DE60313786T2 - Poly(ethylen glykol)-konjugate von insulinähnlichem wachstumfaktor bindenden protein-4 - Google Patents

Poly(ethylen glykol)-konjugate von insulinähnlichem wachstumfaktor bindenden protein-4 Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft Konjugate von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktorbindenden Protein-4 (IGFBP-4) mit Poly(ethylenglykol) (PEG), pharmazeutische Zusammensetzungen, welche solche Konjugate enthalten und Verfahren zur Herstellung und Verfahren zur Verwendung solcher Konjugate.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGFs) sind Mitogene, die eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose spielen. Sechs (GF-bindende Proteine (IGFBPs) können die Wirkungen von IGFs beeinflussen (Yu, H., und Rohan, T., J. Natl. Cancer Inst. 92 (2000) 1472-1489).
  • Reifes humanes IGFBP-4 wird in der Literatur als ein monomeres Protein mit 24 kDa beschrieben und besteht aus 237 Aminosäuren. Das aus der Aminosäuresequenz berechnete Molekulargewicht des Proteins beträgt 26 kDa. Seine biologische Rolle ist in Yu, H., und Rohan, T., J. Natl. Cancer Inst. 92 (2000) 1472-1489 zusammengefasst. Conover, C.A., et al. beschreiben in J. Biol. Chem. 270 (1995) 4395-4400 Protease-resistente Mutanten von IGFBP-4. Alle vier IGFBP-4-Mutanten um die mutmaßliche Spaltungsstelle an Met135-Lys 136 und das Wildtypprotein binden IGFs mit gleichen Affinitäten. Eine Beständigkeit von IGFBP-4 gegenüber proteolytischer Spaltung wird auch durch Deletion der Aminosäuren 121-141 erzielt, wie von Miyakoshi, N., et al. in Endocrinology 142 (2001) 2641-2648 beschrieben. Byun, D., et al. bestimmten in J. Endocrinology 169 (2001) 135-143 verschiedene Regionen, die an der IGF-Bindung durch IGFBP-4 beteiligt sind. Die Deletion der Segmente Leu72-Ser91 oder Leu72-His74 führt zu einem Verlust der IGF-Bindung. Auch die Mutation von bestimmten Cysteinresten in der N- und der C-terminalen Domäne verringert signifikant die Bindung von IGFs.
  • IGFBP-4 wurde erstmals aus Medium isoliert, welches mit humanen Osteosarkom-TE-89-Zellen konditioniert war (Mohan, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 8338-8342). Es ist bekannt, dass IGFBP-4 natürlich als nicht glykosylierte Form mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 24 kDa oder in der glykosylierten Form mit einem Gewicht von 28 kDa vorliegt. Rekombinantes IGFBP-4 wurde durch Expression in verschiedenen eukaryotischen und prokaryotischen Systemen hergestellt. Humanes IGFBP-4 wurde durch Expression in E. coli als Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase (Honda, Y., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 81 (1996) 1389-1396) oder als Fusionsprotein mit einem Hexahistidin-Tag (Qin, X., et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 23509-23516) oder durch Expression in Hefe als Ubiquitin-Fusionsprotein (Kiefer, M. C., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 12692-12699) hergestellt. Die Sequenz von humanem IGFBP-4 ist ausführlich in der SwissProt-Datenbank (http://www.expasy.ch) beschrieben und mit der Hinterlegungs-Nummer P22692 bezeichnet. Die im Folgenden beschriebenen Aminosäurepositionen beziehen sich auf die Sequenz der reifen Formen von IGFBP-4 (Sequenz nach Entfernung des Signalpeptids beginnend mit Aminosäureposition 1) oder es wird auf die in den zitierten Literaturstellen verwendete Nummerierung Bezug genommen.
  • IGFBP-4 hemmt die (GF-stimulierte Knochenzellproliferation in vitro (Mohan, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 8338-8342), das IGF-vermittelte Wachstum von Kükenknorpel (Schiltz, P. M., et al., J. Bone Mineral Res. 8 (1993) 391-396) und das Wachstum von HT-29-Zellen (Culouscou, J. M., und Shoyab, M., Cancer Res. 51 (1991) 2813-2819). Überexpression von IGFBP-4 in der malignen M 12-Prostataepithelzelllinie verringert die IGF-induzierte Proliferation der Zellen, hemmt die Kolonienbildung in weichem Agar, steigert Apoptose in Antwort auf 6-Hydroxyharnstoff und verzögert die Bildung von Tumoren durch die transformierten Zellen (Damon, S. E., et al., Endocrinology 139 (1998) 3456-3464). Überexpression von IGFBP-4 in humanen Kolorektalkarzinomzellen verringert die Proliferation dieser Zellen und unterdrückt die Kolonienbildung (Diehl, D., et al., J. Cancer Res. Clinical Oncol. 127, Ergänzung 1 (2001) S54).
  • Die kovalente Modifikation von Proteinen mit Poly(ethylenglykol) (PEG) hat sich als nützliches Verfahren erwiesen, um die Umlaufhalbwertszeiten von Proteinen im Körper auszudehnen (Hershfield, M. S., et al., New England Journal of Medicine 316 (1987) 589-596; und Meyers, F. J., et al., Clin. Pharmacol. Ther. 49 (1991) 307-313). Weitere Vorteile der Pegylierung sind eine Erhöhung der Solubilität und eine Verringerung der Proteinimmunogenizität (Katre, N. V., J. Immunol. 144 (1990) 209-213). Ein gebräuchliches Verfahren für die Pegylierung von Proteinen ist die Verwendung von Poly(ethylenglykol), der mit Amino-reaktiven Reagenzien wie etwa N-Hydroxysuccinimid (NHS) aktiviert ist. Mit solchen Reagenzien wird Poly(ethylenglykol) an die Proteine an freie primäre Aminogruppen angebunden, wie etwa die N-terminale α-Aminogruppe und die ε-Aminogruppen von Lysinresten. Eine vorrangige Einschränkung dieses Ansatzes ist jedoch, dass Proteine typischerweise eine beträchtliche Menge von Lysinresten enthalten und die Poly(ethylenglykol)-Gruppen daher an das Protein auf unspezifische Weise an alle der freien ε-Aminogruppen angebunden werden, was zu einem heterologen Produktgemisch von zufällig pegylierten Proteinen führt. Daher sind viele NHS-pegylierte Proteine aufgrund der geringen spezifischen Aktivität für die kommerzielle Verwendung ungeeignet. Die Inaktivierung ergibt sich aus einer kovalenten Modifikation eines oder mehrerer Lysinreste oder des N-terminalen Aminosäurerests, der für die biologische Wirkung benötigt wird oder aus der kovalenten Anbindung der Poly(ethylenglykol)-Reste in der Nähe oder an der aktiven Stelle des Proteins. Es wurde beispielsweise gefunden, dass die Modifikation von humanem Wachstumshormon unter Verwendung von NHS-Pegylierungsreagenzien die biologische Wirkung des Proteins um mehr als das Zehnfache verringert (Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 21969-21977).
  • Humanes Wachstumshormon enthält 9 Lysine zusätzlich zu der N-terminalen Aminosäure. Bestimmte dieser Lysine befinden sich in Regionen des Proteins, von denen bekannt ist, dass sie für die Rezeptorbindung entscheidend sind (Cunningham, B. C., et al., Science 254 (1991) 821-825). Außerdem führt die Modifizierung von Erythropoietin durch Verwendung von Amino-reaktiven Poly(ethylenglykol)-Reagenzien auch zu einem nahezu vollständigen Verlust der biologischen Wirksamkeit (Wojchowski, D. M., et al., Biochim. Biophys. Acta 910 (1987) 224-232). Eine kovalente Modifizierung von Interferon-α2 mit Amino-reaktiven Pegylierungsreagenzien führt zu einem 40-75%-igen Verlust der Bioaktivität ( US-Patent Nr. 5,382,657 ). Eine ähnliche Modifikation von GCSF führt zu mehr als 60%-igem Aktivitätsverlust (Tanaka, H., et al., Cancer Res. 51 (1991) 3710-3714) und bei Interleukin-2 zu einem mehr als 90%-igen Verlust der Bioaktivität (Goodson, R. J., und Katre, N. V., BioTechnology 8 (1990) 343-346).
  • Van den Berg, C. L., et al. (Europ. J. Cancer 33 (1997) 1108-1113; und WO 94/22466 ) koppelten Cystein-reaktives Poly(ethylenglykol) (20 kDa) kovalent an IGFBP-1, was zu einer verlängerten Serumhalbwertszeit von 13,6 h führt. Wie in WO 94/22466 beschrieben wird, nimmt man an, dass Aminosäuren in der mittleren Domäne von IGFBP-1 für eine spezifische Pegylierung durch Cystein ersetzt werden können, ohne die IGF-Bindung und Hemmung zu beeinträchtigen. Aminosäuren in den Positionen 98 und 101 wurden durch Cystein ausgetauscht, da Serin 101 eine natürliche vorrangige Phosphorylierungsstelle ist, die an der Proteinoberfläche ausgesetzt ist und nicht an der Bindung an IGFs beteiligt ist. Das 20 kDa monopegylierte IGFBP-1 zeigt im Hinblick auf die Hemmung des Tumorzellwachstums eine vergleichbare, aber nicht verbesserte in vitro-Aktivität im Vergleich zu Wildtyp-IGFBP-1. Gemäß van den Berg, C. L., et al., Europ. J. Cancer 33 (1997) 1108-1113, ist ihr pegyliertes IGFBP-1 in vivo möglicherweise nicht in der Lage, die IGF-Wirkung direkt an der Tumorzelle zu hemmen.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes IGFBP-Derivat mit inhibitorischer Wirksamkeit auf das Tumorwachstum und einer verlängerten Halbwertszeit in vivo bereitzustellen, das vorzugsweise in Form von nur wenigen Bolus-Applikationen pro Woche verabreicht werden kann und das in der Lage ist, Tumorwachstum, Angiogenese und/oder Metastasierung zu unterdrücken.
  • Zusammenfassung der Erfindunq
  • Es wurde überraschenderweise gefunden, dass 30 kDa- bis 40 kDa-pegyliertes (30-40 kDa pegyliertes IGFBP-4), vorzugsweise monopegyliertes, IGFBP-4 erfindungsgemäß überlegene Eigenschaften im Hinblick auf die therapeutische Anwendbarkeit bei der Tumorbehandlung wie etwa bei der Unterdrückung des Tumorwachstums, Angiogenese und/oder Metastasierung in vivo besitzt, die für IGFBP-4 allein oder für niedrigergewichtig pegyliertes IGFBP-4 nicht vorgefunden werden. Außerdem verhindern die erfindungsgemäßen Konjugate unerwünschte Nebeneffekte in vivo, wie etwa die Veränderung normaler Nierenzellen, die bei niedrigergewichtig pegyliertem IGFBP-4 vorgefunden werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Konjugat bereit, welches aus einem Insulinähnlichen Wachstumsfaktor bindenden Protein 4 (IGFBP-4) und einer oder zwei Poly(ethylenglykol)-Gruppe(n) besteht, wobei die Poly(ethylenglykol)-Gruppe(n) ein Gesamtmolekulargewicht von etwa 30 bis 40 kDa aufweisen. Vorzugsweise ist/sind die Poly(ethylenglykol)-Gruppe(n) an IGFBP-4 über primäre Aminogruppe(n) konjugiert (Amino-rReaktive Pegylierung). Es ist außerdem bevorzugt, dass es sich bei dem Konjugat um ein MonoPEG-IGFBP-4-Konjugat handelt. Es ist besonders bevorzugt, dass das Konjugat ein Mono-N-terminales-PEG-IGFBP-4-Konjugat ist, das über die N-terminale Aminogruppe von IGFBP-4 gekoppelt ist.
  • Ebenfalls bevorzugt sind Konjugate, die ein verzweigtes PEG enthalten.
  • Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate.
  • Die Erfindung umfasst ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein erfindungsgemäßes Konjugat enthalten.
  • Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, welche ein erfindungsgemäßes Konjugat enthalten.
  • Die Erfindung umfasst ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Konjugats zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs, vorzugsweise Pankreaskrebs.
  • Die Erfindung umfasst ferner Verfahren für die Behandlung von Humankrebs (z.B. Brust-, Lungen-, Prostata- oder Darmkrebs), vorzugsweise Pankreaskrebs, dadurch gekennzeichnet, dass eine pharmazeutisch wirksame Menge von 30-40 kDa-pegyliertem IGFBP-4 einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, verabreicht wird, vorzugsweise in ein bis sieben Bolus-Applikationen pro Woche.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • „Amino-reaktiv pegyliertes IGFBP-4" oder „Amino-reaktive Pegylierung" bedeutet, wie hierin verwendet, dass IGFBP-4 kovalent an eine, zwei oder drei Poly(ethylenglykol)-Gruppen gebunden ist, durch Amino-reaktive Kopplung an das IGFBP-4-Molekül. Die PEG-Gruppen können an unterschiedliche Stellen des IGFBP-4-Moleküls angebunden sein, bei denen es sich um primäre Aminogruppen handelt, vorzugsweise um die reaktivsten Stellen, z.B. die ε-Aminogruppen der Lysinseitenketten oder die N-terminale α-Aminogruppe. Aufgrund des verwendeten Syntheseverfahrens kann pegyliertes IGFBP-4 aus einem Gemisch von mono- und/oder dipegyliertem IGFBP-4 bestehen, wobei die Pegylierungsstellen in verschiedenen Molekülen unterschiedlich sein können oder im Wesentlichen homogen sein können, im Hinblick auf die Menge der Poly(ethylenglykol)-Seitenketten pro Molekül und/oder die Stelle der Pegylierung in dem Molekül.
  • Amino-reaktive Pegylierung bezeichnet wie hierin verwendet ein Verfahren zur zufälligen Anbringung von Poly(ethylenglykol)-Ketten an primäre Aminogruppe (n) des Zielproteins IGFBP-4 mittels Verwendung von reaktivem (aktiviertem) Poly(ethylenglykol), vorzugsweise mittels Verwendung von N-Hydroxysuccinimid-Estern von vorzugsweise Methoxypoly(ethylenglykol). Die Kopplungsreaktion bringt vorzugsweise Poly(ethylenglykol) an reaktiven primären Aminogruppen an, wie etwa den ε-Aminogruppen von Lysinresten oder der α-Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure von IGFBP-4. Eine solche Aminogruppen-Konjugation von PEG an Proteine ist im Fachbereich gut bekannt. Ein Überblick über solche Verfahren findet sich beispielsweise bei Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. Gemäß Veronese kann die Konjugation von PEG an primäre Aminogruppen von Proteinen durchgeführt werden, indem aktivierte PEGs verwendet werden, die eine Alkylierung der primären Aminosäuren durchführen. Für eine solche Reaktion können aktivierte Alkylierungs-PEGs, beispielsweise PEG-Aldehyd, PEG-Tresylchlorid oder PEG-Epoxid verwendet werden. Weitere nützliche Reagenzien sind Acylierungs-PEGs wie etwa Hydroxysuccinimidester von carboxylierten PEGs oder PEGs, in denen die terminale Hydroxygruppe durch Chloroformate oder Carbonylimidazol aktiviert ist. Weitere nützliche PEG-Reagenzien sind PEGs mit Aminosäurearmen. Solche Reagenzien können die sogenannten verzweigten PEGs umfassen, wobei wenigstens zwei identische oder unterschiedliche PEG-Moleküle über einen peptidischen Spacer (vorzugsweise Lysin) miteinander verknüpft sind und beispielsweise an IGFBP-4 als aktiviertes Carboxylat des Lysinspacers gebunden sind. Die mono-N-terminale Kopplung ist außerdem bei Kinstler, O., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 477-485 beschrieben.
  • Das Auftreten mehrerer potenziell reaktiver primärer Aminogruppen in dem Zielprotein (für IGFBP-4 gibt es 12 Lysine + 1 terminale Aminosäure) führt zu einer Reihe pegylierter IGFBP-4-Isomere, die sich in dem Punkt der Anbringung der Poly(ethylenglykol)-Kette unterscheiden und die im Folgenden hierin als „Positionsisomere" bezeichnet werden. Die Anbringungsstelle in einem einzelnen IGFBP-4-Molekül ist nicht eindeutig vorhersagbar und aus diesem Grund wird sie als „zufällig" bezeichnet. Neun dieser zwölf Lysine (Lys 67, Lys 124, Lys 134, Lys 136, Lys 192, Lys 204, Lys 210, Lys 215 und Lys 223) befinden sich in Regionen, von denen berichtet wurde, dass sie zur Komplexbildung mit IGF benötigt werden (Qin, X., et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 23509-23516). Daher wäre eine starke Verringerung der Affinität von IGF für zufällig pegyliertes IGFBP-4 zu erwarten. Überraschenderweise war dies bei den erfindungsgemäßen Konjugaten nicht der Fall.
  • Es ist außerdem bevorzugt, die PEG-Gruppen an IGFBP-4 mittels Thiolreaktiver Pegylierung anzubringen. Thiol-reaktive Pegylierung bezeichnet wie hierin verwendet ein Verfahren zur Anbringung von Poly(ethylenglykol) an ein Zielprotein (IGFBP-4-Mutante) durch die Verwendung von aktiviertem, Thiolreaktivem Poly(ethylenglykol), vorzugsweise durch die Verwendung von N-Maleimidestern von vorzugsweise Methoxypoly(ethylenglykol). Die Kopplungsreaktion bringt vorzugsweise Poly(ethylenglykol) an Cys 110 und/oder Cys 117 an. Eine solche Sulfhydryl-Konjugation von PEG an Proteine ist im Stand der Technik weithin bekannt. Ein Überblick über solche Verfahren findet sich beispielsweise auch bei Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. Gemäß Veronese kann die Konjugation von PEG an Thiolgruppen von Proteinen unter Verwendung von Thiol-aktivierten PEGs durchgeführt werden. Für eine solche Reaktion können aktivierte Thiol-reaktive PEGs, beispielsweise PEG-Orthopyridyldisulfid, PEG-Maleimid, PEG-Vinylsulfon und PEG-Iodacetamid verwendet werden.
  • Die Erfindung stellt pegylierte Formen von IGFBP-4 mit verbesserten Eigenschaften bereit. Solche pegylierten IGFBP-4-Konjugate enthalten eine oder zwei PEG-Gruppen, die linear oder verzweigt sind und die zufällig daran angebunden sind, wobei das Gesamtmolekulargewicht aller PEG-Gruppen in dem Konjugat etwa 30-40 kDa beträgt. Es ist für einen Fachmann offensichtlich, dass kleine Abweichungen von diesem Molekulargewichtsbereich möglich sind, solange das pegylierte IGFBP-4 keinen so negativen Einfluss auf normale Nierenzellen zeigt, wie er in Beispiel 15 für PEG20-IGFBP-4 beschrieben ist. Auch die Pegylierung von IGFBP-4 mit PEG mit höherem Molekulargewicht als 40 kDa führt zu einer Antitumorwirkung. Es wird jedoch angenommen, dass diese Wirkung mit zunehmendem Molekulargewicht aufgrund der verringerten Tumorpenetration abnimmt.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet „Molekulargewicht" das mittlere Molekulargewicht des PEG. Die Bezeichnung „etwa" vor einem bestimmten Molekulargewicht deutet an, dass in den PEG-Präparationen einige Moleküle mehr und einige weniger als das angegebene Molekülgewicht wiegen.
  • Die folgenden pegylierten Formen von IGFBP-4 sind Beispiele für die erfindungsgemäßen Konjugate und als Ausführungsformen anzusehen:
    • – monopegyliertes IGFBP-4, worin die PEG-Gruppe ein Molekulargewicht von 30 oder 40 kDa aufweist;
    • – dipegyliertes IGFBP-4, worin die PEG-Gruppen ein Molekulargewicht von jeweils etwa 20 kDa aufweisen;
    und Gemische davon.
  • „PEG oder PEG-Gruppe" bedeutet erfindungsgemäß einen Rest, der Poly(ethylenglykol) als wesentlichen Teil enthält. Ein solches PEG kann weitere chemische Gruppen enthalten, die für Bindungsreaktionen notwendig sind; die sich aus der chemischen Synthese des Moleküls ergeben; oder bei denen es sich um einen Spacer für einen optimalen Abstand der Teile des Moleküls voneinander handelt. Außerdem kann ein solches PEG aus einer oder mehreren PEG-Seitenketten bestehen, die miteinander verknüpft sind. PEG-Gruppen mit mehr als einer PEG-Kette werden mehrarmige oder verzweigte PEGs genannt. Verzweigte PEGs können beispielsweise durch die Addition von Polyethylenoxid oder verschiedenen Polyolen einschließlich Glycerin, Pentaerythritol und Sorbitol hergestellt werden. Z.B. kann ein vierarmig verzweigtes PEG aus Pentaerythritol und Ethylenoxid hergestellt werden. Verzweigte PEGs besitzen üblicherweise 2-8 Arme und sind beispielsweise in EP-A 0 473 084 und in US-Patent Nr. 5,932,462 beschrieben. Besonders bevorzugt sind PEGs mit zwei PEG-Seitenketten (PEG2), die über primäre Aminogruppen von einem Lysin verknüpft sind (Monfardini, C., et al., Bioconjug. Chem. 6 (1995) 62-69).
  • „Im Wesentlichen homogen" bedeutet wie hierin verwendet, dass die einzigen pegylierten IGFBP-4-Moleküle, die hergestellt werden, enthalten sind oder verwendet werden, solche sind, die eine oder zwei angebundene PEG-Gruppen enthalten. Die Präparation kann kleine Mengen von nicht umgesetztem Protein enthalten (d.h., dem die PEG-Gruppe fehlt). Wie durch Peptidmapping und N-terminale Sequenzierung bestätigt wurde, ermöglicht ein nachstehendes Beispiel die Herstellung von wenigstens 90% PEG-IGFBP-4-Konjugat (vorzugsweise monopegyliert) und höchstens 5% nicht umgesetztem Protein. Isolierung und Reinigung solcher homogener Präparationen von pegyliertem IGFBP-4 können über übliche Reinigungsverfahren, vorzugsweise Größenausschlusschromatographie, erfolgen.
  • „Monopegyliert" bedeutet wie hierin verwendet, dass IGFBP-4 an nur einer Aminogruppe pro IGFBP-4-Molekül pegyliert ist, so dass nur eine PEG-Gruppe kovalent an diese Stelle gebunden ist und die Anbindungsstellen können innerhalb der monopegylierten Spezies variieren. Das monopegylierte IGFBP-4 beträgt wenigstens 90% der Präparation und am meisten bevorzugt beträgt das monopegylierte IGFBP-4 92% oder mehr der Präparation, wobei es sich bei dem Rest um nicht umgesetztes (nicht pegyliertes) IGFBP-4 handelt. Die monopegylierten IGFBP-4-Präparationen gemäß der Erfindung sind daher ausreichend homogen, um die Vorteile einer homogenen Präparation z.B. in einer pharmazeutischen Anwendung zu zeigen. Dasselbe trifft für die dipegylierten Spezies zu.
  • „Aktivierte PEGs oder aktivierte PEG-Reagenzien" sind im Stand der Technik gut bekannt. Vorzugsweise werden elektrophil aktivierte PEGs wie beispielsweise Alkoxybutansäuresuccinimidester von Poly(ethylenglykol) („Niederalkoxy-PEG-SBA") oder Alkoxypropionsäuresuccinimidester von Poly (ethylenglykol) („Niederalkoxy-PEG-SPA") oder N-Hydroxysuccinimid-aktivierte PEGs verwendet. Ein beliebiges herkömmliches Verfahren zur Umsetzung eines aktivierten Esters mit einem Amin, um ein Amid zu bilden, kann eingesetzt werden. In der Reaktion des aktivierten PEG mit IGFBP-4 ist der beispielhafte Succinimidester eine Abgangsgruppe, die zur Amidbildung führt. Die Verwendung von Succinimidestern zur Herstellung von Konjugaten mit Proteinen ist in US-Patent Nr. 5,672,662 offenbart.
  • Wenn das Pegylierungsreagenz mit IGFBP-4 kombiniert wird, so findet man, dass bei einem pH-Wert von etwa 7,0, einem Protein:PEG-Verhältnis von etwa 1:3 und einer Reaktionstemperatur von 20-25 °C ein Gemisch von mono- und dipegylierten Spezies und Spurenmengen der tripegylierten Spezies hergestellt werden. Wenn das Protein:PEG-Verhältnis etwa 1:1 beträgt, wird in erster Linie die monopegylierte Spezies hergestellt. Durch Beeinflussung der Reaktionsbedingungen (z.B. Verhältnis der Reagenzien, pH-Wert, Temperatur, Proteinkonzentration, Reaktionsdauer, etc.) können die relativen Mengen der verschiedenen pegylierten Spezies variiert werden.
  • Monopegyliertes IGFBP-4 kann auch nach den in WO 94/01451 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. WO 94/01451 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids mit einer modifizierten terminalen Aminosäure-α-Kohlenstoff-reaktiven Gruppe. Die Schritte des Verfahrens schließen die Bildung des rekombinanten Polypeptids und dessen Schutz mit einer oder mehreren biologisch hinzugefügten Schutzgruppen an dem N-terminalen α-Amin und C-terminalen α-Carboxyl ein. Das Polypeptid kann dann mit chemischen Schutzreagenzien umgesetzt werden, um reaktive Seitenkettengruppen selektiv zu schützen und dadurch eine Modifizierung der Seitenkettengruppen zu verhindern. Das Polypeptid wird dann mit einem für die biologische Schutzgruppe spezifischen Spaltungsreagenz gespalten, um eine ungeschützte terminale Aminosäure-α-Kohlenstoff-reaktive Gruppe zu bilden. Die nicht geschützte terminale Aminosäure-α-Kohlenstoff-reaktive Gruppe wird mit den aktivierten PEG-Reagenzien modifiziert. Das Seitenketten-geschützte terminal modifizierte einzelne Polypeptid wird dann an den Seitenkettengruppen entschützt, um ein terminal modifiziertes rekombinantes einzelnes Polypeptid zu bilden. Die Anzahl und Abfolge der Schritte in dem Verfahren kann variiert werden, um eine selektive Modifizierung zu erzielen.
  • Erfindungsgemäße IGFBP-4-Konjugate können hergestellt werden, indem eine primäre Aminogruppe eines IGFBP-4-Proteins kovalent mit einem bifunktionalen Reagenz umgesetzt wird, um ein Intermediat mit einer Amidverknüpfung zu bilden und indem das Intermediat, welches eine Amidverknüpfung enthält, kovalent mit einem aktivierten Poly(ethylenglykol)-Derivat umgesetzt wird unter Bildung eines IGFBP-4-Proteinkonjugats. In dem vorstehenden Verfahren ist das bifunktionale Reagenz vorzugsweise N-Succinimidyl-S-Acetylthiopropionat oder N-Succinimidyl-S-Acetylthioacetat und das aktivierte Poly(ethylenglykol)-Derivat ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Iod-Acetyl-Methoxy-PEG, Methoxy-PEG-Vinylsulfon und Methoxy-PEG-Maleimid.
  • Die IGFBP-4-Konjugate können durch Amino-reaktive kovalente Verknüpfung von Thiolgruppen mit IGFBP-4 („Aktivierung") und Kopplung des resultierenden aktivierten IGFBP-4 mit einem Poly(ethylenglykol) (PEG)-Derivat hergestellt werden. Der erste Schritt umfasst die kovalente Verknüpfung von Thiolgruppen über NH2-Gruppen von IGFBP-4. Diese Aktivierung von IGFBP-4 wird mit bifunktionalen Reagenzien durchgeführt, die eine geschützte Thiolgruppe tragen und eine zusätzliche reaktive Gruppe wie etwa aktive Ester (z.B. ein Succinimidester), Anhydride, Ester von Sulfonsäuren, Halogenide von Carbonsäuren bzw. Sulfonsäuren. Die Thiolgruppe wird durch im Fachbereich bekannte Gruppen geschützt, z.B. durch Acetylgruppen. Diese bifunktionalen Reagenzien sind in der Lage, mit den ε-Aminogruppen der, Lysinaminosäuren unter Bildung einer Amidverknüpfung zu reagieren. Die Herstellung der bifunktionalen Reagenzien ist im Fachbereich bekannt. Vorläufer bifunktionaler NHS-Ester sind in DE 39 24 705 beschrieben, wohingegen die Derivatisierung der Acetylthioverbindung in March, J. Advanced Organic Chemistry (1977) 375-376 beschrieben ist. Das bifunktionale Reagenz SATA ist kommerziell erhältlich (Molecular Probes, Eugene, OR, USA und Pierce, Rockford, IL) und in Duncan, R. J., Anal. Biochem. 132 (1983) 68-73 beschrieben.
  • Die Anzahl der Thiolgruppen, die an ein IGFBP-4-Molekül addiert werden sollen, kann gewählt werden, indem die Reaktionsparameter angepasst werden, d.h. die Protein (IGFBP-4)-Konzentration und das Verhältnis Protein/bifunktionales Reagenz. Vorzugsweise wird das IGFBP-4 durch kovalente Verknüpfung von 1 bis 5 Thiolgruppen pro IGFBP-4-Molekül aktiviert, weiter bevorzugt sind 1,5 bis 3 Thiolgruppen pro IGFBP-4-Molekül. Diese Bereiche beziehen sich auf die statistische Verteilung der Thiolgruppen über die IGFBP-4-Proteinpopulation.
  • Die Reaktion wird beispielsweise in einer wässrigen Pufferlösung, pH 6,5-8,0 durchgeführt, z.B. in 10 mM Kaliumphosphat, 300 mM NaCl, pH 7,3. Das bifunktionale Reagenz kann in DMSO hinzugefügt werden. Nach Beendigung der Reaktion, vorzugsweise nach 30 min, wird die Reaktion durch Hinzufügen von Lysin gestoppt. Überschüssiges bifunktionales Reagenz kann durch im Fachbereich bekannte Verfahren abgetrennt werden, z.B. durch Dialyse oder Säulenfiltration. Die durchschnittliche Anzahl von Thiolgruppen, die zu IGFBP-4 hinzugefügt werden, kann über photometrische Verfahren, die beispielsweise in Grasetti, D. R., und Murray, J. F. in J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49 beschrieben sind, bestimmt werden.
  • Im Anschluss an die obige Reaktion folgt die kovalente Kopplung eines aktivierten Poly(ethylenglykol) (PEG)-Derivates. Geeignete PEG-Derivate sind aktivierte PEG-Moleküle mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 15 bis etwa 40 kDa, in Abhängigkeit davon, ob mono- oder dipegyliertes Produkt gewünscht ist.
  • Aktivierte PEG-Derivate sind im Fachbereich bekannt und werden beispielsweise in Morpurgo, M., et al. J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368 für PEG-Vinylsulfon beschrieben. Geradkettige und verzweigtkettige PEG-Spezies sind für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen geeignet.
  • Beispiele für reaktive PEG-Reagenzien sind Iod-Acetyl-Methoxy-PEG und Methoxy-PEG-Vinylsulfon. Die Verwendung dieser Iod-aktivierten Substanzen ist im Fachbereich bekannt und wird z.B. von Hermanson, G. T., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) S. 147-148 beschrieben.
  • Ein bevorzugtes Verfahren für die Cystein-spezifische Pegylierung wie hierin verwendet bezeichnet ein Verfahren zur Anbringung von Poly(ethylenglykol)-Ketten an ein Zielpolypeptid (IGFBP-4) unter Verwendung eines 20 kDa Methoxy-Poly(ethylenglykol)-Maleimids oder eines verzweigten 40 kDa PEG2-Maleimids (=PEG-Maleimid) (Shearwater Polymers, Inc.; Huntsville, Alabama) an eine reduzierte Sulfhydrylgruppe der Polypeptidkette des Proteins. Natives IGFBP-4 besitzt keine freien Cysteine, da alle Cysteine an der Bildung von Disulfidbindungen beteiligt sind. Die Reduktion von nativem IGFBP-4 in Gegenwart milder oder niedriger Konzentrationen von Reduktionsmitteln wie etwa β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol oder TCEP führt zu einer selektiven Öffnung einer Disulfidbindung und zur Freilegung reduzierter Sulfhydrylgruppen, die spezifisch mit PEG-Maleimid modifiziert werden können.
  • Man nimmt an, dass die Disulfidbindungen in der mittleren Domäne von IGFBP-4 hochempfindlich gegenüber Reduktion sind und daher eine Cysteinspezifische Pegylierung an Cystein110 oder Cystein117 ermöglichen. Die Spezifität der Kopplungsreaktion für Cystein110 und 117 von IGFBP-4 wurde durch Peptidmapping des isolierten monopegylierten IGFBP-4 und durch Identifizierung der Peptide mittels LC-MS-Massenspektrometrie und Sequenzierung der Peptidpeaks bestätigt. Pegylierte Formen von IGFBP-4 zeigten eine verringerte Peakfläche des Peptids, welches die zwei Cysteine enthält.
  • Am meisten bevorzugt werden die PEG-Spezies durch Maleimid aktiviert, unter Verwendung von (Alkoxy-PEG-Maleimid) wie etwa Methoxy-PEG-Maleimid (MW 15.000 bis 40.000; Shearwater Polymers, Inc.). Die Kopplungsreaktion mit Alkoxy-PEG-Maleimid erfolgt nach der in situ-Spaltung der Thiolschutzgruppe in einer wässrigen Pufferlösung, z.B. 10 mM Kaliumphosphat, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2. Die Abspaltung der Schutzgruppe kann beispielsweise mit Hydroxylamin in DMSO bei 25 °C, pH 6,2 für etwa 90 min durchgeführt werden. Für die PEG-Modifizierung sollte das Verhältnis von aktiviertem IGFBP-4 zu Alkoxy-PEG-Maleimid von etwa 1:1 bis etwa 1:6 betragen. Die Reaktion kann gestoppt werden durch Hinzufügen von Cystein und Umsetzung der verbleibenden Thiol (SH)-Gruppen mit N-Methylmaleimid oder anderen entsprechenden Verbindungen, die in der Lage sind, Disulfidbindungen zu bilden. Aufgrund der Reaktion jeglicher verbleibender aktiver Thiolgruppen mit einer Schutzgruppe wie etwa N-Methylmaleimid oder einer anderen geeigneten Schutzgruppe können die IGFBP-4-Proteine in den erfindungsgemäßen Konjugaten solche Schutzgruppen enthalten. Im Allgemeinen wird das hierin beschriebene Verfahren ein Gemisch von Molekülen erzeugen, die unterschiedliche Anzahlen von Thiolen enthalten, die durch unterschiedliche Anzahlen der Schutzgruppe geschützt sind, abhängig von der Anzahl aktivierter Thiolgruppen an dem Protein, die nicht an PEG-Maleimid konjugiert waren.
  • Während N-Methylmaleimid bei der Verwendung zur Blockierung der verbleibenden Thiolgruppen an dem pegylierten Protein dieselbe Art von kovalenter Bindung bildet, werden Disulfidverbindungen in einer intermolekularen Sulfid/Disulfid-Austauschreaktion zu einer Disulfidverbrückten Kopplung des Blockierungsreagenzes führen. Bevorzugte Blockierungsreagenzien für diese Art der Blockierungsreaktion sind oxidiertes Glutathion (GSSG), Cystein und Cystamin. Während mit Cystein keine zusätzliche Nettoladung in das pegylierte Protein eingebracht wird, führt die Verwendung der Blockierungsreagenzien GSSG oder Cystamin zu einer zusätzlichen negativen oder positiven Ladung.
  • Thiol-reaktive Pegylierung von IGFBP-4-Mutanten kann nach Verfahren des Standes der Technik durchgeführt werden (siehe z.B. WO 94/22466 und Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417). Weitere aktivierte PEG- Derivate sind im Fachbereich bekannt und werden beispielsweise in Morpurgo, M., et al. J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368 für PEG-Vinylsulfon beschrieben. Linearkettige und verzweigtkettige PEG-Spezies sind für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen geeignet. Beispiele für reaktive PEG-Reagenzien sind Iod-Acetyl-Methoxy-PEG und Methoxy-PEG-Vinylsuifon. Die Verwendung dieser Iod-aktivierten Substanzen ist im Fachbereich bekannt und wird beispielsweise von Hermanson, G. T., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) S. 147-148 beschrieben.
  • Die weitere Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen einschließlich der Abtrennung von mono- und/oder dipegylierten IGFBP-4-Spezies von höher pegylierten Formen kann durch im Fachbereich bekannte Verfahren erfolgen, z.B. durch Säulenchromatographie.
  • Der Prozentsatz monopegylierter Konjugate sowie das Verhältnis von Mono- und Di-PEG-Spezies kann kontrolliert werden, indem breitere Fraktionen um den Elutionspeak zusammengefasst werden, um den Prozentsatz von Mono-PEG zu verringern oder indem engere Fraktionen zusammengefasst werden, um den Prozentsatz von Mono-PEG in der Zusammensetzung zu erhöhen. Etwa 90% Mono-PEG-Konjugate stellt ein gutes Gleichgewicht zwischen Ausbeute und Aktivität dar. Manchmal können Zusammensetzungen, in denen beispielsweise wenigstens 92% oder wenigstens 96% der Konjugate Mono-PEG-Spezies sind (n gleich 1) gewünscht sein. In einer Ausführungsform dieser Erfindung beträgt der Prozentsatz von Konjugaten, bei denen n 1 ist, 90% bis 96%.
  • Pharmazeutische Formulierungen:
  • Pegyliertes IGFBP-4 kann als Gemisch oder als durch Ionenaustauschchromatographie oder Größenausschlusschromatographie aufgetrennte unterschiedliche pegylierte Spezies verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gemäß der Verfahren für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, bei denen es sich um dem Fachmann bekannte Verfahren handelt, formuliert werden. Für die Herstellung solcher Zusammensetzungen wird erfindungsgemäßes pegyliertes IGFBP-4 in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert, vorzugsweise durch Dialyse gegen eine wässrige Lösung, die die gewünschten Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen enthält. Solche annehmbare Träger sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, 1990, Mack Publishing Company, herausgegeben von Oslo et al. (z.B. S. 1435-1712) beschrieben. Typische Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge der erfindungsgemäßen Substanz, beispielsweise von etwa 0,1 bis 100 mg/ml, zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers. Die Zusammensetzungen können parenteral verabreicht werden.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen können nach im Fachbereich bekannten Verfahren hergestellt werden. Üblicherweise werden Lösungen von pegyliertem IGFBP-4 gegen einen Puffer dialysiert, der in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden soll und die gewünschte Proteinendkonzentration wird durch Aufkonzentrieren oder Verdünnen eingestellt.
  • Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können für die Verabreichung zur Injektion oder Infusion verwendet werden und enthalten eine wirksame Menge des monopegylierten IGFBP-4 zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnern, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Emulgatoren, Hilfsstoffen und/oder Trägern. Solche Zusammensetzungen beinhalten Verdünner mit verschiedenem Puffergehalt (z.B. Arginin, Acetat, Phosphat), pH- und Ionenstärke, Zusatzstoffe wie etwa Detergenzien und Solubilisierungsmittel (z.B. TweenTM 80/Polysorbat, PluronicTM F68), Antioxidanzien (z.B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (TimersolTM, Benzylalkohol) und Füllstoffe (z.B. Saccharose, Mannitol), die Aufnahme des Materials in teilchenförmige Präparationen polymerer Verbindungen wie etwa Polymilchsäure, Polyglykolsäure, etc. oder in Liposome. Solche Zusammensetzungen können die Stabilität des physikalischen Zustands, die Freisetzungsrate und Clearance des erfindungsgemäßen monopegylierten IGFBP-4 beeinflussen.
  • Dosierungen und Arzneistoffkonzentrationen:
  • Typischerweise werden bei einer standardmäßigen Krebsbehandlungsmethode Patienten mit Dosierungen im Bereich zwischen 0,01 bis 3 mg an pegyliertem IGFBP-4 pro kg pro Tag über einen bestimmten Zeitraum, der von 1 Tag bis zu etwa 30 Tagen oder noch länger dauern kann, behandelt. Der Arzneistoff wird als einzelne Tagesdosis subkutan oder i.v. oder i.p. (intraperitoneal) als Bolusinjektion oder Infusion einer pharmazeutischen Formulierung, die 0,1 bis 100 mg pegyliertes IGFBP-4 pro ml enthält, angewendet. Diese Behandlung kann mit einer beliebigen Standardbehandlung (z.B. Chemotherapie) komibinert werden, indem pegyliertes IGFBP-4 vor, während oder nach der Standardbehandlung eingesetzt wird. Dies führt zu einem verbesserten Ergebnis im Vergleich zu der Standardbehandlung allein.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1: Pegylierung von IGFBP-4 mit 40 kDa PEG und Auftrennung der pegylierten Produkte mit SEC.
    • A) Coomassie-angefärbtes SDS-PAGE des Ausgangsmaterials (Bahn 1) und Ergebnis der 40 kDa-Pegylierungsreaktion. Std = Mark12 Molekulargewichtsstandard (Invitrogen); 1 = IGFBP-4-Wildtyp (Ausgangsmaterial); 2 = IGFBP-4 nach Pegylierung mit 40 kDa mPEG2.
    • B) Auftrennung der pegylierten Produkte mittels Größenausschlusschromatographie („SEC"). SEC von zufällig 40 kDa pegyliertem IGFBP-4 wurde an Superose 6 (Pharmacia) in 20 mM Phosphat pH 7,5, 500 mM NaCl, Fließrate 0,5 ml/min durchgeführt.
    • C) Analyse pegylierter Produkte mittels SDS-PAGE. Std = Mark12 Molekulargewichtsstandard (Invitrogen); 3 = polyPEG40-IGFBP-4; 4 = nicht pegyliertes IGFBP-4; 5 = monoPEG40-IGFBP-4.
  • 2: Serumkinetik von mono40kDa-PEG-IGFBP-4 im Vergleich zu mono20kDa-PEG-IGFBP-4 und nicht pegyliertem IGFBP-4.
    SCID-Mäusen wurde subkutan eine Einzeldosis von 1 mg/200 μl mono40kDa-PEG-IGFBP-4 oder mono20kDa-PEG-IGFBP-4 oder nicht pegyliertem IGFBP-4 in PBS injiziert. Serumproben wurden in einem Zeitrahmen von 0,5 bis 120 h nach Injektion wie angegeben gesammelt und auf mono40kDa-PEG-IGFBP-4 oder mono20kDa-PEG-IGFBP-4 oder nicht pegyliertes IGFBP-4 analysiert mittels Western Blotting mit einem Anti-IGFBP-4-Antikörper (UBI) nach Affinitätsreinigung oder mittels ELISA.
  • 3: Hemmung der IGF-I-vermittelten Phosphorylierung von IGF-I-Rezeptor durch IGFBP-4-Derivate.
    • A) Western Blot-Analyse der IGF-IR-Phosphorylierung durch IGF-I in Abwesenheit und Anwesenheit der IGFBP-4-Derivate. IGF-I-Rezeptor überexprimierende NIH3T3-Zellen wurden mit 2 nM IGF-I in Gegenwart oder Abwesenheit eines dreifachen Überschusses von IGFBP-4 stimuliert. Nach 10 min wurden die Zellen lysiert und die Lysate wurden einer Western Blot-Behandlung mit Antiphosphotyrosin-Antikörpern unterzogen, um Tyrosin-phosphorylierten IGF-I-Rezeptor nachzuweisen. mono20kDa-PEG-IGFBP-4 und mono40kDa-PEG-IGFBP-4 hemmten die Rezeptorstimulierung vollständig bei Konzentrationen von 6 nM. Im Hinblick auf die Hemmung der IGF-I-induzierten IGF-I-Rezeptor-Phosphorylierung erwiesen sich beide pegylierten Formen von IGFBP-4 als ebenso wirkungsvoll wie Wildtyp-IGFBP-4.
    • B) Titration der IGF-I-vermittelten Phosphorylierung von IGF-I-Rezeptor durch IGFBP-4-Derivate. NIH3T3-Zellen, welche IGF-I-Rezeptor überexprimieren, wurden mit 3,3 nM IGF-I in Gegenwart oder Abwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von IGFBP-4-Derivaten stimuliert. Nach 10 min wurden die Zellen lysiert und die Lysate wurden einem ELISA unterzogen, auf Grundlage der Messung des phosphorylierten IGF-I-Rezeptors. Monopegyliertes IGFBP-4 (20 oder 40 kDa) und Wildtyp-IGFBP-4 hemmten die Rezeptorstimulation mit einem IC50 von 3 nM.
  • 4: (GF-Bindung von MonoPEG20-IGFBP-4 wurde mittels Größenausschlusschromatographie bestimmt.
    Die Bindungsfähigkeiten von IGFBP-4 oder pegylierten Isoformen davon wurden durch einen Assay auf Basis von Größenausschlusschromatographie bestimmt. 70 nmol (6 μg) IGF-I wurden auf die Säule injiziert (HRP 75, Pharmacia; Betriebsbedingungen: 20 mM Natriumphosphat pH 7,4, 500 mM NaCl, 1 ml/min) entweder allein oder zusammen mit 96 nmol mono20kDa-PEG-IGFBP-4 (äquivalent zu 25 μg Wildtyp-IGFBP-4) nach einem Vorinkubationsschritt (30 min bei Raumtemperatur). Freies IGF-I wird quantifiziert mittels Integration des IGF-I-Peaks des Chromatogramms (Chromeleon, Dionex). Die Peakfläche ist negativ korreliert mit der Bindungskapazität von IGFBP-4. In dem gezeigten Experiment sind mehr als 90% des IGF-I durch mono20kDa-GFBP-4 gebunden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit mono40kDa-PEG-IGFBP-4 erhalten.
  • 5: Hemmung der IGF-I-Bindung an immobilisiertes Wildtyp-IGFBP-4 durch Wildtyp-, mono- und poly20kDa zufällig pegyliertes IGFBP-4. Bestimmung der IC50-Werte von Wildtyp-, monoPEG-IGFBP-4 und polyPEG-IGFBP-4. Für die Messung der IC50-Werte wurde Wildtyp-IGFBP-4 auf der Oberfläche eines Sensorchips immobilisiert. Die Bindung von IGF-I (10 nM) an das immobilisierte IGFBP-4 wurde durch Zugabe steigender Konzentrationen an Wildtyp-IGFBP-4, monoPEG20-IGFBP-4 und polyPEG20-IGFBP-4 vor dem Kontakt mit dem Chip gechallenged. Es stellte sich heraus, dass die Kompetition der IGF-I-Bindung an das immobilisierte IGFBP-4 mit mono- oder polypegyliertem IGFBP-4 ebenso effizient ist wie mit Wildtyp-IGFBP. Ähnliche Ergebnisse wurden mit 40 kDa-PEG-IGFBP-4 erhalten.
  • Beispiel 1
  • Fermentation, Renaturierung und Reinigung von IGFBP-4
  • Die Herstellung von rekombinantem Wildtyp-IGFBP-4 in E. coli oder Hefe wurde beispielsweise von Miyakoshi, N., et al., Endocrinology 142 (2001) 2641-2648 und von Kiefer, M. C., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 12692-12699 beschrieben. Humanes rekombinantes IGFBP-4 ist außerdem kommerziell erhältlich (z.B. von GroPep Ltd.; Adelaide, Australien).
  • Fermentationsbedingungen:
  • Eine Keimkultur erfolgte in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einem Kulturvolumen von 100 ml bei 37 °C auf einem Schüttelinkubator für 7 h. Die Hauptkultur wurde als Fermentation einer 10 l-Charge mit einem Anfangsvolumen von 8 l durchgeführt. Der pH-Wert des Kulturmediums (Springer-Hefe 50 g/l, K2HPO4·3H2O3 g/l, MgSO4·7H2O 0,74 g/l, Glukose 4,0 g/l, Ampicillin 100 mg/l, Kanamycinsulfat 50 mg/l) wurde bei pH 6,8 + 0,3 gehalten durch Zugabe einer Ammoniaklösung (12% w/v) als Base und einer Glukosemonohydratlösung (75% w/v) als Säure und Kohlenstoffquelle. Die Menge an gelöstem Sauerstoff wurde bei oder über 20% gehalten, indem Luft mit einer Rate von 1,0 vvm zugeführt wurde und die Rührgeschwindigkeit verändert wurde (500 Upm-1000 Upm).
  • Nachdem die Kultur eine optische Dichte (OD) von 10 erreichte (gemessen bei 580 nm mit einem UV-sichtbar Spektrometer) wurde mit der Zugabe einer Springer-Hefe-Lösung (500 g/l) begonnen. Die Induktion der Proteinexpression wurde bei einer OD von 15 mit 1 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) durchgeführt. IGFBP-4 wird überwiegend in unlöslicher Form als Einschlusskörper exprimiert (ungefähr 80%).
  • Die Kultur wurde für bis zu 12 h fortgesetzt für einen OD von 35 und anschließend wurden die Zeilen durch Zentrifugation geerntet (13.000 Upm für 30 min).
  • Isolierung und Reinigung der Einschlusskörper:
  • Das Zellpellet wurde in einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), der 1 mM MgSO4 enthielt, suspendiert. Nach Zugabe von 0,3 g Lysozym pro 100 g Trockenzellgewicht und 30 U Benzonase pro 1 g Trockenzellgewicht wurde die Zellsuspension einer französischen Presse unterzogen (1000 bar (14.500 psi), ein Zyklus), um diese zu zerbrechen. Nach dem Zerbrechen wurde die Suspension 1:2 mit Brij-Puffer (200 ml/l Brij 30%, 1,5 M NaCl, 0,1 M EDTA, pH 7,0) verdünnt und bei Raumtemperatur für weitere 30 min gerührt. Um die Einschlusskörper zu isolieren, wurde die Suspension bei 13.000 Upm für 30 min zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,5) resuspendiert, der 5 mM EDTA enthielt und erneut bei 13.000 Upm für 30 mm zentrifugiert. Das Pellet, welches die gereinigten Einschlusskörper enthielt, wurde bis zur weiteren Reinigung von IGFBP-4 bei –20 °C gelagert.
  • Solubilisierung, Naturierung und Reinigung:
  • 20 g Einschlusskörper wurden in einem Puffer solubilisiert, der 8 M Guanidiniumchlorid, 100 mM Tris, 5 mM EDTA und 100 mM DTE enthielt (pH 8,5). Nach der Solubilisierung wurde mit HCl pH 2,5 eingestellt und das Solubilisat wurde gegen 6 M Guanidiniumchlorid, 5 mM EDTA (pH 2,5) dialysiert. Der Proteingehalt wurde durch UV-Absorption analysiert. Naturierung erfolgte bei Raumtemperatur. Das ungefaltete Protein wurde in zwei Stufen (mit einem 5 h-Intervall) mit 0,25 mg Protein pro ml in einem Volumen von 4500 ml (0,6 M Arginin, 1 mM EDTA, 3 mM GSH, 1 mM GSSG (pH 8,5)) auf eine Proteinendkonzentration von 0,5 mg/ml verdünnt. Die Naturierung wurde über Nacht abgeschlossen.
  • Die Naturierungsprobe wurde mit 25% (NH4)2SO4 aufgestockt und zentrifugiert. Der Überstand wurde gegen 50 mM Natriumcitrat, 100 mM NaCl (pH 4,5) dialysiert und auf 0,8 M (NH4)2SO4 und 0,2 M Arginin gebracht (durch Zugabe von festem (NH4)2SO4 und Verdünnung einer 1 M Arginin/HCl-Stammlösung).
  • Nach Anpassung des pH-Werts auf pH 8,5 mit NaOH wurde die Probe auf eine Phenylsepharosesäule aufgebracht (Phenylsepharose-Schnelldurchfluss (Pharmacia); equilibriert mit 20 mM Natriumphosphat, 100 mM NaCl, 1 M (NH4)2SO4 (pH 7,5)). Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer ohne (NH4)2SO4 gewaschen. Die Elution von IGFBP-4 wurde in einem Gradienten von 20 mM Natriumphosphat zu 20 mM Natriumphosphat ergänzt mit 50% Ethylenglykol erzielt und durch eine Nachelutionswaschung mit 20 mM Natriumphosphat, 100 mM NaCl, 50% Ethylenglykol, pH 7,5.
  • Das Eluat wurde gemäß SDS-PAGE zusammengefasst, 1:2 mit 50 mM Citrat, pH 4,2 verdünnt und auf eine S-Sepharosesäule (Pharmacia) aufgebracht. Die Säule wurde mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5 gewaschen und die Elution erfolgte mit einem Gradienten zu 20 mM Natriumphosphat, 600 mM NaCl. IGFBP-4 wurde schließlich auf Grundlage von SDS-PAGE zusammengefasst.
  • Beispiel 2
  • 40 kDa-Pegylierung von IGFBP-4 (zufällige Amino-reaktive Pegylierung)
  • Die 40 kDa-Pegylierung wird durch Umsetzung von IGFBP-4 mit mPEG2-NHS-Ester, einem Lysinderivat, das zwei 20 kDa-PEG-Ketten und einen einzelnen reaktiven N-Hydroxysuccinimidester trägt, durchgeführt (Shearwater Polymers, Inc.; Huntsville, Alabama, USA; im Folgenden als 40 kDa-mPEG2 bezeichnet).
  • IGFBP-4 wird durch Zugabe einer wässrigen Lösung von 40 kDa-mPEG2 zu einer konzentrierten IGFBP-4-Lösung in PBS pegyliert. 40 kDa-mPEG2 wurde in einem molaren Verhältnis von 2 Molekülen PEG pro Molekül IGFBP-4 hinzugefügt. Man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur für 30 min ablaufen und schließlich wurde sie durch Zugabe von 1 M Argininlösung (gepuffert auf pH 8,0 mit HCl) gequencht zu einer Endkonzentration von 100 mM.
  • Das Ergebnis der Pegylierungsreaktion wurde für eine maximale Produktion von monopegyliertem IGFBP-4 bei gleichzeitig minimalem Verbrauch an mPEG2-NHS-Reagenz optimiert, indem Protein- und PEG-Konzentrationen sorgfältig titriert wurden. Für IGFBP-4 sind die Ausbeuten der monopegylierten Isoformen bei erhöhten Proteinkonzentrationen (c = 5 mg/ml oder mehr) und einem zweifachen molaren Überschuss an Pegylierungsreagenz am besten.
  • Beispiel 3
  • N-terminale Pegylierung von IGFBP-4
  • N-terminale spezifische Pegylierung bedeutet, wie hierin verwendet, ein Verfahren zum Anbringen von Poly(ethylenglykol)-Ketten an ein Zielpolypeptid (IGFBP-4) durch die Verwendung eines Poly(ethylenglykol)-Aldehyds bei saurem pH unter reduzierenden Bedingungen. Die Kopplungsreaktion bindet vorzugsweise PEG-Aldehyd an die N-terminale Aminogruppe einer Polypeptidkette an, wobei wenige oder keine Nebenreaktionen an denen ε-Aminogruppen von Lysin beteiligt sind, auftreten.
  • Humanes IGFBP-4 wurde gegen 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, dialysiert und durch Zugabe einer wässrigen Lösung von 40 kDa oder 20 kDa PEG-Aldehyd (Shearwater Polymers, Inc.; Huntsville, Alabama) pegyliert. PEG-Aldehyd wurde in einem molaren Verhältnis von 2 Molekülen PEG pro Molekül IGFBP-4 hinzugefügt. PEG-Aldehyd bildet eine Schiffsche Base mit der N-terminalen Aminogruppe, die anschließend (d.h. nach 1 h Inkubation) durch Zugabe von Natriumcyanoborhydrid auf eine Endkonzentration von 20 mM reduziert wird. Man lässt die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur fortschreiten.
  • Das Ergebnis der Pegylierungsreaktion wurde für eine maximale Produktion von N-terminal monopegyliertem IGFBP-4 bei gleichzeitig minimalem Verbrauch an PEG-Aldehydreagenz optimiert, indem Protein- und PEG-Konzentrationen sorgfältig titriert wurden. Für IGFBP-4 sind die Ausbeuten der N-terminal monopegylierten Isoformen bei erhöhten Peptidkonzentrationen (c = 1 mg/ml oder mehr) und einem 1,5-molaren Überschuss an Pegylierungsreagenz am besten. Die Reinigung von monopegyliertem IGFBP-4 wurde wie für das zufällig pegylierte Protein beschrieben durchgeführt. Die Spezifität der Kopplungsreaktion für den N-Terminus des Proteins wurde durch N-terminale Sequenzierung bestätigt sowie durch Peptidmapping des isolierten monopegylierten IGFBP-4 durch Verwendung der Endoproteinase Lys C (Sequenzierungsgrad; Roche Diagnostics GmbH; Deutschland) und Identifizierung der Peptide durch LC-MS-Massenspektrometrie.
  • Beispiel 4
  • Cystein-spezifische Pegylierung von Wildtyp-IGFBP-4
  • Cystein-spezifische Pegylierung bedeutet, wie hierin verwendet, ein Verfahren zum Anbringen von Poly(ethylenglykol)-Ketten an ein Zielpolypeptid (IGFBP-4) durch die Verwendung eines 20 kDa-Methoxy-Poly(ethylenglykol)-Maleimids oder eines verzweigten 40 kDa PEG2-Maleimids (= PEG-Maleimid) (Shearwater Polymers, Inc.; Huntsville, Alabama) an eine reduzierte Sulfhydrylgruppe der Polypeptidkette des Proteins. Natives IGFBP-4 besitzt keine freien Cysteine, da alle Cysteine an der Bildung von Disulfidbindungen beteiligt sind. Die Reduktion von nativem IGFBP-4 in Gegenwart von milden oder niedrigen Konzentrationen an Reduktionsmitteln wie etwa β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol oder TCEP führt zu einer selektiven Öffnung einer Disulfidbindung und zur Freilegung reduzierter Sulfhydrylgruppen, die spezifisch mit PEG-Maleimid modifiziert werden können.
  • IGFBP-4 wurde bei einer Konzentration von 0,75 mg/ml gegen 20 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,2, dialysiert und DTT oder β-Mercaptoethanol wurden für Konzentrationen von 30 bis 1000 uM hinzugefügt. Die Gemische wurden für 4 h inkubiert und anschließend wurde eine wässrige Lösung von 20 kDa PEG-Maleimid zu einer Konzentration von 1,6 mg/ml hinzugefügt. Die Reaktion wurde gestoppt und nach 1 h durch SDS-PAGE analysiert. Monopegyliertes IGFBP-4 wurde aus den Proben isoliert, welche den höchsten Anteil dieses pegylierten Derivats enthielten, über die Verfahren, die für zufällig pegyliertes IGFBP-4 beschrieben wurden.
  • Es wird angenommen, dass die Disulfidbindungen in der mittleren Domäne von IGFBP-4 hochempfindlich gegenüber Reduktion sind und daher eine Cystein spezifische Pegylierung an Cystein 110 oder Cystein 117 ermöglichen. Die Spezifität der Kopplungsreaktion für Cystein 110 und 117 von IGFBP-4 wurde durch Peptidmapping des isolierten monopegylierten IGFBP-4 und durch Identifizierung der Peptide durch LC-MS-Massenspektrometrie und Sequenzierung der Peptidpeaks bestätigt. Pegylierte Formen von IGFBP-4 zeigten eine verringerte Peakfläche des Peptids, welches die beiden Cysteine enthält.
  • Beispiel 5
  • Reinigung von 40 kDa-PEG-IGFBP-4-Isomeren
  • Eine präparative Trennung der Pegylierungsprodukte für die biochemische und biologische Analyse wird durch Größenausschlusschromatographie an einer Sephacryl S 400-Säule (Pharmacia) in einem Laufpuffer, der aus 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, besteht und mit 500 mM Natriumchlorid ergänzt ist, erzielt.
  • Die 40 kDa-PEG-IGFBP-4-Isomere eluieren bei der Größenausschlusschromatographie im Vergleich zu der nicht modifizierten Form früher. Dies liegt an dem größeren hydrodynamischen Radius des Moleküls.
  • Die Elutionsfraktionen wurden weiter durch SDS-PAGE analysiert. In SDS-PAGE werden Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Pegylierte Formen von IGFBP-4 wanderten langsamer als das Wildtypprotein. Die Geschwindigkeit der Wanderung ist umgekehrt korreliert zu der Menge an PEG, die an das Protein gebunden ist. Die Auftrennung wurde an NOVEX 4-12% NuPage-Gels in einem MOPS SDS-Puffersystem durchgeführt.
  • Die Produkte wurden zu drei Gruppen zusammengefasst, die wie folgt bezeichnet werden:
    • – poly40kDa-PEG-IGFBP-4: eine gemischte Population von Pegylierungsisoformen, die aus mehr als 90% IGFBP-4, welches zwei oder mehr 40 kDa-mPEG2-Reste trägt, bestehen. Das theoretische Molekulargewicht des poly40kDa-PEG-IGFBP-4 beträgt 86 kDa und mehr. In SDS-PAGE laufen sie scheinbar bei mehr als 200.
    • – mono40kDa-PEG-IGFBP-4: eine zu mehr als 90% homogene Gruppe von pegyliertem IGFBP-4, bei der ein Molekül 40 kDa-mPEG2 an ein Molekül IGFBP-4 gebunden ist. Am wahrscheinlichsten besteht diese Gruppe aus einem Gemisch von Positionsisomeren, was bedeutet, dass die PEG-Kette an verschiedene Aminosäurereste in einzelnen Proteinmolekülen geknüpft sein kann. Das theoretische Molekulargewicht von mono40kDa-PEG-IGFBP-4 beträgt etwa 66 kDa. In SDS-PAGE läuft mono40kDa-PEG-IGFBP-4 scheinbar bei 120 kDa.
    • – Nicht pegyliertes IGFBP-4: eine homogene Gruppe von IGFBP-4, welches nicht mit dem PEG-Reagenz reagiert hat und beispielsweise für eine Rückführung zurückgewonnen wird.
  • Beispiel 6
  • a) Herstellung von zufällig pegyliertem IGFBP-4 (20 kDa)
  • Humanes rekombinantes Wildtyp-IGFBP-4 wurde zufällig pegyliert durch Zugabe einer wässrigen Lösung von N-Hydroxysuccinimidester von Methoxypoly(ethylenglykol)-Propionsäure, MW 20.000 (Shearwater Polymers, Inc.; Huntsville, Alabama; im Folgenden als 20 kDa-mPEG-SPA bezeichnet). 20 kDa mPEG-SPA wurde in einem molaren Verhältnis von 3 Molekülen PEG pro Molekül IGFBP-4 hinzugefügt. Man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur für 30 min fortschreiten und schließlich wurde durch Zugabe von 1 M Argininlösung (gepuffert auf pH 8,0 mit HCl) gequenscht zu einer Endkonzentration von 100 mM.
  • Das Ergebnis der Pegylierungsreaktion wurde für eine maximale Produktion von monopegyliertem IGFBP-4 bei gleichzeitig minimalem Verbrauch an mPEG-SPA-Reagenz optimiert, indem Protein- und PEG-Konzentrationen sorgfältig titriert wurden. Für IGFBP-4 Ist die Ausbeute der monopegylierten Isoformen bei erhöhten Proteinkonzentrationen (c = 5 mg/ml oder mehr) und einem 1,5-molaren Überschuss an Pegylierungsreagenz am besten.
  • b) Reinigung von 20kDa-PEG-IGFBP-4-Isomeren
  • Eine präparative Auftrennung der Pegylierungsprodukte für eine biochemische und biologische Analyse wurde durch Größenausschlusschromatographie an einer Sephacryl S 300-Säule (Pharmacia) in einem Laufpuffer, der aus 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, bestand und mit 500 mM Natriumchlorid ergänzt war, erzielt. Die 20 kDa pegylierten Spezies eluieren früher in der Größenausschlusschromatographie (SEC) im Vergleich zu der nicht modifizierten Form. Dies ist auf den größeren hydrodynamischen Radius des Moleküls zurückzuführen.
  • Die eluierten Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert. Bei SDS-PAGE werden Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Pegylierte Formen von IGFBP-4 wanderten langsamer als das Wildtypprotein. Die Geschwindigkeit der Wanderung ist umgekehrt korreliert zu der Menge an PEG, die an das Protein angebunden ist. Die Auftrennung wurde an NOVEX 4-12% NuPage-Gels in einem MOPS SDS-Puffersystem durchgeführt.
  • Beispiel 7
  • Entfernung von 40 kDa mPEG2 oder 20 kDa mPEG-SPA durch Ionenaustauschchromatographie
  • Restliche Pegylierungsreagenzien, die nicht mit IGFBP-4 reagierten, wurden durch Ionenaustauschchromatographie (IEC) unter Verwendung von SP Sepharose (Pharmacia) entfernt. Die Proben wurden vor der Beladung auf die Säule gegen 20 mM Natriumphosphat, pH 5,5, dialysiert, um die Konzentration an Natriumchlorid zu verringern und um den sauren pH einzustellen. Unter diesen Bedingungen band PEG nicht an das Säulenharz und wurde in dem Säulendurchfluss durch einen kolorimetrischen Assay detektiert, wie von Nag, A., et al., Anal. Biochem. 237 (1996) 224-231 beschreiben. Die Flution von gebundenem Protein wurde in einem einzelnen Schritt mit 300 mM Natriumchlorid in 20 mM Natriumphosphat, pH 5,5, durchgeführt. Die Proben wurden gegen 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid dialysiert, bevor sie gelagert oder weiter analysiert wurden.
  • Beispiel 8
  • Bestimmung der Bindungsaktivitäten durch Größenausschlusschromatographie
  • Verschiedene Mengen an IGFBP-4 (25 μg oder äquivalente Mengen an pegylierten Isoformen von IGFBP-4) wurden gegen bekannte Mengen (3,6 bzw. 9 μg) an IGF-I titriert. Restliches freies IGF-I wurde durch Peakintegration quantifiziert, nachdem es von IGF-I/IGFBP-4-Komplexen durch Größenausschlusschromatographie an einer HRP75-Säule abgetrennt worden war (Pharmacia, Laufpuffer bestehend aus 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, ergänzt mit 500 mM Natriumchlorid; Fließrate 1 ml/min).
  • In diesem Assay zeigten nicht pegyliertes, mono20kDa-PEG-IGFBP-4, Poly20kDa-PEG-IGFBP-4 und mono40kDa-PEG-IGFBP-4 eine identische Bindung von IGF-I. Z.B. banden 96 nmol mono20kDa-PEG-IGFBP-4 70 nmol IGF-I.
  • Beispiel 9
  • Bestimmung der Bindungsparameter mit FCS
  • Die Fähigkeit von IGFBP-4 zur Komplexbildung mit TAMRA (Tetramethylrhodamin)-markiertem IGF-I wurde durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) gemessen. Das Assayprinzip beruht darauf, dass freies fluoreszent markiertes IGF-I in Abwesenheit eines Bindungspartners mit einer anderen Geschwindigkeit diffundiert. Die Zugabe von IGFBP-4 oder pegylierten Isoformen führt zu einer Komplexbildung mit dem markierten IGF-I und einer gleichzeitigen Änderung der Diffusionsgeschwindigkeit. Aufgrund des unterschiedlichen Diffusionsverhaltens kann FCS zwischen gebundenem und freiem IGF-I unterscheiden und diese quantitativ bestimmen. Durch die Bestimmung der Menge an gebundenem IGF-I für verschiedene Konzentrationen von IGFBP-4 ist es möglich, eine Bindungskurve aufzustellen und kDa-Werte durch Kurvenangleichung zu bestimmen.
  • Alle Messungen wurden an einem Confocor I (Zeiss, Jena) bei einer Wellenlänge von 543 nm in einem Puffer durchgeführt, welcher besteht aus: 100 mM HEPES (pH 7,6), 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1 mM EDTA, 10 mM D(+) Glucose, 15 mM Natriumacetat, 1 % dialysiertes Rinderserumalbumin.
  • Die IGF-I-Bindung schien für verschiedene IGFBP-4-Chargen nicht unterscheidbar zu sein; mono20kDa-PEG-IGFBP-4, poly20kDa-PEG-IGFBP-4, mono40kDa-PEG-IGFBP-4 und Wildtyp-IGFBP-4 zeigten ein vergleichbares Verhalten im Hinblick auf die Komplexbildung und Bindungskonstanten (0,34 +/– 0,08 nM).
  • Beispiel 10
  • Bestimmung der Bindungsparameter
  • Die Inhibitorkonstanten (IC50-Werte) für Wildtyp-IGFBP-4 und verschiedene pegylierte Isoformen wurden in Biacore-Experimenten bestimmt (http://www.biacore.com). Kurz zusammengefasst wurde Wildtyp-IGFBP-4 auf der Oberfläche eines Biacore CM5-Chips durch im Fachbereich bekannte NHS-EDC-Kopplungschemikalien immobilisiert (http://www.biacore.com). Alle IGF-I-Bindungsexperimente wurden in einem kommerziell erhältlichen Puffer (Biacore HBP-EP; 0,01 M HEPES, pH 7,4; 0,15 M NaCl; 3 mM EDTA; 0,005% Polysorbat 20 (v/v)) durchgeführt. Um IC50-Werte zu bestimmen, wurden 10 nM IGF-I mit 8 Konzentrationen von 0,5 bis 1000 nM Wildtyp-IGFBP-4 (oder mono20kDa-PEG-IGFBP-4 oder mono40kDa-PEG-IGFBP-4) vermischt und auf den Chip mit immobilisiertem IGFBP-4 aufgebracht. Die Hemmung wurde als Verringerung der Antworteinheiten im Vergleich zu Proben von 10 nM reinem IGF-I in Abwesenheit von IGFBP-4 gemessen. Mono20kDa-PEG-IGFBP-4 und mono40kDa-PEG-IGFBP-4 hemmten die IGF I-Bindung ebenso wirksam wie Wildtyp-IGFBP-4 Kontrolle mit IC50-Werten von etwa 4 +/– 2 nM.
  • Beispiel 11
  • Hemmung der IGF-I-induzierten IGF-I-Rezeptorphosphorylierung durch pegylierte IGFBP-4-Isoformen
  • Konfluente Monoschichten von NIH3T3-Zellen, die stabil humanes IGF-IR exprimieren, wurden in 3,5 cm-Schalen in DMEM ausgehungert, welches 0,5% dialysiertes fötales Kälberserum enthält. Nach 48 h wurden die Zellen ohne jegliches Hormon oder mit 5 × 10–9 M IGF-I inkubiert; jede Probe wurde mit zunehmenden Konzentrationen an IGF-Bindungsproteinen oder pegylierten Isoformen davon bei Raumtemperatur für 1 h vorinkubiert. Nach einer 10 minütigen Stimulierung bei 37 °C wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit 250 μl Lysepuffer lysiert (20 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Nonidet P40, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA (1,2-Bis(2-aminoethoxyethan)-N,N,N',N'-tetraessigsäure, Aldrich, USA), 10 mM Natriumorthovanadat und Proteaseinhibitorcocktail Complete (Roche Diagnostics GmbH, DE) für 10 min auf Eis. Anschließend wurden die Zellen von der Platte abgekratzt und das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation für 20 min bei 4 °C abgetrennt. Die Proteinkonzentration des Überstands wurde unter Verwendung von Bicinchoninsäure bestimmt (Pierce, Rockford, USA; Shihabi, Z. K., und Dyer, R. D., Ann. Clin. Lab. Sci. 18 (1988) 235-239). Eine äquivalente Proteinkonzentration wurde mit dem SDS-Probenpuffer inkubiert (63 mM Tris-HCl, pH 6,8, 3% SDS, 10% Glycerin, 0,05% Bromphenol-Blau, 100 mM DTT), für 5 min gekocht und auf ein 7,5%-iges SDS-Polyacrylamidgel geladen. Nach Elektrophorese wurden die Proteine auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, die zuerst für 1 h mit dem 3%-igen BSA, welches PEST (Phosphat-gepufferte Saline-Tween) enthält, blockiert wurde, anschließend wurde über Nacht mit 1 μg/ml monoklonalem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Roche Diagnostics GmbH, DE) in PEST, welches 3% BSA enthielt inkubiert. Nicht gebundener Antikörper wurde durch ausgiebiges Waschen entfernt. Der Blot wurde dann mit 1:10.000 verdünntem Anti-Maus-IgG-spezifischem Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert war (Roche Diagnostics GmbH, DE) inkubiert und entwickelt.
  • IGFBP-4, mono20kDa-PEG-IGFBP-4, poly20kDa-PEG-IGFBP-4 und mono40kDa-PEG-IGFBP-4 zeigten jeweils gleich gutes Inhibitorpotenzial. Ein dreifacher molarer Überschuss (geringste gemessene Dosis) jeder Isoform blockierte die von 2 nM IGF-I induzierte Rezeptorphosphorylierung vollständig.
  • Beispiel 12
  • Hemmung des Wachstums von Tumorzelllinien durch IGFBP-4-Derivate
  • Die humanen Tumorzelllinien PC-3, MDA-MB 231, DU-145, HT29, AsPC-1 und PancTu-1 (von ATCC, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) wurden verwendet, um die Inhibitorwirkungen der IGFBP-4-Derivate auf das Tumorzellwachstum zu untersuchen. 4000 AsPC-1-Zellen oder 1000 Zellen der anderen Zelltypen wurden pro Well in 100 ul RPMI-Medium gesät, welches 10% FBS (fötales Rinderserum) und 1% Glutamin enthielt. Die Zellen wurden in Abwesenheit oder in Anwesenheit von nicht modifiziertem IGFBP-4 oder mono20kDa-PEG-IGFBP-4 für 5 Tage kultiviert und die Zellproliferation wurde quantitativ bestimmt, indem die Spaltung von Tetrazoliumsalzen, die zu dem Wachstumsmedium zugegeben wurden, detektiert wurde. Tetrazoliumsalze werden durch Mitochondriendehydrogenase in lebenden Zellen gespalten (WST-1-Assay, PanVera, USA). Das Wachstum der Zelllinien PC-3, MDA-MB 231, DU-145 wurde durch IGFBP-4-Derivate nicht signifikant gehemmt, aber das Wachstum der Zelllinien HT29, AsPC-1 und PancTu-1 wurde um bis zu 55% durch IGFBP-4 gehemmt. Pegyliertes IGFBP-4 ist sogar noch wirkungsvoller als nicht modifiziertes IGFBP-4. Tabelle 1: Hemmung des Wachstums von Tumorzelllinien durch IGFBP-4-Derivate
    PC-3 MDA-MB 231 DU-145 HT29 AsPC-1 PancTu-1
    IGFBP-4 [%Hemmung] 10 0 0 30 40 50
    mono20kDa-PEG-IGFBP-4 [% Hemmung] 10 0 10 40 50 55
  • Beispiel 13
  • Serumkinetik von IGFBP-4-Derivaten
  • SCID-Mäusen wurde subkutan eine Einzeldosis von 1 mg/200 μl mono20kDa-PEG-IGFBP-4 oder mono40kDa-PEG-IGFBP-4 oder nicht pegyliertes IGFBP-4 in PBS injiziert. Serumproben wurden in einem Zeitrahmen von 0,5 bis 120 h nach Injektion gesammelt und auf mono20kDa-PEG-IGFBP-4 oder mono40kDa-PEG-IGFBP-4 oder nicht pegyliertes IGFBP-4 analysiert durch Western Blotting mit einem Anti-IGFBP-4 Antikörper (United Biomedical Inc., USA) nach Affinitätsreinigung oder durch ELISA. Eine Affinitätsreinigung wurde durchgeführt, indem biotinyliertes IGF-I an Streptavidin-beschichtete Magnetbeads (Roche Diagnostics GmbH, DE) gekoppelt wurde und indem IGFBP-4-Derivate aus den jeweiligen Serumproben durch magnetische Abtrennung präzipitiert wurden. Gebundenes Protein wurde eluiert durch Erwärmen in SDS-Probenpuffer und abgetrennt durch SDS-PAGE. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran übertragen und durch einen IGFBP-4-spezifischen Antikörper detektiert. Die quantitative Bestimmung der Banden, welche IGFBP-4-Derivaten entsprechen, wurde an einer Lumilmager-Vorrichtung (Roche) durchgeführt.
  • Die ELISA-Untersuchung wurde durchgeführt, indem pegylierte Proteine mit einem biotinyliertem monoklonalen Antikörper gegen PEG eingefangen wurden (Cheng T. et al., Bioconjugate Chem. 10 (1999) 520-528), der an eine Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatte gebunden war und indem IGFBP-4 mit polyklonalem IGFBP-4-Antiserum (markiert mit Peroxidase), produziert von Kaninchen, spezifisch nachgewiesen wurde.
  • Serumwerte an mono40kDa-PEG-IGFBP-4 wiesen nach 24 h einen Spitzenwert auf (> 75 μg/ml) und blieben für bis zu 120 h erhöht. Im Vergleich dazu zeigten nicht pegyliertes oder monoPEG20-IGFBP-4 wesentlich kleinere Peakwerte (12 bzw. 35 μg/ml) und eine sehr viel schnellere Clearance. Die Mengen von nicht pegyliertem IGFBP-4 kehrten bereits nach 2 h auf die Grundlinie zurück. AUC ist durch die Pegylierung signifikant erhöht und die Pegylierung mit 40kDa PEG führt zu signifikant höheren Serumwerten für einen längeren Zeitraum als für das 20 kDa PEG-Derivat von IGFBP-4 beobachtet wird.
  • Eine tägliche Anwendung von mono20kDa-PEG-IGFBP-4 oder mono40kDa-PEG-IGFBP-4 oder nicht pegyliertem IGFBP-4 führte nur bei mono40kDa-PEG-IGFBP-4 zu einer Anreicherung im Serum der behandelten Mäuse. Serumwerte von mehr als 300 μg/ml wurden am Ende der dreiwöchigen Studie erreicht.
  • Beispiel 14
  • Antitumorwirkung von IGFBP-4-Derivaten in dem PancTu-1 orthotopischen Pankreaskrebsmodell
  • In vitro expandierte PancTu-1-Tumorzellen wurden aus Kulturkolben entnommen (0,05% Trypsin-EDTA) und in 50 ml Kulturmedium (RPMI 1640) am Tag der Injektion übertragen, 1× gewaschen (300 × g, 10 min), in PBS resuspendiert, zusätzlich mit PBS gewaschen und filtriert. Zellkonzentration und Zellgröße wurden bestimmt und die Konzentration der Zellen wurde mit PBS auf einen Zelltiter von 6,6 × 107/ml eingestellt.
  • Tumorzellen in einem Volumen von 15μl (= 1,0 × 106 Zellen) wurden unter Sichtkontrolle in den Duodenallappen der Pankreas injiziert durch die Serosa in Richtung des Pankreasgewebes von 8-10 Wochen alten weiblichen SCID- Mäusen (C.B-17) mit einem Körpergewicht von wenigstens etwa 20 g. Anschließend wurde die Pankreas sanft wieder an der abdominalen Kavität positioniert und der Peritoneumschnitt wurde mit einer kontinuierlichen Naht (4-0 Vicryl) geschlossen. Die Haut wurde angeglichen und mit 3-4 Wundclips verschlossen.
  • Beginnend an Tag 7 nach der Inokulation mit Tumorzellen wurden zwei Gruppen von Tieren mit 8 Tieren pro Gruppe mit entweder mono20kDa-PEG-IGFBP-4 oder mono40kDa-PEG-IGFBP-4 behandelt. Die i.p. verabreichte Tagesdosis von 1 mg Protein in 0,2 ml PBS wurde auf den Proteingehalt der Probe normalisiert, indem die Absorption des Proteins bei 280 nm bestimmt wurde. Eine dritte Gruppe von 8 Tieren wurde nur mit PBS behandelt. Nach 21 Behandlungstagen wurden Blutproben von jedem Tier entnommen und das Volumen des Primärtumors und das Tumorgewicht wurde bei jedem Tier bestimmt. Der Pankreastumormarker CA19.9, eine Kohlenhydratantigendeterminante, die auf einem hochmolekulargewichtigen Mucin (MUC1) exprimiert wird, wurde durch EIA detektiert (ADI, Alpha Diagnostics, Texas, USA) und Cyfra 21.1 wurde an Elecsys1010 bestimmt (Roche Diagnostics GmbH, Deutschland).
  • Beide Tumormarker wurden durch die Behandlung mit MonoPEG40-IGFBP-4 signifikant verringert, aber nicht durch die Behandlung mit MonoPEG20-IGFBP-4.
  • Eine chronische Verabreichung von MonoPEG20-IGFBP-4 hemmte das Tumorwachstum nicht. Das mittlere Tumorvolumen betrug am Ende 287 mm3, sehr ähnlich zu der Kontrollgruppe, die nur PBS erhielt (226 mm3). Im Gegensatz dazu verringerte die Behandlung mit MonoPEG40-IGFBP-4 das Tumorwachstum. Das berechnete mittlere Tumorvolumen betrug 163 mm3. Tabelle 2: Wirkung der Behandlung von Mäusen mit PancTu-1-Tumor mit IGFBP-4-Derivaten auf den Serumtumormarker CA19.9
    Gruppe Behandlung Applikation CA19.9-Werte (median, U/ml) Veränderung (%) Cl
    2 Kontrolle i.p. 127,3
    4 mono20kDa-PEG-IGFBP-4 i.p. 108,5 (–16%) 0,57-1,24
    6 mono40kDa-PEG-IGFBP-4 i.p. 40,2 (–66%) 0,17-0,79
    Tabelle 3: Wirkung der Behandlung von Mäusen mit PancTu-1-Tumor mit IGFBP-4-Derivaten auf den Serumtumormarker Cyfra 21.1
    Gruppe Behandlung Applikation Cyfra 21.1-Werte (median, ng/ml) Veränderung (%) Cl
    2 Kontrolle i.p. 19,3
    4 mono20kDa-PEG-IGFBP-4 i.p. 22,6 (+11%) 0,63-1,74
    6 mono40kDa-PEG-IGFBP-4 i.p. 10,2 (–65%) 0,17-0,82
  • Beispiel 15
  • Einfluss von pegyliertem IGFBP-4 auf normale Nierenzellen/Nierenorgane
  • Primärtumore und Nierenorgane wurden resektiert und in Formalin fixiert. Die Tumore wurden mittig in zwei Teile geteilt und beide wurden in einem Block von Paraplast eingebettet. Beide Nierenorgane wurden bearbeitet (längs und vertikal geschnitten) und eingebettet. Eine histologische Standardanfärbung mit Hämatoxylin und Eosin wurde auf Paraffin durchgeführt.
  • Eine chronische Behandlung mit mono20kDa-PEG-IGFBP-4, welches s.c. oder i.p. appliziert wurde, induzierte eine moderate bis starke histopathologische Veränderung des Nierengewebes. Zellen, die zu den proximalen Tubuli gehören, bildeten ohne Zeichen von Entzündung und Nekrose Vakuolen. Diese Befunde wurden nach s.c.- oder i.p.-Applikation von mono40kDa-PEG-IGFBP-4 nicht beobachtet.
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Claims (8)

  1. Konjugat, das aus Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindenden Protein 4 (IGFBP-4) und ein oder zwei Poly(ethylenglycol)-Gruppen besteht, wobei die Poly(ethylenglycol)-Gruppe(n) ein Gesamtmolekulargewicht von 30 bis 40 kDa aufweist/aufweisen.
  2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Poly(ethylenglycol)-Gruppe(n) eine verzweigte Poly(ethylenglycol)-Gruppe ist/verzweigte Poly(ethylenglycol)-Gruppen sind.
  3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Konjugat über eine primäre Aminogruppe/primäre Aminogruppen von IGFBP-4 verknüpft ist.
  4. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Konjugat über Cystein 110 und/oder Cystein 117 von IGFBP-4 verknüpft ist.
  5. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches eine Poly(ethylenglycol)-Gruppe enthält.
  6. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats, das ein Insulin-ähnliches Wachstumsfaktor-bindendes Protein 4 (IGFBP-4) und ein oder zwei Poly(ethylenglycol)-Gruppen umfasst, wobei die Poly(ethylenglycol)-Gruppe(n) ein Gesamtmolekulargewicht von 30 bis 40 kDa aufweist/aufweisen, wobei das Verfahren die Umsetzung des IGFBP-4 mit aktiviertem Poly(ethylenglycol) unter solchen Bedingungen umfasst, dass das Poly(ethylenglycol) über primäre Aminogruppen oder Thiolgruppen von IGFBP-4 chemisch an das IGFBP-4 gebunden wird.
  7. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Konjugat nach Anspruch 1 bis 4 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Konjugat nach Anspruch 1 bis 4, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs.
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