacht gefriergetrocknet.
  • 1.2 Untersuchung auf Maleimidgehalt
  • In dieser Untersuchung wird Cystein mit dem Maleimid am Polymer umgesetzt, wobei weitere Reaktionen mit Ellmans-Reagenz (5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)) verhindert wird, die ein Disulfid enthält, das eine intensive gelbe Farbe bildet, wenn es für ein Thiol substituiert wird, das nicht zu einem aromatischen Ring benachbart ist. Somit kann der Maleimidgehalt durch Messen der Inhibierung der Reaktion zwischen Cystein und dem Ellmans-Reagenz-Assay berechnet werden.
  • Zuerst wurde ein anfänglicher Ansatz von Cystein mit 12 × 10–3 M (0,145 mg/ml) in PBS hergestellt. In einer sauberen Mikrotiterplatte wurden verdoppelnde Verdünnungen mit einem Volumen von 100 μl von 12 × 10–3 M bis 0,375 × 10–3 M von Reihe B bis Reihe H durchgeführt. In Reihe A wurden 100 μl PBS als Null-Standard verwendet. Proben von CA und CA-Maleimid (CAM) wurden mit 5 oder 10 mg/ml und 100 μl jeder Probe zu Doppelspalten der Cysteinverdünnungen gegeben. In einem Satz wurden 100 μl PBS ohne CA als Kontrolle hinzugegeben. Die Platte wurde bedeckt und 1 h bei 37°C inkubiert. Danach wurden 20 μl Ellmans-Reagenz (4 mg/ml in PBS) zu jeder Mulde gegeben und die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert. Die Extinktion bei 405 nm wurde in den Mulden gemessen. Es wurden dann Standardkurven für die Proben aufgezeichnet und die Menge an vorhandenem Maleimid aus der Inihibierung des Signals berechnet.
  • 1.3 Thiolierung von FAb und Konjugation an CAM
  • Im ersten Schritt wird eine Thiolgruppe in ein Modellprotein durch Thiolierung eines Amins von Lysin eingeführt.
  • Schaf-FAb (anti-Desipramin/Norityrptalin, 4 mg, 7,2 × 10–8 mol) wurde in 0,25 ml PBS + 10 mM EDTA gelöst, dazu wurden 0,498 mg 2-Iminothiolan (2-IT, Trauts-Reagenz, 50 Moläquivalent, 3,6 × 10–6 mol) in 0,25 ml des gleichen Puffers gegeben. Das Rohr wurde in Folie gewickelt und aufrechtstehend 1 h bei 37°C aufrecht stehend unter Rühren inkubiert.
    Figure 00110001
  • Thioliertes FAb wurde von freiem 2-IT Trauts-Reagenz durch Gelfiltration (PD-10) gereinigt und 0,5 ml Fraktionen auf Anwesenheit von Protein (BCA-Assay) oder Thiol (Ellmans Assay) untersucht. Der erste Elutionspeak, der beide enthält, wurde gesammelt und Protein und Thiole wurden quantifiziert.
  • 1.5 Konjugation von FAb-Thiol an CAM
  • Zu thioliertem FAb (3,6 mg, 6,6 × 10–8 mol) in 2 ml PBS/EDTA wurden 22,5 mg CAM (9 × 10–7 mol, 15 Moläquivalente) zugegeben. Das Rohr wurde verschlossen und unter sanftem Mischen 1 h bei 37°C inkubiert. Das sich ergebende Konjugat wurde dann gemäß den akzeptierten Protokollen zur Entfernung von freiem CAM gereinigt. Sowohl der CA- als auch der Proteingehalt wurden am Konjugat untersucht, um das Konjugationsverhältnis zu berechnen.
  • Kontrollreaktionen wurden mit CA als negativer Kontrolle durchgeführt.
  • Verschiedene Chargen von CAM-FAb wurden mit verschiedenen Thiolierungsgraden hergestellt, wobei das Verhältnis von CAM : FAb von 15:1 aber beibehalten wurde. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1
    Thiol pro FAb Konjugatverhältnis (CA: Fab)
    1 0,53:1
    2 0,9:1
    5 (dreifache Reaktion) 1,925: 1 ± 0,19: 1 FAb
    10 3,51:1
  • 1 zeigt ein SDS-PAGE-Gel von dreifachen Proben und relevanten Kontrollen.
  • 1.6 Schlussfolgerung
  • Die Ergebnisse zeigen, dass in allen Kontrollmulden (Proben von thioliertem FAb) die Wanderung der Probe ähnlich zu der von frischem FAb (unter der des 50 kDa Markers) ist, was auf keine Vernetzung von FAb-Molekülen während des Prozesses der Konjugation hinweist. In den Wiederholungsbahnen gibt es eine merkliche Bandverbreiterung mit einer maximalen Intensität zwischen den 98 und 250 kDa Markern, was typischerweise auf einen Massenanstieg hinweist, was auf ein polysialyliertes Produkt hinweist.
  • 1.7 Konjugation von CAM an beta-Galactosidase
  • Zu β-Galactosidase von E. coli ((β-gal), 5,0 mg, 4,3 × 10–8 mol) in 1 ml PBS wurden 15 mg CAM hinzugegeben (6,59 × 10 mol, 15 Moläquivalente). Das Rohr wurde verschlossen, mit Folie umwickelt und bei leichter Mischung 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das sich ergebende Konjugat wurde durch SDS-PAGE analysiert und dann gemäß den akzeptierten Protokollen zur Entfernung von freiem CAM gereinigt. Die Proben wurden wie anderswo angegeben auf den Polymer- und Proteingehalt untersucht.
  • Kontrollreaktionen wurden mit CA als negativer Kontrolle durchgeführt.
  • 1.8 Untersuchung auf Enzymaktivität
  • Standards von 60 μg/ml bis 3,75 μg/ml frischer β-Galactosidase wurden in PBS hergestellt. Proben von CAM-β-gal wurden auf 60 μg/ml im gleichen Puffer verdünnt. Die Enzymaktivität der Konjugate wurde folgendermaßen gemessen.
  • Auf einer Mikrotiterplatte wurden zu 100 μl Probe oder Standard 100 μl Allin-One-β-gal-Substrat (Pierce) hinzugegeben. Die Platte wurde 30 min bei 37°C inkubiert und die Extinktion bei 405 nm abgelesen. Eine Eichkurve wurde aus den Standards hergestellt und die Aktivität der Proben aus der Gleichung für die lineare Regression der Kurve berechnet.
  • 1.9 Ergebnisse
  • Aus den Protein- und Polymeruntersuchungen wurde das Konjugationsverhältnis mit 1,23 CAM : 1 β-Gal bestimmt. Es gab auch einen entsprechenden Anstieg in der scheinbaren Molekülmasse gemäß SDS-PAGE der Proben (2). Die Enzymaktivität in der gereinigten Probe wurde mit 100,4% im Vergleich zum freien Enzym berechnet.
  • BEISPIEL 2
  • Syntheseroute 2
  • Schritt 1 Aminierung von CA-aldehyd (CHO)
    Figure 00130001
    Schritt 2 Einführung von Maleimidring
    Figure 00130002
  • Synthese
  • 2.1. Schritt 1 Aminierung von oxidierter CA
  • Oxidierte Colominsäure (CAO) mit 10 bis 100 mg/ml wurde in 2 ml entionisiertem Wasser mit einem 300-fachen molaren Überschuss von NH4Cl in einem 50 ml Rohr gelöst und dann wurde NaCNBH3 (5 M Ansatz in 1 N NaOH (wässrig)) mit einer Endkonzentration von 5 mg/ml hinzugegeben. Die Mischung wurde 5 Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde auch eine Kontrollreaktion mit Colominsäure (A) anstelle von CAO aufgestellt. Das Colominsäureamin-Derivatprodukt wurde durch Zugabe von 5 ml eiskaltem Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren bei 4.000 U/min, 30 min, Raumtemperatur in einer Tischzentrifuge gewonnen. Das Pellet wurde beibehalten und erneut in 2 ml entionisiertem Wasser suspendiert, dann wiederum mit 5 ml eiskaltem Ethanol in einem 10 ml Ultrazentrifugenrohr ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren bei 30.000 U/min über 30 min bei Raumtemperatur gesammelt. Das Pellet wurde erneut suspendiert in 2 ml entionisiertem Wasser und gefriergetrocknet.
  • 2.2. Untersuchung auf den Amingehalt
  • Der TNBS (Picrylsulfonsäure oder 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure)-Assay wurde verwendet, um die Menge von Aminogruppen zu bestimmen, die im Produkt vorhanden waren.
  • In der Mulde einer Mikrotiterplatte wurde TNBS (0,5 μl von 15 mM TNBS) zu 90 μl eines 0,1 M Boratpuffers von pH 9,5 gegeben. Dazu wurden 10 μl einer 50 mg/ml-Lösung von CA-Amid gegeben, man ließ die Platte 20 min bei Raumtemperatur stehen, bevor die Extinktion bei 405 nm abgelesen wurde. Glycin wurde als Standard mit einem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1 mmol verwendet, TNBS primäre Trinitrophenylat-Amingruppen. Das TNP-Addukt des Amins wird nachgewiesen.
  • Die Prüfung des Produkts, das mit einer zweifachen Fällung mit kaltem Ethanol gereinigt wurde, unter Verwendung des TNBS-Assays zeigte eine Umwandlung nahe an 90%.
  • 2.3. Maleimidierung von CA-Amin
  • CA-Amin (17 mg) wurde in 1 ml entionisiertem Wasser gelöst, dazu wurden 6 mg Methoxycarbonylmaleimid (MCM) hinzugegeben. Man ließ die Mischung bei Raumtemperatur über 30 min reagieren. Zu der Probe 1 wurden 100 μl Wasser und 200 μl Acetonitril hinzugegeben und dann wurde 4 h bei Raumtemperatur inkubiert, wonach 300 μl CHCl3 zugegeben wurden, das Rohr geschüttelt und die wässrige Fraktion gesammelt wurde. Dann wurde die Fraktion über einer Säule PD-10 gereinigt, um kleine Moleküle zu entfernen. Das Eluat wurde gefriergetrocknet und auf den Maleimidgehalt untersucht. Die molare Konzentration von Maleimid war 44 Mol-%.
  • BEISPIEL 3: Herstellung von Jodacetat-Derivat von Colominsäure (CAI)
  • Figure 00150001
  • 3.1 Synthese
  • Zu 40 mg Colominsäureamin (85 Mol-% Amin) (beschrieben in Beispiel 2.1) gelöst in 1 ml PBS, pH 7,4, wurden 5 mg N-Succinimidyliodacetat (SIA) gegeben. Man ließ die Mischung 1 h bei 37°C reagieren, wonach überschüssiges SIA durch Gelfiltration über eine 5 ml Entsalzungsäule Hightrap® (AP Bioscience) unter Flution mit PBS entfernt wurde. 0,5 ml Fraktionen wurden von der Säule gesammelt und Proben von jeder Fraktion auf den Colominsäuregehalt (Resorcin-Assay) und die Reaktivität mit auf Cystein hinweisendem Iodid (Ellmans-Assay) geprüft. Fraktionen, die sowohl für Iodid als auch für CA positiv waren, wurden gesammelt.
  • 3.2 Konjugation von CAI an β-Galactosidase
  • Zu β-Galactosidase von E. coli (5,0 mg, 4,3 × 10–8 mol) in 1 ml PBS wurden 15 mg CAI zugegeben (6,59 × 10–7 mol, 15 Moläquivalent). Das Rohr wurde verschlossen, in Folie gewickelt und es wurde bei Raumtemperatur für 1 h unter sanftem Mischen inkubiert. Das sich ergebende Konjugat wurde mit SDS-PAGE analysiert und dann gemäß den akzeptierten Protokollen zur Entfernung von freiem CAI gereinigt. Die Proben wurden wie anderswo ausgeführt auf den Polymer- und Proteingehalt untersucht.
  • Kontrollreaktionen wurden mit CA als negativer Kontrolle durchgeführt. Alle Proben wurden auf β-gal-Aktivität wie im obigen Beispiel 1.8 analysiert.
  • 3.3 Schlussfolgerungen
  • Die Fraktionen 3 bis 6 waren sowohl für Polymer und Iodacetat positiv und wurden gesammelt. SDS-PAGE (4 bis 12% Bis/Tris-Gel; 2) zeigte einen Anstieg in der scheinbaren Molekülmasse für Proben, die mit dem Iodacetamid-Derivat inkubiert waren, aber nicht bei dem Kontrollpolymer. Aus den Protein- und Polymeruntersuchungen wurde das Konjugationsverhältnis mit 1,63 für CAI:1 β-gal bestimmt. Die β-gal-Aktivität wurde mit 100,9% für die konjugierte Probe im Vergleich zum freien Enzym berechnet.
  • BEISPIEL 4
  • 4.1 Synthese: Aktivierung des nicht reduzierenden Endes mit 4-(4-N-Maleimidphenyl)-buttersäurehydrazid (CA-MBPH) und 3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid (CA-PDPH)
  • Es erfolgten folgende Herstellungen:
  • Colominsäurealdehyd (CAO; 22,7 kDa, Camida, Irland), hergestellt gemäß WO-A-9222331 (73 mg für MBPH, Rohr A; 99,3 mg für PDPH; Rohr B), wurde einzeln in 800 ml 0,1 M Natriumacetat (pH 5,5) gelöst. Zu Rohr A wurden 15 mg MBPH (Verhältnis Verknüpfungsmittel:CA von 15:1) gelöst in 200 μl DMSO hinzugegeben. Zu Rohr B wurden 15 mg (Verhältnis Verknüpfungsmittel: CA von 15:1) von PDPH gelöst in 200 μl DMSO hinzugegeben. Der pH wurde in jedem Fall für jeden Reaktionsbehälter auf 5,5 eingestellt. Diese Mischungen wurden dann wirbelvermischt und in Folie eingewickelt und man ließ 2 h bei 37°C auf einem Orbitalmischer inkubieren. Jede Polymerlösung wurde durch Gelfiltration (Säule PD 10) unter Flution mit PBS, pH 7,4, gereinigt und die 1 ml Fraktion enthaltend CA (über Resorcin-Assay) wurde gesammelt. Diese Probe wurde über Nacht gefriergetrocknet und auf den Maleimidgehalt wie in Beispiel 1.2. beschrieben untersucht.
  • 4.2 Synthese: Aktivierung des reduzierenden Endes mit 4-(4-N-Maleimidphenyl)buttersäurehydrazid (MBPH-CA), (2-Pyridyldithio)propionylhydrazid (PDPH-CA) und N-β-Maleimidpropionsäurehydrazid)hydrazid (BMPH-CA)
  • Die Herstellungen wurden folgendermaßen alle bei Molverhältnissen von Verknüpfungsmittel zu CA von 25:1 durchgeführt:
  • Colominsäure (CA; 22,7 kDa; 73 mg für MBPH, Rohr A: 99,3 mg für PDPH; Rohr B und 76,6 mg für BMPH; Rohr C) wurde einzeln in 800 μl 0,1 M Natriumacetat (pH 5,5) gesondert gelöst. Zu Rohr A wurden 25 mg MBPH (gelöst in 200 μl DMSO), zu Rohr B 25 mg PDPH (gelöst in 200 μl DMSO) und zu Fläschchen C 25 mg BMPH (gelöst in 200 μl Natriumacetat-Puffer) hinzugegeben. Der pH der Reaktionsmischung wurde auf 5,5 eingestellt. Jede Mischung wurde dann wirbelvermischt, in Folie gewickelt und auf einem Orbitalmischer 72 h bei 37°C inkubiert. Jede Polymerlösung wurde durch Gelfiltration (Säule PD 10) unter Flution mit PBS, pH 7,4, gereinigt und die 1 ml Fraktion enthaltend CA (durch Resorcin-Assay) wurde gesammelt. Diese Probe wurde über Nacht gefriergetrocknet und auf den Maleimidgehalt wie in Beispiel 1.2 beschrieben untersucht.
  • 4.3 Ergebnisse
  • Die molare Konzentration von Maleimid war 49,0 und 35,0 Mol-% für MBPH bzw. PDPH an dem nicht reduzierenden (hochreaktiven) Ende. Die molare Konzentration von Maleimid betrug 41,5, 32,5 und 48,3 Mol-% für MBPH, PDPH bzw. BMPH an dem reduzierenden Ende (schwach reaktiv). Die Werte am reduzierenden Ende waren das Mittel von zwei Werten in jedem Fall.
  • 4.4 Konjugation von β-Galactosidase (β-gal) an mit Maleimid aktivierten Colominsäuren (reduzierendes Ende und nicht reduzierendes Ende)
  • Zu β-gal in gesonderten Rohren wurde ein 15-molarer Überschuss jeweils von mit Maleimid aktiviertem CA (MBPH, PDPH und BMPH an dem nicht reduzierenden oder reduzierenden Ende aus den obigen Beispielen) gesondert hinzugegeben. Jedes Rohr wurde verschlossen und 1 h bei 37°C unter sanftem Mischen inkubiert. Das sich ergebende Konjugat wurde dann gemäß den akzeptierten Protokollen zur Entfernung von freiem aktiviertem Polymer gereinigt. Alle Proben wurden durch SDS-PAGE und bezüglich der β-gal-Aktivität wie in Beispiel 1.8 analysiert.
  • 4.5 Ergebnisse
  • Die Ergebnisse (3) zeigen, dass in allen Kontrollmulden (mit β-gal) die Wanderung der Probe ähnlich ist wie die für frisches β-gal. In den Konjugatbahnen gab es eine beträchtliche Bandverbreiterung mit einer maximalen Intensität zwischen den 98 und 250 kDa Markern, was typischerweise auf einen Anstieg in der Masse hinweist, was für ein polysialyliertes β-gal hinweist. Die β-gal-Aktivität wurde mit 91,0 bis 106% für die konjugierten Proben berechnet.

Claims (29)

  1. Verbindung umfassend ein Polysaccharid mit mindestens zwei Sialsäure-Einheiten, die miteinander 2,8- und/oder 2,9-verknüpft sind, und mit einer Seitengruppe, die mit mindestens einer von einer Sialsäure-Einheit abgeleiteten endständigen Einheit verknüpft ist und eine funktionelle Gruppe ausgewählt aus N-Maleimid-Gruppen, Vinylsulfon-Gruppen, N-Iodacetamid-Gruppen und Orthopyridyldisulfid-Gruppen beinhaltet.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, bei der die Seitengruppe mit der reduzierenden endständigen Einheit des Polysaccharids verknüpft ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der die Gruppe mit der nicht reduzierenden endständigen Einheit des Polysaccharids verknüpft ist.
  4. Verbindung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei der die Gruppe eine Alkandiylgruppe und/oder eine Arylengruppe und eine Verknüpfung, gegebenenfalls in Kombination mit einer Oxalkylen- oder Oligooxalkylen-Gruppe, die eine sekundäre Amin-Verknüpfung, ein Hydrazon, eine Alkylhydrazid-Verknüpfung oder eine Peptidverknüpfung ist, umfasst.
  5. Verbindung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei der die funktionelle Gruppe N-Maleimid ist.
  6. Verbindung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei der das Polysaccharid eine Polysialsäure ist.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, bei der das Polysaccharid im wesentlichen nur aus Sialsäure-Einheiten besteht.
  8. Verbindung nach Anspruch 1, die die Formel
    Figure 00200001
    aufweist, worin eine der folgenden Definitionsgruppen gilt: i) R1 ist H oder -CHOHCH2OH, R2 ist OH und R3 ist -CH2CHR4R5 oder -CH(CH2OH)CHR4R5, worin R4 und R5 zusammen =N-NR6 darstellen oder R4 H ist und R5 -NR6R7 ist, worin R6 eine organische Gruppe umfassend die funktionelle Gruppe ausgewählt aus N-Maleimid, Vinylsulfon, N-Iodacetamid und Orthodipyridyl oder H ist und R7 H ist oder R6 und R7 zusammen eine 1,3-But-2-endioyl-Gruppe sind; ii) R1 und R2 stellen zusammen =N-NR6 dar oder R1 ist H und R2 ist -NR6R7, worin R6 eine organische Gruppe umfassend die genannte funktionelle Gruppe ist und R7 H ist oder R6 und R7 zusammen eine 1,3-But-2-endioyl-Gruppe sind; Gly-O eine Glycosyl (Saccharid)-Gruppe ist; n 0 oder größer ist; und Ac Acetyl ist.
  9. Verbindung nach Anspruch 8, bei der jedes Gly eine Sialsäure-Einheit ist.
  10. Verbindung umfassend ein Protein mit mindestens einer freien Cystein-Einheit und, verknüpft über eine Thioesterbindung an der Seitenkette der Cystein-Einheit mit einer Polysialsäure über eine Einheit, die an einer oder jeder endständigen Einheit der Polysialsäure verbunden ist, wobei die Polysialsäure mindestens zwei Sialsäure-Einheiten aufweist, die miteinander 2,8- und/oder 2,9-verknüpft sind.
  11. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, bei der das Polysaccharid, oder entsprechend Anspruch 10, bei der die Polysialsäure mindestens 10 Sialsäure-Einheiten aufweisen.
  12. Verbindung nach Anspruch 10 oder 11, bei der je nach Fall die Polysialsäure oder das Polysaccharid mindestens 50 Sialsäure-Einheiten aufweisen.
  13. Verfahren, bei dem ein Polysaccharid mit mindestens zwei Sialsäure-Einheiten, die miteinander 2,8- und/oder 2,9-verknüpft sind, und umfassend mindestens eine endständige Einheit, die von einer Sialsäure-Einheit abgeleitet ist, mit einem heterobifunktionellen Reagenz mit einer ersten funktionellen Gruppe ausgewählt aus N-Maleimid-Gruppen, Vinylsulfon-Gruppen, N-Iodacetamid-Gruppen und Orthopyridyldisulfid-Gruppen und einer zweiten funktionellen Gruppe, die sich von der ersten Gruppe unterscheidet, umgesetzt wird, wodurch die zweite funktionelle Gruppe mit der endständigen Sialsäure-Derivateinheit reagiert, um eine kovalente Bindung damit zu bilden und ein funktionelles Polysaccharid zu bilden, das sich für die selektive Konjugation an eine Thiolgruppe eignet.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die zweite funktionelle Gruppe eine nucleophile Gruppe ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die nucleophile Gruppe ein Hydrazin ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die endständige Einheit des Polysaccharids eine Carbonylgruppe aufweist, die mit der nucleophilen Gruppe reagiert.
  17. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die zweite funktionelle Gruppe eine elektrophile Gruppe ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die elektrophile Gruppe eine N-Alkoxycarbonylimid- oder Carbodiimid-Gruppe ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, bei dem die endständige Einheit des Polysaccharids eine Aminogruppe aufweist, die mit der elektrophilen Gruppe reagiert.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem eine Peptid- oder Urethanverknüpfung gebildet wird.
  21. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 20, bei dem das Reagenz eine bifunktionelle organische Gruppe umfasst, die die erste und zweite funktionelle Gruppe verknüpft.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die bifunktionelle organische Gruppe ausgewählt ist aus einer C2-18-Alkandiylgruppe, einer Arylengruppe, einem Oligopeptid und einer Oligo(alkoxy)alkylgruppe.
  23. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 22, bei dem die erste funktionelle Gruppe eine N-Maleimidgruppe ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Reagenz die allgemeine Formel X-R-Y aufweist, worin: X eine N-Maleimid-, N-Iodacetamid-, S-Vinylsulfon- oder S-Orthopyridyldisulfid-Gruppe ist, R eine Alkandiyl-, Arylen- oder Aralkylen-, Alkarylen-, Alkylenoxalkylen- oder Alkylenoligooxaalkylen- oder Alkyloligopeptidylalkyl-Gruppe ist und Y eine Hydrazid-, Amin- oder N-Hydroxysuccinimid-Gruppe ist.
  25. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 24, bei dem das Polysaccharid mindestens 10 Sialsäure-Einheiten aufweist.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem das Polysaccharid mindestens 50 Sialsäure-Einheiten aufweist.
  27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, bei dem die Sialsäure-Einheiten miteinander 2,8- und/oder 2,9-verknüpft sind.
  28. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 27, bei dem die funktionelle Polysialsäure eine Maleimido-funktionelle Polysialsäure ist und umgesetzt wird mit einem Polypeptid oder einem Protein mit mindestens einer freien ungeschützten Cys-Einheit, wodurch die Maleimidgruppe eine Thioether-Verknüpfung mit der Thiolgruppe einer Cys-Einheit bildet, um ein polysialysiertes Polypeptid oder Protein zu bilden.
  29. Verfahren, bei dem eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 mit einem Polypeptid oder einem Protein mit mindestens einer freien und ungeschützten Cys-Einheit umgesetzt wird, wodurch die funktionelle Gruppe eine Thioether-Verknüpfung mit der Thiolgruppe einer Cys-Einheit bildet, um ein Konjugat des Polysaccharids mit dem Polypeptid oder Protein zu bilden.
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