DE69309452T2

DE69309452T2 - Herstellung von aktivierten Carbamaten von Polyalkylenglycol und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE69309452T2
Application number: DE69309452T
Authority: DE
Inventors: Yvan Looze
Original assignee: Heylecina S A
Current assignee: Heylecina S A
Priority date: 1993-06-29
Filing date: 1993-06-29
Publication date: 1997-11-06
Anticipated expiration: 2013-06-30
Also published as: EP0632082B1; DE69309452D1; ATE151090T1; EP0632082A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf chemische Änderungen von Folypeptiden mittels kovalenten Verbindungen durch poly(Alkylen Glykol) Fasern, für eine Verbesserung ihrer Abgabe von Arzneimitteln.

STAND DER TECHNIK

Der potentielle Wert von Peptiden und Proteinen als Heilmitteln ist seit langein bekannt. Ihre Lieferung stellt aber immer noch jetzt eine Herausforderung dar.
In der Vergangenheit, vor der Entwicklung von industriellen Herstellungsverfahren für menschliche recombinante Proteinen, wurden die meisten Proteine und Polypeptiden, die für die Heilung genutzt wurden, von nicht-menschlichen Quellen abgeleitet
Eine überhöhte Verabreichung von solchen nichtmenschlichen Proteinen hatte leider die Ausbildung von immunen Antworten zur Folge, die eine Überempfindlichkeit oder auch den Tod bewirken könnten. Zudem wurde auch die Ausbildung einer immunen Antwort mit einer vermehrten Beseitigung von proteinen verbunden, die die Verwendung stärkerer Dosierungen erforderte, damit die therapeutische Wirksamkeit beibehaltet würde.
Dies hatte einen fehlerhaften Zyklus von stärkeren Dosierungen zur Folge, dem eine immune Antwort folgte, die für sich die Beseitigung vermehrte und so einen Mangel an Wirksamkeit bewirkte.
Man glaubte, daß durch die Verwendung von solchen menschlichen Proteinen, die durch die rekombinante Technologie erzeugt werden, diese Probleme beseitigt würden.
Eine steigende Zahl von rekombinanten menschlichen Proteinen stehen nun auf dem Markt zur Verfügung. Eine Zahl von rekombinanten Proteinen wurde schon durch die Food and Drugs Administration (FDA) für die Verwendung genehmigt Während aber die Bewertung solcher Proteine fortschrittete, wurde es deutlich, daß sich die Hoffnung, daß die rekombinante Technologie könne alle Problemen lösen, die im Zusammenhang mit dem therapeutischen Einsatz von Preoteinen autreten, nicht bewahrleistete. Die Schwierigkeiten mit rekombinanten Interleukin-2 (rIL-2) stellen in diesem Zusammenhang ein typisches Beispiel dar.
Menschliches Interleukin-2 (IL-2), ein einzige Polypeptidkette mit 133 Aminoaciden, ist auf Threonin in der Position 3 glycosyliert, während im E. Coli erzeugte rIL-2 unglycosyliert bleibt (R. Devos et al., Nucleic Acids Res., 1983, 11:4307, und S.A. Rosenberg et al., Science, 1984, 223:1412).
Infolge eines fehlenden Karbohydratausschnitts ist rIL-2 kaum in wäßrigen Lösungen mit einem physiologischen pH löslich, und sein umlaufendes Halbleben ist sehr kurz (anfängliches Halbleben von 7 bis 13 Minuten und endliches Halbleben von 70 bis 85 Minuten - M.T. Lotze et al., J. Immunol., 1985, 135:2865; M. W. Konrad et al., Cancer Res., 1990, 50:2009).
Ferner wurden bei Patienten, die klinischen Prüfungen mit der rekombinanten Cytokin unterzogen wurden, Antikörper zu rIL-2 gefunden CM. Allegretta et al., J. Clin. Immunol., 1986, 6:481; M. B. Atkins et al., J. Clin. Oncol., 1986, 4:1380; R. L. Krigel et al., Cancer Res., 1988, 48:3875). Um diese Probleme zu überwinden, wurden stärkere Dosierungen angewendet und die langdauernde intravenöse Verabreichung vön rIL-2 wurde erfolgreich geprüft; in der Tat antitumorale Wirkungen wurden erhalten. Beschränkt aber wurde die Zahl der reagierenden Patienten, und die Behandlung war nicht frei von einer gravierenden Toxizität (S. A. Rosenberg et al., N. Engl. J. Med., 1987, 316:889).
Sei auch erwähnt, daß einige für menschliche Therapie potentiell nutzbare Enzyme (z. B. Uricase, die die Menge Harnsaüre im Plasma und Urin reduziert) durch menschliche Zellen nicht produziert Werden.
Daher braucht die Verabreichung von Polypeptiden, entweder von nicht- oder menschlichem Ursprung ferner untersucht werden, um dann diesem Material eine pharmazeutische Wirksamheit zu erleihen, wenn es als Medikament genützt wird.
Jetzt ist die chemische Verbindung von Poly(Alkylen- Glykol) (PAG) mit Polypeptiden als ein interessantes Verfahren bekannt zum Verleihen zahlreicher und interessanter Eigenschaften der modifizierten Polypeptiden, in Zusammenhang mit ihrer Verwendung als Medikamenten.
In der Regel haben die PAG-modifizierten Polypeptide eine höhere Stabilität, eine höhere Festigkeit gegen proteolytische Inaktivation, längere umlaufende Leben, reduzierte bis nicht-vorhandene Antigenität und Immunogenität, und langere Toxizität.
In Folge der potentiellen Nutzbarkeit aller dieser verlichenen Eigenschaften, wurde schon die kovalente Verbindung von PAG mit verschiedenen therapeutisch interessanten Proteinen versucht und sind zur Zeit klinisch ausgewertet.
Eine PAG-modifizierte Form vob Adenosindeaminase (ADAGEN ) hat sogar die Genehmigung der FDA für die Vermarktung zur Behandlung von der mit der Adenosindeaminase-Defizienz verbundenen, gravierenden kombinierten Immunodefizienz-Krankheit.
Bei dem obergenannten rIL-2, hat die chemische Pfropfung von 2 bis 3 Poly(Ethylen Glykol)-(PEG) Ketten (jeden mit 7 kDa) eine Verbindung zur Folge, die eine verstärkte Löslichkeit und ein 10 bis 20 mal verlängertes umlaufendes Halbleben aufweist (M. J. Knauf et al., J. Biol. Chem., 1985, 263:15064; F. J. Meyer et al., Clin. Pharmacol. Ther., 1991, 49:307).
Ferner weist der intravenös verabreichte PEG-rIL-2 eine Antitumoraktivität auf, die wesentlich stärker ist, als der von rIL-2 (F.J. Meyer et al., Loc. cit.; R.J. Zimmerman et al., Cancer Pes., 1989, 49:6521; Y.Shih et al., Eur J. Immunol., 1992, 22:127; V. Mattijssen et al., Int. J. Cancer, 1992; 51:812.- J.C. Yang et al., Lymphokine Cytokine Bes., 1992, 10:475), zusammen mit einer verringerten Immunogenität (N.V. Katre, J. Immunol., 1990, 144:209).
Seit seinem Auftreten schon im Jahre 1977 (A. Abuchowski et al., 1977, J. Biol. Chem., 152:3578) wurde die Technologie der Verwendung von PAG in verschiedenen medizinischen Bereichen, wie die Enzyme-Ersetzung-Therapie (S. Chaffee et al., 1992, J. Clin. Inverstig., 89:1643), cancer immunotherapy (F.J. Meyers et al., 1991, Loc. cit.; V. Mattijssen et al., 1992, Loc. cit.) and allergy hyposensitizing treatments (U. Müller et al., 1987, J. Allergy Clin. Immunol., 80:252; H. Mosbech et al., 1990, Allergy, 45:130).
Ferner erwartet man von der Beobachtung, daß eine PAG- Veränderung von Epitopen von Proteinen eine Immunotoleranz zu den ursprünglichen Epitopen induziert, und daß die PAG- Technologie im Bereich der autolinmunen Krankheiten interessant werden könnte (A.M Schon, 1991, Advanced Drug Delivery Rev., 6:203; M.Z. Atassi et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:5852).
Schließlich sei es die Beobachtung erwähnt, daß die kovalente Veränderung von Proteinen mit PAG-Ketten eine verstärkte und/oder selektive Absorbierung von diesen Polypeptiden durch verschiedene Typen von Zellen und/oder Geweben zur Folge haben könnte (P. Caliceti et al., 1989, Il Farmaco, 44:711; J.S. Beckman et al., 1988, J. Biol. Chem., 263:6884; A.V. Kabanov et al., 1992, J. Controlled Release, 22:141).
Obwohl der Mechanismus dieses Prozesses unklar bleibt, mehrere Erscheinungen darauf hinzuweisen, daß das PAG die Anbindung zur Zellmembran erleichert; die Endocytose von dem PAG-Polypeptid-Konjugat (J.S. Beckman et al., Loc. cit.) diesem Schritt dann nachgeschaltet wäre.
Die Offensichtlichkeit der Interaktion zwischen PEG und Zellmembranen ist nun gut dokumentiert seit der Entdeckung der PEG-induzierten Fusion von Zellen und Liposomen (K.N. Kao et al., 1974, Planta, 120:215; Q. Ahkong et al., 1975, Nature, 253:194; G. Fontecorvo, 1975, Somat. Cell Genet, 1:397; M. Yamazaki and T. Ito, 1990, Biochemistry 29:1309; L.T. Boni et al., 1984, Biochim. Biophys. Acta, 775:409; G.D. Bittner et al., 1986, Brain Res., 367:351; T.L. Krause and G.D. Bittner, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:1471; N. Geron and H. Mein, 1985, Biochim. Biophys. Acta, 819:258).
Auch die Interpretation einiger Erfolge von Zwei-Phasen Verteilungen fördert den Eindruck, daß PEG mit Zellmembranen interagiert (H. Walter et al., 1992, J. Chromatog., 609:219). Von diesen Beobachtungen kann man erwarten, daß die Verwendung von PAG ein gezieltes Durchdringen von Polypeptid-Arzneimitteln in ausgewählte Zellen und/oder Gewebe erlauben könnte.
Die PAG sind lineare, hydrophobische, nicht-geladene und flexible Polymerisate, die auf dem Markt mit verschiedenen Molekulargewichten zur Verfügung stehen.
Diese Polymerisate sind nicht-toxisch und in der Regel als sicher zu betrachten. Insbesondere ist das Monomethoxy- Poly(Ethylen Glykol) (mPEG) durch die FDA genehmigt als Träger oder Basis für eine Zahl von pharmazeutischen Präparationen und in oralen, parenteralen und epidermalen Verwendungen, es weist eine verringerte Toxizität auf (C.B. Shaffer and F.M. Critchfield, 1947, J. Am. Pharm. Assoc., 36:157; C.P. Carpenter and C.B. Shaffer, 1952) J. Am. Pharm. Assoc., 41:27; H.F. Smyth et al., 1950, J. Am. Pharm. Assoc., 39:349).
Bei einer intravenösen Verabreichung am Mensch werden die mPEG mit einem Molekulargewicht von 1 bis 6 kDa leicht ausgeschieden, hauptsächlich durch die Niere (C.B. Shaffer and F.M. Critchfield, 1947, Loc. cit.).
Einen wesentlichen Vorteil stellt die niedrige Toxizität des PAG dar, die die niedrige Toxizität von den Polypeptiden, mit weichen sie kovalent verbunden sind, erklären kann, mit dem inhärenten Nachteil, daß die PAG keine chemische Aktivität aufweisen
Folglich, um die kovalente Verbindung von PAG mit Polypeptiden herzustellen, müßen zuerst die terminalen Hydroxyl-Gruppe des PAG in reaktive funktionelle Gruppen umgewandelt werden
Dieser Prozess wird oft "Aktivierung" genannt, und die Produkte werden "aktivierte" oder "derivatisierte" oder "funktionalisierte" PAG genannt.
In den meisten Fällen wurden auf einem Ende mit einer funktionellen Gruppe bedeckte mPAG-Derivate verwendet, obwohl die für die Aktivierung von PAG bzw. mPAG verwendeten Verfahren keine wesentlichen Unterschiede von einem sein chemischen Standpunkt aus aufweisen.
Gegenstand von intensiven Versuchen während das letztes Jahrzehnt wurden die chemische Verfahren zur Herstellung von aktivierten PAG, die den wesentlichen Schritt darstellen für die Herstellung angepaßter PAG-Polypeptid- Konjugate.
Polymerische Derivate für die selektive Anbindung von PEG zu den Arginin-Seitenketten von Polypeptiden wurden als Träger während der Semisynthese von Peptiden in wäßrigen Lösungen vorgestellt (C.S. Pande et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 77:895; J.D. Glass et al., 1981 in: Peptides Structure and Function, (D. Rich ed) p209 Pierce Chemical Co, Rockford, IL; J.D. Glass et al., 1979, in: Peptides 1978 (I.Z. Siemion and G. Kupryszewski, eds) p235, Wroclav University Press, Poland).
Die Reagente wurden leicht herstellbar durch die Reaktion von Kampferquinon-10-Sulfonyl Chlorid mit mPEG, mPEG-NH&sub2;, oder vorzugsweise mit dem Norleucin-Ester des Polymerisats.
X= O, NH oder N-O

DERIVAT D1

Die modifizierten Peptide wurden in einem Borat-Puffer auf pH 9,0 auf 37ºC formuliert.
Sie wurden stabil gegen verschiedene sauere und nucleophile Reagenten, auch gegen Hydroxylamin) der das empfohlene Mittel für die Spaltung von Cyclohexandion- Arginin-Addukten darstellt Mittels O-Phenylendiamin konnten aktive Peptide von dem polymerischen Träger befreit werden. Bei dem Einbau von Norleucin als Abstandhalter zwischen der Kampferquinon-Einheit und dem Polymerisat, wird der Umfang der Arginin-Modifizierung leicht durch die Aminosäure-Bestimmung von den Hydrolysaten der PEG-Peptiden bestimmt.
Verschiedene Proteine wurden auch mit DERIVAT D2, einem mPEG-5 kDa-Analog von Phenylglyoxal, einem bekannten Reagent für die Modifizierung von Guanidino Gruppen (Seitenketten-Funktion von Arginin-Resten) modifiziert (EP-A-0 340 741 - 1989 - von A; Sano, E Maeda, Y. Kai und K. Ono). Die Synthese von DERIVAT D2 wurde nach die Reaktionen gemäß Schema 01 ausgeführt. Schema 01: Präparation des mPEG-Phenoxyglyoxals: DERIVAT D2 4-hydroxyacetophenone DERIVAT
Fertig verfügbares mPEG-Tosylat (S. Zalipsky et al. 1987, Int. J. Peptide Protein Res., 30:740; J.M. Harris et al., 1984, J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 22:341) wurde einer nucleophilen Versetzung durch 4-Hydroxyacetophenon unterworfen, und wurde dann durch Selenlum Dioxid oxidiert um mPEG-Phenylglyoxal zu liefern.
Die Anbindung von DERIVAT D2 zu Proteinen durch Arginyl- Reste fand statt bei Raumtemperatur im pH-Bereich von 5,5- 9,3, und wurde durch die Abnahme der Arginin-Menge in Hydrolysaten von modifizierten Polypeptiden gemessen. Dabei werden sehr gute Stabilität und biologische Aktivität des DERIVAT D2-Konjugats verlangt.
Maleimidhaltige Reagenten sind wirksame Modifizierungsmittel von freie Cysteinyl-Resten von Polupeptiden (M.Z. Atassi, 1977, in: Immunochemistry of Proteins; M.Z. Atassi, Ed. Vol 1, Plenium Press, New York). Die Herstellung von DERIVAT D3, der Maleimido funktionellen Gruppen enthält, mittels zugänglichen PEG- NH&sub2; (S. Zalipsky et al., 1983, Eur. Polym. J., 19:1177; A. Buckmann et al., 1981, Makromol. Chem., 182:1379) und aktive Estern von 6-Maleimidohexanoischen Saüre (R.J. Goodson and N.V. Katre, 1990, Biotechnology, 8:343) und der 3-Maleimidopropionische säuren (S. Romani et al. 1984, in: Chemistry of Peptides and Proteins; W. Voelter, E. Bayer, Y.A. Oychinnikov and E. Wunsch, Eds; Vol 2, P.29, Walter de Gruyter, Berlin) als Ausgansmaterialen wurden bekanntgemacht (Schema 02). Schema 02: Präparation von PEG-Maleimiden: DERIVAT D3 Protein-SH S-Protein mPEG-Protein addukt
Ein mutantes Protein von Interleukin-2, in weichein Cystein auf Position 3 den von natürlichen Ursprung glycosylierten Threonin-Rest ersetzte, wurde mit DERIVAT D3 (n=5) gekoppelt, um ein gut bestimmtes, völlig bioaktives PEG- Polypeptid zu liefern (R.J. Goodson and N.V. Katre, 1990, Loc. cit.). DERIVAT D3 (n=2) wurde für die selektive Anbindung von freien Thiol-haltigen Peptiden auf das Polymerisat genutzt, un die Reinigung von nichtsymmetrischen Cystin-Peptiden aus eine Reaktionsmischung zu vereinfachen (S. Romani et al., 1984, Loc. cit.).
Amino-PEG ließ man mit 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)- Carbodiimid aktivierten Carboxy Gruppen von Trypsin und anderen Proteinen reagieren (US Patent 4 179 337 (1979) von F. F. Davis, T. Van Es und N. C. Palczuk).
Die Selektivität einer solchen Reaktion ist ziemlich schlecht, weil das Amino-PEG eine gleichartige Reaktivität auf die Lysyl-Resten von Proteinen hat. In einer Variante dieser Reaktion wurde ein p-Aminobenzyläther von PEG mit Carboxy Gruppen von D-Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase gekoppelt, mittels Behandlung mit 1-Ethyl-3-(3- Aminopropyl)-Carbodiimid (A. Pollak and G M. Whitesides, 1976, J. Am. Chem. Soc., 98:289).
Das rohe Konjugat behielt 22% von der ursprunglischen Aktivität. Die aromatische Amino-Gruppen auf dem Polymerisat weisen ein niedriges pKa als die Amino-Gruppen von Lysin-Resten auf, und aus diesen Gründen würde man erwarten, daß sie eine höhere Aktivität aufweisen zu aktivierten Carboxyle unter den sauren Bedingungen von solchen Reaktionen (pH 4,8-6,0). Bei beiden Typen von Modifizierungen, in welchen aliphatische und aromatische Amino-PEG einbezogen wurden, wurde die Zusammensetzung der Konjugaten nicht bestimmt.
Nach einem neuere Bericht, wurde Bilirubin-Oxidase gemäß einem Zwei-Schritte-Protokol modifiziert (N. Kimura et al., 1988, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 188:364).
Zuerst wurde 1,4-Diaminobutan mit den Carboxy-Gruppen mittels wasserlöslichen Carbodiimids gekoppelt.
Dann wurden die neu eingebauten Amino-Gruppen zusammen mit den ursprünglichen Aminen des Proteins mit Cyanurchlorid modifiziert.
Die Aktivität des PEG-Bilirubin oxidase-Konjugats betrug annähernd 30% derjenigen des ursprünglichen Enzyms.
Leider wurde die Zusammensetzung des Konjugats nicht offenbart. Wenn man die Kopplung eines angepaßten Nucleophils mit einem Protein mittels Carbodiimid ausgeführt, muß man mögliche Nebenreaktionen wie die Modifizierung von Tyrosyl- und Cysteinyl-Resten oder auch die Ausbildung von N-Acyl-Harnstoff-Derivaten berücksichtigen (M. Z. Atassi, 1977, Loc. cit.).
In der ursprünglichen Arbeit von Davis und Mitarbeitern (Abuchowsky et al., 19771 Loc. cit.), ließ man 2,4,6- Trichloro-s-Triazin (Cyanurchlorid) solcherweise mit den primären Alkohol-Gruppen auf das PEG reagieren, daß eines der Chloride von dem Triazin-Ring verdrängt wurde, und daß eines der restlichen Chloride für die nachträgliche Reaktion mit den Amino-Gruppen des Polypeptids genützt wurde, wie es im Schema 03 gezeigt wird. Schema 03: Präparation und Verwendung eines mPEG-Triazin Protein-NH&sub2; Protein-NH&sub2;
Dieser Ansatz wurde später von vielen anderen Untersuchenden verfolgt) und diese Methode blieb lange eine der am weitesten verbreiteten.
Obwohl dieser Ansatz eine sehr wirksame Aktivierung des PAG in einem einzigen Schritt ist, ist er mit verschiedene Nachteile behaftet, wie die Toxizität des Cyanurchlorids und die überschussige Reaktivität des PEG-Trazin-Addukts auf nicht-Aminen nucleophile funktionelle Gruppen (z. B. Cysteinyl- und Tyrosyl-Resten). Die Modifizierung von bestimmten Proteinen mit den PEG-Traizin-Addukten bringt daher oft eine wesentliche Verminderung an biologische Aktivität mit sich (Y. Ashihara et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun., 93:385; K.J Wieder et al., 1979, J. Biol. Chem., 254:12579; S. Davis et al., 1981, Clin. Exp. Immunol., 46:649; K. Yashinaga and J.M. Harris, 1989, J. Bioact. Compatible Polym., 4:17).
Ferner sind alle oben ausgelegten Ansätze mit dem Nachteil behaftet, daß noch vorhandene Ringe (von denen einige aromatische Ringe sind) das Polypeptide mit den PAG-Fasern verbinden.
Solche in den PAG-Polypeptid-Konjugaten vorhandene Strukturen könnten Toxizität-Problemen erzeugen.
Die Nachteile der oben ausgeführten Aktivierungsmethoden wurden mittels Verwendung von PEG-Succinimidyl Succinat überwunden (SS-PEG, DERIVAT D4). Diese Form von aktiviertem PEG wurde erstmals für die Vernetzung von Proteinen (US Patent 4 101 380, M. Rubinstein - 1978) und die Synthese von mit PEG-Ketten auf den Enden substituierten Peptiden (M. Jappich and P.L. Luisi, 1979, Makromol. Chem., 180:1381) verwendet, doch wurde sie später für die Herstellung von in mPEG-Protein-Konjugaten angepaßt (A. Abuchowski et a., 1984, Cancer Biochem. Biophys., 7:175).
DERIVAT D4 wird herkömmlich durch Succinylation der Hydroxy-Endgruppen von PEG hergestellt, mit nachträglicher Kondensation mit N-Hydroxysuccinimid, mittels Dicyclohexylcarbodiimid. Es reagiert in kurzer Zeit mit Proteinen unter mäßigen Bedingungen (30 Minuten,; pH < 7,8; 25ºC), mit der Erzeugung von weiteren modifizierten Proteinen mit gut erhaltenen biologischen Aktivitäten.
Leider Weist die Ester-Verbindung zwischen dem PEG- Polymerisat und dem Succinic Ester-Rest eine beschränkte Stabilität in wäßrigen Medien auf (US Patent 4 670 417, 1987, K. Iwasaki, Y. Iwashita und T. Okami), welches eine langsame hydrolytische Spaltung den PEG-Ketten aus den SS- PEG-modifizierten Polypeptiden unter physiologischen Bedingungen mit sich bringt. SUCCINIMIDYL-PEG-DERIVATE
D4 M=2, X=O
D5 M=3, X=O
D6 M=2. X=NH
Die Substitution des Succinatteiles in Derivat D4 mit
Glutarat erzeugt eine aktivierte Form des Polymerisats (DERIVAT D5) sehr ähnlich zu dem SS-PEG, doch mit einer etwas verbesseren Festigkeit der Ester-Verbindung gegen Hydrolyse (V.N. Katre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:1487).
Außerdem verbessert die Ersetzung des aliphatischen Esters in dem SS-PEG durch eine Amid-Verbindung, welche das DERIVAT-D6 erzeugt, zusätzlich die Stabilität des Reagents und dessen Konjugats (US Patent 4 670 417, Loc. cit.). Leider setzt die Herstellung des DERIVATS D6 aus mPEG mit Hydroxyl-Endgruppen 4 bis 5 Syntheseschritte voraus (E. Boccu et al., 1983, Z. Naturforsch., 38C:94).
Die Ausbildung von Urethan (Carbamate) Verbindungen zwischen en Amino-Gruppen eines Proteins und dem PAG sind völlig stabil unter verschiedenen physiologischen Bedingungen (D. Larwood and F. Szoka, 1984, J. Labelled Compd. Radiopharm., 21.603).
Die unmittelbare (ohne Abstandhalter) Anbindung von mPEG- Ketten an Polypeptiden durch Carbamat Verbindungen wurde erstmals mittels Verwendung von Imidazoylformat-Derivaten von PEG (DERIVAT D7) erreicht, wie im SCHEMA 04 gezeigt. Schema 04: Präparation und Verwendung eines mPEG-Imidazol-1-yl Protein-NH&sub2; Protein Derivat
Mehrere Varianten einer Ein-Schritte Synthese von DERIVAT D7 mittels Carbonyldiimidazol wurden bekanntgemacht (C.O. Beauchamp et al., 1983, Anal. Biochem., 131:25 L. Tondelli et al., 1985, J. Controlled Release, 1:251).
Die völlige Umwandlung der Hydroxyl-Gruppen des PEG in DERIVAT D7 wurde kürzlich erreicht (J. Brygier et al., 1993, Biotechnol. Appl. Biochem., 15: in der Fachpresse)
Eine gute Erhaltung der Aktivität wurde üblicherweise in den mit Derivat D7 modifizierten Enzymen beobachtet.
Leider weisen die so aktivierten PAG eine ziemlich mäßige Reaktivität auf, und daher sind lange Reaktionszeiten zur Modifizierung des Proteins erforderlich (48 - 72 Stunden, pH 8,5).
Die Produkte der Modifizierung des Proteins mittels aktivierten Sarbonaten des PEG (DERIVATE D8, D9 und D10) weisen auch PEG-Ketten, die auf den Amino-Gruppen des Polypeptids durch Urethan-Verbindungen gepfropft sind, auf. AKTIVE CARBONATE VON PEG
Ein-Schritt-Verfahren mit einer einziger Schritte unter Verwendung von handelsüblichen Chloroformiaten des 4- Nitrophenols und des 2,4,5-Trichlorophenols, wurden zur Herstellung von DERIVATEN D8 bzw. D9 durchgeführt (E.M. Veronese et al., 1985, Appl. Biochem. Biotechnol., 11:141).
Diese aktivierten PEG scheinen rascher zu reagieren als Derivat D7. Die beiden, im Laufe des PEG-Propfungsprozess entstandenen 4-Nitrophenol und 2,4,5-Trichlorophenol sind aber toxische, hydrophobische Moleküle mit Affinitäten zu Polypeptiden.
Vor kurzem wurde dem Derivat 10 und einer Reihe von verbundenen Carbonaten (in welchen daß N-Succinimid durch N-Phthalimid, N-Glutarimid, N-Tetrahydrophthalimid bzw. N- Norbornen-2,3-Dicarboximid versetzt ist) ein Patent verliehen (US Patent 5 122 614, 16. Juni 1992, Zalipsky).
Succinimidyl Carbonate von PEG (SC-PEG) stellen eine weitere Verbesserung in Urethan-ausbildenden PEG Reagenten dar.
Das SC-PEG und seine bifunktionelle Analoge (BSC-PEG) mit verschiedenen Molekulargewichten wurden gemäß einer "Ein- Topf" Verfahrensweise, mit einer globalen Ausbeute von 85% bereitet.
Polymerisches Chloroformiat, das "in situ" durch Behandlung von PEG mit Phosgen erzeugt wurde, ließ man mit N-Hydroxysuccinimid (HOSu) reagieren. Zur Bewertung der Reaktivität des SC-PEG wurden Messungen der Geschwindigkeit der Hydrolyse bzw. der Aminolyse an den beiden aktivierten, aus PEG-5000 erhaltenen, Polymerisaten, ausgeführt.
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß das SC-PEG eine etwas geringere Reaktivität und eine erhöhte Selektivität aufweist. Reaktionen zur Modifizierung von Proteinen mittels SC-PEG kbnnen in kurzer Zeit (± 30 Minuten) in einem weiten pH-Bereich ausgeführt werden, mit der hochster Reaktivitat auf einem pH von 9,3 (US Patent 5 122 614; Loc. cit.).
Derivat 10 wurde auch in einer anderen "Ein-Topf" Verfahrensweise aus mPEG (5 kDa) und dem handelsüblichen Disucinimidyl Carbonat hergestellt (N. Nijs et al., 1993, Biotechnol. Appl. Biochem., 15:in der Fachpresse). Die Ausbeute betrug auch 85%, und die Reaktivität des SC-PEG wurde durch Verwendung mehreren Enzymen, wie Lysozym, Papaya Proteinase III, Katalase und Lactoperoxidase, bewertet.
Der Ergebnis dieser Versuche zeigte, daß nur zwei Mol des SC-mPEG pro Mol der Amino-Gruppe erforderlich waren, um höhe Modifizierungsgrade (70%) zu erreichen.
Die Aktivität des Enzyms wurde erhalten. In einigen Fällen (Papaya Proteinase III, Katalase), wurde die Modifizierung mit SC-mPEG mit einem Ansteig der spezifischen Aktivtät verbunden (250% im Falle des Papaya Proteinase III) (M. Nijs et al.; Loc. cit).
Das während der Modifizierung des Polypeptids befreite HOSu ist ein nicht-toxisches Material, das oft als trennende Gruppe in der Chemie der Biokonjugaten und der Peptiden verwendet wird.
Anders als das obengenannte 4-Nitrophenol und das 2,4,5- Trichlorophenol weist das HOSu keine Affinität zu Proteinen auf, und daher kann es leicht aus den Reaktionsmedien, entweder mittels Dialyse, Diafiltration oder Molekularsieb, entfernt werden.
DERIVAT 11 stellt ein anderes, mit N-Succinimid aktiviertes PEG dar, und wurde durch K. Iwasaki, et al patentiert (US Patent 4 670 417; Loc. cit.) und gemaß dem SCHEMA 05 hergestellt. Schema 05: Präparation des Derivats 11 Na in naphtalene HOSu dicyclohexylcarbodiimide Derivat
Derivat 11 wurde durch Veresterung mittels Carbodiimid von carboxymethylierten PEG mit HOSu hergestellt.
Die Carboxymethylierung des PEG stellt einen des unmittelbarsten Wege zum Einbau von Carbonsaüre-Endgruppen auf das PEG-Polymerisat dar.
Dies wird am Besten wie im Schema 05 gezeigt, durch nucleophile Versetzung des Bromids in Ethylbromoacetat mit einem PEG-Alkoxid ausgeführt, gefolgt von der Verseifung des Esters.
Einen alternativen weg zu einem wesentlich gleichartigen Derivat stellt die Oxidation der Hydroxy-Endgruppen von PEG dar (G. Johansson, 1986, H. Chromatogr., 368:309), doch ist dieser Prozess oft verbunden mit einer Beschädigung des Polyäther-Skelett Zahlreiche Enzyme wurden mit sehr guter Erhaltung der spezifischen Aktivität modifiziert (F.M. Veronese et al., 1989, J. Controlled Release, 10:145; T. Yashimoto et al., 1986, Biotechnol. Lett., 8:771).
In einer Bewertung auf Basis von Hydrolyse - (t0,5 = 1 Minute, pH 7,5 und 27ºC) und Aminolysegraden der aktivierten mPEG wurde bekanntgemacht (D.E. Nitechi et al., 1988, in: Peptide Chemistry (T. Shiba and S. Sakakibara, eds) p243, Protein Res. Foundation, Osaka), daß die Reaktivität des Derivats 11 das Zehnfache von derjenigen der obengenannten Derivate betrug.
Leider erfordert die Herstellung des Derivats 11 4 Schritte, wie im Schema 05 gezeigt.
Gemäß einer Variante des Schemas 05, wurde PEG- Carboxymethylazid (DERIVAT 12) "in situ" aus Carboxymethylhydrazid erzeugt, und dann ließ man es gemäß der in dem SCHEMA 06 gezeigten Reaktion mit Proteinen reagieren. Schema 06: präparation und Verwendung von PEG-Carboxymethylazid Protein-NH&sub2; Protein
Normalerweise erhält die langsam reagierende Acylazid Funktion durch die stärke Elektröphilizität des Carboxymethyl-Rests eine Vergrößerung seiner Reaktivität (US Patent 4 179 337, Loc. cit.; US Patent 4 101 380, Loc. cit.; US Patent 4 495 285; 1985 to K. Shimizu, T. Nakahara and T. Kinoshita; US Patent 4 640 835; 1987 to K. Shimizu, T. Nakahara, T. Kinoshita, J. Takatsuka and M. Igarashi).
Diese Variante, die zuin Derivat 12 führt, ist mit denselben Nachteilen behaftet wie die ursprüngliche Form, die zum Derivat 11 führt.
Die PEG wurden auch in Xanthat (Dithiccarbonat) Derivate umgewandelt, wie DERIVAT 13, welche sich als nutzbar zur Pfropfung PEG-Ketten auf Polypeptiden durch Thionourethan Verbindungen erwiesen (T.P. King and C. Weiner, 1980, Int J. Peptide Protein Res., 16:147; S. Zalipsky et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30:740). Struktur des Derivats 13
Die oxythiocarbonylisierte Protein-PEG Konjugate wiesen eine gute chemische Stabilität in verschiedenen wäßrigen Puffern auf. Leider mußten wegen einer mäßigen Reaktivität der Derivate 13 die Modifizierungsreaktionen mit Proteinen in einem erhöhten pH-Bereich und über lange Zeit (24 Stunden) durchgeführt werden. Nicht alle Folypeptide sind in der Lage, solchen extremen Bedingungen zu widerstehen.
Ester von organischen sulfonischen Säuren und PEG, besonders p-Toluensulfonate (Tosylate), waren als Ausgangmaterial nützlich zur Herstellung von verschiedenen funktionalisierten Polymerisaten.
Es wurde kürzlich gezeigt daß Tresylate (2,2,2- Trifluoroethansulfonate) von PEG (DERIVAT 14, mPEG- OSO&sub2;CH&sub2;CF&sub2;) genügend reaktiv zu Amino-Gruppen sind (etwa 100-fach mehr reaktiv als Tosylate) um als Polypeptide modifizierende Reagenten nützlich eingschätzt zu werden (C Delgado et al., 1990, Biotechnol. Appl. Biochem., 12:119) - Leider hydrolysierte das mPEG-Tresylat leicht in einer wäßrigen Lösung. Dieses hatte zur Folge, daß eine wesentliche Modifizierung des Rund-Serum-Albumins auf einem pH von 7,5 einen 16-fachen Überschuß an mPEG- Tresylat gegenüber den Amino-Gruppen erforderte.
Dieser Wert muß mit dem 2-fach, durch die Verwendung von SC-PEG erfordeten Überschuß, verglichen werden.
Doch verlaufen die Modifizierungen von Proteinen schnell mit PEG-Tresylat, da sie in einer Stunde vollendet sind.
Ferner werden die Polymerisat-Ketten auf die Polypeptide durch sehr starke sekundäre Amine-Verbindungen gepfropft infolge der Modifizierung des Proteins mittels des PEG- Tresylats. Infolgedessen bleibt die globale Ladung des Proteins unverändert von dem Modifizierungsprozess. Schema 07: Präparation und Verwendung von mPEG-Imidoresteren Protein-NH&sub2; DERIVAT
Imidoester von (PEG DERIVAT 15), die nützlich für die Modifizierung von Poteinen sind, wurden gemäß den Reaktionen im SCHEMA 07 hergestellt (Eur. Patent Anmeld. 0 236 987 (1987), H. Ueno und M. Fujino).
Wie im Schema 07 gezeigt, wurden diese aktivierte Polymerisate durch Säure-katalysierte Methanolyse von mPEG-cyanoalkyläthern hergestellt und mit Amino-Gruppen von Proteinen auf einem pH im Bereich von 7-9 mitreagiert.
Die Tatsache, daß die amidinierten Proteine dieselbe Ladung haben, wie diejenige der ursprünglichen Proteine, stellt einen Vorteil dieses Weges zur Modifizierung von Proteinen dar.
Der wesentliche Nachteil dieser Methode ist darin zu sehen ist, daß ein höherer Überschuß an Imidoestern vön PEG erforderlich wurde. Auch unter diesen Bedingungen wurden die Proteine in einem geringen Maß modifiziert.
Beispielhaft hatte die Modifizierung des rIL-2 mit einem 10-fachen Überschuß an mPEG-Imidoestern zu die Amino- Gruppen eine Modifizierung von 2,8 Lysyl-Resten aus den sämtlichen elf Lysinen zum Resultat (Eur. Patent Anmeld. 0 236 987, Loc. cit.).
Herkömmlich wurden irreversibele Modifizierungen von Polypeptiden ausgewählt.
Eine mangelhafte Festigkeit der PAG-Polypeptiden (wie die aus den Derivaten D4 und D5 erzeugten Konjugate) gegen eine hydrolytische Spaltung auf einem physiologischen pH wurde in der Regel als ein Nachteil betrachtet.
Es gibt drei Ausnahman, bei welchen die Reversibilität der Modifizierung von Peptiden und Proteinen mit den PAG gezielt ausgewählt wurdgn.
Tatsächlich hat Gaman die Synthese eines polymerischen Analogs des Dimethylmaelischen Anhydrids (DERIVAT 16), das für die Anbindung des PEG mit Amino-Gruppen von Polypeptiden durch eine langsam abtrennbare Amid- Verbindung angepaßt ist, patentiert. Derivat 16
Die Gültigkeit dieses Weges zum Hervorrufen einer andauernden Freigabe von aktiven Proteinen wurde auf von Plasminogen-Aktivator Proteinen bewiesen
Die durch diese Verfahren erhaltenen PEG-Plasminogen-Aktivator-Konjugate lieferten aktive, völlig deacylierte Proteine nach 44 Stunden Inkubation auf pH 7 und 37ºC (US Patent 4 935 465 (1990) to A.J. Garman).
Andererseits offenbarten Glass und Mitarbeiter die Herstellung von 4-Phenoxy-3,5-dinitrobenzoyl-PEG (J.D Glass et al., 1979, Biopolymers, 18:383). Dieses PEG- Derivat reagierte schnell und selektiv auf neutralem pH mit Sulphydryl-Gruppen von Peptiden zu Polymerisat-Peptid- Addukten, dessen Komponenten durch eine Thiol-empfindliche Dinitrophenylen-Verbindung Verbunden waren. Daher war es möglich, ein Peptid mit dein Polymerisat anzubinden, und nach bestimmten chemische und/oder enzymatische Veränderungen des Konjugates, das modifizierte Peptid aus dem PEG-Träger abzutrennen
PEG-Derivate, die in der Lage sind, reversibel, spezifisch und quantitativ mit Thiol-Funktionen von Peptiden und Proteinen zu reagieren, wurden vor kurzem in einem Europäischen Patentanmeldung, Y. Looze et al., 1993, beschrieben, die nicht vor dem Priritätsdatum des vorliegendes Falles veröffentlicht worden ist. Dabei erwies es sich, daß die Derivate 17, 18, 19 und 20 unmittelbar und stoichiometrisch unter Ausbildung von durch Disulfidbrücken verbundenen PEG-Polypeptid- Konjugaten reagieren. PEG-Derivate zur Anbindung mit Thiol-Funktionen von Polypentiden
Eine Reihe von PAG-Derivaten wurde bereits hergestellt, und nun stehen diese zur Verfügung zur Pfropfung von PAG- Fasern auf Polypeptiden, um die Freigabe entweder als Arzneimitteln oder als Träger zu angezielten Arzneimitteln zu erleichtern.
Eine reversibele Modifizierung von entweder natürlich vorhandenen oder eingebauteten Thiol-Funktionen von Polypeptiden kann stoichiometrisch ausgeführt werden (somit unter Verwendung von einem Mol von PEG-Derivat pro Mol der SH-Gruppe).
Leider ist eine nicht-reversibel Modifizierung von den chemischen Funktionen, die auf Polypeptiden vorhanden sind, noch mit inhärenten Nachteilen verbunden, von welchen einige oben kurz angedeutet wurden.
Somit ist deutlich, dab es noch viel braucht um es zu verwirklichen, daß neue PAG-Derivate mit heute nicht verfügbaren Eigenschaften gefunden wurden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Bei der vorliegenden Erfindung wurden neue funktionalisiert PAG-Derivate für dessen Aktivitätsbereich ausgewählt, die heute nicht zur Verfügung stehen.
Dieser Aktivitätsbereich steht zwischen der Reaktivität von den PAG Chloroformiaten und der Reaktivität von den oben ausgeführten aktivierten Carbonaten und Estern.
Die sehr intensive Reaktivität von den Chloroformiaten schießt aus; daß Selektivität und Spezifizität erreicht werden könnten.
Somit sind die Chloroformiate leicht reaktionsfähig mit Aminen, Alkoholen, Phenolen, Carbonsäuren, Amiden, usw. Andererseits weisen die meiste oben genannten PAG-Derivate eine Selktivität zu Aminen auf.
Das heißt, daß die meiste PEG-Derivate mit Aminen und nicht mit anderen chemischen Funktionen, wie den Alkoholen reagieren.
Leider haben diese PAG-Derivate eine schwache Reaktivität zum Vergleich mit der von den Chloroformiaten.
Unter Verwendung von polyfunktionalen Verbindungen, wie z. B. Peptiden, die Modifizierung ihren Amino-Funktionen mittels eines nicht-selektiven Acylierenden Mittel setzt voraus, daß zuerst die andere Funktionen geschützt werden.
Nachdem die Acylierungsschritte ausgeführt wurden, kann das Entschützen ausgeführt werden.
Somit ist die Verwendung eines nicht-selektiven Acylierungsmittels zusätzliche Verfahrensschrittes erforderlich, welches das gesamte Prozess kompliziert.
Andererseits könnte die Verwendung eines weniger reaktiven Acylierungsmittels die Ausbeute der Reaktion wesentlich behindern, und weiter erfordert solche Verwendung, daß zusätzliche Reinigungsschritte im gesamten Verfahren einschlossen werden.
Somit gibt es ein dringendes Bedürfnis für neue PAG- Derivate, die eine höhere Reaktivität und auch eine Selektivität zu Amin-Funktionen aufweisen.
Mit der vorliegenden Erfindung hat man nun gefunden, daß bestimmte PAG-Carbamate in der Lage sind, dieses Ziel zu erreichen. Die Carbamate und durch die generelle Formel repräsentiert:
in welcher R&sub1; H oder CH&sub3;, x eine ganze Zahl zwischen 10 und 1000, und X&supmin; ein Anion ist.
Als einem typischen Beispiel von diesen PAG-Carbamaten, kann man das mPEG-N-(4-Dimethylamino)-pyridin Carbamat feststellen, dessen Struktur:
ist.
Die Elektronentrennungswirkungen der Gruppe von Atomen, die hier in der Para-Position liegen, auf die Carbamat- Funktion, ist für die höhere Reaktivität von diesem mPEG- Derivat verantwortlich, das stoichiometrisch und unmittelbar mit Aminen reagiert, unter Erzeugung von quantitativen Acylierungsausbeuten.
Andererseits wurde ihre Selektivität für Aminen evaluiert und ziemlich zufriedenstellend gefunden.
Mit der vorliegenden Erfindung wurden daher neue Wege zur PAG-Derivatisierung beschritten, um neue PAG-Derivate zu finden, die in der Lage sind, die chemische Modifizierung der Amino-Funktion von aminhaltigen Verbindungen zu erlauben, unter Bedingungen und mit Vorteilen, die heute nicht zur Verfügung stehen.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese neue PAG- Derivate auf Basis irgendwelcher PAG gebaut werden, wie:
Polyethylen Glykol der generellen Formel:
OH-(CH&sub2;-CH&sub2;-O)x-CH&sub2;-CH&sub2;-OH
(in welcher x eine, wie oben ausgeführt, ganze Zahl ist), und
Monomethoxy Polyethylen Glykole der generellen Formel:
CH&sub3;O-(CH&sub2;-CH&sub2;-O)x-CH&sub2;-CH&sub2;-OH
(in welcher x eine, wie oben ausgeführt, ganze Zahl ist).
Die Pluronics stellen typischc Beispiele solcher Polymerisate dar.
Die neuen, in vorliegender Erfindung beschriebenen PAG- Derivate weisen eine höhere Diversität in ihren Strukturen auf.
Vorzug ist aber solchen gegeben, die von polymerischen Natur sind.
Andererseits besitzen die hier beschriebenen, funktionalisierten PAS gemeinsam eine aktivierte Carbamat- Funktion.
Ein typisches Beispiel solcher aktivierten Carbamat- Funktion wird im Beispiel 1 offenbart.
Beispiel 1, das ein Verfahren zum Erhalten einer aktivierten Carbamat-Funktion beschreibt, verdient eine kurze Auslegung.
In diesem Beispiel 1 wurde mPEG-N-(4-Dimethylamino) Pyridin Carbamat (D) quantitativ erreicht nach Reaktion von stoichiometrischen Mengen von PEG-Chloroformiat und 4-Dimethylaminopyridin. mPEG-aktivierte Carbamate
Im oben gezeigten, erwarteten Mechanismus stellt der nucleophile Angriff vom 4-Dimethylaminopyridin auf das mPEG-chloroformiat die erste Schritt dar.
Dieses erscheint rationell, da Pyridin ein bekannter Katalysator der Acylierungen durch Chloroformiaten ist, unter Ausbildung von nicht-stabilen Komplexen mit diesen.
Im hier dargestellten Beispiel erwartet man, daß ein solcher Komplex stabilisiert werden könnte durch die oben gezeigten Resonanz-Interaktionen.
Andererseits erscheint das im Beispiel 1 ausgebildete Carbamat besonders reaktiv im Vergleich mit z. D. dem oben ausgelegten mPEG-Imidazol-1-yl-carbamat (siehe "Background der Erfindung").
Man erwartet, daß diese ungewöhnliche Reaktivität von elektronentrennenden Wirkungen hervorgerufen wird, die nicht im mPEG-Imidazol-1-yl-carbamat beobachtet werden.
Das aktivierte Carbamat gemäß Beispiel 1 erscheint viel reaktiver, als die im Ausschnitt "Background der Erfindung" ausgeführten aktivierten Carbonate oder aktivierten Ester.
Im Vergleich mit mPEG-Chloroformiaten weist das aktivierte Carbamat D eine geringere Reaktivität auf.
Während die mPEG-Chloroformiate leicht mit Aminen, Alkoholen, Phenolen, Carbonsaüren, uzw... reagieren, reagiert das hier gefundene aktivierte Carbamat nur mit Aminen.
Somit erlaubt dieser höhe Selektivitätsgrad eine Möglichkeit zur Modifizierung von Amino-Funktionen in polyheterofunktionellen Verbindungen, ohne daß die andere chemische Funktion geschützt werden müssen.
Einen wichtigen Vorteil stellt die Eigenschaft, die in den Beispielen 2, 3 und 4 gezeigt wird, dar.
Die Möglichkeit zur selektiven Modifizierung von Amino- Funktionen in Gegenwart von anderen chemischen Funktionen ist von besonderer Bedeutung in verschiedenen industriellen Bereichen.
Von diesen industriellen Bereichen verwenden die biotechnologischen und pharmazeutischen Industrien polyheterofunktionelle Verbindungen wie Nucleotiden, Nucleosiden, Carbohydrate, Peptide,... Für solche Industrien könnte daher der durch die hier gefundenen aktivierten Carbamate gezeigten höheren Selektivitätsgrad eine wichtige Bedeutung darstellen.
Neben der Selektivität weisen die hier gefundenen aktivierten Carbamate eine höhere Reaktivität auf.
Höhe Ausbeute an Acylierung wird unter Verwendung von stoichiometrischen Mengen von Reagenten erreicht. In den meistes Fällen entwickelt die Acylierung unmittelbar.

BEISPIELE

Beispiel 1: SYNTHESE UND VORCHARAKTERISIERUNG VON POLYETHYLEN GLYKOL-N'-(4-DIMETHYLANINO)-PYRIDIN CARBAMAT (Derivat "D" oder mPEG-N(DMA)Py)

Eine Lösung wird aus mPEG (25 g; 5 mmol) und Toluen bereitgestellt Vorhandene Wasserspuren im mPEG (0,2%, gemäß der Karl-Fischer-Titration) werden mittels azeotropischen Destillation von 150 ml Toluen entfernt. Die restliche Menge wird dann roto-verdämpft bis zur Trockenheit und der Rest wird in Acetonitril (100 ml) auf 0ºC gelöst. Phosgen (20 mmol; 10 ml einer 2M-Lösung in Toluen) wird der kalten mPEG Lösung zugesetzt.
Man läßt die Temperatur der Reaktionsmischung bis zur Raumtemperatur steigen, und die Reaktion entwickelt sich während 20 Stunden. Überschüssiges Phosgen wird dann unter Vakuum beseitigt, danach wird die Lösung rotoverdämpft zur Beseitigung des HCl.
Eine Portion wurde zur Analyse entnominen Das Infrarotspektrum (Figur 1.1) weist ein Absorptionsband auf 1776 cm&supmin;¹ auf, das kennzeichnend ist für den C=O- Schwingungen der Chloroformiaten (M. Matzer, R.P Kurkji and R.J. Cotter, 1964, Chem. Rev., 64:645).
Von der Abwesenheit eines Abscrptionsbandes im Bereich zwischen 1715 und 1740 cm&supmin;¹ schließt man auf die Abwesenheit einer Ausbildung von di(mPEG)-Carbonat.
Die Erreichungsausbeute von mPEG-Chloroformiaten scheint quantitativ zu sein, auf Basis von den Ergebnissen von Cl&supmin;-Titration unter Verwendung von Silber-Nitrat als Titrationsmittel (H.G. Ashbrun, A.R. Collet and C.L. Lazzell, 1938, J. Am. Chem. Soc., 60.2933).
Das mPEG-Chloroformiat wird gelöst im kalten Acetonitril (100 ml; 0ºC). Dieser Lösung wird 4-Dimethylaminopyridin zugefügt, mit der Folge der unmittelbaren Umwandlung von mPEG-Chloroformiat in mPEG-Nl-(4-Dimethylamino)pyridin Carbamat. Die Ausbeute, die 100% beträgt, wird wie folgt bestimmt:
Eine Portion der Lösung von D im Acetonitril wurde abgetrennt und tropfenweise zu getrockneten Diethyläther zugesetzt. Das Solid D wurde mittels Futration gesammelt, mit Diethyläther gewaschen und gegen P&sub2;O&sub5; unter Vakuum getrocknet.
Figur 1: Infrarotspektrum von mPEG-Chloroformiat Das UV-Spektrum einer frisch bereitgestellten Lösung einer bekannten Konzentration von D im Acetonitril wurde aufgenommen. Das in der Figur 2 gezeigte UV-Spektrum von D weist ein Absorptionsband auf 305 nm (8,11 = 24100 M&supmin;¹. cm&supmin;¹) auf, wo das mPEG lichtdurchlässig ist. Unter Hydrolyse wandelt sich dieses Spektrum in einem anderen Spektrum um (auch in der Figur 2 gezeigt), das gleich mit solchem des urkundlichen 4-Dimethylaminopyridin bewiesen wurde (λmax = 276nm; &epsi;276 = 13900 M&supmin;¹.cm&supmin;¹).
Unter Verwendung des Wertes &epsi;&sub2;&sub7;&sub6; = 13900 M&supmin;¹. cm&supmin;¹ für das 4-Dimethylaminopyridin berechnete man, daß die Hydrolyse Von D 1.02 ± 0,03 Mol von 4-Dimethylaminopyridin pro Mol D1 ergab.
Wie man es erwartete, ist D ziemlich reaktiv zum Wasser. Wie in der Figur 3 gezeigt, wickelt die Hydrolyse langsämer aus mit sauretn pH als in neutralen oder leicht alkalischen Medien. Diese Beobachtung könnet anzeigen, daß der nucleophilische Angriff durch OH die die Geschwindigkeit beschränkende Schritt des Hydrolyse- Prozess darstellt.
Jedenfalls wird D besser in einer Lösung erhalten in z. B. Acetonitril, als in der Form eines Pulvers.
Figur 2: UV-Absorption Spektra von D (im Acetonitril) bzw. von seiner UV-absorbienden Hydrolyse-Produkt, als 4- Dimethylaminopyridin bestimmt.
Figur 3: pH-Zusammenhang für die Kinetik der Hydrolyse von D. Ein Lösung von D im Acetonitril wurde in 50 mM Puffern auf angepaßtem pH verdünnt A&sub3;&sub1;&sub5; wurde durchgehend auf 25ºC in Funktion von der Zeit autgenommen, und t0,5 wurde bestimmt. Die Punkte ( ) stellen die Versuchswerte dar.

Beispiel 2: REAKTIVITÄT DES mPEG-N-(DMA)Py IN SOLVENTHALTIGEM WASSER: AMINOLYSE GEGEN HYDROLYSE

Da das mPEG-N-(DMA)Py leicht zu hydrolysieren scheint, ist es nötig, die Aminolyse unter strikt anhydrischen Bedingungen zu prüfen.
Diese Information wurde geliefert durch Vergleich zwischen den entsprechenden Geschwindigkeiten der Hydrolyse bzw. Aminolyse.
Praktisch bestimmten wir somit die Ausbeute des gemäß dem SCHEMA 2.1, des in Gegenwart von Wasser erhaltenen DERIVATS 20. Schema 2.1: Schematischer Weg, unter Verwendung von D, zur Erhaltung von Derivat 20. Derivat
Eine Lösung von Cysteamin Hydrochlorid (2,2 mmol) in EtOH (10 ml) wurde tropfehweise einer 20 mMol von 2,2'- Dipyridyl Sulfid in EtOH (30 ml) erithaltenden Lösung hinzugefügt. Nach Beendigung des Zusatzes wurden 10 ml einer wäßrigen Lösung von K&sub2;CO&sub3; (1,1 mmol) hinzugefügt, und die so erhaltene Mischung Wurde der Reaktion mit 2 mMol von im Acetonitril gelösten (40 ml)mPEG-N-(DMA)Py ausgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann durch Rotoverdämpfung konzentriert und endlich tropfenweise in Diethyläther (300 ml) hinzugefügt.
Das Derivat 20 wurde durch Filtration gesammelt, mit Diethyläther gewaschen und unter Vakuum gegen P&sub2;O&sub5; getrocknet. Die Ausbeute betrug 10 g (96% von der theoretischen Ausbeute).
Die Figur 4: zeigt das UV-Absorptionspektrum einer wäßrigen Lösung von Derivat 20, das Maxima auf 231 und 281 nm aufweist (&epsi;&sub2;&sub8;&sub1; = 4900 M&supmin;¹. cm&supmin;¹).
Als überschüssiges Cystein hinzugefügt wurde, wurde 2- Thiopyridon aus Derivat 20 befreit und ein Absorptionsband erschien auf 343 nm. Ein Wert für &epsi;&sub3;&sub4;&sub3; = 7725 M&supmin;¹. cm&supmin;¹ wurde bestimmt, in sehr guter Übereinstimmung mit dem Wert von der Literatur (&epsi; = 7700 M&supmin;¹. cm&supmin;¹).
Die Figur 4: UV-Absorptionspektrum von Derivat 20 (0,06 mM, 25ºC, pH 6, H&sub2;O) vor (1) und nach (2) dem Zusatz von 2-Cystein (5 mM).
Ferner bestätigt die spektrophotometrische Titration des Derivats 20 mit frisch bereitgestellten und (mittels 2,2'- Dipyrridyl Disulfid) normalisierten Lösungen von Cystein die Stoichiometrischkeit der Reaktion, wie in der Figur 5 gezeigt.
Daher kann man ausschließen, daß das Derivat 20 auf Basis des mPEG-N-(DMA)Py quantitativ hergestellt werden kann) auch in Gegenwart von zur Amino-Verbindung überschüssigem Wasser (wie in dem hier ausgeführten Experiment, in welchem der Überschuß 250 Mol H&sub2;O/mol NH&sub2; betrug).
Mit anderen Worten haben wir ausgeschlossen) daß die Derivatisierung einer aminohaltigen Verbindung mittels mPEG-N-(DMA)Py genau anhydrische Bedingungen nicht erfordert.
Die Figur 5: Spektrophotometrische Titration einer wäßrigen 0,1 mM Lösung des Derivats 20 mittels einer normalisierten 10 mM L-Cystein Lösung. Die Freigabe von dem 2-Thiopyridon aus dem Derivat 20 wurde auf 343 nm und 25ºC bemessen. Die Punkte ( ) stellen die Versuchswerte dar.
In einem Vergleich mit Verfahren) die solche Derivate als das mPEG-Chloroformiat- verwenden, stellt dies einen Vorteil dar. Der Vorteil könnet entscheidend sein bei der Derivatisierung einer hygroskopischen, aminohaltigen Verbindung.
Stellt man die enormen Schwierigkeiten (die sich aus der Hydrolyse des mPEG-N-(DMA)Py ergeben) in Rechnung bei dem Versuch einer Fraktionierung des mPEG aus dem mPEG- Konjugat, wird man die volle Bedeutung dieses Vorteiles bewerten.
Ferner stellt dieses Beispiel eine Garantie dar, daß ein Molekül, das beide Amino- und Hydroxyl-Funktionen beinhalten wurde, spezifisch und selektiv N-acyliert werden kann.

Beispiel 3: ENTSPRECHENDE REAKTIVITÄTEN VON D ZU PRIMÄREN UND SEKUNDÄREN AMINEN

Damit die relative Reaktivitätsgrade von D zu primären und sekundären Aminen restgestellt wurden, wurde D (0,75 mMol in 15 ml Acetonitril) mit 4-Amino-2,2,6,6- Teramethylpiperidin (0,825 mMol) mitreagiert.
Der so im Laufe der unmittelbaren Reaktion ausgebildete Niederschlag wurde mittels Filtration ausgetrennt.
Das Filtrat wurde mittels Rotoverdämpfung konzentriert, und tropfenweise in Diethyläther hinzugefügt und unter Vakuum gegen P&sub2;O&sub5; getrocknet.
Eine wäßrige Lösung von D 3.1 (1,2 mM) wurde bereitgestellt und erschien als lichtdurchlässig im UV- Bereich zwischen 200 und 350 nm; diese Beobachtung zeigt an, daß das 4-Dimethylaminopyridin quantitativ substituiert mit 4'-Amino-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin.
Um eine Prüfung durchzuführen, ob es die primäre bzw. sekundäre in dem 4-Amino-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin enthaltene Amin-Funktion für das 4-Dimethylaminopyridin sich substituierte, wurde Derivat D 3.1 mit Fluorescamin reagiert; bekanntlich ruft diese Reaktion die Ausbildung von fluoreszenten Adduktsverbindungen mit primären Aminen hervor, doch nicht mit sekundären Aminen.
Die Ergebnisse einer solchen Prüfung sind in der Figur 6 angedeutet.
Von diesen Ergebnissen berechnete man, daß mindestens 94% von D 3.1 mit der Struktur 3.1.A, und weniger als 6% mit der Struktur 3.1.B übereinstimmten. Strukturen des D 3.1
Figur 6: Fluorescamin-Bestimmung von 4-Amino-2,2,6,6- Tetramethylpiperidin ( ) bzw. des Derivats D 3.1 (*). Die Punkte ( ) bzw. (*) stellen Versuchswerte dar.

Beispiel 4: REAKTIVITÄTEN VON D bzw. mPEG-CHLOROFORMIAT ZU PHENOLEN

Einer kalten (0ºC), gemäß dem Beispiel 1 bereitgestellten Lösung von mPEG-Chloroformiat (5 mMol) im Acetonitril, wurde p-Dimethylsulfoniophenol hinzugefügt und auflösen lassen (10 Minuten).
4-Dimethylaminopyridin (613 mg; 5 mMol) wurde dann hinzugefügt und die Reaktion(en) wurden fur 3 Stunden bei Raumtemperatur entwickelt.
Der im Laufe der Reaktion(en) ausgebildete Niederschlag wurde mittels Filtration gesammelt, mit Acetonitril gewaschen und unter Vakuum gegen P&sub2;O&sub5; getrocknet, um die erste Fraktion (F1) aufzumachen.
Andererseits wurde das klare Filtrat mittels Rotoverdämpfung konzentriert, und tropfenweise in Diethyläther hinzugefügt und unter Vakuum gegen P&sub2;O&sub5; getrocknet, um die zweite Fraktion (F1) aufzumachen.
F1 beinhaltete 925 mg einer Substanz, die dem p- Dimethylsulfoniophenol (Methyl Sulfat) Salz gleichgesetzt wurde, auf Basis von:
- seinen UV-Absorptionspektren in der protonierten Form wie auch in der nicht-protonierten Form;
- dem Wert seines pKa;
- dem Wert seines Molekulargewichtes, das von den Ergebnissen der Titration (mit NaOH), von der mit einer bekannten Mass-Konzentration F1-Lösung, berechnet wurde.
Andererseits beinhaltete F2 (24,70 g von dem Material) eine Mischung (jedes mit ±50%) von D und hydrolysierten D (mPEG + 4-Dimethylaminopyridin).

Synthese von mPEG- (p-Dmethylsulfonio)phenyl Carbonat

Diese Verbindung wurde (Ausbeute 65%) aus mPEG- Chloroformiat und p-Dimethylsulfoniophenol, in Gegenwart eines Äquivalentes von Triethyamin erreicht.
Von allen diesen Ergebnisses kann man ausschließen, daß:
- das 4-Dimethylaminopyridin viel schneller mit mPEG Chloroformiat als ein Phenol, typischerweise ein p- Dimethylsulfoniophenol, reagierte;
- unter den hier Verwendeten Versuchsbedingungen, die (eventuell vorhandene) Reaktion zwichen D und einer phenolischen Funktion ziemlich langsam entwickelte.

Claims

1. Verbindung mit der Struktur:

in der R1 H- oder CH&sub3;- ist, x eine ganze Zahl zwischen 10 und 1000, und X&supmin; ein Anion ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, in der X&supmin; Cl&supmin; bedeutet