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Die
vorliegende Erfindung betrifft Polysialsäure-Derivate, die zur Konjugation
an Arzneimittel, Proteine und Peptide oder für Arzneimittelzufuhrsysteme,
wie Liposomen mit Sulfhydrylgruppen geeignet sind, und auch konjugierte
Produktverfahren zur Synthese der Derivate und der Konjugate und
neue synthetische Zwischenprodukte.
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Die
verlängerte
Anwesenheit von Arzneimitteln im Gefäßsystem oder bei der extravaskulären Verwendung
ist häufig
eine Voraussetzung für
ihren optimalen Einsatz. Zum Beispiel werden viele Antibiotika und
Zytostatika ebenso wie eine Vielzahl von therapeutischen Peptiden
und Proteinen und Liposomen vorzeitig und bevor wirksame Konzentrationen
in Zielgeweben erreicht werden können
aus dem Kreislauf entfernt. Die Halbwertszeiten einer Reihe von
kurzlebigen Proteinen (z.B. Enzymen, Zytokinen usw.) sind erhöht worden,
indem sie an niedrigmolekulares Poly(ethylenglycol) konjugiert wurden.
Es scheint, dass PEG-Moleküle
die Kreislaufzeit von Proteinen und Teilchen durch Bilden einer
Wolke um ihre Oberfläche
und somit sterisches Verhindern einer Wechselwirkung mit Faktoren,
die für
ihre Clearance verantwortlich sind, verlängern. PEG ist aber nicht biologisch
abbaubar und die intrazelluläre
Anreicherung von PEG-ylierten Proteinen kann insbesondere bei chronischer
Verwendung unerwünscht
sein [Bendele, A., Seely, J. Richey, C., Sennello, G., Shopp, G.,
Renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol
conjugated Proteins, Toxicological sciences, 42 (1998) 152–157; Convers,
C.D., Lejeune, L., Shum, K., Gilbert, C., Shorr, R.G.L., Physiological
effect of polyethylene glycol conjugation an stroma-free bovine
hemoglobin in the conscious dog after partial exchange transfusion,
Artificial Organ, 21 (1997) 369–378].
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Wir
haben die Konjugation eines Polysaccharids umfassend 2→8- und/oder
2→9-(z.B.
alternierend 2→8-
und 2→9-)verknüpften Sialsäure-Einheiten
konjugiert an Proteine zur Erhöhung
ihrer Halbwertszeit, zur Verringerung ihrer Immunogenität/Antigenität oder zur
Erhöhung
der Stabilität
einer Vielzahl von Proteinen beschrieben. In
WO 92/22331 werden Polysialsäuren mit
einem Modell-Arzneimittel
umgesetzt und wird die Verlängerung
der Halbwertszeit in dem Kreislauf von Mäusen nachgewiesen. in Cell.
Mol. Life Sci. 57 (2000) 1964 bis 1969 und in Biotechnol. Genet.
Eng. Rev. 16 (1999) 203 bis 215 beschreiben Gregoriadis et al. die
Konjugation von Polysialsäuren
an Asparaginase und Katalase und zeigen, dass die Clearance-Raten
aus dem Kreislauf verringert waren, wobei die Enzymaktivität beibehalten
wurde. Wir haben auch Insulin polysialyliert (Biochim. Biophys.
Acta 1622 (2003) 42–49)
und gezeigt, dass es aktiv ist. Wir haben auch Interferon polysialyliert
(AAPS Annual Meeting 2002, Toronto, Kanada, M1056). Wir haben auch
Antikörper-Fragment
Fab polysialyliert (Epenetos, A. et al., Proceedings of ASCO (Clinical
Pharmacy) 21 (2002) 2186).
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In
allen diesen Veröffentlichungen
wird Polysialsäure
reaktionsfähig
gemacht, indem eine Aldehydgruppe am nicht reduzierenden Ende durch
Oxidation der 7,8-Vicinaldiol-Gruppe mit Natriumperiodat erzeugt wird.
Die Aldehydgruppe wurde dann mit primären Amingruppen an Proteinen
umgesetzt, wobei allgemein angenommen wurde, dass es sich um epsilon-Aminogruppen
von Lysineinheiten des Proteins oder N-endständige Amingruppen handelte.
Die Reaktion bildet eine Schiff-Base, die durch Cyanoborhydrid zu
einem sekundären
Amin reduziert wird.
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In
WO-A-01/87922 schlagen
wir auch vor, dass die Derivatisierung mit anderen Molekülen in Anwesenheit
eines Denaturierungsmittels durchgeführt werden könnte, um
erhöhte
Derivatisierungsgrade zu erreichen. Beispiele für andere Derivatisierungsmittel
sind Polyethylenglycol-Verbindungen. Aktivierte PEG-Verbindungen
wie Tresyl-PEG und Succinimidylsuccinatester von PEG wurden genannt.
In den Beispielen wurden mit Succinimidylsuccinat aktiviertes PEG
eingesetzt, von dem angenommen wird, dass es mit Amingruppen reagiert.
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PEG-Derivate
mit funktionellen Gruppen zur Kupplung an Thiolgruppen sind im Handel
erhältlich.
Bei den funktionellen Gruppen kann es sich um Maleimid-, Vinylsulfon-,
Iodacetamid- oder Orthopyridyldisulfid-Gruppen handeln. Da diese
Reagenzien spezifisch mit Cysteinen reagieren und da Proteine weniger
Cysteine auf ihren Oberflächen
als Lysingruppen aufweisen, ist die Derivatisierung regulierbarer.
In Abwesenheit eines freien Cysteins in einem natürlichen
Protein können
außerdem
ein oder mehrere freie Cysteine durch Genmanipulation addiert werden.
Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass eine ortsspezifische Derivatisierung
in Bereichen auf dem Protein ermöglicht
wird, was den Verlust an biologischer Aktivität minimiert.
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Es
ist festgestellt worden, dass PEG-ylierte Proteine Anti-PEG-Antikörper erzeugen,
-welche die Verweilzeit des Konjugats im Blutkreislauf auch beeinflussen
könnten
(Cheng, T., Wu, M., Wu, P., Chern, J., Roffer, SR., Accelerated
clearance of polyethylene glycol modified Proteins by anti-polyethylene
glycol IgM. Bioconjugate chemistry, 10 (1999) 520–528). Trotz
der etablierten Tradition von PEG als parenteral verabreichtes,
an Therapeutika konjugiertes Polymer ist ein besseres Verständnis seiner
Immunotoxizität,
Pharmakologie und seines Metabolismus erforderlich (Hunter, A.C.;
Moghimi, S.M., Therapeutic synthetic polymers: a game of Russian
Roulette. Drug Discovery Today, 7 (2002) 998–1001; Brocchini, S., Polymers
in medicine: a game of chess. Drug Discovery Today, 8, (2003) 111–112).
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Eine
Modifizierung durch Polysialsäure
zur Abzielung auf Thiol (Sulfhydryl)-Gruppen wäre zweckmäßig. Es wäre auch wünschenswert, die Wirksamkeit
der Derivatisierung durch Sialsäure
zu erhöhen,
wobei die in unserem vorstehend genannten Stand der Technik beschriebenen
Verfahren hohe Überschüsse an aktiver Polysialsäure erfordern.
Es wäre
auch zweckmäßig, den
Einsatz von Cyanoborhydrid zu vermeiden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine neue Verbindung bereitgestellt, die umfasst
ein Polysaccharid mit mindestens zwei Sialsäure-Einheiten, die miteinander
2,8- oder 2,9-verknüpft
sind, und mit einer Gruppe, die mit einer oder jeder von einer Sialsäure-Einheit
abgeleiteten endständigen
Einheit verknüpft
ist, die eine funktionelle Gruppe ausgewählt aus N-Maleimid-Gruppen,
Vinylsulfon-Gruppen,
N-Iodacetamid-Gruppen und Orthopyridyldisulfid-Gruppen beinhaltet.
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Die
endständige
Einheit, an welche die Gruppe verknüpft ist, kann an dem nicht
reduzierenden Ende der Polysialsäure
oder am reduzierenden Ende der Polysialsäure sein. Allgemein ist die
endständige
Sialsäure-Einheit
einer vorhergehenden chemischen Reaktion unterworfen worden, um
nützliche
funktionelle Gruppen zu erzeugen, an die ein Maleimid-Gruppen enthaltendes
Reagenz verknüpft
werden kann. Wir haben festgestellt, dass es zweckmäßig ist,
die in unseren früheren
Veröffentlichungen
offenbarte Chemie zu verwenden, in der als vorausgehender Schritt
eine Aldehydgruppe erzeugt wird, um die funktionelle Gruppe zu bilden, über welche
die Maleimidgruppe verknüpft
werden kann.
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In
unseren früheren
vorstehend genannten Veröffentlichungen
ist es die nicht reduzierende endständige Einheit, die durch Oxidation
der 7,8-vicinal-Diol-Gruppe
mit Natriumperiodat unter Bildung der Kohlenstoff 7-Aldehyd-Verbindung
in eine Aldehydgruppe umgewandelt wird. Dies ist eine zweckmäßige Reaktion
für die vorliegende
Erfindung.
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Als
eine Alternative ist es möglich,
die Aldehydgruppe an der reduzierenden endständigen Einheit bereitzustellen.
In diesem Fall ist es bevorzugt (aber nicht wesentlich), einen vorausgehenden
Schritt durchzuführen,
bei dem das nicht reduzierende Ende durch vorausgehende Oxidations-
und Reduktionsschritte deaktiviert wird. Ein erster Reduktionsschritt
wandelt die Ketaleinheit am reduzierenden Ende in eine reduzierte ringgeöffnete Form
mit vicinalen Diolen um. Die vicinalen Diole werden anschließend mit
Natriumperiodat oxidiert, um eine Aldehydgruppe am Kohlenstoffatom
zu bilden, das vorher den 7-Kohlenstoff der reduzierenden endständigen Einheit
bildete. Wenn das nicht reduzierende endständige Glycosyl (gewöhnlich Sialsäure) nicht durch
einen vorausgehenden Oxidationsschritt deaktiviert wird, wird die
endständige
Einheit gleichzeitig aktiviert.
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In
der Erfindung kann die Gruppe, welche die funktionelle Gruppe beinhaltet,
direkt an der Polysialsäure-Einheit
verknüpft
sein oder sie kann zweckmäßiger über eine
difunktionelle organische Gruppe, wie eine Alkandiylgruppe, eine
Arylengruppe oder eine Oligo(alkylenoxy)alkan-Gruppe oder alternativ
eine Oligopeptidyl-Gruppe, verknüpft
sein. Die Verknüpfung
an die Polysialsäure
(von der Verknüpfungsgruppe
oder der Gruppe mit der funktionellen Gruppe) kann ein sekundäres Amin,
ein Hydrazon, ein Alkylhydrazin, ein Ester oder eine Peptidylgruppe
sein. Die Gruppe kann durch Reaktion eines Polysialsäure-Substrats
mit einem heterobifunktionellen Reagenz erzeugt werden. Das Verfahren
bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung.
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Reagenzien,
die zur Einführung
der ausgewählten
funktionellen Gruppen geeignet sind, sind im Handel erhältlich.
Eine Verbindung, die eine Maleimidgruppe an eine Amingruppe ohne
Einführung
einer zusätzlichen
Verknüpfungs gruppe
einführt,
ist N-Methoxycarbonylmaleimid. Im allgemeinen beinhalten die Reagenzien
eine zweite funktionelle Gruppe zur Reaktion mit einer Gruppe an
der Polysialsäure,
wobei es sich um die vorstehend beschriebene Aldehydgruppe oder
eine Amingruppe handeln kann. Geeignete zweite funktionelle Gruppen
beinhalten N-Hydroxysuccinimidester und ihre Sulfosuccinimid-Analoga
und Hydrazide. Die Verbindung ist bevorzugt ein N-Maleimidalkansäurehydrazid
oder ein N-Maleimidarylalkansäurehydrazid,
d.h. eine Verbindung mit der allgemeinen Formel X-R-Y, worin:
- X eine N-Maleimid-, N-Iodacetamid-, S-Vinylsulfonyl- oder S-Orthopyridyldisulfid-Gruppe
ist,
- R eine Alkandiyl-, Arylen- oder Aralkylenalkarylen-, Alkylenoxaalkylen-
oder Alkylenoligooxaalkylen- oder Alkyloligopeptidylalkyl-Gruppe
ist; und
- Y eine Hydrazid-, Amin- oder N-Hydroxysuccinimid-Gruppe ist.
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Vorzugsweise
ist R C1-6-Alkandiyl, C2-3-Alkyloxa-C2-3-alkylen, C2-3-Alkyloligo(oxa-C2-3-alkylen) oder C2-6-Alkylenphenyl.
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X
ist bevorzugt N-Maleimid oder Orthopyridyldisulfid. Y ist vorzugsweise
ein Hydrazid oder ein Hydroxylsuccinimid.
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Verbindungen,
die mit einer Aldehydgruppe umgesetzt werden können und die eine Verknüpfungsgruppe
beinhalten und eine Maleimidgruppe einführen, beinhalten N-[β-Maleimidpropionsäure]hydrazid
und 4-(4-N-Maleimidphenyl)buttersäurehydrazid. Die Hydrazidgruppe
reagiert mit dem Aldehyd unter Bildung einer stabilen Hydrazongruppe.
Eine geeignete heterobifunktionelle Verbindung, die eine Oligo(ethylenoxy)ethylen-Gruppe
beinhaltet, ist eine Verbindung umfassend eine Polyethylenglycol(poly(ethylenoxy))-Gruppe
an einem Ende mit einer N-Hydroxysuccinimid
(NHS)-Gruppe und der funktionellen Gruppe am anderen Ende. Die NHS-Gruppe
reagiert mit Amingruppen unter Bildung stabiler Amidverknüpfungen.
Heterobifunktionelle Polyethylenglycole mit NHS an einem Ende und
entweder Vinylsulfon oder Maleimid am anderen Ende sind erhältlich.
Andere Beispiele von heterobifunktionellen Reagenzien beinhalten
3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid, N-Succinimidyl-3-[2-pyridyldithio]propionat,
Succinimidyl-H-[N-maleimidmethyl]cyclohexan-1-carboxylat), m-Maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester,
N-Succinimidyl-[4-iodacetyl]aminobenzoat, N-[gamma-Maleimidbutyryl oxy]succinimidester,
N-[epsilon-Maleimidcaproyloxy]succinimidester und N-Succinimidyliodacetat. Andere
Reagenzien sind von Pierce Biotechnology and Shearwater Corporation
(auf Basis von Polyethylenglycol) erhältlich.
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Sialsäuren (auch
als Nonulosonsäuren
bekannt) sind Mitglieder einer Familie von Amino enthaltenden Zuckern
enthaltend 9 oder mehr Kohlenstoffatome. Die wichtigste der Sialsäuren ist
N-Acetylneuraminsäure (auch
als 5-(Acetylamino)-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galactononulosonsäure, Lactaminsäure und
O-Sialsäure bekannt),
welche die folgende Formel aufweist:
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Polysialsäuren können 2→8 oder 2→9 verknüpft sein,
gewöhnlich
in der α-Konfiguration. In
manchen Polysialsäuren
sind die Verknüpfungen
alternierend 2→8
und 2→9.
Die Erfindung ist auch von Nutzen für heteropolymere Polysaccharide
umfassend Glycosyleinheiten, die von Sialsäure-Einheiten verschieden sind.
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Es
wird im allgemeinen festgestellt, dass Polysialsäuren nicht toxisch und im wesentlichen
nicht immunogen sind. Ferner sind die Einheiten des biologischen
Abbaus, Sialsäure,
nicht als toxisch bekannt und in der Tat werden Sialsäuren weit
verbreitet in Tierproteinen und -zellen, einschließlich Blutzellen
und zirkulierenden Proteinen, gefunden.
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Polysaccharid-Verbindungen,
die viele Sialsäure-Einheiten
enthalten, sind Polysaccharide, die von Escherichia coli, Moraxella
nonliquifaciens, Pasteurella aeroginosis und Neisseria meningitidis
oder Derivaten davon gebildet werden. Beispielsweise umfasst Colominsäure, die
(durch Hydrolyse zur Verkürzung
der Kettenlängen)
von E. coli KI abgeleitet ist, α-2→8-verknüpfte Sialsäure-Einheiten.
Polysaccharid aus dem E. coli K92-Stamm umfasst alternierend 2→8- und 2→9- verknüpfte Sialsäure-Einheiten.
Polysaccharid C von N. meningitidis-Gruppe C weist 2→9-verknüpfte Sialsäure-Einheiten
auf.
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Eine
Gruppe von Polysaccharid-Verbindungen, von denen festgestellt wurde,
dass sie von besonderem Nutzen in der Erfindung sind, sind Gruppe
B Polysaccharide. Diese Verbindungen werden von N. meningitidis,
M. nonliquifaciens, P. aeroginosis A2 und E. coli K1 produziert.
Diese Verbindungen umfassen ein Polysaccharid-Komponente umfassend
Sialsäure-Reste
und eine Phospholipid-Komponente. Die Sialsäure-Reste sind (2→8)-α-verknüpft, das
natürlich
vorkommende Polymer besteht aus etwa 200 Resten. Es scheint, dass einige
der Glycolipidmoleküle,
insbesondere die hochmolekularen Verbindungen, ein kovalent gebundenes Phospholipid
an dem reduzierenden Ende der Polysaccharid-Komponente aufweisen.
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Es
ist bevorzugt, dass die Bakterien, von denen die Polysaccharid-Verbindung abgeleitet
ist, aus Gründen
der Bequemlichkeit während
der Produktion nicht pathogen ist. Es ist daher besonders zweckmäßig, dass
das Polysaccharid von einem nicht pathogenen Stamm von E. coli,
wie E. coli K92 oder bevorzugt K1, das nicht immunogen ist, abgeleitet
ist. E. coli K92- und K1-Isolate sind wohlbekannt und jeder derartige
Typ von solchen Stämmen
kann als Quelle des geeignetes Polysaccharids verwendet werden.
Die Polysialsäure sollte
bevorzugt mindestens 2, bevorzugt mindestens 5, bevorzugter mindestens
10, z.B. mehr als 50 Sialsäure-Einheiten
aufweisen.
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Gemäß der Erfindung
wird auch ein Konjugat von einem Protein und dem neuen aktivierten
Polysaccharid bereitgestellt. Die neue Verbindung umfasst ein Protein
mit mindestens einer Cystein-Einheit und, verknüpft über eine Thioetherbindung an
die Seitenkette einer Cystein-Einheit, eine Polysialsäure über eine
Gruppe, die mit einer oder beiden endständigen Einheiten der Polysialsäure verbunden
ist.
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Wenn
das Polysialsäure-Derivat
eine N-Maleimid-Gruppe war, beinhaltet die Gruppe eine N-Succinimidyl-Gruppe,
wobei der Thioester am α-Kohlenstoffatom
verknüpft
ist. Die Gruppe umfasst bevorzugt auch ein sekundäres Amin,
ein Hydrazon oder eine Amidbindung.
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In
der Erfindung wird auch ein neues Verfahren bereitgestellt, bei
dem ein Polysaccharid mit mindestens zwei Sialsäure-Einheiten, die miteinander
2,8- oder 2,9-verknüpft
sind und umfassend mindestens eine endständige Einheit, die von einer
Sialsäure-Einheit,
bevorzugt einer Polysialsäure,
abgeleitet ist, mit einem heterobifunktionellen Reagenz mit einer
ersten funktionellen Gruppe zur Reaktion mit Sulfhydrylgruppen und einer
zweiten funktionellen Gruppe, die sich von der ersten Gruppe unterscheidet,
umgesetzt wird, wodurch die zweite funktionelle Gruppe mit einer
endständigen
Einheit der Polysialsäure
reagiert, um damit eine kovalente Bindung zu bilden und eine funktionelle
Polysialsäure
zu bilden, die in der Lage ist, mit einer Thiolgruppen-funktionellen
Polysialsäure
zu reagieren.
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In
einer Ausführungsform
ist die zweite funktionelle Gruppe eine nukleophile Gruppe, bevorzugt
Hydrazin. Dies ist von besonderem Nutzen, wenn die Polysialsäure eine
Aldehydgruppe in der endständigen
Einheit umfasst, deren Carbonylgruppe durch die nukleophile Gruppe
angegriffen wird.
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In
einer anderen Ausführungsform
des Verfahrens ist die zweite funktionelle Gruppe elektrophil, wie ein
N-Alkoxycarbonylimid, wie N-Hydroxysuccinimidester oder Sulfosuccinimidester,
oder Carbodiimid. Die endständige
Gruppe ist in solchen Fällen
bevorzugt nukleophil, wie Amin.
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In
dem Verfahren ist es bevorzugt, dass das Reagenz eine bifunktionelle
organische Gruppe umfasst, welche die erste und zweite funktionelle
Gruppe verknüpft.
Die bifunktionelle organische Gruppe wird bevorzugt ausgewählt aus
einer C2-18-Alkandiylgruppe, einer Arylengruppe,
einer Oligopeptid- und einer Oligo(alkoxy)alkyl-Gruppe.
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Beispiele
für geeignete
Reagenzien sind oben angegeben.
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Es
ist am zweckmäßigsten,
dass das Verfahren einen anschließenden Schritt beinhaltet,
in dem die funktionelle Polysialsäure mit einem Polypeptid oder
einem Protein mit mindestens einer freien und ungeschützten Cys-Einheit
umgesetzt wird, wodurch die funktionelle Gruppe eine Thioetherverknüpfung mit
der Thiolgruppe einer Cys-Einheit bildet, um polysialyliertes Polypeptid
oder Protein zu bilden. Das Verfahren ist besonders geeignet, wenn
das Protein eine einzelne Cys-Einheit enthält, wodurch eine Stellen-regulierte
Derivatisierung erreicht wird.
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Die
Erfindung wird in den beigefügten
Beispielen erläutert. BEISPIEL
1
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1.1 Synthese
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Es
wurden folgende drei separate Herstellungen durchgeführt:
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Colominsäurealdehyd
(CAD), das gemäß
WO-A-9222331 hergestellt
wurde (100 mg, 4,4 × 10
–6 mol), wurde
in 500 μl
0,1 M Natriumacetat gelöst,
dazu wurden 5 Moläquivalente
von N-[β-Maleimidpropionsäure]hydrazid
(6,5 mg, 2,2 × 10
–6 mol)
hinzugegeben. Diese Mischung wurde dann wirbelvermischt und mit
Folie umwickelt und 2 h bei 37°C
auf einem Kreiselmischer inkubiert. Das Polymer wurde dann durch
Zugabe von 2 Volumen (1,0 ml) Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren
(13.000 U/min, 2 min) in einer Tischmikrozentrifuge gesammelt. Die überstehende
Lösung
wurde verworfen und das Pellet in 500 μl 0,1 M Acetat gelöst. Dieses
Verfahren wurde weitere zweimal wiederholt und das schließliche Pellet
in entionisiertem Wasser gelöst
und über
Nacht gefriergetrocknet.
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1.2 Untersuchung auf Maleimidgehalt
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In
dieser Untersuchung wird Cystein mit dem Maleimid am Polymer umgesetzt,
wobei weitere Reaktionen mit Ellmans-Reagenz (5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)) verhindert
wird, die ein Disulfid enthält,
das eine intensive gelbe Farbe bildet, wenn es für ein Thiol substituiert wird,
das nicht zu einem aromatischen Ring benachbart ist. Somit kann
der Maleimidgehalt durch Messen der Inhibierung der Reaktion zwischen
Cystein und dem Ellmans-Reagenz-Assay berechnet werden.
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Zuerst
wurde ein anfänglicher
Ansatz von Cystein mit 12 × 10–3 M
(0,145 mg/ml) in PBS hergestellt. In einer sauberen Mikrotiterplatte
wurden verdoppelnde Verdünnungen
mit einem Volumen von 100 μl
von 12 × 10–3 M
bis 0,375 × 10–3 M
von Reihe B bis Reihe H durchgeführt.
In Reihe A wurden 100 μl
PBS als Null-Standard
verwendet. Proben von CA und CA-Maleimid (CAM) wurden mit 5 oder
10 mg/ml und 100 μl
jeder Probe zu Doppelspalten der Cysteinverdünnungen gegeben. In einem Satz
wurden 100 μl
PBS ohne CA als Kontrolle hinzugegeben. Die Platte wurde bedeckt
und 1 h bei 37°C
inkubiert. Danach wurden 20 μl
Ellmans-Reagenz (4 mg/ml in PBS) zu jeder Mulde gegeben und die
Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert. Die Extinktion
bei 405 nm wurde in den Mulden gemessen. Es wurden dann Standardkurven
für die
Proben aufgezeichnet und die Menge an vorhandenem Maleimid aus der
Inihibierung des Signals berechnet.
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1.3 Thiolierung von FAb und Konjugation
an CAM
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Im
ersten Schritt wird eine Thiolgruppe in ein Modellprotein durch
Thiolierung eines Amins von Lysin eingeführt.
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Schaf-FAb
(anti-Desipramin/Norityrptalin, 4 mg, 7,2 × 10
–8 mol)
wurde in 0,25 ml PBS + 10 mM EDTA gelöst, dazu wurden 0,498 mg 2-Iminothiolan
(2-IT, Trauts-Reagenz, 50 Moläquivalent,
3,6 × 10
–6 mol)
in 0,25 ml des gleichen Puffers gegeben. Das Rohr wurde in Folie
gewickelt und aufrechtstehend 1 h bei 37°C aufrecht stehend unter Rühren inkubiert.
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Thioliertes
FAb wurde von freiem 2-IT Trauts-Reagenz durch Gelfiltration (PD-10)
gereinigt und 0,5 ml Fraktionen auf Anwesenheit von Protein (BCA-Assay) oder Thiol
(Ellmans Assay) untersucht. Der erste Elutionspeak, der beide enthält, wurde
gesammelt und Protein und Thiole wurden quantifiziert.
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1.5 Konjugation von FAb-Thiol an CAM
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Zu
thioliertem FAb (3,6 mg, 6,6 × 10–8 mol)
in 2 ml PBS/EDTA wurden 22,5 mg CAM (9 × 10–7 mol,
15 Moläquivalente)
zugegeben. Das Rohr wurde verschlossen und unter sanftem Mischen
1 h bei 37°C
inkubiert. Das sich ergebende Konjugat wurde dann gemäß den akzeptierten
Protokollen zur Entfernung von freiem CAM gereinigt. Sowohl der
CA- als auch der Proteingehalt wurden am Konjugat untersucht, um
das Konjugationsverhältnis
zu berechnen.
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Kontrollreaktionen
wurden mit CA als negativer Kontrolle durchgeführt.
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Verschiedene
Chargen von CAM-FAb wurden mit verschiedenen Thiolierungsgraden
hergestellt, wobei das Verhältnis
von CAM : FAb von 15:1 aber beibehalten wurde. Die Ergebnisse sind
in nachstehender Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1
| Thiol
pro FAb | Konjugatverhältnis (CA:
Fab) |
| 1 | 0,53:1 |
| 2 | 0,9:1 |
| 5
(dreifache Reaktion) | 1,925:
1 ± 0,19:
1 FAb |
| 10 | 3,51:1 |
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1 zeigt
ein SDS-PAGE-Gel von dreifachen Proben und relevanten Kontrollen.
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1.6 Schlussfolgerung
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Die
Ergebnisse zeigen, dass in allen Kontrollmulden (Proben von thioliertem
FAb) die Wanderung der Probe ähnlich
zu der von frischem FAb (unter der des 50 kDa Markers) ist, was
auf keine Vernetzung von FAb-Molekülen während des Prozesses der Konjugation
hinweist. In den Wiederholungsbahnen gibt es eine merkliche Bandverbreiterung
mit einer maximalen Intensität
zwischen den 98 und 250 kDa Markern, was typischerweise auf einen
Massenanstieg hinweist, was auf ein polysialyliertes Produkt hinweist.
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1.7 Konjugation von CAM an beta-Galactosidase
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Zu β-Galactosidase
von E. coli ((β-gal),
5,0 mg, 4,3 × 10–8 mol)
in 1 ml PBS wurden 15 mg CAM hinzugegeben (6,59 × 10 mol, 15 Moläquivalente).
Das Rohr wurde verschlossen, mit Folie umwickelt und bei leichter
Mischung 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das sich ergebende Konjugat
wurde durch SDS-PAGE analysiert und dann gemäß den akzeptierten Protokollen
zur Entfernung von freiem CAM gereinigt. Die Proben wurden wie anderswo
angegeben auf den Polymer- und Proteingehalt untersucht.
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Kontrollreaktionen
wurden mit CA als negativer Kontrolle durchgeführt.
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1.8 Untersuchung auf Enzymaktivität
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Standards
von 60 μg/ml
bis 3,75 μg/ml
frischer β-Galactosidase
wurden in PBS hergestellt. Proben von CAM-β-gal wurden auf 60 μg/ml im gleichen
Puffer verdünnt.
Die Enzymaktivität
der Konjugate wurde folgendermaßen
gemessen.
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Auf
einer Mikrotiterplatte wurden zu 100 μl Probe oder Standard 100 μl Allin-One-β-gal-Substrat (Pierce)
hinzugegeben. Die Platte wurde 30 min bei 37°C inkubiert und die Extinktion
bei 405 nm abgelesen. Eine Eichkurve wurde aus den Standards hergestellt
und die Aktivität
der Proben aus der Gleichung für
die lineare Regression der Kurve berechnet.
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1.9 Ergebnisse
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Aus
den Protein- und Polymeruntersuchungen wurde das Konjugationsverhältnis mit
1,23 CAM : 1 β-Gal
bestimmt. Es gab auch einen entsprechenden Anstieg in der scheinbaren
Molekülmasse
gemäß SDS-PAGE
der Proben (2). Die Enzymaktivität in der
gereinigten Probe wurde mit 100,4% im Vergleich zum freien Enzym
berechnet.
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BEISPIEL 2
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Syntheseroute 2
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Schritt
1 Aminierung von CA-aldehyd (CHO)
Schritt
2 Einführung
von Maleimidring
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Synthese
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2.1. Schritt 1 Aminierung von oxidierter
CA
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Oxidierte
Colominsäure
(CAO) mit 10 bis 100 mg/ml wurde in 2 ml entionisiertem Wasser mit
einem 300-fachen molaren Überschuss
von NH4Cl in einem 50 ml Rohr gelöst und dann
wurde NaCNBH3 (5 M Ansatz in 1 N NaOH (wässrig))
mit einer Endkonzentration von 5 mg/ml hinzugegeben. Die Mischung
wurde 5 Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde auch eine Kontrollreaktion
mit Colominsäure
(A) anstelle von CAO aufgestellt. Das Colominsäureamin-Derivatprodukt wurde durch Zugabe von
5 ml eiskaltem Ethanol ausgefällt. Der
Niederschlag wurde durch Zentrifugieren bei 4.000 U/min, 30 min,
Raumtemperatur in einer Tischzentrifuge gewonnen. Das Pellet wurde
beibehalten und erneut in 2 ml entionisiertem Wasser suspendiert,
dann wiederum mit 5 ml eiskaltem Ethanol in einem 10 ml Ultrazentrifugenrohr
ausgefällt.
Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren bei 30.000 U/min über 30 min
bei Raumtemperatur gesammelt. Das Pellet wurde erneut suspendiert
in 2 ml entionisiertem Wasser und gefriergetrocknet.
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2.2. Untersuchung auf den Amingehalt
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Der
TNBS (Picrylsulfonsäure
oder 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure)-Assay
wurde verwendet, um die Menge von Aminogruppen zu bestimmen, die
im Produkt vorhanden waren.
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In
der Mulde einer Mikrotiterplatte wurde TNBS (0,5 μl von 15
mM TNBS) zu 90 μl
eines 0,1 M Boratpuffers von pH 9,5 gegeben. Dazu wurden 10 μl einer 50
mg/ml-Lösung
von CA-Amid gegeben, man ließ die Platte
20 min bei Raumtemperatur stehen, bevor die Extinktion bei 405 nm
abgelesen wurde. Glycin wurde als Standard mit einem Konzentrationsbereich
von 0,1 bis 1 mmol verwendet, TNBS primäre Trinitrophenylat-Amingruppen.
Das TNP-Addukt des Amins wird nachgewiesen.
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Die
Prüfung
des Produkts, das mit einer zweifachen Fällung mit kaltem Ethanol gereinigt
wurde, unter Verwendung des TNBS-Assays zeigte eine Umwandlung nahe
an 90%.
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2.3. Maleimidierung von CA-Amin
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CA-Amin
(17 mg) wurde in 1 ml entionisiertem Wasser gelöst, dazu wurden 6 mg Methoxycarbonylmaleimid
(MCM) hinzugegeben. Man ließ die
Mischung bei Raumtemperatur über
30 min reagieren. Zu der Probe 1 wurden 100 μl Wasser und 200 μl Acetonitril
hinzugegeben und dann wurde 4 h bei Raumtemperatur inkubiert, wonach
300 μl CHCl3 zugegeben wurden, das Rohr geschüttelt und
die wässrige
Fraktion gesammelt wurde. Dann wurde die Fraktion über einer
Säule PD-10
gereinigt, um kleine Moleküle
zu entfernen. Das Eluat wurde gefriergetrocknet und auf den Maleimidgehalt
untersucht. Die molare Konzentration von Maleimid war 44 Mol-%.
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BEISPIEL 3: Herstellung von Jodacetat-Derivat
von Colominsäure
(CAI)
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3.1 Synthese
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Zu
40 mg Colominsäureamin
(85 Mol-% Amin) (beschrieben in Beispiel 2.1) gelöst in 1
ml PBS, pH 7,4, wurden 5 mg N-Succinimidyliodacetat (SIA) gegeben.
Man ließ die
Mischung 1 h bei 37°C
reagieren, wonach überschüssiges SIA
durch Gelfiltration über
eine 5 ml Entsalzungsäule
Hightrap® (AP
Bioscience) unter Flution mit PBS entfernt wurde. 0,5 ml Fraktionen
wurden von der Säule
gesammelt und Proben von jeder Fraktion auf den Colominsäuregehalt
(Resorcin-Assay)
und die Reaktivität
mit auf Cystein hinweisendem Iodid (Ellmans-Assay) geprüft. Fraktionen,
die sowohl für
Iodid als auch für
CA positiv waren, wurden gesammelt.
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3.2 Konjugation von CAI an β-Galactosidase
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Zu β-Galactosidase
von E. coli (5,0 mg, 4,3 × 10–8 mol)
in 1 ml PBS wurden 15 mg CAI zugegeben (6,59 × 10–7 mol,
15 Moläquivalent).
Das Rohr wurde verschlossen, in Folie gewickelt und es wurde bei
Raumtemperatur für
1 h unter sanftem Mischen inkubiert. Das sich ergebende Konjugat
wurde mit SDS-PAGE analysiert und dann gemäß den akzeptierten Protokollen
zur Entfernung von freiem CAI gereinigt. Die Proben wurden wie anderswo
ausgeführt
auf den Polymer- und Proteingehalt untersucht.
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Kontrollreaktionen
wurden mit CA als negativer Kontrolle durchgeführt. Alle Proben wurden auf β-gal-Aktivität wie im
obigen Beispiel 1.8 analysiert.
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3.3 Schlussfolgerungen
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Die
Fraktionen 3 bis 6 waren sowohl für Polymer und Iodacetat positiv
und wurden gesammelt. SDS-PAGE (4 bis 12% Bis/Tris-Gel; 2)
zeigte einen Anstieg in der scheinbaren Molekülmasse für Proben, die mit dem Iodacetamid-Derivat inkubiert
waren, aber nicht bei dem Kontrollpolymer. Aus den Protein- und Polymeruntersuchungen
wurde das Konjugationsverhältnis
mit 1,63 für
CAI:1 β-gal
bestimmt. Die β-gal-Aktivität wurde
mit 100,9% für
die konjugierte Probe im Vergleich zum freien Enzym berechnet.
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BEISPIEL 4
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4.1 Synthese: Aktivierung des nicht reduzierenden
Endes mit 4-(4-N-Maleimidphenyl)-buttersäurehydrazid (CA-MBPH)
und 3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid (CA-PDPH)
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Es
erfolgten folgende Herstellungen:
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Colominsäurealdehyd
(CAO; 22,7 kDa, Camida, Irland), hergestellt gemäß
WO-A-9222331 (73 mg für MBPH,
Rohr A; 99,3 mg für
PDPH; Rohr B), wurde einzeln in 800 ml 0,1 M Natriumacetat (pH 5,5)
gelöst.
Zu Rohr A wurden 15 mg MBPH (Verhältnis Verknüpfungsmittel:CA von 15:1) gelöst in 200 μl DMSO hinzugegeben.
Zu Rohr B wurden 15 mg (Verhältnis
Verknüpfungsmittel:
CA von 15:1) von PDPH gelöst
in 200 μl
DMSO hinzugegeben. Der pH wurde in jedem Fall für jeden Reaktionsbehälter auf
5,5 eingestellt. Diese Mischungen wurden dann wirbelvermischt und
in Folie eingewickelt und man ließ 2 h bei 37°C auf einem
Orbitalmischer inkubieren. Jede Polymerlösung wurde durch Gelfiltration
(Säule
PD 10) unter Flution mit PBS, pH 7,4, gereinigt und die 1 ml Fraktion
enthaltend CA (über
Resorcin-Assay) wurde gesammelt. Diese Probe wurde über Nacht
gefriergetrocknet und auf den Maleimidgehalt wie in Beispiel 1.2.
beschrieben untersucht.
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4.2 Synthese: Aktivierung des reduzierenden
Endes mit 4-(4-N-Maleimidphenyl)buttersäurehydrazid (MBPH-CA), (2-Pyridyldithio)propionylhydrazid
(PDPH-CA) und N-β-Maleimidpropionsäurehydrazid)hydrazid (BMPH-CA)
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Die
Herstellungen wurden folgendermaßen alle bei Molverhältnissen
von Verknüpfungsmittel
zu CA von 25:1 durchgeführt:
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Colominsäure (CA;
22,7 kDa; 73 mg für
MBPH, Rohr A: 99,3 mg für
PDPH; Rohr B und 76,6 mg für BMPH;
Rohr C) wurde einzeln in 800 μl
0,1 M Natriumacetat (pH 5,5) gesondert gelöst. Zu Rohr A wurden 25 mg
MBPH (gelöst
in 200 μl
DMSO), zu Rohr B 25 mg PDPH (gelöst
in 200 μl
DMSO) und zu Fläschchen
C 25 mg BMPH (gelöst
in 200 μl
Natriumacetat-Puffer) hinzugegeben. Der pH der Reaktionsmischung
wurde auf 5,5 eingestellt. Jede Mischung wurde dann wirbelvermischt,
in Folie gewickelt und auf einem Orbitalmischer 72 h bei 37°C inkubiert.
Jede Polymerlösung
wurde durch Gelfiltration (Säule
PD 10) unter Flution mit PBS, pH 7,4, gereinigt und die 1 ml Fraktion
enthaltend CA (durch Resorcin-Assay)
wurde gesammelt. Diese Probe wurde über Nacht gefriergetrocknet
und auf den Maleimidgehalt wie in Beispiel 1.2 beschrieben untersucht.
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4.3 Ergebnisse
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Die
molare Konzentration von Maleimid war 49,0 und 35,0 Mol-% für MBPH bzw.
PDPH an dem nicht reduzierenden (hochreaktiven) Ende. Die molare
Konzentration von Maleimid betrug 41,5, 32,5 und 48,3 Mol-% für MBPH,
PDPH bzw. BMPH an dem reduzierenden Ende (schwach reaktiv). Die
Werte am reduzierenden Ende waren das Mittel von zwei Werten in
jedem Fall.
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4.4 Konjugation von β-Galactosidase (β-gal) an
mit Maleimid aktivierten Colominsäuren (reduzierendes Ende und
nicht reduzierendes Ende)
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Zu β-gal in gesonderten
Rohren wurde ein 15-molarer Überschuss
jeweils von mit Maleimid aktiviertem CA (MBPH, PDPH und BMPH an
dem nicht reduzierenden oder reduzierenden Ende aus den obigen Beispielen)
gesondert hinzugegeben. Jedes Rohr wurde verschlossen und 1 h bei
37°C unter
sanftem Mischen inkubiert. Das sich ergebende Konjugat wurde dann
gemäß den akzeptierten
Protokollen zur Entfernung von freiem aktiviertem Polymer gereinigt.
Alle Proben wurden durch SDS-PAGE und bezüglich der β-gal-Aktivität wie in Beispiel 1.8 analysiert.
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4.5 Ergebnisse
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Die
Ergebnisse (3) zeigen, dass in allen Kontrollmulden
(mit β-gal)
die Wanderung der Probe ähnlich
ist wie die für
frisches β-gal.
In den Konjugatbahnen gab es eine beträchtliche Bandverbreiterung
mit einer maximalen Intensität
zwischen den 98 und 250 kDa Markern, was typischerweise auf einen
Anstieg in der Masse hinweist, was für ein polysialyliertes β-gal hinweist.
Die β-gal-Aktivität wurde
mit 91,0 bis 106% für
die konjugierten Proben berechnet.
