DE69317979T2 - PEG-Interferon-Konjugate - Google Patents

PEG-Interferon-Konjugate

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Description

  • Verschiedene natürliche und rekominante Proteine sind von medizinischem und pharmazeutischem Nutzen. Wenn sie gereinigt und formuliert sind, können sie parenteral für verschiedene therapeutische Indikationen verabreicht werden. Parenteral verabreichte Proteine können jedoch immunogen sein, können relativ wasserunlöslich sein und können eine kurze pharmakologische Halbwertzeit haben. Daher kann es schwierig sein, therapeutisch nützliche Blutspiegel der Proteine bei Patienten zu erreichen.
  • Diese Probleme können überwunden werden, indem die Proteine an Polymere, wie Polyethylenglykol, konjugiert werden. Davis et al. offenbaren in US-Patent Nr. 4 179 337 die Konjugation von Polyethylenglykol (PEG) an Proteine, z.B. Enzyme und Insulin, um Konjugate zu erhalten, bei denen das Protein weniger immunogen ist, aber einen wesentlichen Anteil der physiologischen Aktivität behält. Nakagawa et al. (US-Patent Nr. 4 791 192) offenbaren, PEG an inselzellenaktivierendes Protein zu konjugieren, um dessen Nebenwirkungen und die Immunogenität zu vermindern. Veronese et al. offenbaren in Applied Biochem. and Biotech. 11: 141-152 (1985) die Aktivierung von Polyethylenglykolen mit Phenylchlorformiaten, um eine Ribonuclease und eine Superoxiddismutase zu modifizieren. Katre et al offenbaren auch in den US-Patenten Nr. 4 766 106 und 4 917 888 die Solubilisierung von Proteinen durch Polymerkonjugation. PEG und andere Polymere werden mit rekombinaten Proteinen konjugiert, um deren Immonogenität zu vermindern und die Halbwertszeit zu erhöhen. Siehe Nitecki et al., US-Patent Nr. 4 902 502, Enzon Inc, Internationale Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer. WO 90113540, Nishimura et al, Europaische Patentanmeldung 154 316 and Tomasi, Internationale Anmeldung Veröffentlichungsnummer WO 86/04145.
  • EP 426 488 beschreibt die Kupplung eines PEG/PPG-Polymers an Superoxiddismutase, wobei die entstehende Verbindung die Formel PEG/PPG-O-CO-NH-SOD hat.
  • Frühere Methoden zur Bildung von PEG/Proteinkonjugaten und die Konjugate, die mit diesen Methoden entstehen, weisen mehrere Probleme auf. Zu diesen Problemen gehört, daß bestimmte Methoden zur Bildung dieser mit PEG konjugierten Proteine das Protein so inaktivieren können, daß die entstehenden Konjugate eine geringe biologische Aktivität aufweisen. Außerdem können bestimmte Linker, die zur Bildung dieser PEG-Protein- Konjugate verwendet werden, empfindlich sein für eine hydrolytische Spaltung in vivo. Wenn eine solche Spaltung nach Verabreichung auftritt, verlieren die Konjugate die nützlichen Eigenschaften, die das PEG beiträgt.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung sind neue Interferon-PEG- Konjugate mit einzigartigen Linkern, die eine Interferon(IFN)-Aminogruppe mit PEG verbinden. Die vorliegende Erfindung ist auf physiologisch aktive Interferonkonjugate der allgemeinen Formel: interferon
  • gerichtet, worin R ein C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest ist, R¹, R², R³ und R&sup4; H oder C&sub1;-C&sub4;-Alkylreste sind,
  • m 1 oder 2 ist,
  • W O oder NH ist,
  • x eine ganze Zahl zwischen 1 und 1000 ist und jeder der Indices y und z eine ganze Zahl von 0 bis 1000 ist und die Summe von x, y und z 3 bis 1000 ist, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Reste R¹, R², R³ und R&sup4; ein C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest ist und x, y und z so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht der Polymereinheit in dem Konjugat im Bereich von etwa 1000 Dalton bis etwa 10000 Dalton ist.
  • Es ist selbstverständlich, das die -NH-Gruppe in Formel I von einer zugänglichen Aminogruppe des Interferonmoleküls stammt.
  • Genauer haben die zwei verschiedenen Interferonkonjugate die folgenden Formeln: interferon
  • worin R ein C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest ist, R¹, R², R³, R&sup4; H oder C&sub1;-C&sub4;- Alkylreste sind, m 1 oder 2 ist, x, y, z wie in Formel I oben definiert sind, mit der in Formel I oben erwähnten Maßgabe.
    • Kurze Beschreibung der Figuren Figur 1: Zeitverlauf der PEG-Modifizierung mit der Verbindung von Beispiel 7
  • Interferon (5 mg/ml) wurde mit einem 10-fachen, 20-fachen oder 40-fachen überschuß des Reagenzes bezogen auf Protein über die angegebenen Zeiträume mit 25 mM Tricin (pH 10,0) 0,5 M KSCN, 100 mM NaCl inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen, mit Glycin abgeschreckt und an einem 15% SDS-PAGE-Gel analysiert. "I" auf der Markierung steht für Interferon.
    • Figur 2: Zeitverlauf der PEG-Modifizierung mit der Verbindung von Beispiel 5
  • Interferon wurde mit einem 3-fachen oder mit einem 10-fachen Überschuß an Reagenz über die angegebenen Zeiträume, wie in Figur 1, inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen, mit Glycin abgeschreckt und an einem 15% SDS-PAGE-Gel analysiert. "S" ist die Bezeichnung für Proteinmolekulargewichtstandards, "I" ist die Bezeichnung für Interferon.
    • Figur 3: Vergleich der PEG-Modifizierung mit der Verbindung von Beispiel 1 (linke Seite) und von Beispiel 3 (rechte Seite)
  • Interferon wurde mit einem 3-fachen Überschuß jeden Reagenzes 0,25, 1,5 oder 24 Stunden lang inkubiert. Es wurden Aliquots entnommen, mit Glycin abgeschreckt und an einem 15% SDS-PAGE- Gel analysiert. "S" ist die Bezeichnug für Proteinmolekulargewichtsstandard, "I" ist die Bezeichnung für Interferon.
  • Erfindungsgemäß können die IFN-Konjugate der Formel IA und IB hergestellt werden, indem aktiviertes PEG, bei dem eine endständige Hydroxy- oder Aminogruppe durch einen aktivierten Linker ersetzt wurde, kondensiert wird. Diese Reagenzien können dann mit einer oder mehreren Aminogruppen in dem IFN reagieren. Die Kondensation mit nur einer Aminogruppe unter Bildung eines mono-PEG-ylierten Konjugates ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Daher betrifft die Erfindung auch neue aktivierte Verbindungen (Reagenzien), die verwendet werden können, um die Interferonkonjugate der vorliegenden Verbindung herzustellen. Diese Verbindungen haben die folgenden allgemeinen Formeln:
  • worin R ein C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest ist, R¹, R², R³ und R&sup4; H oder C&sub1;-C&sub4;- Alkylreste sind, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Reste R¹, R², R³ und R&sup4; ein C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest ist,
  • R&sup5; H oder ein C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest ist, wenn W NH ist oder R&sup5; H ist, wenn W ZO ist, W NH oder O ist,
  • x eine ganze Zahl zwischen 1 und 1000 ist und jeder der Indices y und z eine ganze Zahl von 0 bis 1000 ist und die Summe von x, y und z 3 bis 1000 ist und x, y und z so ausgewählt werden, daß das Molekulargewicht der Polymereinheit im Konjugat im Bereich von etwa 1000 Dalton bis etwa 10000 Dalton liegt, und
  • worin R ein C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest ist, R¹, R², R³ und R&sup4; H oder C&sub1;-C&sub4;- Alkylreste sind, x eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und jeder der Indices y und z eine ganze Zahl von 0 bis 1000 ist, und die Summe von x, y und z 3 bis 1000 ist, wobei mindestens einer der Reste R¹, R², R³ und R&sup4; ein C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest ist und wobei x, y und z so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht der Verbindung im Bereich von etwa 1000 Dalton bis etwa 10000 Dalton liegt.
  • Genauer schließt die Formel II Verbindungen der folgenden zwei Arten ein:
  • Für IIA und IIB sind R, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; und x, y und z wie oben definiert und es gilt dieselbe Maßgabe wie oben.
  • Erfindungsgemäß wird unter Verwendung der aktivierten PEG- Reagenzien der Formeln IIA, IIB oder III zur Erzeugung der Konjugate, eine Verbindung zwischen den freien Aminogruppen in einem Protein, wie Interferon (IFN), und PEG gebildet, sodaß das entstehende Konjugat mindestens ein Teil der biologischen Aktivität des Proteins behält bei verminderter Immogenität. Außerdem erzeugen die Verbindungsgruppen, die in dem Konjugat der Erfindung gebildet werden, durch die Verwendung irgendeines der aktivierten Polyethylenglykole der Formeln IIA, IIB oder III ein Proteinkonjugat, das nicht leicht einer hydrolytischen Spaltung in vivo unterliegt und nicht die Nachteile, die bei PEG-Proteinkonjugaten des Standes der Technik vorhanden sind, aufweist.
  • Erfindungsgemäß können R, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; irgendwelche Niedrigalkylgruppen sein, bevorzugt Methylgruppen. Der Ausdruck Niedrigalkylgruppe bezeichnet Niedrigalkylgruppen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, z.B. Methyl-, Ethyl-, n- Propyl-, Isopropylgruppen etc. Im allgemeinen ist die bevorzugte Alkylgruppe eine Niedrigalkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wobei eine Methylgruppe am meisten bevorzugt ist. R, R¹, R², R³, R&sup4; und R&sup5; können auch Wasserstoff sein, aber R¹, R², R³ und R&sup4; können nicht alle gleichzeitig Wasserstoff sein.
  • Erfindungsgemäß können x, y und z aus irgendeiner Kombination von Zahlen ausgewählt werden, sodaß das entstehende Konjugat mindestens einen Teil der biologischen Aktivität des IFN, das das Konjugat bildet, behält. Es ist offensichtlich, daß die Summe von x, y und z und m umgekehrt proportional zum Anteil der biologischen Aktivität des IFN ist, die in dem Konjugat erthalten bleibt. Der numerische Wert für x, y und z bedeutet die Anzahl von Glykoleinheiten in dem Polyglykol, das das Konjugat bildet. Der Term m bedeutet die Anzahl von freien oder verfügbaren Aminogruppen, die in dem IFN enthalten sind, die mit der aktivierten PEG-Mischung reagieren können. Je höher der Wert für m und für x, y und z ist, desto höher ist das Molekulargewicht des Konjugats. Erfindungsgemäß sind x, y und z irgendwelche Zahlen, sodaß das Molekulargewicht des Konjugats, unter Ausschluß des Gewichts des Proteins, zwischen etwa 300 und etwa 30000 Dalton liegt. Für IFN ist es bevorzugt, daß m eine Zahl von 1 bis 3 ist. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist ein mono-PEG-yliertes Konjugat, worin m 1 ist, das unter solchen Bedingungen hergestellt wurde, das eine hohe Ausbeute an IFN-Konjugat erhalten wird, das aus IFN aufgebaut ist, bei dem nur eine freie Aminogruppe mit dem PEG-Reagenz der Formel IIA oder IIB oder III reagiert hat. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, bei der m 1 ist, sind x, y und z solche Zahlen, daß das Glykol, das das Konjugat bildet, ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 300 bis etwa 30000 Dalton, bevorzugt etwa 1000 bis etwa 10000 Dalton, insbesondere etwa 1000 bis etwa 5000 Dalton hat. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Molekulargewicht etwa 2000 Dalton.
  • Was die Zahlen x, y und z der Einheiten betrifft, ist x eine ganze Zahl von 1 bis 1000 und jeder der Indices y und x ist eine ganze Zahl von 0 bis 1000 und die Summe von x, y und z ist 3 bis 1000.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Konjugate der Formeln IA und IB sind x und y 5 bis 500 und z ist 0 bis 4. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das verwendete Glykol eine Mischung von Glykolen, worin x 10 bis 100 ist, y 1 bis 10 ist und z 0 ist. Am meisten bevorzugt ist ein Interferonkonjugat der Formel IA, worin m 1 ist, R, R² und R&sup4; CH&sub3; sind, R¹ H ist, x etwa 19 ist, y etwa 2 und z 0 ist. Dieses entspricht einem durchschnittlichen Molekulargewicht der PEG-Einheit von etwa 1000 Dalton.
  • Um irgendwelche Zweifel im Hinblick auf die Anzahl der Einheiten in dem PEG-Molekül zu vermeiden, ist die Charakterisierung des Polyethylenglykolpolymers durch das Molekulargewicht bevorzugt gegenüber einer Angabe der Anzahl der sich wiederholenden Einheiten (SRU) in dem PEG-Polymer durch x, y und z. Es kann schwierig sein, diese Werte festzustellen, aufgrund der potentiellen Inhomogenität der Ausgangs-PEG- Verbindungen, die gewöhnlich durch ihr durchschnittliches Molekulargewicht und nicht durch die Anzahl der sich wiederholenden Einheiten, die sie enthalten, definiert werden. Die Ausgangs-PEG-Verbindungen mit verschiedenen Molekulargewichten können mit im Stand der Technik bekannten Methoden hergestellt werden oder von kommerziellen Lieferanten erhalten werden.
  • Wenn die Werte für x, y und z, die durch Bestimmung der Molekulargewichte erhalten werden, oder vom Lieferanten angegeben werden, keine ganze Zahlen sind (was gewöhnlich der Fall ist) müssen ihre Werte in üblicher Weise auf- oder abgerundet werden, um eine Zuordnung der ganzen Zahlen zu dem Polymermolekül, das wahrscheinlich den Hauptteil der Polymermischung bildet, zu ermöglichen.
  • Wenn das Reagenz gemäß einer der Formeln IIA, IIB oder III mit einem IFN umgesetzt wird, das mehr als eine freie Aminogruppe enthält, kann das Konjugat als Mischung verschiedener Reaktionsprodukte von IFN mit PEG-Reagenzmischungen hergestellt werden. Diese Reaktionsprodukte bilden sich als Ergebnis der Reaktion des PEG-Reagenzes mit einer oder mehreren freien Aminogruppen. Dies wird durch m in den Formeln IA und IB angegeben. Wenn z.B. das IFN drei freie Aminogruppen enthält, kann das aktivierte PEG-Reagenz mit einer der freien Aminogruppen, mit zwei der freien Aminogruppen oder mit allen drei reagieren. In dieser Situation enthält die Mischung konjugierte Reaktionsprodukte, die sich in allen drei Fällen gebildet haben. Da die verschiedenen konjugierten Reaktionsprodukte in dieser Mischung breit differierende Molekulargewichte haben, abhängig von dem Wert für m, d.h. 1, 2 oder 3, können diese Reaktionsprodukte mit üblichen Methoden, wie Chromatographie, getrennt werden. Um zu bestimmen, ob m und x, y und z richtig ausgewählt wurden, können die getrennten konjugierten Reaktionsprodukte auf ihre biologische Aktivität untersucht werden mit den gleichen Mittel, die verwendet werden, um das Stamm-IFN zu screenen, um zu bestimmen, ob das konjugierte Reaktionsprodukt immer noch einen Teil der biologischen Aktivität des zur Bildung des Konjugats verwendeten IFN's behalten hat. Auf diese Weise können die Zahlen m, x, y und z in irgendeiner gewünschten Art und Weise eingestellt werden, um die gewünschte Aktivität zu liefern.
  • Bei der bevorzugten Ausführungsform ist m 1. Wenn m 1 ist, kann dieses Konjugat auch erhalten werden, wenn zwei oder mehr freie Aminogruppen vorhanden sind. Das aktivierte PEG- Reagenz reagiert zuerst mit einer der freien Aminogruppen, die in dem IFN enthalten sind. Indem die Konzentration der Reagenzien, z.B. des IFN, und die Reaktionsbedingungen gemäß Standardmethoden der Aminkondensation eingestellt werden, kann der Grad der Pegylierung der freien Aminogruppen, die in dem Protein enthalten sind, eingestellt werden. Bei Proteinen, die eine oder mehr freie Aminogruppen enthalten, wobei eine der freien Aminogruppe aktiver als die anderen Aminogruppen ist, können die Bedingungen so ausgewählt werden, daß das Protein mit der aktivierten Verbindung umgesetzt wird unter Bildung der Verbindung der Formel IA oder IB, worin m 1 ist. Andere freie Aminogruppen, die innerhalb der Aminosäuren vorhanden sind, die das Protein bilden, können nachfolgend mit dem PEG umgesetzt werden, indem die Kondensationsreaktion länger durchgeführt wird oder indem strengere Bedingungen verwendet werden.
  • In der vorliegenden Beschreibung und den Anspüchen sollen die Ausdrücke Interferon und IFN alle Arten von Interferon (d.h. Moleküle mit einer Interferonaktivität) einschließen, z.B. α-, β-, γ- und ω-Interferon, und alle Unterarten dieser Typen, z.B. α1, α2, α2A, α2B oder α2C und Hybride oder Chimere der verschiedenen Arten und/oder Unterarten. Das Interferon kann jeden Ursprungs sein und kann aus natürlichen Quellen, Gewebekulturen oder durch Gentechnik erhalten werden. Methoden zur Erzeugung und Isolierung von natürlichen oder rekombinanten Interferonen sind im Stand der Technik wohlbekannt und werden z.B. in den Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern EP 43 980, EP 211 148, EP 140 127, DE 3 028 919, USP 4503035 und USP 4414150 beschrieben.
  • Der Vorteil der Verwendung der Reagenzien der Formeln IIA, IIB und III, worin mindestens einer der Reste R¹, R², R³, R&sup4; ein Niedrigalkylrest, insbesondere ein Methylrest ist (alkylsubstituierte Reagenzien) liegt in der unerwartenden Verbesserung der Ausbeute des Konjugats, d.h. des PEG-ylierten Proteins, wenn die alkylsubstituierten Reagenzien verwendet werden im Vergleich zu den entsprechenden unsubstituierten Reagenzien. Alkylsubstituierte Reagenzien liefern mindestens die 2-fache Menge an Konjugaten in der gleichen Reaktionszeit verglichen mit den entsprechenden unsubstituierten Reagenzien bei der Erzeugung solcher Konjugate.
  • Wenn die Konjugate der Formeln IA und IB, die aus den oben beschriebenen substituierten Reagenzien hergestellt wurden, an Patienten für therapeutische Zwecke verabreicht werden, haben sie eine unerwartet verbesserte Halbwertszeit in vivo im Blutstrom des Patienten, verglichen mit einem Konjugat, das aus dem entsprechenden unsubstituierten Reagenzien gebildet wurde. Obwohl die Halbwertszeit in vivo direkt proportional dem Molekulargewichte des Konjugats ist, hat ein Konjugat, das aus einem substituierten Reagenz hergestellt wurde, überraschenderweise eine solche Halbwertszeit, wie ein Konjugat mit höherem Molekulargewicht, das aus einem unsubstituierten Reagenz hergestellt wurde. Eine längere Halbwertszeit für ein therapeutisches Mittel im Blutstrom des Patienten liefert eine verbesserte Effizienz bei der Verabreichung des Mittels an einen Patienten. Z.B. können Konjugate aus alkylsubstituierten Reagenzien weniger häufig und/oder in geringeren Mengen verabreicht werden, als Konjugate, die aus dem entsprechenden unsubstituierten Reagenz hergestellt wurden. Um die Effizienz der Verabreichung von biologisch aktiven Proteinkonjugaten mit Polyethylenglykol zu verbessern, wurden erhöhte Molekulargewichte von Polyethylenglykol zur Bildung dieser Proteinkonjugate verwendet. Jedoch vermindert sich die biologische Wirksamkeit des aktiven konjugierten IFN mit steigendem Molekulargewicht. Durch die Verwendung dieser erfindungsgemäßen Konjugate, die mit substituierten Reagenzien hergestellt werden, wird jedoch die Effizienz der Verabreichung gegenüber der Verwendung des entsprechenden unsubstituierten Konjugats bei einem weniger hohen Anstieg des Molekulargewichts verbessert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf Verfahren zur Herstellung der neuen Konjugate.
  • Das Konjugat der Formel IA kann wie folgt hergestellt werden: PEG-Amin Protein
  • worin R, R¹, R², R³, R&sup4; md R&sup5;, m und x, y und z wie oben sind, mit der Maßgabe, daß einer oder mehrere der Reste R¹, R², R³, R&sup4; Niedrigalkylreste sein können.
  • Bei dieser Reaktion wird ein PEG-Amin mit der Verbindung der Formel IV in einem Kohlenwasserstoff oder chlorierten Kohlenwasserstoff als Lösungsmittel vermischt, um die Verbindung der Formel IIA zu erzeugen. Die Verbindung der Formel IIA kann in einem wäßrigen Medium mit einer oder mehreren der freien Aminogruppen des Proteins kondensiert werden, um das Konjugat der Formel IA herzustellen. Diese Reaktion kann unter üblichen Bedingungen zur Kondensation von Ammen in wäßrigem Medium durchgeführt werden. Im allgemeinen wird diese Reaktion in einer wäßrigen Standardpufferlösung mit einem pH zwischen 7 und 10 durchgeführt, um das Konjugat der Formel IA zu erzeugen. Diese Reaktion kann eine Mischung von PEG- Protein-Konjugaten mit verschiedenen Molekulargewichten erzeugen, abhängig von der Anzahl der freien Aminogruppen in dem Protein und der Reaktionszeit. Die PEG-Protein-Konjugate können dann in die einzelnen Komponenten aufgetrennt werden mit üblichen Methoden, wie Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder Gelelektrophorese. Die üblichen Bedingungen zur Auftrennung von Verbindungen nach dem Molekulargewicht mit HPLC oder Gelelektrophorese können verwendet werden. Die Auftrennung dieser Mischung kann nach den Molekulargewichten der gebildeten Produkte, wie hier beschrieben, durchgeführt werden.
  • Ein IFN-Konjugat der Formel IB kann gemäß dem folgenden Reaktionsschema hergestellt werden: PEG-Alkohol NH&sub2;-Interferon Interferon
  • worin R, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, m, x, y, z und die Maßgabe wie vorher definiert sind.
  • Die Verbindung der Formel IV wird hergestellt, indem Phosgen mit 2-Hydroxypyridin (substituiert falls R&sup5; ein NiedrigAlkylrest ist) unter Verwendung irgendeiner üblichen Methode zur Kondensation eines Säurehalogenids mit einem Alkohol kondensiert wird.
  • Die Kondensation eines PEG-Alkohols mit der Verbindung der Formel IV wird bewirkt, indem übliche Bedingungen zur Kondensation eines Alkohols mit einem Carbonat verwendet werden, um die Verbindung der Formel IIB herzustellen. Die Verbindung der Formel IIB wird mit dem Protein über eine oder mehrere freie Aminogruppen an dem Protein kondensiert, um die Verbindung der Formel IB herzustellen. Diese Reaktion wird in der für die Kondensation der Verbindung der Formel IIA beschriebenen Weise durchgeführt, um das Konjugat der Formel IA herzustellen. Abhängig von der Anzahl der freien Aminogruppen, die in den Proteinen enthalten sind, die mit der Verbindung der Formel IIB reagieren, kann das Konjugat der Formel IB als Mischung von Konjugaten mit verschiedenen Molekulargewichten gebildet werden. Diese Konjugatmischung kann in der vorher beschriebenen Weise aufgetrennt werden.
  • Die Verbindung der Formel IB kann auch unter Verwendung des folgenden Reaktionsschemas hergestellt werden: NH&sub2;-Interferon interferon
  • worin R, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, m, x und y wie oben definiert sind.
  • In diesem Reaktionsschema wird ein PEG-Alkohol mit der Verbindung der Formel IV kondensiert, um die Verbindung der Formel III herzustellen. Bei dieser Reaktion wird die Verbindung der Formel IIB als Zwischenprodukt gebildet, die dann mit einem zweiten Mol PEG-Alkohol reagiert, um die Verbindung der Formel III herzustellen. Bei der Durchführung dieser Reaktion ist der PEG-Alkohol in einem Anteil von mindestens 2 mol pro mol der Verbindung der Formel IV vorhanden. Für dieses Verfahren kann jede übliche Methode zur Kondensation eines Alkohols mit einem Carbonat verwendet werden. Die Verbindung der Formel III wird mit Interferon umgesetzt unter Bildung des Konjugats der Formel IB, in der für die Umwandlung der Verbindung der Formel IIA in die Verbindung der Formel IA beschriebenen Weise. Abhangig von der Menge an freien Aminogruppen, die in dem Protein enthalten sind, erzeugt die Kondensation der Verbindung der Formel III mit dem Protein eine Mischung von Konjugaten, die in die einzelnen Komponenten in der vorher zur Auftrennung des Konjugats von Formel IA beschriebenen Weise aufgetrennt werden können.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Verbindung wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Interferonkonjugate den gleichen Nutzen wie das Protein, das zur Bildung des Konjugats verwendet wurde, haben. Daher sind diese Konjugate therapeutisch auf gleiche Weise aktiv, wie das Protein aus dem sie gebildet wurden, und können auf gleiche Weise, wie das Protein selbst, verwendet werden, ohne die unerwünschten Immunreaktionen zu erzeugen, die mit der Verabreichung der Proteine selbst an Patienten verbunden sein können. Daher umfaßt die vorliegende Erfindung auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen auf Basis von Verbindungen der Formel I und deren Salzen und Methoden zu ihrer Herstellung.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die zur Kontrolle oder Verhütung von Krankheiten verwendet werden, umfassen ein Interferonkonjugat der allgemeinen Formel I und ein therapeutisch inertes, nicht toxisches und therapeutisch annehmbares Trägermaterial. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die verwendet werden sollen, können gemäß guter medizinischer Praxis formuliert und dosiert werden, wobei die zu behandelnde Störung, der Zustand des einzelnen Patienten, der Ort der Abgabe des Proteinkonjugats, die Verabreichungsmethode und andere dem Praktiker bekannte Faktoren in Betracht gezogen werden sollten.
  • Die folgenden Beispiele erläutern beispielhafte Auführungsformen der vorliegenden Erfindung, ohne diese zu beschränken.
  • Jeffamin M-2070, das in diesen Beispielen verwendet wird, ist ein Monomethoxypolyoxyalkylenpropylaminpolymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2070, das von Propylen- und Ethylenoxid abgeleitet ist, das aus einem Polyethylenglykolgerüst aufgebaut ist und durchschnittlich 30% statistisch eingebaute Propylengruppen enthält.
  • Jeffamin M-1000 ist ein Monomethoxypolyoxyalkylenpropylaminpolymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000, das von Propylen- und Ethylenoxid abgeleitet ist, das aus einem Polyethylenglykolgerüst aufgebaut ist, das 14% spezifisch eingebaute Propylenoxidgruppen enthält, wobei x einen Durchschnittswert von 18,6 hat, y einen Durchschnittswert von 1,6 hat und z 0 ist (x, y und z werden hier mit der gleichen Bedeutung verwendet wie oben beschrieben).
  • Alle in den Beispielen beschriebenen Reagenzien können wasserfrei in Braunglasfläschchen bei 4ºC aufbewahrt werden, bis sie benötigt werden. Frische Aliquots werden für jede Modifikation verwendet.
    • Beispiele Referenzbeispiel 1 Herstellung von alpha,alpha-Oxomethylen-bis-[omegamethoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl)]SRU 111
  • Aus einer Suspension von 1,5 g MPEG (Methoxypolyethylenglykol) (Molekulargewicht ungefähr 5000) in 80 ml trockenem Toluol wurden 50 ml Lösungsmittel abdestilliert. Die Lösung wurde dann abgekühlt und 30,5 mg Di-2-pyridylcarbonat zugegeben. Die entstehende Mischung wurde dann 24 Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde dann gekühlt und der entstehende Niederschlag filtriert und mit einem kleinen Volumen Toluol und anschließend Diethylether gewaschen. Der Feststoff wurde dann im Hochvakuum getrocknet, was 0,6 g alpha,alpha-Oxomethylen-bis-(omega-methoxypoly(oxy-1,2- ethandiyl)SRU 111 als weißes Pulver lieferte. PEG- modifiziertes Interferon wurde mit der Methode 1, wie unten beschrieben, hergestellt.
    • Herstellung von PEG-modifiziertem Interferonalpha Methode 1:
  • Rekombinantes Interferon-alpha mit 5 mg Protein pro ml wurde gegen einen Puffer, der 5 mM Natriumacetat, pH 5,0, 120 mM NaCl enthielt, dialysiert. Kaliumthiocyanat wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,5 M zu erhalten, und der pH wurde durch Zugabe von ein 10-tel Volumen 1 M Tricinnatriumhydroxid, pH 11,9, eingestellt, um schließlich eine Lösung mit einem pH von 10,0 zu erhalten. PEG-Reagenz wurde zu dem Protein zugegeben in einem molaren Verhältnis von 3:1 als Feststoff oder gelöst in DMSO (das Volumen von DMSO war kleiner als 10% der Gesamtmenge). Die Modifikation wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten bis 4 Stunden lang fortschreiten gelassen und anschließend wurde 1 M L-Glycin (pH 6,3) auf eine Endkonzentration von 20 mM zugegeben, um die weitere Modifikation zu stoppen. PEG-modifiziertes Protein wurde ausgefällt durch Zugabe von 3,5 M Ammoniumsulfat, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, auf eine Endkonzentration von 1,1 M Ammoniumsulfat (1,0 M Ammoniumsulfat für PEG-10000), der Niederschlag durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und wieder in 25 mM Ammoniumacetat, pH 5,0, aufgelöst. Die PEG- modifizierten Proteine wurden durch Chromatographie auf einer hydrophoben Anstauschsäule (z.B. 75 x 7,5 mm), wie BioRad TSK-Phenyl-5-PW oder Toyopearl Phenyl-650 M unter Verwendung eines Gradienten mit abnehmenden Gehalt an Ammoniumsulfat in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, gereinigt. Als Alternative wurde PEG-IFN durch Gelfiltration auf einer Sephacryl-S-200- Säule (Z.B. 90 cm x 3,2 cm Säule) (Pharmacia), die mit 25 InM Natriumacetat (pH 5,0), 200 mM NaCl equilibriert war, gereinigt. Das PEG-modifizierte Protein wurde mit SDS-PAGE identifiziert. Protein, das von der Säule eluierte, das einem Interferon mit einem (PEG&sub1;-IFN) oder 2 (PEG&sub2;-IFN) gebundenen PEG entsprach, wurde zusammengefaßt, eingeengt und das Protein durch Absorption bei 280 nm oder durch colorimetrischen Test (Pierce) bestimmt. PEG-IFN wurde bei 4ºC in Puffer, der 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 0,3 M Ammoniumsulfat enthielt, aufbewahrt
    • Methode 2:
  • Interferon-alpha-2a mit einer Konzentration von ungefähr 6 mg/ml wurde gegen 5 mM Natriumacetat, pH 5,0, 0,12 M Natriumchlorid dialysiert. Die Proteinkonzentration wurde bestimmt, indem die Absorption bei 280 nm gemessen wurde unter Verwendung von 1,0 mg&supmin;¹ml als Extinktionskoeffizient. Die Proteinlösung wurde mit dem modifizierenden Reagenz in einem molaren Verhältnis von Protein zu Reagenz von 1:3 vermischt. Die Modifikationsreaktion wurde gestartet, indem der pH auf 10,0 eingestellt wurde unter Verwendung von ein 10-tel Volumen von 0,1 M Na&sub2;B&sub4;O&sub7; NaOH, pH 10,7. Nach 1-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktion gestoppt durch Zugabe von ein 12-tel Volumen 1 M Glycin, pH 7,5. Nach 3 bis 5 Minuten sank der pH auf 5,0 bis 6,0 durch Zugabe von ein 12- tel Volumen 1 M Natriumacetat, pH 4,0.
  • Die Lösung, die PEG-Interferon, abgesättigtes Reagenz und unmodifiziertes Interferon enthielt, wurde 4-fach mit 40 mM Ammoniumacetat, pH 4,5, verdünnt und auf eine CM-Cellulosesäule (Whatman CM-52, ungefähr 0,5 ml Harz pro mg Protein) gegeben. Nach Waschen der Säule mit 5 Volumina 40 mM Ammoniumacetat, pH 4,5, wurden PEG-Interferon und unmodifiziertes Interferon eluiert unter Verwendung eines linearen Natriumchloridgradienten (0 bis 0,5 M) in 40 mM Ammoniumacetat, pH 4,5. Die Fraktionen, die Protein enthielten, wurden durch ihre Absorption bei 280 nm identifiziert, und Fraktionen, die PEG- Interferon enthielten, wurden mit SDS-PAGE identifiziert.
  • PEG-Interferon wurde weiter durch Größenausschluß-Gelfiltrations-Chromatographie auf einer Säule, die Sephacryl S-200- Harz enthielt (Pharmacia LKB), gereinigt. Die Fraktionen, die von der Säule eluiert wurden, wurden mit SDS-PAGE analysiert und das Peak-Material, das PEG-Interferon enthielt, wurde zusammenge faßt.
    • Referenzbeispiel 2 Herstellung von alpha,alpha-Oxomethylen-bis-[omegamethoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl)]SRU 28,3
  • Mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde MPEG (Molekulargewicht 1300) in alpha, alpha-Oxomethylen-bis-[omegamethoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 28,3 umgewandelt und PEG- modifiziertes Interferon wurde hergestellt unter Verwendung dieses Reagenzes mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode 1.
    • Referenzbeispiel 3 Herstellung von alpha-Methyl-omega-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]oxy]ethoxy]-poly(oxy-1,2-ethandiyl)SRU 111,7
  • Aus einer Lösung mit 1 g MPEG mit einem Molekulargewicht von 5000, die in 30 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; gelöst war, wurden 10 ml Lösungsmittel abdestilliert. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und 132 mg (0,6 mM) Di-2-pyridylcarbonat und 4 mg DMAP wurden zugegeben. Die entstehende Lösung wurde dann 14 Stunden lang gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Diethylether verrieben und der entstehende Niederschlag abfiltriert. Das Produkt wurde dann in 7 ml trockenem Glyme gelöst, erwärmt, um die Auflösung zu bewirken, und die entstehende Lösung abkühlen gelassen und bei Raumtemperatur mehrere Stunden lang stehen gelassen. Der entstehende Niederschlag wurde dann abfiltriert und mit 2 x 5 ml trockenem Glyme gewaschen. Der Feststoff wurde dann in einem Vakuumofen und unter Stickstoffströmung getrocknet, was 0,7 g alpha-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]omega-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl)SRU 111,7 lieferte.
  • Analyse für: C&sub9;H&sub1;&sub1;NO&sub4; (CH&sub2;CH&sub2;O)111,7.
  • berechnet: C 54,57; H 9,02; N 0,28;
  • gefunden: C 54,51; H 9,19; N 0,28.
  • PEG-modifiziertes Interferon wurde hergestellt unter Verwendung dieses Reagenzes mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode 1.
    • Referenzbeispiel 4 Herstellung von alpha-(2-Pyridinyloxy)carbonyl]- omega-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl)SRU 225
  • Mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren wurde MPEG mit einem Molekulargewicht von 10000 in alpha-[(2- Pyridinyloxy)carbonyl]omega-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl)SRU 225 umgewandelt.
  • Analyse für: C&sub9;H&sub1;&sub1;NO&sub4; (CH&sub2;CH&sub2;O)&sub2;&sub2;&sub5;:
  • berechnet: C 54,54; H 9,08; N 0,14;
  • gefunden: C 54,54; H 9,12; N 0,11.
  • PEG-modifiziertes Interferon wurde unter Verwendung des Reagenzes mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode 1 hergestellt.
    • Beispiel 5 Herstellung von alpha-Methyl-omega-[2-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]oxy]propoxy]propoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl)SRU 64,7
  • Aus einer Lösung mit 0,5 g alpha-2-[2-(Hydroxypropoxy)propyl]omega-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl)SRU 64,7 in 40 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; wurden 15 ml Lösungsmittel abdestilliert. Zu der Lösung wurden dann 108 mg Di-2-pyridylcarbonat, 4 mg DMAP und mehrere Kügelchen 4 A-Molekularsiebe zugegeben. Die Mischung wurde dann über Nacht gerührt, filtriert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Größenausschluß-Chromatographie gereinigt.
  • Dieses Reagenz entsprach einer Verbindung der Formel
  • worin n etwa 64 ist.
  • Dies entspricht einem Molekulargewicht des Polymers von etwa 3000 Dalton.
  • PEG-modifiziertes Interferon wurde unter Verwendung dieses Reagenzes mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode 1 hergestellt.
    • Beispiel 6 Herstellung von alpha-Methyl-omega-[2-[2-[[(2-pyridinyloxy)- carbonyl]oxy]propoxy]propoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl)SRU 110
  • Mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren wurde alpha-2- [2-(Hydroypropoxy)propyl]omega-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl)SRU 110 in alpha-Methyl-omega-[2-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]oxy]propoxylpropoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl)SRU 110 umgewandelt.
  • Dieses Reagenz (IIB-2) entspricht dem in Beispiel 5 (IIB-1) beschriebenen, außer das n etwa 110 ist, was etwa 5000 Dalton entspricht.
  • PEG-modifiziertes Interferon wurde unter Verwendung dieses Reagenzes mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode 1 hergestellt.
    • Beispiel 7 Herstellung von Methyloxiran Oxiranpolymer-[2-[[2- Pyridinyloxy)carbonyl]amino]propylmethylether (MO/O =10/32)
  • Aus einer Lösung von 1 g Jeffamin M-2070 (Texaco Chemical Co.) in 40 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; wurden 15 ml Lösungsmittel abdestilliert. Die Lösung wurde auf 0ºC gekühlt und 215 mg Di- 2-pyridylcarbonat wurden zugegeben. Die entstehende Lösung wurde weitere 4 Stunden lang bei 0ºC gerührt, wonach das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt wurde. Der Rückstand wurde dann mit Hilfe von 2 Phenomenex-Größenausschlußsäulen, die aufeinanderfolgend verbunden waren (500 Å und 1000 Å) gereinigt. Das Produkt zeigte zwei Banden im UV bei 232 nm und 310 nm.
  • Dieses Reagenz entsprach einer Verbindung der Formel
  • worin R&sup5; H ist, R² H oder ein Methylrest ist und als durchschnittliche Verteilung n 32 ist, wenn R² H und n 10 ist, wenn R² ein Methylrest ist.
  • PEG-modifiziertes Interferon wurde unter Verwendung dieses Reagenzes mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode 2 hergestellt.
    • Beispiel 8 Herstellung von Methyloxiran Oxiranpolymer-[2-[[(3-Methyl-2- pyridinyloxy)carbonyl]amino]propylmethylether (MO/O = 10/32)
  • Mit dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren wurde 1 g Jeffamin M-2070 mit bis-(3-Methyl-2-pyridyl)carbonat umgesetzt, was Methyloxiran-Oxiranpolymer-[2-[[(3-Methyl-2- pyridinyloxy)carbonyl]amino]propylmethylether lieferte (MO/O = 10/32).
  • Dieses Reagenz (IIA-2) entspricht dem in Beispiel 7 (IIA-1) beschriebenen, außer das R&sup5; CH&sub3; ist.
  • PEG-modifiziertes Interferon wurde unter Verwendung dieses Reagenzes mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode 1 hergestellt.
    • Beispiel 9 Herstellung von Methyloxiran-Oxiranpolymer-[2-[[(2- Pyridinyloxy)carbonyl]amino]propylmethylether, Block (MO/O = 1,6/18,6)
  • Mit dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren wurden 0,6 g Jeffamin M-1000 (Texaco Chemical Co.) mit 155,6 mg Di-2- pyridylcarbonat umgesetzt, was Methyloxiran-Oxiranpolymer-[2- [[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]amino]propylmethylether als Blockpolymer (MO/O = 1,6/18,6) lieferte.
  • Dies liefert eine Verbindung der Formel
  • Mit der angegebenen durchschnittlichen Verteilung der Einheiten in dem polymeren Produkt.
  • PEG-modifiziertes Interferon wurde unter Verwendung dieses Reagenzes mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode 1 hergestellt.
  • Antivirale Akivität von Interferon: Die antivirale Aktivität von Interferon und PEG-modifiziertem Interferon wurde bestimmt (Rubenstein et al (1981) J. Virol. 37: 755-758; Familletti et al (1981) Methods Enzymol. 78: 387-394). Alle Tests wurden bezogen auf die Kontrolle standardisiert. Der in dem Test verwendete Interferonstandard hatte eine spezifische Aktivität von 2 x 10&sup8; Einheiten pro mg Protein.
  • Die zur Modifikation von Interferon verwendeten Bedingungen basierten auf optimierten Protokollen, wie beschrieben. Die PEG-Modifikation wurde mit SDS-PAGE analysiert bezüglich der Umwandlung von Interferon in Mono-PEG-Interferon bei verschiedenen Inkubationszeiten (chemische Reaktivität) und bezüglich der Verteilung auf verschiedene Arten von PEG- Interferonkonjugaten (Ortsselektivität). Bei der SDS-PAGE wurden PEG-modifizierte Molekularten als langsame wandernde Banden auf dem Gel beobachtet. Sowohl Mono-PEG- als auch Di- PEG-Interferone wurden in ausreichender Ausbeute erzeugt, sodaß diese Molekülarten aus den Reaktionsmischungen durch Chromatographie unter Ausnutzung hydophober Wechselwirkungen gereinigt werden konnten. Gereinigte PEG-Interferone wurden auf ihre antivirale Aktivität getestet und mit unmodifizierten Interferon-a2a-Standards verglichen. Die Molekulargewichte der verwendeten Polymere ebenso wie die antivirale Aktivität einiger pegylierter Derivate sind in Tabelle 1 beschrieben. Tabelle 1 Physikalische Eigenschaften von PEG-Reagenzien und biologischen Aktivitäten der Proteinkonjugate
  • ND = nicht bestimmt.

Claims (19)

1. Interferon-Konjugat der Formel:
worin R C1-C4-Alkyl ist; R¹, R², R³ und R&sup4; H oder C1-C4-Alkyl sind;
m 1 oder 2 ist;
W O oder NH ist;
x eine ganze Zahl zwischen 1 und 1000 ist und jede von y und z eine ganze Zahl von 0 bis 1000 ist und die Summe von x, y und z 3 bis 1000 ist;
mit der Maßgabe, daß mindestens einer von R¹, R², R³ und R&sup4; C1-C4-Alkyl ist und x, y und z so gewählt sind, daß das Molekulargewicht der Polymereinheit in dem Konjugat im Bereich von etwa 1000 Dalton bis etwa 10 000 Dalton ist.
2. Interferon-Konjugat nach Anspruch 1, worin m 1 ist.
3. Interferon-Konjugat nach Anspruch 1, worin R Methyl ist.
4. Interferon-Konjugat nach Anspruch 1, worin x, y und z so gewählt sind, daß das Molekulargewicht der Polymereinheit in dem Konjugat im Bereich von etwa 1000 Dalton bis etwa 5000 Dalton ist.
5. Interferon-Konjugat nach Anspruch 1, worin x, y und z so gewählt sind, daß das Molekulargewicht der Polymereinheit in dem Konjugat im Bereich von etwa 1000-2200 Dalton ist.
6. Interferon-Konjugat nach Anspruch 1, worin x und y 5,0 bis 500,0 sind und z 0,0 bis 4,0 ist.
7. Interferon-Konjugat nach Anspruch 1, worin x 10,0 bis 100,0 ist, y 1,0 bis 10,0 ist und z 0 ist.
8. Interferon-Konjugat nach Anspruch 1, worin das Interferon Interferon-α2A ist.
9. Interferon-Konjugat nach Anspruch 8, worin W NH ist; m 1 ist; R, R² und R³ CH&sub3; sind; R¹ H ist; x 18,6 ist, y 1,6 ist und z 0 ist.
10. Verbindung der Formel:
worin R C1-C4-Alkyl ist, R¹, R², R³, R&sup4; H oder C1-C4-Alkyl sind, vorausgesetzt, daß mindestens einer von R¹, R², R³ und R&sup4; C1-C4-Alkyl ist; R&sup5; H oder C1-C4-Alkyl ist, wenn W NH ist, oder R&sup5; H ist, wenn W O ist;
W NH oder O ist;
x eine ganze Zahl zwischen 1 und 1000 ist und jede von y und z eine ganze Zahl von 0 bis 1000 ist und die Summe von x, y und z 3 bis 1000 ist und x, y und z so gewählt sind, daß das Molekulargewicht der Polymereinheit in dem Konjugat im Bereich von etwa 1000 Dalton bis etwa 10 000 Dalton ist.
11. Verbindung nach Anspruch 10, worin R Methyl ist.
12. Verbindung nach Anspruch 10, worin x 10,0 bis 100,0 ist, y 1,0 bis 10,0 ist und z 0,0 bis 4,0 ist.
13. Verbindung der Formel:
worin R C1-C4-Alkyl ist; R¹, R², R³ und R&sup4; H oder C1-C4-Alkyl sind, x eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und jede von y und z eine ganze Zahl von 0 bis 1000 ist und die Summe von x, y und z 3 bis 1000 ist, worin mindestens einer von R¹, R², R³ und R&sup4; C1-C4-Alkyl ist und worin x, y und z so gewählt sind, daß das Molekulargewicht der Verbindung im Bereich von etwa 1000 Dalton bis etwa 10 000 Dalton ist.
14. Verbindung nach Anspruch 13, worin R Methyl ist.
15. Interferon-Konjugate nach einem der Ansprüche 1-9 zur Verwendung als therapeutisch wirksame Verbindungen bei der Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen.
16. Verfahren zur Herstellung eines Interferon-Konjugats, wie in einem der Ansprüche 1-9 beansprucht, wobei das Verfahren die Umsetzung einer in den Ansprüchen 10-14 beanspruchten Verbindung mit Interferon oder einem Salz davon und die Isolierung des Interferon-Konjugats aus der Reaktionsmischung umfaßt.
17. Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend ein Interferon-Konjugat, wie in einem der Ansprüche 1-9 beansprucht, und einen therapeutisch inerten Träger.
18. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung oder Prophylaxe immunmodulatorischer Erkrankungen wie neoplastischen Krankheiten oder infektiösen Krankheiten, umfassend ein Interferon-Konjugat, wie in einem der Ansprüche 1-9 beansprucht, und einen therapeutisch inerten Träger.
19. Verwendung von Interferon-Konjugaten nach einem der Ansprüche 1-10 zur Herstellung von Medikamenten zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen.
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