JP7038663B2 - 環中に少なくとも２個の（－ｃｈ２－ｃｈ２－０－）単位を含むリンカーを含むコンジュゲート及びコンジュゲート試薬 - Google Patents

環中に少なくとも２個の（－ｃｈ２－ｃｈ２－０－）単位を含むリンカーを含むコンジュゲート及びコンジュゲート試薬 Download PDF

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Description

この発明は、新規なコンジュゲート及び新規なコンジュゲート試薬に関する。
多くの研究調査が近年、広範囲の用途のためのペプチド及びタンパク質への、多種多様なペイロード、例えば治療剤、診断剤及び標識化剤のコンジュゲーションに専念してきた。タンパク質又はペプチドそれ自体は、治療的特性を有することがあり、及び/又はそれは、結合性タンパク質であり得る。
ペプチド及びタンパク質は、治療剤としての潜在的使用を有し、コンジュゲーションは、それらの特性を改善する1つのやり方である。例えば、水溶性合成ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、治療活性ペプチド又はタンパク質をコンジュゲートするために広く使用される。これらの治療用コンジュゲートは、好ましくは循環時間を延長すること及びクリアランス速度を減少すること、全身的毒性を減少すること、並びにいくつかの場合において、臨床的効力の増加を呈することによって、薬物動態を変えることが示された。ポリエチレングリコール、PEGを、タンパク質に共有結合でコンジュゲートする方法は、「PEG化」として共通して知られている。PEG鎖は、ペイロード、例えば治療剤、診断剤又は標識化剤を保有することができる。
結合性タンパク質、特に抗体又は抗体断片は、頻繁にコンジュゲートされる。標的細胞及び分子の表面上の特異的マーカーに対する結合性タンパク質の特異性は、それら自体で治療剤若しくは診断剤として又は治療剤、診断剤若しくは標識化剤を含み得るペイロードのための担体としてのいずれかで、それらの広範な使用に至っている。標識及びレポーター基、例えばフルオロフォア、放射性同位体及び酵素にコンジュゲートされているこうしたタンパク質は、標識化及び画像化の用途における使用を見出し、一方、細胞毒性剤及び化学療法薬等の薬物へのコンジュゲーションで抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を生成することは、特定の組織又は構造、例えば特別な細胞型又は成長因子へのこうした薬剤の標的化送達を可能にして、正常の健常組織に対する影響を最小化し、化学療法処置に関連する副作用を著しく低減する。こうしたコンジュゲートは、いくつかの疾患部域において、特にがんにおいて広範な潜在的治療用途を有する。結合性タンパク質を含有するコンジュゲートは、頻繁にPEGを含有する。
タンパク質及びペプチドをコンジュゲートする多くの方法が文献に報告されてきた。おそらく、最も共通して使用される方法は、マレイミド又はスクシンイミドに基づくコンジュゲート試薬の使用を伴う。こうした試薬は、多くの公報、例えばWO 2004/060965及びWO 2013/090590に記載されている。より均質な生成物に至る代替の手法が、Liberatoreら、Bioconj. Chem 1990、1、36～50頁、及びdel Rosarioら、Bioconj. Chem. 1990、1、51～59頁によって記載されており、これらは、抗体を含めてタンパク質におけるジスルフィド結合間をクロスリンクするために使用することができる試薬の使用を記載している。WO 2005/007197は、タンパク質中のジスルフィド結合から誘導される両方の硫黄原子とコンジュゲートすることで新規なチオエーテルコンジュゲートを得る能力を有する新規なコンジュゲート試薬を使用する、タンパク質へのポリマーのコンジュゲーションための方法を記載しており、一方、WO 2009/047500は、同じコンジュゲート試薬の使用で、タンパク質に結合されているポリヒスチジンタグに結合させることを記載している。WO 2010/100430は、タンパク質中のジスルフィド結合間に単一の炭素架橋を形成できる試薬を記載している。タンパク質のコンジュゲーションに関する他の文書としては、WO 2014/064423、WO 2013/190292、WO 2013/190272及びEP 2260873が挙げられる。
WO 2014/064424は、薬物がメイタンシンであるとともに抗体がジスルフィド結合間をクロスリンクすることによって結合されている特定のADCを記載している。WO 2014/064423は、薬物がオーリスタチンであるとともに抗体がジスルフィド結合間をクロスリンクすることによって結合されている特定のADCを記載している。これらの文書の実施例に例示されているリンカーは、リンカーの骨格の一部としてPEG部分を含有し、ここで、直鎖状PEG鎖の一方の端部はリンカーのさらなる部分を介して薬物に結合されており、一方、PEG鎖の他方の端部は、リンカーのさらなる部分を介して抗体に結合されている。これは、ADCについて共通の構造パターンである。WO 2015/057699及びUS 2016/0000933は、直鎖状PEG鎖がリンカーの骨格に結合されている代替構造を記載している。
WO 2009/152440は、標的化用リガンド;治療剤及び/又は画像化剤;並びにリガンドを治療剤及び/又は画像化剤に接続するリンカーを含む小分子コンジュゲート化合物を記載している。可能なリンカーの非常に長いリストが含まれており(段落0060)、これはクラウンエーテルを含む(金属でキレート化するため)。WO 2007/055700は、2つのエチルイミノ二酢酸側鎖を有するジアザクラウンエーテルから誘導されるランタニドキレートに関係する。ここでも、クラウンエーテルは、それのキレート化能力のために存在する。
近年にわたって、コンジュゲートにおいてペイロードをタンパク質又はペプチドに連結するリンカーの重要性が明らかになってきている。しばしば、行うべき重要な決定は、開裂可能なリンカー、即ちコンジュゲートの投与で分解して遊離ペイロードを放出するリンカー、又は開裂不可能なリンカーを有することが所望されるかどうかである。別の重要な決定は、リンカーにPEGを含む又は含まないかである。これらの考慮に従って、原則として、任意のリンカーが使用され得る。しかしながら実際に、リンカーの構造の変化は、コンジュゲート試薬又は結果として得られたコンジュゲートのいずれかの特性における差異に至ることがある。
頻繁に見出される1つの問題は、コンジュゲートが所望されるよりも貯蔵安定でないことがあるということである。これは、開裂可能なリンカーが使用される場合に特に当てはまり、この場合、コンジュゲートが投与前に長い保存期間を有するべきであるが次いで適用で速やかに開裂すべきであることが所望されるが、それは、いずれのリンカーにも当てはまり得る。コンジュゲートの貯蔵安定性を増加させる必要がある。加えて、インビボにおける安定性の改善が望ましいが、これは、生物学的活性の増加に至り得るからである。生物学的活性を増加させる必要もある。最終的に、高均質な生成物を提供するため、及びコンジュゲーション方法を行う間に起きる凝集を最小化するため、コンジュゲートを作製する時のコンジュゲーション効率を改善する必要がある。本発明者らは、ここで、特別なクラスのコンジュゲートの場合、特別な構造のPEG含有リンカーの使用が、有利な特性を与えることを見出した。詳細には、高い安定性及び/又は効力を有するコンジュゲートが得られ得る。
WO 2004/060965 WO 2013/090590 WO 2005/007197 WO 2009/047500 WO 2010/100430 WO 2014/064423 WO 2013/190292 WO 2013/190272 EP 2260873 WO 2014/064424 WO 2015/057699 US 2016/0000933 WO 2009/152440 WO 2007/055700 US 4,838,274 US 2014/0072900 US 4,179,337 WO201173391 GB 1418186 WO 2016/059377 WO 2009/047500 US7090843
Liberatoreら、Bioconj. Chem 1990、1、36～50頁 del Rosarioら、Bioconj. Chem. 1990、1、51～59頁 Dreborgら Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315～365頁 WHO Drug Information、25巻、1号、2011; International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances (INN)、Recommended International Nonproprietary Names、List 65 Smithら、J. Am. Chem. Soc,. 2010、132、1960～1965頁 Schumacherら、Bioconj. Chem.、2011、22、132～136頁 Belchevaら、J. Biomater. Sci Polymer Edn. 9(3)、207～226頁 Nature Protocols、2006、1(54)、2241～2252頁 Lyonら.、(2015) Nature Biotechnology、33(7) 733～736頁 Lyonら.、(2012)、Methods in Enzymology、502巻、123～137頁 (Promega Corp.社Technical Bulletin TB288; Lewis Phillips G.D、Cancer Res 2008; 68:9280～9290頁)
本発明は、リンカーを介して治療剤、診断剤又は標識化剤にコンジュゲートされているタンパク質又はペプチドを含むコンジュゲートであって、リンカーが環内に少なくとも2個の～(CH2-CH2-O-)～単位を含むことを特徴とするコンジュゲートを提供し、前記環は、環内の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に結合されているか、又は前記環は、環内の2個以上のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合されている。
本発明は、タンパク質又はペプチドと反応できる官能基を含むコンジュゲート試薬も提供し、この試薬は、治療剤、診断剤又は標識化剤、及び環内に少なくとも2個の～(CH2-CH2-O-)～単位を含むリンカーも含み、前記環は、環内の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に結合されているか、又は前記環は、環内の2個以上のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合されている。
本発明は、タンパク質又はペプチドを本発明によるコンジュゲート試薬と反応させることを含む、本発明によるコンジュゲートの調製のための方法も提供し、前記環は、環内の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に結合されているか、又は前記環は、環内の2個以上のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合されている。
本発明の試薬は、式:
Figure 0007038663000001
によってスキーム的に表すことができ、式中、Dは、治療剤、診断剤又は標識化剤を表し、Fは、タンパク質又はペプチドへ結合できる官能グルーピングを表し、
Figure 0007038663000002
は、少なくとも2個のエチレングリコール、～(CH2-CH2-O-)～単位を含む環を表す。官能グルーピングFは、より詳細に下記で説明されている通り、タンパク質又はペプチドと反応できる。
本発明のコンジュゲートは、式:
Figure 0007038663000003
によってスキーム的に表すことができ、式中、Dは、治療剤、診断剤又は標識化剤を表し、F'は、リンカーの一部に結合するタンパク質又はペプチドを介してコンジュゲートの残部に結合されているタンパク質又はペプチドを表し、
Figure 0007038663000004
は、少なくとも2個のエチレングリコール、～(CH2-CH2-O-)～単位を含む環を表す。
ポリエチレングリコール環
この明細書の全体にわたって、「ポリエチレングリコール環」は、少なくとも2個のエチレングリコール、～(CH2-CH2-O-)～単位を含む環を意味すると理解されるべきである。該環は、2個以上の別々の～(CH2-CH2-O-)～単位を含むことができるか、又はそれは、式～(CH2-CH2-O-)x～の1個又は複数の単位を含むことができ、ここでxは、少なくとも2の数である。該環は、環構造を完成させるために1つ又は複数の追加原子を含有することができる。追加原子は、例えば、窒素原子、炭素原子、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子及び/又はリン原子であってよい。
該環は、リンカーの骨格の一部を形成することよりもむしろリンカーの残部に懸垂しており、即ち、それはリンカーの残部に結合されているが、溶液中の場合、リンカーの残部に相対して柔軟に動けることが本発明の特色である。WO 2007/055700に記載されている通り環がリンカーの骨格の一部を形成する状況と対照的に、これは、環がリンカーの骨格内に強固に保持される場合よりも、コンジュゲートが、溶液中の場合、柔軟な立体配座を取り入れるのを可能にして、改善された特性を与えると考えられる。WO 2007/055700及びWO 2009/152440の両方は、金属イオンをキレート化するためにリンカーに環を含み、これは、本発明のそれと全く異なる目的である。
この目的のため、該環は、環内の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合され得るか、又はそれは、2つ以上の点で結合され得る。代替として、該環は、環内の2個以上のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合され得る。テザリング原子は、例えば、窒素原子、炭素原子、リン原子又はケイ素原子、殊に窒素原子及び/又は炭素原子であってよく、リンカーの残部に結合点で存在する原子は、例えば、窒素原子又は炭素原子であってよい。
以下は、本発明のコンジュゲート又は試薬におけるリンカーの残部への環の結合の可能な形態のスキーム図であり、Tは、環中のテザリング原子を表し、PEGは、少なくとも2個の～(CH2-CH2-O-)～単位を表す:
Figure 0007038663000005
適当な環の具体例としては、以下が挙げられ、式中、記号～は、リンカー
への環の組み込み点を示す:
Figure 0007038663000006
好ましくは、該環は、リンカーの残部に単一の点で結合されており、最も好ましくは、該環は、環中の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合されている。
該環は、例えば、xが少なくとも2、好ましくは2から20である～(CH2-CH2-O-)x～単位からなっていてよい。代替として、該環は、xが少なくとも2、好ましくは2から50、殊に2から20である～(CH2-CH2-O-)x～単位を含有することができるが、上に記述されている通りの1つ又は複数の追加原子を含むこともできるか、又は一部の他のやり方で誘導体化することができる。
コンジュゲート及び試薬は、クラウンエーテルから容易に合成することができる。クラウンエーテルは、エチレングリコールの環状オリゴマーであり、多くの異なるクラウンエーテルが知られており、これらの一部は全体がエチレングリコール単位からなるとともにこれらの一部は環内に追加原子を含有する。例えば、アザ-クラウンエーテルは窒素原子を含有し、一方、ジアザ-クラウンエーテルは、2個の窒素原子を含有する。多くのクラウンエーテルは市販されており、これらは、本発明によるコンジュゲート及び試薬の合成のための好都合な出発点を提供する。クラウンエーテルが他の化合物と反応することができる官能基を保有するクラウンエーテルは知られており、例えばカルボキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基又はアルデヒド基を保有するクラウンエーテルが、カルボキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、イソシアネート基、ニトロ基又はアルデヒド基等の官能基を任意選択により保有するベンゼン環に縮合されるクラウンエーテルと同様に、知られている。
クラウンエーテルは、カチオンをキレート化することが知られており、ペルフルオロクラウンエーテルは、US 4,838,274内でMRIにおける使用について記載されている。そのため、本発明のコンジュゲートは、MRI又はPET等の画像化技術内の用途において使用することができる。
本発明によるコンジュゲート及び試薬に組み込むことができる典型的なクラウンエーテルは、下記に示される構造を含む。
Figure 0007038663000007
これらは、環内に存在する原子、殊に窒素原子を介する、又は側鎖上に存在する基、例えばヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アルデヒド基、イソシアネート基若しくはニトロ基を介する反応によって、本発明のコンジュゲート及び試薬のリンカーの骨格に結合することができる。典型的な連結は、下記に示されている通りである:
Figure 0007038663000008
クラウンエーテルから誘導される環に加えて、クリプタンドから誘導される環が、本発明において使用することができる。こうした環は、例えばUS 2014/0072900に記載されており、以下が挙げられる:
Figure 0007038663000009
本発明のコンジュゲート及び試薬は、少なくとも2個の～(CH2-CH2-O-)～単位を含む1個の環を含有することができるか、又はそれらは、2個以上のこうした環を含有することができる。該環は単環式であってよいか、又はそれは、二環式若しくは多環式であってよい。2個以上の環がリンカーの骨格に結合され得るか、又はそれらは互いに結合されており、したがって:
Figure 0007038663000010
であり得る。
環の多くの異なるサイズ及び構造が可能であると理解される。本発明の重要な特色は、PEG鎖が環構造の一部を形成することであり:この鎖は、リンカーの骨格の一部を形成する直鎖状PEG鎖ではなく、それは、一方の端部でリンカーに繋がれているが繋がれていない遊離端部を有するペンダントPEG鎖でもない。むしろ、それは、リンカーの骨格の一部を形成しないペンダントPEG含有環構造である。
好ましい一実施形態において、本発明によるコンジュゲート又は試薬におけるPEGの全てが、1個又は複数の環内に存在する。別の実施形態において、PEGは、リンカー中の他所に、具体的にはリンカーの骨格中に、又は該環をリンカーの骨格に連結する基中に存在することもでき、これは、より詳細に下記で考察されている。
本発明のコンジュゲート及び試薬中に存在する～(CH2-CH2-O-)～単位の総数は、当然、意図される用途に依存する。一部の用途のため、高分子量PEGが使用されることがあり、例えば、数平均分子量は、最大約75,000g/モルまで、例えば最大50,000g/モル、40,000g/モル又は30,000g/モルまでであってよい。例えば、数平均分子量は、500g/モルから約75,000g/モルの範囲であってよい。しかしながら、より小さいPEG部分が一部の用途にとって好ましいことがある。
本発明のコンジュゲート又は試薬中に存在するPEGの合計分量と同様に、該環中に存在する～(CH2-CH2-O-)～単位の数は、意図される用途に依存する。例えば、環状PEG部分は、最大3,000g/モルまでの分子量を有することができる。しかしながら、わずか2個のエチレングリコール単位、例えば、2個から50個のエチレングリコール単位を含有する環式基が一部の用途について有用であり、本発明の好ましい一実施形態において、環状PEG基として存在する。2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個若しくは20個の反復単位、又は24個、36個、40個若しくは48個の反復単位を有するPEG含有環が、例えば使用され得る。
ペイロード
本発明のコンジュゲート及び試薬は、治療剤、診断剤又は標識化剤であるペイロードを保有する。治療剤、診断剤又は標識化剤の単一分子が存在し得るか、又は2つ以上の分子が存在し得る。1つ又は複数の薬物分子、例えば細胞毒性剤又は毒素の包含が好ましい。オーリスタチン、メイタンシノイド及びデュオカルマイシンは、典型的な細胞毒性薬である。薬物コンジュゲート、特に抗体薬物コンジュゲートは、該薬物の複数のコピーを含有するべきであることがしばしば好ましい。標識化剤(これは、画像化剤を含むと理解されるべきである)としては、例えば、放射性核種、蛍光薬剤(例えば、5-ジメチルアミノナフタレン-1-(N-(2-アミノエチル)等のアミン誘導体化蛍光プローブ)スルホンアミド-ダンシルエチレンジアミン、Oregon Green(登録商標)488カダベリン(カタログ番号O-10465、Molecular Probes)、ダンシルカダベリン、N-(2-アミノエチル)-4-アミノ-3,6-ジスルホ-1,8-ナフタルイミド、二カリウム塩(ルシファーイエローエチレンジアミン)、又はローダミンBエチレンジアミン(カタログ番号L2424、Molecular Probes)、又はチオール誘導体化蛍光プローブ、例えばBODIPY(登録商標)FL L-シスチン(カタログ番号B-20340、Molecular Probes)が挙げられ得る。ビオチンも使用することができる。
好ましくは、該ペイロードは、治療剤、殊に、上に記述されているものの1つである。
タンパク質
このセクション及び他所における便宜上、「タンパク質」は、文脈が他の意味を必要としている場合を除いて、「タンパク質及びペプチド」を含むと理解されるべきである。
本発明のコンジュゲート中に存在することができる適当なタンパク質としては、例えば、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、酵素、サイトカイン、ケモカイン、受容体、血液因子、ペプチドホルモン、毒素、転写タンパク質又は多量体タンパク質が挙げられる。
酵素としては、炭水化物特異的酵素及びタンパク質分解酵素等、例えば、US 4,179,337によって開示されているオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが挙げられる。特定の対象酵素としては、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ及びグルタミナーゼが挙げられる。
血液タンパク質としては、アルブミン、トランスフェリン、因子VII、因子VIII又は因子IX、フォンビルブランド因子、インスリン、ACTH、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体化ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、インターロイキン、インターフェロン、例えばIFN-α又はIFN-β、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、サイトカイン、抗体、抗体断片、絨毛性ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、及び組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
他の対象タンパク質は、ポリ(アルキレンオキシド)等のポリマーとコンジュゲートされているとともにその結果として寛容誘発剤としての使用に適当である場合、低減されたアレルゲン性を有するような、Dreborgら Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315～365頁によって開示されているアレルゲンタンパク質である。開示されているアレルゲンには、ブタクサ抗原E、ミツバチ毒液、及びダニアレルゲン等がある。
糖ポリペプチド、例えば免疫グロブリン、オバルブミン、リパーゼ、グルコセレブロシダーゼ、レクチン、組織プラスミノゲン活性化因子及びグリコシル化インターロイキン、インターフェロン、並びにコロニー刺激因子が、免疫グロブリン、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びその断片と同様に対象である。
特別な対象は、診断的及び治療的な目的で臨床医学において使用される受容体及びリガンド結合性タンパク質並びに抗体及び抗体断片である。抗体又は抗体断片に基づく抗体-薬物コンジュゲートは、殊に薬物が細胞毒性薬、例えばオーリスタチン、メイタンシノイド又はデュオカルマイシンである場合、本発明の殊に好ましい実施形態である。文脈が他の意味を必要としている場合を除いて、この明細書における本発明のコンジュゲートへのいずれの言及も、抗体薬物コンジュゲートへの具体的な言及を含むと理解されるべきである。
本発明のコンジュゲートにおいて有用であり得る抗体の例は、抗CD30抗体、例えばキメラモノクローナル抗体cAC10、例えばブレンツキシマブである。ブレンツキシマブは、ブレンツキシマブベドチン(INN)、商品名Adcetris(登録商標)の抗体部分である。ブレンツキシマブベドチンは、WHOによって以下の通りに定義されている:
免疫グロブリンG1-カッパオーリスタチンEコンジュゲート、抗-[Homo sapiens TNFRSF8(腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー8、KI-1、CD30)]、オーリスタチンEにコンジュゲートされているキメラモノクローナル抗体;ガンマ1重鎖(1-446) [Mus musculus VH (IGHV1-84*02 -(IGHD)-IGHJ3*01) [8.8.10] (1-117) -Homo sapiens IGHG1*01 CH3 K130>del (118-446)]、カッパ軽鎖(1'-218') [ Mus musculus V-KAPPA (IGKV3-4*01 -IGKJ1*01) [10.3.9] (1'-111') -Homo sapiens IGKC*01 (112'-218')]を有する(220-218')-ジスルフィド(コンジュゲートされていない場合); (226-226'')-ジスルフィド二量体;マレイミドカプロイル-バリル-シトルリニル-p-アミノベンジルカーバメート(mc-valcit-PABC)リンカーを介して、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)に、平均3から5のシステイニルで、コンジュゲートされている。
ベドチン部分について、「INN for pharmaceutical substances: Names for radicals, groups and others」*という文書を参照されたい。
重鎖
QIQLQQSGPE VVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYITWVKQK PGQGLEWIGW 50
IYPGSGNTKY NEKFKGKATL TVDTSSSTAF MQLSSLTSED TAVYFCANYG 100
NYWFAYWGQG TQVTVSAAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF 150
PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC 200
NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT 250
LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY 300
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT 350
LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 400
DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG 446
軽鎖
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSYMNWY QQKPGQPPKV 50
LIYAASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSNEDPW 100
TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV 150
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV 200
THQGLSSPVT KSFNRGEC 218
ジスルフィド架橋位置
Intra-H 22-96 144～200 261-321 367-425
22''-96'' 144''-200'' 261''-321'' 367''-425''
Intra-L 23'-92' 138'-198'
23'''-92''' 138'''-198'''
Inter-H-L * 220-218' 220''-218'''
Inter-H-H * 226-226'' 229-229''
*鎖間ジスルフィド架橋の2つ又は3つは存在せず、抗体は、各々チオエーテル結合を介して平均3個から5個の薬物リンカーにコンジュゲートされている。
N-グリコシル化部位
297、297''
(WHO Drug Information、25巻、1号、2011; International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances (INN)、Recommended International Nonproprietary Names、List 65)
タンパク質は、所望であれば誘導体化又は官能化することができる。特に、コンジュゲーションより前に、タンパク質、例えば未変性タンパク質は、その上の感受性基を保護するために様々な遮断基と反応させていてよいか;又はそれは、1つ又は複数のポリマー又は他の分子と事前にコンジュゲートされていてよい。それは、コンジュゲーション反応中にコンジュゲート試薬によって標的化することができるポリヒスチジンタグを含有してよい。
コンジュゲート試薬及び方法
ペイロードをタンパク質にコンジュゲートするために使用することができる多くのコンジュゲート試薬が知られており、本発明の新規なコンジュゲート試薬は、それらが含有するリンカーの性質において、これらの公知の試薬と異なる。こうした試薬は、タンパク質又はペプチドと反応できる少なくとも1個の官能基Fを含有する。例えば、コンジュゲート試薬は、少なくとも1個の求電子試薬又は殊にタンパク質中に存在する求核試薬と反応することができる官能基を含むことができ、官能基は、リンカーを介してペイロードに結合されている。
公知のコンジュゲーション反応のいずれの型も、本発明のコンジュゲートを形成するために使用することができる。例えば、該反応は、チオール結合、アミンコンジュゲーション、又はクリックケミストリーの公知の方法を使用して実施することができる。例えば、該試薬は、マレイミド基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、クリック化学基、例えばアジ化物若しくはアルキン基、アミン基、カルボキシル基、カルボニル基、又は活性エステル基を含有することができる。他の可能な手法としては、具体的には、工学的改変システイン又は非天然アミノ酸等のコンジュゲーション、及びトランスグルタミナーゼ等との特定の酵素反応を介する酵素的なコンジュゲーションのために、アミノ酸で組換え改変されているタンパク質の使用が挙げられる。タンパク質上の反応部位は、本来は求核性又は求電子性のいずれかであり得る。共通のタンパク質コンジュゲーション部位は、リジンアミノ酸残基若しくはシステインアミノ酸残基又は炭水化物部分である。代替として、コンジュゲーションは、結合性タンパク質に結合されているポリヒスチジンタグで起き得る。
本発明によるコンジュゲート試薬は、有利には、タンパク質における求核試薬と反応でき、それゆえに、そこに化学結合される。したがって、該コンジュゲート試薬は、典型的に、求核試薬との反応で失われる少なくとも1個の脱離基を含む。該コンジュゲート試薬は、例えば、2個以上の脱離基を含むことができる。好ましくは、本発明によるコンジュゲート試薬は、2個の求核試薬と反応できる。有利には、本発明によるコンジュゲート試薬は、少なくとも2個の脱離基を含む。2個以上の脱離基が存在するならば、これらは同じ又は異なっていてよい。代替として、コンジュゲート試薬は、2個の脱離基と化学的に等価である単一の基を含有することができ、この単一の基は2個の求核試薬と反応できる。
求核基としては、硫黄原子及びアミン基が挙げられ、タンパク質における求核基は、例えば、システイン残基、リジン残基又はヒスチジン残基によって提供される。本発明の好ましい一実施形態において、求核基は、タンパク質中に存在するシステイン残基中に存在する硫黄原子である。こうした構造は、タンパク質中に存在するジスルフィド結合の還元によって得ることができる。別の実施形態において、求核基は、タンパク質に結合されているポリヒスチジンタグ中に存在するヒスチジン残基中に存在するイミダゾール基であり得る。
1つのグループの試薬は、Smithら、J. Am. Chem. Soc.、2010、132、1960～1965頁、及びSchumacherら、Bioconj. Chem.、2011、22、132～136頁に記載されている通りのビス-ハロ-マレイミド又はビス-チオ-マレイミド及びその誘導体に基づく。これらの試薬は、官能グルーピング:
Figure 0007038663000011
を含有し、式中、各Lは脱離基である。マレイミド環の窒素原子は、リンカーに接続されている。
同様に、単一の脱離基L:
Figure 0007038663000012
を含有するマレイミドが使用され得る。やはり、マレイミド環の窒素原子は、リンカーに接続されている。
その上、脱離基:
Figure 0007038663000013
を欠如しているマレイミドが使用され得る。やはり、マレイミド環の窒素原子は、リンカーに接続されている。
別のグループの試薬は、WO201173391内に記載されているものである。これらの試薬の例は、官能グルーピング:
Figure 0007038663000014
を含み、式中、各Lは脱離基である。
本発明の殊に好ましい実施形態において、コンジュゲート試薬は、官能グルーピングF:
Figure 0007038663000015
を含有し、式中、Wは、電子吸引性基、例えばケト基、エステル基-O-CO-、又はスルホン基-SO2-を表し;A及びBの各々は独立して、C1～5アルキレン鎖又はアルケニレン鎖を表し;各Lは独立して脱離基を表す又は両Lは一緒になって1個の脱離基を表すのいずれかである。こうした基を含有する試薬がタンパク質と反応する場合、第1の脱離基Lが失われて、式:
Figure 0007038663000016
(式中、mは、0から4である)
の官能グルーピングを含有するコンジュゲート試薬をインサイチュで形成し、これは、第1の求核試薬と反応する。第2の脱離基Lが次いで失われ、第2の求核試薬との反応が起きる。出発材料として官能グルーピングIを含有する試薬を使用する代替として、官能グルーピングIIを含有する試薬が使用され得るが、これは、官能グルーピングI及びIIは、互いの化学的等価物だからである。
本発明のこれらのコンジュゲート試薬は、WO 2005/007197及びWO 2010/100430に開示されている一般の型である。こうした試薬は、例えば、タンパク質中のジスルフィド結合の還元によって得られる2個の硫黄原子、又はタンパク質に結合されているポリヒスチジンタグ中に存在するヒスチジン残基中に存在するイミダゾール基を標的化するために使用することができる。この型の試薬への本発明による環状PEG基の組み込みは、特に良好な結果を与え、コンジュゲーション反応が、高程度の均質性を有する安定なコンジュゲートを生成するのに効果的に起きることが見出された。
脱離基Lは、例えば、-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P、-N+PR2R3、ハロゲン又は-OΦであってよく、ここでPは、水素原子又はアルキル(好ましくはC1～6アルキル)基、アリール(好ましくはフェニル)基若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1～6アルキル-フェニル)基を表すか、或いは-(CH2CH2O)n-部分を含む基であり、ここで、nは2以上の数であり、R2及びR3の各々は独立して、水素原子、C1～4アルキル基又はP基を表し、Φは、少なくとも1個の置換基、例えば-CN、CF3、-NO2、-CO2Ra、-COH、-CH2OH、-CORa、-ORa、-OCORa、-OCO2Ra、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-NHCORa、-NRaCORa、-NHCO2Ra、-NRaCO2Ra、-NO、-NHOH、-NRaOH、-CH=N-NRaCORa、-N+Ra 3、-、ハロゲン、殊に塩素又は殊にフッ素、-C≡CRa、及び-CH=CRa 2を含有する置換アリール基、殊にフェニル基を表し、ここで、各Raは独立して、水素原子又はアルキル(好ましくはC1～6アルキル)基、アリール(好ましくはフェニル)基若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1～6アルキル-フェニル)基を表す。電子吸引性置換基の存在が好ましい。
Pが-(CH2CH2O)n-部分を含む基を表し、ここでnが2以上の数であるコンジュゲート試薬は、WO 2016/059377として公開された本発明者らの同時係属出願GB 1418186の対象である。この出願は、以下を開示している:
「脱離基は、例えば、-(CH2CH2O)n-R1を含むことができ、ここでR1はキャッピング基である。非常に広い範囲のキャッピング基が使用され得る。R1は、例えば、水素原子、アルキル基、殊にC1～4アルキル基、特にメチル基、又は任意選択により置換されているアリール基、例えば任意選択により置換されているフェニル基、例えばトリル基であってよい。代替として、キャッピング基は、カルボキシル基又はアミン基等の官能基を含むことができる。こうしたキャッピング基は、例えば、式-CH2CH2CO2H又は-CH2CH2NH2を有することができ、-(CH2CH2O)n-鎖の末端単位を官能化することによって調製することができる。代替として、キャッピング基によって終端されるよりもむしろ、-(CH2CH2O)n-基は、コンジュゲート試薬内に2つの結合点を有することができることで、2個の脱離基の化学的等価物が存在し、2個の求核試薬と反応できる。
脱離基の-(CH2CH2O)n-部分は、PEG、ポリエチレングリコールに基づく。PEGは直鎖又は分岐であってよく、それは、任意のやり方で誘導体化又は官能化することができる。nは、2以上の数、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である。例えば、nは5から9であってよい。代替として、nは10以上の数であってよい。nについて特別な上限はない。nは、例えば150以下、例えば120以下、例えば100以下であってよい。例えばnは、2から150、例えば7から150、例えば7から120であってよい。脱離基のPEG部分-(CH2CH2O)n-は、例えば、1kDaから5kDaの分子量を有することができ;それは例えば、1kDa、2kDa、3kDa、4kDa又は5kDaであってよい。脱離基は、所望であれば、1つ又は複数のスペーサーによって隔てられている2つ以上の-(CH2CH2O)n-部分を含有することができる。
本発明によるコンジュゲート試薬における脱離基は、適当には、式-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P、-N+PR2R3であり、ここで、Pは、-(CH2CH2O)n-部分を含む基であり、R2及びR3の各々は独立して、水素原子、C1～4アルキル基又はP基を表す。好ましくは、R2及びR3の各々は、C1～4アルキル基、殊にメチル基、又は殊に水素原子を表す。代替として、コンジュゲート試薬は、式-S-P-S-; -O-P-O-; -SO2-P-SO2-; -OSO2-P-OSO2-;及び-N+R2R3-P-N+R2R3-の基を含むことができる。この型の特定の基としては、-S-(CH2CH2O)n-S-、-O-(CH2CH2O)n-O-; -SO2-(CH2CH2O)n-SO2-; -OSO2-(CH2CH2O)n-OSO2-;又は-N+R2R3-(CH2CH2O)n-N+R2R3-が挙げられる。それらは、型:
Figure 0007038663000017
の基も挙げることができ、式中、-(CH2CH2O)n-基は、任意の適当な連結基、例えばアルキル基によって保有される。これらの二価の基は、2個の求核試薬と反応できる2個の脱離基と化学的に等価である。」
本発明による新規なコンジュゲート試薬中に存在する殊に好ましい脱離基Lは、-SP又は-SO2P、殊に-SO2Pである。この基内において、好ましい一実施形態は、Pがフェニル基、又は殊にトリル基を表す場合である。別の好ましい実施形態は、Pが、-(CH2CH2O)n-部分を含む基、殊に、nが上に記述されている値の1つ、殊に7を有する基を表す場合である。殊に好ましい脱離基Lは、-SO2-(CH2CH2O)n-H/Me、殊に-SO2-(CH2CH2O)7-H/Meである。この明細書の全体にわたって、脱離基Lへのいずれの言及も、これらの好ましい基、殊に-SO2-(CH2CH2O)n-H/Me、及びより殊に-SO2-(CH2CH2O)7-H/Meへの具体的な言及を含むと理解されるべきである。
好ましくは、Wはケト基を表す。好ましくは、A及びBの各々は-CH2-を表す。
上記の式I及びIIの試薬は、グルーピングF':
Figure 0007038663000018
を含むコンジュゲートを形成し、式中、W'は、電子求引基又は電子求引基の還元によって得られる基を表し、Prは、求核試薬Nuを介してA及びBに結合されているタンパク質又はペプチドを表す。該コンジュゲーション方法(より詳細に下記で記載されている通り)の即時生成物は、電子吸引性基Wを含有するコンジュゲートである。しかしながら、該コンジュゲーション方法は、適当な条件下で可逆的である。これは、一部の用途にとって、例えば、タンパク質の急速な放出が必要とされる場合に望ましいことがあるが、他の用途にとって、タンパク質の急速な放出が望ましくないことがある。そのため、電子吸引性部分の還元によってコンジュゲートを安定化させることで、タンパク質の放出を防止する部分を得ることが望ましくあり得る。したがって、該コンジュゲーション方法は、コンジュゲート中の電子求引基を還元する追加の任意選択のステップを含むことができる。還元剤として、水素化ホウ素、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム又はトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムの使用が特に好ましい。使用することができる他の還元剤としては、例えば、塩化スズ(II)、アルコキシド、例えばアルミニウムアルコキシド、及び水素化アルミニウムリチウムが挙げられる。
したがって、例えば、ケト基を含有するW部分は、CH(OH)基を含有する部分に還元することができ;エーテル基CH.ORaは、エーテル化剤とのヒドロキシ基の反応によって得ることができ;エステル基CH.O.C(O)Raは、アシル化剤とのヒドロキシ基の反応によって得ることができ;アミン基CH.NH2、CH.NHRa又はCH.NRa 2は、還元的アミノ化によってケトンから調製することができ;又はアミドCH.NHC(O)Ra又はCH.N(C(O)Ra)2は、アミンのアシル化によって形成することができ;ここで、Raは、水素原子又はアルキル(好ましくはC1～6アルキル)基、アリール(好ましくはフェニル)基若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1～6アルキル-フェニル)基を表す。スルホンは、スルホキシドエーテル、スルフィドエーテル又はチオールエーテルに還元することができる。
好ましくは、グルーピングF'及びFは、式:
Figure 0007038663000019
殊に
Figure 0007038663000020
を有する。
上記式において、好ましい脱離基は、上に記載されている通りである。好ましくは、各Nuは硫黄原子である。
別の好ましいグループのコンジュゲート試薬は、官能グルーピング:
～W-CR4R4'-CR4.L.L' (IV)
を含有し、ここで、Wは、上記に示されている意味及び好ましい意味を有し、各R4は水素原子若しくはC1～4アルキル基を表す又はR4'は水素原子を表すのいずれかであり、各Lは独立して脱離基を表す又は両Lは一緒になって1個の脱離基を表すのいずれかであり;或いは
各R4は水素原子又はC1～4アルキル基を表し、Lは脱離基を表し、R4'及びL'は一緒になって1個の結合を表す。
別のグループのコンジュゲート試薬は、官能グルーピング:
～W-(CH=CH)p-(CH2)2-L (V)又は
～W-(CH=CH)p-CH=CH2 (VI)
を含み、ここで、Wは、上記に示されている意味及び好ましい意味を有し、pは、0又は1から4の整数、好ましくは0を表す。この型の殊に好ましい試薬は、官能グルーピング:
～NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (Va)又は
～NH-CO-Ar-CO-CH=CH2 (VIa)
を含み、ここでArは、任意選択により置換されているアリール基、殊にフェニル基を表す。
全ての場合において、脱離基L及びL'についての好ましい意味は、上に記述されている通りである。
本発明によるコンジュゲート試薬は、タンパク質との反応のための1個超の官能グルーピングを含有することができる。例えば、試薬は、分子の一方の端部に好ましくは式I又はIIの官能グルーピング、及び分子の他所で1つ又は複数の追加の官能グルーピングを含有することができる。こうした構造は、例えばBelchevaら、J. Biomater. Sci Polymer Edn. 9(3)、207～226頁に記載されており、複数のタンパク質を含有するコンジュゲートの合成において有用である。
本発明の新規なコンジュゲート試薬は、公知の方法に類似した方法によって調製することができる。特定の合成反応は、次に続く実施例に例示されている。
本発明によるコンジュゲート試薬は、タンパク質又はペプチドと反応させることで、本発明によるコンジュゲートを形成することができ、こうした反応は、本発明のさらなる態様を形成する。したがって、適当な官能グルーピング、殊に官能グルーピングI又はIIを含むコンジュゲート試薬は、タンパク質又はペプチド、殊に抗体又は抗体断片と反応させることで、コンジュゲート、殊にグルーピングIIIを含むコンジュゲートを形成する。
式I又はIIのコンジュゲート試薬を使用する重要な特色は、α-メチレン脱離基及び二重結合が、マイケル活性化性部分として働く電子求引性官能基とクロスコンジュゲートされることである。脱離基が、直接的置き換えよりもむしろクロス官能性試薬において脱離しやすく、電子吸引性基がマイケル反応にとって適当な活性化性部分であるならば、逐次の分子内ビス-アルキル化は、連続したマイケル反応及びレトロマイケル反応によって起きることができる。官能グルーピングIを含有する試薬において、脱離基は、第1のアルキル化が起きることで官能グルーピングIIを含む試薬を得た後まで曝露されない潜在的な共役二重結合をマスクする働きをし、ビス-アルキル化は、逐次の及び相互作用的なマイケル反応及びレトロマイケル反応に起因する。クロス官能性アルキル化剤は、二重結合に又は脱離基と電子求引基との間でコンジュゲートされている多重結合を含有することができる。
タンパク質への結合が、タンパク質中のジスルフィド結合から誘導される2個の硫黄原子を介する場合、該方法は、ジスルフィド結合を還元することによって実施することができ、これに続いて、還元生成物は本発明による試薬と反応する。好ましくは、ジスルフィド結合は還元され、任意の過剰の還元剤が例えば緩衝液交換によって除去された後に、コンジュゲート試薬が導入される。ジスルフィド結合は、例えば、従来の方法を使用してジチオスレイトール、メルカプトエタノール又はトリス-カルボキシエチルホスフィンで還元することができる。
コンジュゲーション反応は、WO 2005/007197、WO 2009/047500、WO 2014/064423、WO 2014/064424及びWO 2015/057699に開示されている条件を含めて、公知のコンジュゲーション方法と同様の条件下で実施することができる。該方法は、例えば、全ての反応物が可溶である溶媒又は溶媒混合物中で実施することができる。例えば、タンパク質は、水性反応媒体中でポリマーコンジュゲート試薬と直接的に反応させることができる。この反応媒体は、求核試薬のpH要件に依存して、緩衝することもできる。該反応のための最適なpHは、一般に少なくとも4.5、典型的に約5.0から約8.5、好ましくは約6.0から7.5の間である。最適な反応条件は、当然、用いられる特定の反応物に依存する。
3～40℃の間の反応温度は、一般に、水性反応媒体を使用する場合に適当である。有機媒体(例えばTHF、酢酸エチル、アセトン、DMSO、DMF、MeCN)中で行われる反応は、典型的に、最大室温までの温度で行われる。好ましい一実施形態において、該反応は、有機溶媒のある割合、例えば有機溶媒の体積により最大20%まで、典型的には有機溶媒の体積により5%から20%を含有することができる緩衝水溶液中で実施される。
タンパク質は、化学量論的当量又はわずかに過剰のコンジュゲート試薬を使用して、有効にコンジュゲートすることができる。しかしながら、過剰の化学量論のコンジュゲート試薬を用いてコンジュゲーション反応を行うことも可能であり、これは、一部のタンパク質にとって望ましいことがある。過剰の試薬は、例えばイオン交換クロマトグラフィー又はHPLCによって、コンジュゲートの後続の精製中に、簡便に除去することができる。
当然、1個超のコンジュゲート試薬がタンパク質にコンジュゲートされることは可能であり、ここでタンパク質は、十分な適当な結合点を含有する。例えば、2個の異なるジスルフィド結合を含有するタンパク質において、又は1個のジスルフィド結合を含有するとともにポリヒスチジンタグも保有するタンパク質において、タンパク質の1分子当たり試薬の2個の分子をコンジュゲートすることが可能であり、こうしたコンジュゲートは本発明の一部を形成する。
リンカー
本発明のコンジュゲート及び試薬は、本発明のコンジュゲート中のタンパク質若しくはペプチドに又は本発明のコンジュゲート試薬中の官能グルーピングに、治療剤、診断剤又は標識化剤を接続するリンカーを含有する。該リンカーの骨格は、一方の端部の治療剤、診断剤又は標識化剤から他方の端部のタンパク質又はペプチドへ走る原子の連続鎖である。このリンカーは、上に記載されている通り、1つ又は複数の環状PEG部分、即ち、少なくとも2個の-(CH2-CH2-O)-単位を含む環を含まなければならない。それは、任意の他の所望の基、特に、この分野において共通して見出される従来の基のいずれかを含有することもできる。
サブセクション(i)。一実施形態において、ペイロードと式F'/Fのグルーピングとの間のリンカー、特に、式F'/Fのグルーピングに直に隣接するリンカーのその部分は、アルキレン基(好ましくはC1～10アルキレン基)、又は任意選択により置換されているアリール基又はヘテロアリール基を含み、これらのいずれも、1個又は複数の酸素原子、硫黄原子、-NRa基(ここでRaは、水素原子、又はアルキル(好ましくはC1～6アルキル)基、アリール(好ましくはフェニル)基、若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1～6アルキル-フェニル)基を表す)、ケト基、-O-CO-基、-CO-O-基、-O-CO-O基、-O-CO-NRa-基、-NR-CO-O-基、-CO-NRa-基及び/又は-NRa.CO-基によって終端又は中断されていてもよい。適当なアリール基としては、フェニル基及びナフチル基が挙げられ、一方、適当なヘテロアリール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンが挙げられる。殊に適当な連結基は、ヘテロアリール基、又は殊にアリール基、殊にフェニル基である。これらは、-NRa.CO-基又は-CO.NRa-基、例えば-NH.CO-基又は-CO.NH-基である又はそれを含有する連結基のさらなる部分に隣接していてよい。この明細書の全体にわたるここ及び他所で、Ra基が存在する場合、これは、好ましくはC1～4アルキル基、殊にメチル基、又は殊に水素原子である。
任意選択により置換されているアリール基、殊にフェニル基、又はヘテロアリール基上に存在することができる置換基としては、例えば、アルキル(好ましくは、OH又はCO2Hによって任意選択により置換されているC1～4アルキル、殊にメチル)、CF3、NRa 2、-CN、-NO2、-CO2Ra、-COH、-CH2OH、-CORa、-ORa、-OCORa、-OCO2Ra、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-NRaCORa、-NRa.CO2Ra、-NO、-NRa.OH、-CH=N-NRa.CORa、-N+Ra 3、ハロゲン、例えばフッ素又は塩素、-C≡CRa、及び-CH=CRa 2から選択される同じ又は異なる置換基の1つ又は複数が挙げられ、ここで、各Raは独立して、水素原子又はアルキル(好ましくはC1～6アルキル)基、アリール(好ましくはフェニル)基若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1～6アルキル-フェニル)基を表す。電子吸引性置換基の存在は殊に好ましい。好ましい置換基としては、例えばCN、NO2、-ORa、-OCORa、-SRa、-NRa.CORa、-NHOH及び-NRa.CORa、殊にCN及びNO2が挙げられる。
好ましくは、該リンカーは、グルーピングF'/Fに隣接する上記基の1つを含む。1つの好ましいグループのコンジュゲート及び試薬としては、コンジュゲート/試薬が治療剤、診断剤又は標識化剤と式F'/Fのグルーピングとの間にリンカーを含むものが挙げられ、ここで、このリンカーは、グルーピングF'/Fに直に隣接する任意選択により置換されているアリール基又はヘテロアリール基を含み;このリンカーは、前記アリール基又はヘテロアリール基に隣接する-NRa.C(O)-基又は-C(O).NRa-基も含み;したがって、式-NRa.C(O)-(het)アリール-F'又は-C(O).NRa-(het)アリール-Fを有し、ここでRaは、C1～4アルキル又は水素を表す。殊に好ましいのは、グルーピング:
Figure 0007038663000021
又は殊に:
Figure 0007038663000022
を含むコンジュゲート及びコンジュゲート試薬である。
上記式において、好ましくは、Fは、式I又はII、例えば上記のIa、Ib、IIa又はIIbを有し、好ましくは、F'は、式III、例えば上記のIIIa、IIIb、又はIIIcを有する。
代替実施形態において、本発明のコンジュゲート及び試薬としては、治療剤、診断剤又は標識化剤と式F'/Fのグルーピングとの間にリンカーを含むものが挙げられ、このリンカーは、グルーピングF'/Fに直に隣接する任意選択により置換されているアリール基又はヘテロアリール基を含み;このリンカーは、前記アリール基又はヘテロアリール基に隣接する-NRb.C(O)-基又は-C(O).NRb-基も含み;したがって、式-NRb.C(O)-(het)アリール-F'又は-C(O).NRb-(het)アリール-Fを有し、ここでRbは、ポリエチレングリコール環を含有する基を表す。
サブセクション(ii)。一実施形態において、リンカーは、分解性基を含有することができ、即ち、それは、生理学的条件下で切断する基を含有することができ、それが結合された又は結合されるタンパク質とペイロードとを隔てる。代替として、それは、生理学的条件下で開裂可能でないリンカーであってよい。リンカーが生理学的条件下で切断する場合、それは、好ましくは、細胞内条件下で開裂可能である。標的が細胞内である場合、好ましくは、リンカーは、細胞外条件に対して実質的に非感受性である(即ち、治療剤の十分な用量の細胞内標的への送達が妨げられないように)。
該リンカーが分解性基を含有する場合、これは一般に、加水分解条件に対して感受性であり、例えばそれは、ある特定のpH値(例えば酸性条件)で分解する基であってよい。加水分解性/酸性条件は、例えば、エンドソーム又はリソソームにおいて見出され得る。酸性条件下で加水分解に感受性の基の例としては、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、cis-アコニットのアミド、オルトエステル及びケタールが挙げられる。加水分解条件に感受性の基の例としては、以下が挙げられる:
Figure 0007038663000023
好ましい実施形態において、リンカーは、
Figure 0007038663000024
を含む。
例えば、それは、以下を含むことができる:
Figure 0007038663000025
該リンカーは、還元条件下での分解にも感受性であり得る。例えば、それは、チオール等の生物学的還元剤への曝露で開裂可能であるジスルフィド基を含有することができる。ジスルフィド基の例としては、以下が挙げられ:
Figure 0007038663000026
式中、R、R'、R''及びR'''は、各々独立して、水素又はC1～4アルキルである。好ましい実施形態において、リンカーは、
Figure 0007038663000027
を含む。
例えば、それは、
Figure 0007038663000028
を含むことができる。
該リンカーは、酵素分解に感受性である基も含有することができ、例えばそれは、プロテアーゼ(例えばリソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼ)又はペプチダーゼによる開裂に感受性であってよい。例えば、それは、少なくとも1個、例えば少なくとも2個、又は少なくとも3個のアミノ酸残基(例えばPhe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Ala、Val-Cit、Phe-Lys、Glu-Glu-Glu)を含むペプチジル基を含有することができる。例えば、それは、1個から5個、例えば、2個から4個のアミノ酸を有するアミノ酸鎖を含むことができる。酵素分解に感受性の基の別の例は以下であり:
Figure 0007038663000029
式中、AAは、Val-Cit等のプロテアーゼ特異的なアミノ酸配列を表す。
好ましい実施形態において、リンカーは、以下を含む:
Figure 0007038663000030
例えば、それは、
Figure 0007038663000031
を含むことができる。
該リンカーは、単一のペイロードD、又は1個超のD基を保有することができる。複数のD基は、例えばアスパルテート若しくはグルタメート又は同様の残基を組み込むことができる分岐状リンカーの使用によって組み込むことができる。これは、式:
Figure 0007038663000032
の分岐状要素を導入し、式中、bは1、2又は3であり、b=1はアスパルテートであり、b=2はグルタメートであり、b=3は好ましい一実施形態を表す。上記式におけるアシル部分の各々は、D基にカップリングすることができる。上記の分岐状基は、-CO.CH2-基、したがって:
Figure 0007038663000033
を組み込むことができる。
所望であれば、アスパルテート若しくはグルタメート又は同様の残基は、さらなるアスパルテート並びに/若しくはグルタメート及び/又は同様の残基、例えば:
Figure 0007038663000034
等にカップリングすることができる。
同様のやり方において、アミノ酸リジン、セリン、スレオニン、システイン、アルギニン若しくはチロシン又は同様の残基が導入されることで、分岐状基、したがって:
Figure 0007038663000035
(式中、bは、リジンについて4である)、及び
Figure 0007038663000036
(式中、bは、セリンについて1である)
を形成することができる。
同様の分岐状基が使用されることで、該リンカーに環状PEG基を組み込むことができる。それで、例えば、上に記述されている分岐状要素、例えばアスパルテート、グルタメート、リジン若しくはセリン又は同様の残基の1つは、薬物Dに至る1つの分枝を有して存在することができ、一方、他は、環状PEG基を含有する分枝に至る。上に記述されている様々なリンカー部分は、分岐状基の前又は後のいずれの任意の位置に存在することができる。
明らかであるように、グルーピングF/F'とペイロードとの間のリンカーのために多くの代替立体配置が可能である。1つの好ましい立体配置は、以下の通りにスキーム的に表すことができ:
Figure 0007038663000037
式中、Eは、上記のサブセクション(i)に記述されている基の1つを表し、Bは、このサブセクション(ii)に記述されている基の1つを表す。
特定の特に好ましい構築が下記に示されており:
Figure 0007038663000038
式中、F'及びFは、上記に示されている意味及び好ましい意味を有する。こうした構造の特に好ましい例は、以下の通りである:
Figure 0007038663000039
サブセクション(iii)。本発明のコンジュゲートにおけるタンパク質若しくはペプチドに又は本発明のコンジュゲート試薬における官能グルーピングに、治療剤、診断剤又は標識化剤を接続するリンカーは、環状PEG基に加えて追加のPEGを含有することができる。それは、例えば、リンカーの骨格中にPEGを含有することができ、したがって:
Figure 0007038663000040
とスキーム的に示される。
これらの式において、p及びqは、環中に存在するn個のエチレングリコール単位に加えて、コンジュゲート又は試薬のリンカー中に存在する様々なPEG鎖中に存在するエチレングリコール単位の数を表す。明確にするため、PEG単位は直鎖単位として示されるが、該単位のいずれもが分岐鎖を含むことができると理解されよう。同様に、ここ及び他所で、明確にするため、
Figure 0007038663000041
基は、環からリンカーの残部への単一の結合点だけを有するとして示されているが、文脈が他の意味を必要としている場合を除いて、上に記載されている通りの複数の結合点が同等に可能であると理解されるべきである。
サブセクション(iv)。本発明のコンジュゲートにおけるタンパク質若しくはペプチドに又は本発明のコンジュゲート試薬における官能グルーピングに、治療剤、診断剤又は標識化剤を接続するリンカーは、2個以上の環状PEG基を含有することができる。これは、2個の環状PEG基についてスキーム的に、したがって:
Figure 0007038663000042
と例示することができ、明らかに、2個超の環状PEG基が同様に存在することができる。該リンカーは、上記のサブセクション(iii)に記載されている通りの環状PEG基に加えて、追加のPEGを含有することがある又は含有することがない。
複数の環状PEG基は、任意の適当な方法を使用してリンカーに組み込むことができる。環状PEG基は、例えば、上記で考察されているリンカー部分のいずれか中に存在する任意の反応性基との反応によって導入することができる。上に記載されている式の分岐状基が使用され得る。例えば、特定の一実施形態において、2個の環状PEG基は、構造:
Figure 0007038663000043
の使用によって組み込むことができる。
代替として、分岐状は、ポリオール官能性、例えば:
～CHs[(CH2)tO]3-s～
の使用によって導入することができ、ここで、sは0、1又は2であり、tは1から4である。例えば、特定の一実施形態において、3個の環状PEG基は、構造:
Figure 0007038663000044
の使用によって組み込むことができる。
コンジュゲートの一部の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、部分:
Figure 0007038663000045
を含み、式中、W'は、電子求引基又は電子求引基の還元によって得られる基を表し、Prは、求核試薬Nuを介してタンパク質又はペプチド結合を表し、
これは、式IIIaの基に直に隣接する任意選択により置換されているアリール基又はヘテロアリール基を含み;このリンカーは、前記アリール基又はヘテロアリール基に隣接する-NRa.C(O)-基又は-C(O).NRa-基も含み;ここでRaは、C1～4アルキル又は水素を表し;
タンパク質又はペプチドは、抗体(例えば、ブレンツキシマブ等の抗CD30抗体)であり;
リンカーは、基
Figure 0007038663000046
を含み;
治療剤、診断剤又は標識化剤は、細胞毒性剤(例えばオーリスタチン、メイタンシン又はデュオカルマイシン)である。
コンジュゲートの一部の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、部分:
Figure 0007038663000047
を含み、式中、W'は、電子求引基又は電子求引基の還元によって得られる基を表し、Prは、求核試薬Nuを介して結合されているタンパク質又はペプチドを表し、
これは、式IIIaの基に直に隣接する任意選択により置換されているアリール基又はヘテロアリール基を含み;このリンカーは、前記アリール基又はヘテロアリール基に隣接する-NRa.C(O)-基又は-C(O).NRa-基も含み;ここでRaは、C1～4アルキル又は水素を表し;
タンパク質又はペプチドは、抗体(例えば、ブレンツキシマブ等の抗CD30抗体)であり;
リンカーは、基
Figure 0007038663000048
を含み、式中、環は、2個から20個の-CH2CH2-O-単位(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個)を含有し;
リンカーは、
Figure 0007038663000049
である分解性基を含み;
リンカーは、リンカーに環状PEG基を組み込むために、アスパルテート残基、グルタメート残基、リジン残基又はセリン残基である分岐状基を含み;
治療剤、診断剤又は標識化剤は、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)である。
コンジュゲートの一部の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、部分:
Figure 0007038663000050
を含み、式中、W'は、電子求引基又は電子求引基の還元によって得られる基を表し、Prは、求核試薬Nuを介して結合されているタンパク質又はペプチドを表し、
これは、式IIIaの基に直に隣接する任意選択により置換されているアリール基又はヘテロアリール基を含み;このリンカーは、前記アリール基又はヘテロアリール基に隣接する-NRa.C(O)-基又は-C(O).NRa-基も含み;ここでRaは、C1～4アルキル又は水素を表し;
タンパク質又はペプチドは、抗体(例えば、ブレンツキシマブ等の抗CD30抗体)であり;
リンカーは、基
Figure 0007038663000051
を含み;
リンカーは、
Figure 0007038663000052
である分解性基を含み;
リンカーは、環状PEG基をリンカーに組み込むために、グルタメート残基である分岐状基を含み;
治療剤、診断剤又は標識化剤は、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)である。
一部の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、式:
Figure 0007038663000053
を有し、式中、Dは細胞毒性剤(例えばオーリスタチン、メイタンシン又はデュオカルマイシン)であり;
Figure 0007038663000054
は、少なくとも2個のエチレングリコール、～(CH2-CH2-O-)～単位を含む環を表し;
F'は、式
Figure 0007038663000055
の基であり;
Prは、抗体(例えば、ブレンツキシマブ等の抗CD30抗体)である、求核試薬Nuを介して結合されているタンパク質又はペプチドを表す。
一部の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、式:
Figure 0007038663000056
を有し、式中、DはモノメチルオーリスタチンEであり;
Figure 0007038663000057
は、基
Figure 0007038663000058
を表し、式中、環は、2個から20個の-CH2CH2-O-単位(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個)を含有し;
F'は、式
Figure 0007038663000059
の基であり;
Prは、抗体(例えば、ブレンツキシマブ等の抗CD30抗体)である、求核試薬Nuを介して結合されているタンパク質又はペプチドを表す。
一部の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、式:
Figure 0007038663000060
を有し、式中、DはモノメチルオーリスタチンEであり;
Figure 0007038663000061
は、
Figure 0007038663000062
を表し;
F'は、式
Figure 0007038663000063
の基であり;
Prは、抗体(例えば、ブレンツキシマブ等の抗CD30抗体)である、求核試薬Nuを介して結合されているタンパク質又はペプチドを表す。
医薬組成物及び有用性
ペイロードが治療剤である本発明によるコンジュゲートは、ペイロードの性質に依存して様々な病状の処置において有用性を見出す。典型的に、ペイロードは細胞毒性剤であり、本発明はがんの処置において有用性を見出す。したがって、本発明は、本発明によるコンジュゲート、特に、ペイロードが治療剤であるコンジュゲート、詳細には、薬学的に許容される担体と一緒の、及び任意選択によりさらなる活性成分と一緒の抗体-薬物コンジュゲートを更に提供する。本発明は、治療におけるこうしたコンジュゲートの使用を更に提供し、本発明によるコンジュゲート又は医薬組成物を患者に投与することを含む、患者の処置の方法において有用性を見出す。本発明は、例えばがんの処置のための医薬の製造における本発明によるコンジュゲートの使用を更に提供する。
実施例8の結果を示す図である。 (a)腫瘍移植に続いて12日目の1mg/kgのビヒクル又はAdcetris(登録商標)(ブレンツキシマブベドチン)(対照薬)の投与に続く、CB17-SCIDマウスにおける時間の経過による平均腫瘍体積±標準誤差のプロット;及び(b)腫瘍移植に続いて12日目の1mg/kgのビヒクル又はAdcetris(登録商標)(ブレンツキシマブベドチン)(対照薬)の投与に続く、CB17-SCIDマウスにおける時間の経過による個々の腫瘍体積のプロットを示すマウス異種移植片研究の結果を示す図である。 (a)腫瘍移植に続いて12日目の0.8mg/kgのビヒクル又はコンジュゲート32(対照薬)の投与に続く、CB17-SCIDマウスにおける時間の経過による平均腫瘍体積±標準誤差のプロット;及び(b)腫瘍移植に続いて12日目の0.8mg/kgのビヒクル又はコンジュゲート32(対照薬)の投与に続く、CB17-SCIDマウスにおける時間の経過による個々の腫瘍体積のプロットを示すマウス異種移植片研究の結果を示す図である。 (a)腫瘍移植に続いて12日目の0.8mg/kgのビヒクル又はコンジュゲート14の投与に続く、CB17-SCIDマウスにおける時間の経過による平均腫瘍体積±標準誤差のプロット;及び(b)腫瘍移植に続いて12日目の0.8mg/kgのビヒクル又はコンジュゲート14の投与に続く、CB17-SCIDマウスにおける時間の経過による個々の腫瘍体積のプロットを示すマウス異種移植片研究の結果を示す図である。 (a)腫瘍移植に続いて12日目の0.8mg/kgのビヒクル又はコンジュゲート31の投与に続く、CB17-SCIDマウスにおける時間の経過による平均腫瘍体積±標準誤差のプロット;及び(b)腫瘍移植に続いて12日目の0.8mg/kgのビヒクル又はコンジュゲート31の投与に続く、CB17-SCIDマウスにおける時間の経過による個々の腫瘍体積のプロットを示すマウス異種移植片研究の結果を示す図である。
以下の実施例は本発明を例示する。
オーリスタチン細胞毒性ペイロード、MMAEを含むコンジュゲーション試薬1の合成。
Figure 0007038663000064
ステップ1:化合物2の合成。
Figure 0007038663000065
ジクロロメタン(15mL)中のジエタノールアミン(2.5g)及びトリエチルアミン(6.05g)の撹拌溶液に、ジクロロメタン(15mL)中の塩化トシル(3.8g)の溶液を、室温でゆっくり添加した。2時間後、水(25mL)を反応混合物に添加し、生成物をジクロロメタン(5×30mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶液を次いで濾過し、揮発分を真空中で除去することで、化合物2が白色の固体として得られた(4.7g)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δH 7.68 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 3.84 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 3.56 (s, 2H), 3.24 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 2.41 (s, 3H). m/z [M+Na]+ (282, 95%), [M+H]+ (260, 100%).
ステップ2:化合物3の合成。
Figure 0007038663000066
無水THF(2mL)中の化合物2(176mg)の溶液を、滴下により1時間の期間かけて、無水THF(8mL)中の水素化ナトリウム(80mg、鉱物油中60%の分散体)の溶液に室温で添加した。1時間の間撹拌した後、無水THF(2mL)中のヘキサエチレングリコールジ-p-トルエンスルホネート(400mg)の溶液を2時間の期間かけて添加し、反応混合物を室温で72時間の間撹拌した。水(30mL)を添加し、THFを真空中で除去した。水溶液をクロロホルム(4×25mL)で抽出し、有機相を合わせ、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後に、溶液を濾過し、真空中で濃縮した。残渣を次いで、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物3を無色の油として得た(78mg)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δH 7.68 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 8.3 Hz, 4H), 3.67 - 3.58 (m, 24H), 3.58 - 3.53 (m, 4H), 3.38 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 2.40 (s, 3H). m/z [M+Na]+ (528, 80%), [M+H]+ (506, 50%).
ステップ3:化合物4の合成。
Figure 0007038663000067
無水THF(6mL)中の化合物3(78mg)の溶液に、水素化アルミニウムリチウム(1.13mL、THF中1Mの溶液)を添加し、溶液を還流で16時間の間加熱した後に、反応混合物を0℃に冷却し、水の滴下による添加によってクエンチした。懸濁液を濾過し、沈殿物をクロロホルム:エタノール(9:1 v/v、5×6mL)で洗浄した。濾液及び洗浄液を合わせ、真空中で濃縮することで、化合物4を無色の油として得た(50mg)。m/z [M+Na]+ (374、70%)、[M+H]+ (352、100%)。
ステップ4:化合物5の合成。
Figure 0007038663000068
Figure 0007038663000069
DMF(1.0mL)中のFmoc-Glu-(OH)-OAll(48mg)の溶液に、HATU(110mg)を添加し、溶液を30分間0℃で撹拌した。これに、DMF(1mL)中のVal-Cit-PAB-MMAE.TFA塩(Levena Biopharma社、120mg)及びNMM(32μL)の溶液を添加した。反応混合物を0℃で2.5時間の間撹拌した。溶媒を真空中で濃縮し、粗製物をDMF(1.5mL)中に溶解した後に、NMM(32μL)を添加した。テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(45mg)を反応混合物に添加し、これを次いで20時間の間室温で撹拌した。反応溶液を真空中で濃縮し、残渣を、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物5を白色の固体として得た(98.0mg)。m/z [M+H]+ (1475 Da、100%)、[M+2H]2+ (738、50%)。
ステップ5:化合物6の合成。
Figure 0007038663000070
DMF(0.5mL)中の化合物5(15mg)の溶液に、0℃で、HATU(4.3mg)を添加した。溶液を20分間0℃で撹拌した後に、NMM(1.3μL)を添加し、溶液を更に10分間撹拌した。DMF(0.3ml)中の化合物4(5mg)の別の溶液に、NMM(1.3μL)を添加し、溶液を室温で30分間撹拌した。2つの溶液を次いで合わせ、追加分量のHATU(4.3mg)及びNMM(1.3μL)を合わせた溶液に添加し、これを16時間の間室温で撹拌した。反応溶液を真空中で濃縮することで、粗製Fmoc-L-Glu-[Val-Cit-PAB-MMAE]-アザ-24-クラウン-8(18mg)を得た。m/z [M+Na]+ (1831、20%)、[M+H]+ (1809、20%)、[M+2H]2+ (905、100%)。DMF(0.4mL)中のFmoc-L-Glu-[Val-Cit-PAB-MMAE]-アザ-24-クラウン-8(18mg)の溶液に、ピペリジン(5μL)を添加し、溶液を20分間室温で撹拌した。追加のピペリジン(5μL)を添加し、溶液を更に25分間室温で撹拌した。反応溶液を真空中で濃縮し、残渣を、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物6を無色の油として得た(8.5mg)。m/z [M+Na]+ (1609、10%)、[M+H]+ (1587、20%)、[M+2H]2+ (794、100%)。
ステップ6:化合物7の合成。
Figure 0007038663000071
DMF(70mL)中の4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(1.5g、Nature Protocols、2006、1(54)、2241～2252頁)の撹拌溶液に、アルファ-メトキシ-オメガ-メルカプトヘプタ(エチレングリコール)(3.2g)及びトリエチルアミン(2.5mL)を添加した。結果として得られた反応混合物を不活性窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。19時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を水(2.4mL)中に溶解し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物7を濃い清澄な無色の油として得た(1.77g)。m/z [M+H]+ 901。
ステップ7:試薬8の合成。
Figure 0007038663000072
メタノール:水(18mL、9:1 v/v)中の7(1.32g)の撹拌溶液に、室温で、Oxone(登録商標)(2.7g)を添加した。2.5時間後、揮発分を真空中で除去し、水をアセトニトリル(2×15mL)と共沸除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(3×10mL)中に溶解し、硫酸マグネシウムのカラムを介して濾過し、ジクロロメタン(2×7mL)で洗浄した。溶離液及び洗浄液を合わせ、揮発分を真空中で除去することで、濃い清澄な淡黄色の油を得た(1.3g)。残渣の一部(700mg)を、水:アセトニトリル(1.5mL、3:1 v/v)中に溶解し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬8を濃い清澄な無色の油として得た(524mg)。m/z [M+H]+ 965。
ステップ8:試薬1の合成。
DMF(0.3mL)中の試薬8(6mg)の溶液に、0℃で、HATU(2.3mg)を添加した。溶液を0℃で20分間撹拌した後に、NMM(0.6μL)を添加し、溶液を更に10分間撹拌した。DMF(0.3mL)中の化合物6(8.5mg)の別の溶液に、NMM(0.6μL)添加し、溶液を室温で30分間撹拌した。2つの溶液を次いで合わせ、追加分量のHATU(2.3mg)及びNMM(0.6μL)を添加し、溶液を室温で1時間の間撹拌した。さらなる分量のHATU(1.2mg)及びNMM(0.3μL)を次いで添加し、溶液を室温で1.5時間の間撹拌した。反応溶液を真空中で濃縮し、残渣を、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬1を無色の油として得た(10.7mg)。m/z [M+Na]+ (2557、5%)、[M+2H]2+ (1268、40%)、[M+3H]3+ (845、45%)。
オーリスタチン細胞毒性ペイロード、MMAEを含むコンジュゲーション試薬9の合成。
Figure 0007038663000073
ステップ1:化合物10の合成。
Figure 0007038663000074
ジクロロメタン(5mL)中の塩化トシル(307mg)の溶液に、ジクロロメタン(5mL)中のドデカエチレングリコール(400mg)、トリエチルアミン(255μL)及びDMAP(13mg)の溶液を添加し、合わせた溶液を室温で16時間の間撹拌した。追加のDMAP(13mg)及びトリエチルアミン(255μL)を添加し、反応混合物を室温で更に24時間の間撹拌させておいた。反応溶液を真空中で濃縮し、残渣を、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物10を無色の油として得た(287mg)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δH 7.78 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.32 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 4.13 (t, J = 4.9 Hz, 4H), 3.66 (t, J = 4.9 Hz, 4H), 3.62 (br. s, 24H), 3.61 - 3.58 (m, 8H), 3.56 (s, 8H), 2.42 (s, 6H). m/z [M+Na]+ (877, 100%), [M+H]+ (855, 75%).
ステップ2:化合物11の合成。
Figure 0007038663000075
無水THF(2mL)中の化合物2(85mg)の溶液を、滴下により1時間の期間かけて、無水THF(8mL)中の水素化ナトリウム(40mg、鉱物油中60%の分散体)の溶液に、室温で添加した。1時間の間撹拌した後、無水THF(20mL)中の化合物10(280mg)の溶液を2時間の期間かけて添加し、反応混合物を96時間の間室温で撹拌した。水(30mL)を添加し、THFを真空中で除去した。水溶液をクロロホルム(4×25mL)及び次いでクロロホルム:イソプロパノール(9:1 v/v、2×25mL)で抽出した。有機相を合わせ、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後に、溶液を濾過し、真空中で濃縮した。残渣を次いで、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物11を無色の油として得た(58mg)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δH 7.68 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 3.66 - 3.52 (m, 52H), 3.35 (t, J = 6.3 Hz, 4H), 2.40 (s, 3H). m/z [M+Na]+ (792, 100%), [M+H]+ (770, 55%).
ステップ3:化合物12の合成。
Figure 0007038663000076
無水THF(3mL)中の化合物11(54mg)の溶液に、水素化アルミニウムリチウム(513μL、THF中1Mの溶液)を添加し、溶液を還流で4時間の間加熱した後に、反応混合物を0℃に冷却し、水の滴下による添加によってクエンチした。懸濁液を濾過し、沈殿物をクロロホルム:エタノール(9:1 v/v、3×6mL)で洗浄した。濾液及び洗浄液を合わせ、真空中で濃縮することで、化合物12を白色の固体として得た(34mg)。m/z [M+Na]+ (639、10%)、[M+H]+ (617、100%)。
ステップ4:化合物13の合成。
Figure 0007038663000077
DMF(0.4mL)中の化合物5(25mg)の溶液に、0℃で、HATU(7mg)を添加した。溶液を20分間0℃で撹拌した後に、NMM(2μL)を添加し、溶液を更に10分間撹拌した。DMF(0.4ml)中の化合物12(17mg)の別の溶液に、NMM(2μL)を添加し、溶液を室温で30分間撹拌した。2つの溶液を次いで合わせ、追加分量のHATU(7mg)及びNMM(2μL)を合わせた溶液に添加し、これを1時間の間室温で撹拌した。さらなるHATU(7mg)及びNMM(2μL)を添加し、溶液を0.5時間の間撹拌した後に、反応溶液を真空中で濃縮することで、粗製Fmoc-L-Glu-[Val-Cit-PAB-MMAE]-アザ-42-クラウン-14(35mg)を得た。m/z [M+Na]+ (2095、25%)、[M+H]+ (2073、15%、[M+2H]2+ (1037、100%)。DMF(0.5mL)中の粗製Fmoc-L-Glu-[Val-Cit-PAB-MMAE]-アザ-42-クラウン-14(35mg)の溶液に、ピペリジン(10μL)を添加し、溶液を30分間室温で撹拌した。追加のピペリジン(10μL)を添加し、溶液を更に30分間室温で撹拌した。反応溶液を真空中で濃縮し、残渣を、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物13を無色の油として得た(22mg)。m/z [M+Na]+ (1873、10%)、[M+H]+ (1851、50%)、[M+2H]2+ (926、100%)。
ステップ5:試薬9の合成。
DMF(0.3mL)中の試薬8(11.5mg)の溶液に、0℃で、HATU(3.3mg)を添加した。溶液を0℃で20分間撹拌した後に、NMM(0.9μL)を添加し、溶液を更に10分間撹拌した。DMF(0.3mL)中の化合物13(15mg)の別の溶液に、NMM(0.9μL)を添加し、溶液を室温で30分間撹拌した。2つの溶液を次いで合わせ、追加分量のHATU(3.3mg)及びNMM(0.9μL)を添加し、溶液を室温で1時間の間撹拌した。さらなる分量のHATU(3.3mg)及びNMM(0.9μL)を添加し、溶液を室温で1時間の間撹拌した。HATU(3.3mg)及びNMM(0.92μL)を再び添加し、溶液を室温で2時間の間撹拌した後に、反応溶液を真空中で濃縮し、残渣を、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬9を無色の油として得た(11mg)。m/z [M+Na]+ (2822、10%)、[M+H]+ (2800、20%)、[M+2H]2+ (1400、80%)、[M+3H]3+ (933、100%)。
DAR 4との抗体薬物コンジュゲート(ADC)14及び18(比較用)及び21及び22(比較用)をそれぞれ生成するための、ブレンツキシマブ及び抗PSMA抗体への試薬1及び17(比較用)のコンジュゲーション。
WO2014064423及びWO2014064424に記載されている方法に類似した方法を使用して、コンジュゲーション試薬1及び17をブレンツキシマブ又は抗PSMA抗体にコンジュゲートして、ADC 14、18、21及び22をそれぞれ生じさせた。簡潔には、20mMのリン酸ナトリウム、pH7.5(150mMのNaCl及び20mMのEDTAを含有する)中5.2mg/mLの濃度の抗体(ブレンツキシマブ又は抗PSMA抗体)を、40℃に加熱ブロック中で15分間加熱した。TCEP(1mAb当たり6当量)をmAb溶液に添加し、穏やかに混合し、40℃で1時間の間インキュベートした後に、22℃に冷却させておいた。コンジュゲーション試薬をMeCN又はDMF中に溶解させることで、3mMの溶液を得た。還元されたmAb溶液を4.2mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム、pH7.5(150mMのNaCl及び20mMのEDTAを含有する)で希釈した。コンジュゲーション試薬(1mAb当たり5.6当量)をmAb溶液に添加し、反応物を穏やかに混合し、22℃で22時間の間インキュベートした。この後、反応物を50mMのN-アセチル-L-システイン(試薬を20当量超える)にて22℃で1時間の間処理した。粗製のコンジュゲーション混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって分析した。粗製反応物を、50mMのリン酸ナトリウム、pH7(4MのNaCl)の等体積と混合し、結果として得られた溶液を、50mMのリン酸ナトリウム、pH7(2MのNaCl)で平衡化されたToyoPearl社 Phenyl-650S HICカラムにロードした。ADCをカラムから、50mMのリン酸ナトリウムの勾配、pH7(20%イソプロパノール)で溶出した。DAR 4 ADCを含有する画分をプールし、濃縮した(Vivaspin 20、10kDa PES膜)。濃縮試料をPBS、pH7.1～7.5へと緩衝液交換し、滅菌濾過した(0.22μmのPVDF膜)。DAR割り当ては、A248/A280吸収比に基づいた。コンジュゲートの平均DARを、280nmでのHIC分析に続いて個々のDAR種の相対的ピーク面積から算出した。
オーリスタチン細胞毒性ペイロード、MMAEを含むコンジュゲーション試薬15(比較用)の合成。
マレイミド官能グルーピングを含有するコンジュゲーション試薬15を、WO2015057699内に記載されている通りに合成した。
Figure 0007038663000078
オーリスタチン細胞毒性ペイロード、MMAEを含むコンジュゲーション試薬17(比較用)の合成。
Figure 0007038663000079
ステップ1:化合物19の合成。
Figure 0007038663000080
DMF(2mL)中のFmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(36mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却し、(ベンゾトリアゾル-1-イルオキシ)トリス-(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)(41mg)、NH2-PEG(24u)-OMe(100mg)及びDIPEA(19μL)を添加した。溶液を室温に加温させておき、22時間後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をジクロロメタン(1mL)中に溶解し、ジクロロメタン:メタノール(100:0 v/vから80:20 v/v)で溶出する順相カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去することで、Fmoc-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]を無色の油として得た(84mg)。ピペリジン(49μL)を、DMF(2mL)中の化合物Fmoc-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](74mg)の溶液に、アルゴン雰囲気下で添加し、結果として得られた溶液を室温で22時間の間撹拌し、この後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣をヘキサン(3×0.7mL)でトリチュレートした。有機溶媒を各回でデカンテーションし、結果として得られた残渣を真空中で乾燥させることで、化合物19を白色の固体として得た(61mg)。m/z [M+H]+ (1274、70%)、[M+2H]2+ (638、100%)。
ステップ2:試薬20の合成。
Figure 0007038663000081
アルゴン雰囲気下で0℃に冷却したDMF(550μL)中の試薬8(26.6mg)の溶液に、HATU(10.5mg)を添加し、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。これに、DMF(550μL)中の化合物19(32mg)の溶液を添加した。結果として得られた溶液を5分間0℃で撹拌した後に、NMM(2.9μL)及びHATU(10.5mg)を添加した。反応溶液を0℃で2時間の間撹拌させておいた後に、室温に加温し、更に3.5時間の間撹拌した。この時間の後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、水:アセトニトリル(1.2mL、1:1 v/v)中に溶解し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]を無色の油として得た(30.5mg)。1H NMR (400 MHz, MeOH-∂4) 8.19 (2H, d), 8.04 (2H, d), 4.83 - 4.71 (1H, m), 4.58 (1H, dd), 3.92 - 3.83 (6H, m), 3.78 - 3.56 (140H, m), 3.57-3.51 (6H, m), 3.40 (4H, dd), 3.36 (3H, s), 3.35 (6H, s), 2.41 (2H, t), 2.24 - 2.13 (1H, m), 2.10 - 1.98 (1H, m), 1.45 (9H, s). m/z [M+Na]+ (2243, 50%), [M+H]+ (2221, 40%), [M+Na+2H]3+ (747, 100%).ジクロロメタン(2mL)中のビス-mPEG(7u)スルホン-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](30mg)の溶液を、アルゴン雰囲気下で、0℃に冷却し、ここにトリフルオロ酢酸(500μL)を添加し、結果として得られた溶液を1.5時間の間撹拌した。反応混合物を室温に加温させておき、更に1時間の間撹拌した。この時間の後、揮発分を真空中で除去した。結果として得られた残渣を、水:アセトニトリル(0.6mL、1:1 v/v)中に溶解し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬20を無色の油として得た(20mg)。1H NMR (400 MHz, MeOH-∂4) 8.19 (2H, d), 8.04 (2H, d), 4.81 - 4.72 (1H, m), 4.59 (1H, dd), 3.92 - 3.84 (6H, m), 3.67 - 3.50 (146H, m), 3.40 (4H, dd), 3.36 (3H, s), 3.35 (6H, s), 2.48 (2H, t), 2.26 - 2.15 (1H, m), 2.15 - 2.03 (1H, m). m/z [M+2H]2+ (1083, 60%), [M+2H+Na]3+ (729, 100%).
ステップ3:コンジュゲーション試薬17の合成
DMF(500μL)中の化合物20(12.4mg)の溶液を0℃にアルゴン雰囲気下で冷却した。HATU(2.4mg)を添加し、溶液を0.5時間の間0℃で撹拌した。これに、室温で0.5時間の間撹拌しておいたDMF(500μL)中のVal-Cit-PAB-MMAE TFA塩(7.8mg)及びNMM(0.7μL)の溶液を添加した。5分後、追加量のHATU(1.2mg)及びNMM(0.4μL)を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。2時間後、追加量のHATU(1.2mg)及びNMM(0.4μL)を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。更に1時間後、反応溶液を真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬17を無色の油として得た。m/z [M+H]+ (3270、12%)、[M+2H]2+ (1636、50%)、[M+3H]3+ (1091、100%)。
DAR 8との抗体薬物コンジュゲート16(比較用)を生成するための、ブレンツキシマブへの試薬15(比較用)のコンジュゲーション。
WO2015057699、US7090843、Lyonら.、(2015) Nature Biotechnology、33(7) 733～736頁及びLyonら.、(2012)、Methods in Enzymology、502巻、123～137頁内に記載されている方法を使用して、コンジュゲーション試薬15をブレンツキシマブにコンジュゲートして、ADC 16を生じさせた。簡潔には、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5(150mMのNaCl、20mMのEDTA)中のブレンツキシマブを、TCEP(6当量)にて40℃で1時間の間還元した。遊離チオール当たり2.0モル当量の試薬15との還元抗体のコンジュゲーションを次いで行った。試薬15をmAbに添加することで、4mg/mLの最終抗体濃度を得た。溶液を穏やかに混合し、22℃で2時間の間インキュベートした。2時間後、追加の試薬15(0.2モル当量)を添加し、混合物を更に1時間の間22℃でインキュベートした。過剰の試薬15をN-アセチル-L-システイン(試薬を20当量超える)でクエンチし、50mMのリン酸ナトリウム、pH7(2MのNaCl)で平衡化された1mLのToyoPearl社 Phenyl-650S HICカラムを使用して粗製反応物を精製した。ADCをカラムから、50mMのリン酸ナトリウム、pH7(20%イソプロパノール)の勾配で溶出した。ADCを含有する画分をプールし、濃縮する(Vivaspin 20、10kDa PES膜)ことで、平均DAR 8生成物を得た。濃縮試料をDPBS、pH7.1～7.5へと緩衝液交換し、滅菌濾過した。
ADC 16は、反応生成物の不均一性(DAR変異体の数)により、精製及び特徴付けるのが困難であり、分取HICによる個々のDAR種の低い分解能に至った。結果は、最終の反応生成物が、DAR 8よりも大きい及びそれよりも少ないの両方であるDAR種の著しい分量を含有することを示した。DAR 8種よりも高い及びそれよりも低いこれらから完全にDAR 8種を精製することは、最終生成物においてDAR 8の著しく低い収率をもたらすことになる。
熱応力試験による抗体薬物コンジュゲート14及び16(比較用)の比較。
ADC試料14及び16をDPBS pH7.1～7.5での希釈によって0.5mg/mLで各々調製した。
2つのADC試料を65℃で30分間インキュベートし、続いて、氷浴中にて5分間インキュベーションした後に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。TOSOH Bioscience社TSKゲルSuper SW 3000カラムを使用して、SECを行った。280nmでのUV吸光度を、0.2Mのリン酸カリウム緩衝液、pH6.8(0.2M塩化カリウム及び15%イソプロパノール)を用いる均一溶媒溶出中にモニタリングした。
下記のTable 1a(表1)及び1b(表2)は、SECに続いてAbs 280nmによる各ピークの曲線下面積によって測定される場合の、熱応力試験の前後のADC 14及び16の立体配座を示している。
Table 1a(表1)及び1b(表2)における結果は、ADC 14が依然として、熱応力試験に続いてADC 16よりもずっと大きい程度に非凝集状態であることを示している。加えて、結果は、16がコンジュゲート14よりも大きい程度に、より軽い分子量成分に解離することも示している。
Figure 0007038663000082
Figure 0007038663000083
ヒト血清内のインキュベーションに続くADC 14及び16(比較用)の平均DARの比較。
ADC 14及び16をヒト血清中0.1mg/mL、88%(v/v)血清含有量に希釈した。各溶液を直ちに、4×0.5mLの低結合エッペンドルフチューブにサブアリコートした。「0」時点に対応するエッペンドルフチューブの2つを直ちに-80℃の冷凍庫に移し、一方、残りの試料を37℃で6日間インキュベートした。6日後、試料を冷凍庫及び/又はインキュベーターから除去し、コンジュゲートを親和性捕捉(CD30コーティング磁気ビーズ)によって精製し、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用して分析した。平均DAR決定のためのCD30親和性捕捉及びHICを、以下に記載されている通りに実施した:
平均DAR決定のためのCD30親和性捕捉。ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ(Dynabeads-Streptavidin T1、Life Technologies社)を使用して、親和性捕捉を行った。CD30(組換えヒトCD30、Sino Biological Inc.社)をビオチン化し、ストレプトアビジン-ビオチン結合を介してビーズ上に固定化し、最終的に、脱脂乳ペプチドを使用してブロッキングした。PBS中の血漿試料500μLをCD30コーティングビーズに添加し、終夜4℃でインキュベートし、最終的に、PBSを使用して洗浄した。酸性溶出緩衝液を使用して5分間4℃で、捕捉抗体を溶出した。溶出物を引き続いて、酢酸ナトリウム緩衝液、pH8を使用してpH7に中和した。溶出試料をHICローディング緩衝液と更に混合し、UV検出(HIC-UV)とともに疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して分析した。
平均DAR決定のための疎水性相互作用クロマトグラフィー。疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して親和性捕捉ADCを分析することで、平均薬物対抗体比(DAR)を決定した。該方法は、280nmでの検出でTOSOH社TSK ゲル Butyl-NPR HIC分離カラムを使用して30分で100%緩衝液A(50mMのリン酸ナトリウムpH7.0、1.5Mの硫酸アンモニウム)から100%緩衝液B(50mMのリン酸ナトリウムpH7.0、20%イソプロパノール)の直線勾配からなっていた。
図1は、試料の平均DAR値の低減によって示されている通り、ヒト血清中37℃で6日後、コンジュゲート16は、それの細胞毒性ペイロードの多くを失っているが、コンジュゲート14は、依然として大きく変化はしていないことを示している。これは、本発明のコンジュゲートが、改善された安定性を有することを示している。
インビトロ細胞生存能アッセイによる、DAR 4 ADC 14及び18(比較用)並びに21及び22(比較用)の分析。
インビトロにおける細胞毒性薬での処置に続く腫瘍細胞生存能の喪失は、薬物の増加する濃度の存在下で細胞株を成長させること、及びCell-Titer Glo(登録商標)発光試薬(Promega社)を使用して増殖又は代謝活性の喪失を定量化することによって測定することができる。細胞株を過剰発現しているPSMA及びCD30についてのプロトコールは、ウェル中に存在する細胞の数に直接相関するATP合成に基づく未処置細胞を参照して、細胞播種、薬物処置、及び細胞生存能の決定を記載する。
Table 2(表3)にリストされている細胞株を供給元の推奨に従って維持した。
Figure 0007038663000084
結合性のPSMA陽性のLNCaP細胞及びC4-2細胞をTrypLEで剥離し、完全培地中に再懸濁した。使い捨てのNeubauerカウントチャンバーを使用して細胞をカウントし、細胞密度をLNCaPについては10×104細胞/mL及びC4-2については2×104細胞/mLにそれぞれ調整した。細胞をポリ-D-リジンコーティング不透明壁面の96ウェル白色プレート中に播種(100μL/ウェル)し、24時間の間37℃及び5% CO2でインキュベートした。
ヒトT細胞リンパ腫Karpas 299細胞をカウントし、完全成長培地中5×104細胞/mLの細胞密度に調整した。細胞を不透明壁面の96ウェルプレートに播種(50μL/ウェル)し、24時間の間37℃及び5% CO2でインキュベートした。
各化合物の8点系列希釈を関連培養培地中で調製した。細胞を該化合物で処置し、濃度範囲はTable 3(表4)に特定されている。
Figure 0007038663000085
結合性のLNCaP細胞又はC4-2細胞を含有するプレートからの培地を除去し、1X系列希釈化合物100μL/ウェルに置き換えた。Karpas-299細胞を2X系列希釈化合物50μL/ウェルの添加によって処置した。細胞を次いで37℃及び5% CO2で更に96時間の間インキュベートした。
細胞生存能アッセイを、製造者の指示によって記載されている通りにCell-Titer Glo(登録商標)発光試薬を使用して、実施した(Promega Corp.社Technical Bulletin TB288; Lewis Phillips G.D、Cancer Res 2008; 68:9280～9290頁)。
Molecular Devices社Spectramax i3xプレートリーダーを使用して発光を記録し、GraphPad社Prism 4パラメータ非線形回帰モデルを使用してデータを引き続き分析した。
生存能を未処置細胞の%として表し、以下の式を使用して算出した:
Figure 0007038663000086
%生存能をnMの薬物濃度の対数に対してプロットして、IC50値を外挿した。薬物コンジュゲートの抗増殖効果を示すIC50値は、Table 4(表5)に要約されている。これらは、本発明のコンジュゲートが、改善された効力を有することを示している。
Figure 0007038663000087
オーリスタチン細胞毒性ペイロード、MMAEを含むコンジュゲーション試薬23(比較用)の合成。
Figure 0007038663000088
ステップ1:試薬24の合成。
Figure 0007038663000089
4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(1.0g)の溶液を、無水THF(10mL)中のN-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(306mg)に、窒素雰囲気下で添加した。結果として得られた溶液を0℃に冷却し、ジイソプロピルカルボジイミド(310μL)を滴下により添加した。反応混合物を20分間0℃で撹拌した後に、室温に加温した。追加の無水THF(10mL)を反応混合物に1時間後に添加した。18時間後、形成された沈殿物を濾過し、冷THF(2×5mL)で洗浄した後に、真空中で乾燥させた。固体をMeOH(10mL)とともに1時間の間室温で撹拌し、濾過によって回収し、MeOH(2×5mL)及びEt2O(5mL)で逐次に洗浄した。固体を次いで真空中で乾燥させることで、化合物24を白色の固体として得た(1.1g)。m/z [M+H]+ (618、100%)。
ステップ2:試薬25の合成。
Figure 0007038663000090
無水DMF(20mL)中のL-グルタミン酸5-tert-ブチルエステル(198mg)の撹拌懸濁液に、窒素雰囲気下で、NMM(107μL)を添加した。反応混合物を0℃に冷却した後に、試薬24(603mg)を添加した。結果として得られた懸濁液を0℃で1時間の間撹拌し、この後、反応混合物を室温に加温させておいた。19時間後、結果として得られた溶液を真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬25を白色の固体として得た(198mg)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.98 (1H, d), 7.86 (2H), 7.71 - 7.65 (6H, m), 7.36 (4H, d), 4.68 (1H, ddd), 4.34 (1H, q), 3.62 (2H, ddd), 3.50 (2H, ddd), 2.69 (1H ddd), 2.55 - 2.45 (1H, m), 2.48 (6H, s), 2.34-2.16 (2H, m), 1.46 (9H, s); m/z [2M+H]+ (1371,74%), [2M+H-tBu]+ (1315, 70%), [M+H-tBu]+ (630, 100%).
ステップ3:試薬26の合成。
Figure 0007038663000091
試薬25(50mg)及びBOP(40mg)を無水DMF(3mL)中に溶解させ、0℃に冷却し、無水DMF(2mL)中のNH2-PEG(24u)-OMe(99mg)及びNMM(10μL)の溶液に添加した。反応混合物を0℃で撹拌し、4時間後、追加量のBOP(10mg)及びNMM(2.5μL)を反応混合物に添加し、これを更に15分間撹拌した後に、-20℃で18時間の間貯蔵した。反応混合物を次いで真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.1%ギ酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.1%ギ酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-トリルスルホニル-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]を無色の油として得た(128mg)。m/z [M+H]+ (1757、100%)、[M+2H]2+ (879、100%)。ビス-トリルスルホニル-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](126.5mg)をギ酸(2.5mL)中に溶解し、窒素雰囲気下にて室温で撹拌した。20時間後、反応混合物を真空中で濃縮し、高真空下で18時間の間乾燥させることで、試薬26を無色の油として得た(122mg、想定される定量的収量)。m/z [M+Na]+ (1723、15%)、[M+H]+ (1700、100%)。
ステップ4:試薬23の合成。
無水DMF(1mL)中の試薬26(13mg)、HATU(4.1mg)及びVal-Cit-PAB-MMAE.TFA塩(9mg)の溶液を、アルゴン雰囲気下で、0℃に冷却した。これにNMM(2μL)を添加した。1時間後、追加量のHATU(4.1mg)及びNMM(2μL)を添加し、更に1.5時間後、溶液を-20℃で72時間の間貯蔵した。反応溶液を真空中で濃縮し、アセトニトリル(1ml)中に溶解させ、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬23を濃い清澄な無色の油として得た(11.4mg)。m/z [M+H]+ (2805、20%)、[M+2H]2+ (1403、75%)、[M+3H]3+ (936、100%)。
オーリスタチン細胞毒性ペイロード、MMAEを含むコンジュゲーション試薬27(比較用)の合成。
Figure 0007038663000092
ステップ1:化合物28の合成。
Figure 0007038663000093
エタノール(2.5mL)中のNH2-PEG(7u)-OMe(300mg)の溶液に、tert-ブチルアクリレート(194μL)を添加し、反応混合物を室温で72時間の間撹拌した。溶液を真空中で濃縮し、ジクロロメタン:メタノール(100:0 v/vから70:30 v/v)で溶出する順相クロマトグラフィーによって精製した。溶媒を真空中で除去することで、化合物28を淡黄色の油として得た(324mg)。m/z [M+H]+ (468、100%)。
ステップ2:試薬29の合成。
Figure 0007038663000094
無水DMF(2.5mL)中の4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(257mg)の溶液に、0℃で、HATU(204mg)を添加し、反応混合物を0℃で10分間撹拌した。NMM(57μL)を添加し、反応溶液を更に20分間0℃で撹拌した。追加のHATU(102mg)及びNMM(29μL)を添加し、溶液を室温に加温し、30分間、放置撹拌させておいた。この時間の後、無水DMF(2.5mL)中の化合物28(200mg)の溶液を添加した。反応混合物を5時間の間撹拌した。溶液を次いで真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬29を無色の固体として得た(173mg)。m/z [M+Na]+ (973、40%) [M+H]+ (951、100%)、[M+H-tBu]+ (895、90%)。
ステップ3:試薬30の合成。
Figure 0007038663000095
ジクロロメタン(1.6mL)中の試薬29(160mg)の溶液に、0℃で、トリフルオロ酢酸(0.5mL)を添加し、溶液を0℃で1時間の間撹拌し、次いで4℃で16時間の間貯蔵した。揮発分を次いで真空中で除去し、残渣をアセトニトリル(1mL)中に溶解し、緩衝水溶液(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(5mL)で希釈した。溶媒を次いで凍結乾燥によって除去することで、試薬30を琥珀色の油として得た(定量的収量)。m/z [M+Na]+ (916、50%)、[M+H]+ (894、100%)。
ステップ4:試薬27の合成。
無水DMF(0.6mL)中の試薬30(15mg)の溶液に、0℃で、HATU(7.3mg)を添加し、反応混合物を0℃で20分間撹拌した。NMM(2μL)を添加し、溶液を更に20分間0℃で撹拌した。追加のHATU(7.3mg)及びNMM(2μL)を次いで添加し、溶液を室温に加温し、30分間撹拌した。事前に室温で10分間撹拌しておいた、無水DMF(0.6mL)中のVal-Cit-PAB-MMAE.TFA塩(21.8mg)及びNMM(2μL)の別の溶液を、次いで反応溶液に添加した。室温で3時間の間撹拌した後、反応溶液を真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬27を白色の固体として得た(23.7mg)。m/z [M+H]+ (2000、10%)、[M+2H]2+ (1000、100%)。
DAR 4との抗体薬物コンジュゲート(ADC)31及び32(比較用)をそれぞれ生成するための、ブレンツキシマブへの試薬9及び27(比較用)のコンジュゲーション。
実施例3に記載されている方法に類似した方法を使用して、コンジュゲーション試薬9及び27(比較用)をブレンツキシマブにコンジュゲートして、ADC 31及び32(比較用)をそれぞれ生じさせた。簡潔には、ブレンツキシマブ(20mMのリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5中5.0mg/mL)を、40℃に加熱ブロック中で15分間加熱した。TCEP(1mAb当たり6当量)をmAb溶液に添加し、穏やかに混合し、40℃で1時間の間インキュベートした後に、22℃に冷却させておいた。コンジュゲーション試薬9をアセトニトリル中に溶解し、コンジュゲーション試薬27をDMF中に溶解することで、3mM及び1.6mMのストック溶液をそれぞれ得た。還元mAb溶液をおよそ4.3mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で希釈した。コンジュゲーション試薬(1mAb当たり5.6当量から6.0当量)を還元mAb溶液に添加することで、4mg/mLの最終抗体濃度を得た。反応溶液を穏やかに混合し、22℃で16時間から24時間の間インキュベートした。この時間の後、各反応溶液を50mMのN-アセチル-L-システイン(試薬を20当量超える)にて22℃で1時間の間処理した。各粗製コンジュゲーション混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって分析した。粗製反応物を50mMのリン酸ナトリウム、4MのNaCl、pH7の等体積と混合し、結果として得られた溶液を、50mMのリン酸ナトリウム、2MのNaCl、pH7で平衡化されたToyoPearl社 Phenyl-650S HICカラムにロードした。ADCをカラムから、50mMのリン酸ナトリウム、pH7(20%イソプロパノール)の勾配で溶出した。DAR 4 ADCを含有する画分をプールし、濃縮(Vivaspin 20、10kDa PES膜)した。濃縮試料をPBS、pH7.1～7.5へと緩衝液交換し、滅菌濾過(0.22μmのPVDF膜)した。
デュオカルマイシン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬33の合成。
Figure 0007038663000096
ステップ1:化合物34の合成。
Figure 0007038663000097
無水DMF(500μL)中のFmoc-Glu(OtBu)-OH(78mg)の溶液に、0℃で、HATU(108mg)及びNMM(34μL)を添加し、混合物を0℃で10分間撹拌した。これに、無水DMF(500μL)中の化合物4(44mg)の溶液を添加し、混合物を0℃でアルゴン雰囲気下にて15分間撹拌した。反応混合物を次いで真空中で濃縮し、残渣を無水DMF(500μL)中に中に溶解させた。ピペリジン(70μL)を添加し、溶液を90分間室温で撹拌した。反応溶液を真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、化合物34オレンジ色の油として得た(44mg)。m/z [M+H]+ (537、45%)。
ステップ2:試薬35の合成。
Figure 0007038663000098
無水DMF(500μL)中の4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]安息香酸(37.5mg)の溶液に、0℃で、HATU(65mg)及びNMM(20μL)を添加し、混合物を0℃で10分間撹拌した。これに、無水DMF(500μL)中の化合物34(44.3mg)の溶液を添加し、混合物を0℃でアルゴン雰囲気下にて1時間の間撹拌した。反応混合物を次いで真空中で濃縮し、残渣をDMF(1mL)中に溶解させ、緩衝液A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(60:40 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、ビス-トリルスルホニル-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-(OtBu)-アザ-24-クラウン-8を白色の固体として得た(28.5mg)。m/z [M+Na]+ (1041、20%)、[M+H]+ (1019、5%)。無水ジクロロメタン(1mL)中のビス-トリルスルホニル-プロパノイル-ベンズアミド-L-Glu-(OtBu)-アザ-24-クラウン-8(26.5mg)の溶液に、トリフルオロ酢酸(500μL)を添加し、溶液を室温でアルゴン雰囲気下にて1時間の間撹拌した。揮発分を真空中で除去することで、試薬35を白色の固体として得た(想定された定量的収量)。m/z [M+Na]+ (985、35%)、[M+H]+ (963、30%)。
ステップ3:化合物36の合成。
Figure 0007038663000099
無水ジクロロメタン(2mL)中のBoc-Val-Cit-PAB-デュオカルマイシン(Abzena社、TCRS、17mg)の懸濁液に、0℃で、トリフルオロ酢酸(1mL)を添加し、結果として得られた溶液を0℃で75分間撹拌した。揮発分を次いで真空中で除去することで、化合物36を黄色の固体として得た(想定された定量的収量)。m/z [M+H]+ (798、100%)。
ステップ3:試薬33の合成。
無水DMF(500μL)中の試薬35(13.4mg)の溶液に、0℃で、HATU(13.2mg)及びNMM(4μL)を添加し、混合物を0℃で10分間撹拌した。これに、無水DMF(500μL)中の化合物36(12.7mg)の溶液を添加し、混合物を0℃でアルゴン雰囲気下にて20分間撹拌した。追加分量のHATU(7.9mg)及びNMM(2.6μL)を添加し、反応混合物を更に80分間撹拌した。溶液を次いで真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬33を黄色の固体として得た(5.1mg)。m/z [M+Na]+ (1766、60%)、[M+H]+ (1744、70%)、[M+Na+H]2+ (884、90%)、[M+2H]2+ (872、100%)。
デュオカルマイシン細胞毒性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬37(比較用)の合成。
Figure 0007038663000100
無水DMF(500μL)中の試薬30(14.1mg)の溶液に、0℃で、HATU(24mg)及びNMM(7.6μL)を添加し、混合物を0℃で5分間撹拌した。これに、無水DMF(500μL)中の化合物36(14.4mg)の溶液を添加し、混合物を0℃でアルゴン雰囲気下にて40分間撹拌した。溶液を次いで真空中で濃縮し、残渣を水:アセトニトリル(3:7v/v、1mL)中に溶解させ、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬37を黄色の固体として得た(8.9mg)。m/z [M+Na]+ (1696、10%)、[M+H]+ (1675、50%)、[M+Na+H]2+ (848、40%)、[M+2H]2+ (838、85%)。
DAR 4との抗体薬物コンジュゲート(ADC)38及び39(比較用)をそれぞれ生成するための、ブレンツキシマブへの試薬33及び37(比較用)のコンジュゲーション。
実施例3に記載されている方法に類似した方法を使用して、コンジュゲーション試薬33及び37(比較用)をブレンツキシマブにコンジュゲートして、ADC 38及び39(比較用)をそれぞれ生じさせた。簡潔には、ブレンツキシマブ(20mMのリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5中8.5mg/mL)を40℃に加熱ブロック中で15分間加熱した。TCEP(1mAb当たり6当量)をmAb溶液に添加し、穏やかに混合し、40℃で1時間の間インキュベートした後に、22℃に冷却させておいた。コンジュゲーション試薬をプロピレングリコール中に溶解させることで、0.3mMの溶液を得た。コンジュゲーション試薬(1mAb当たり5.6当量)を次いでmAb溶液に添加し、反応物を穏やかに混合し、22℃で42時間から78時間の間インキュベートし、この時間中に、追加の試薬(1mAb当たり最大1.2当量まで)を、必要な場合に反応物に添加した。粗製反応溶液を次いで、50mMのリン酸ナトリウム、4MのNaCl、pH7の等体積、及び50mMのリン酸ナトリウム、2MのNaCl、pH7の粗反応混合物の5倍の体積と混合した。結果として得られた溶液を、50mMのリン酸ナトリウム、2MのNaCl、pH7で平衡化されたToyoPearl社 Phenyl-650S HICカラムにロードした。ADCをカラムから、50mMのリン酸ナトリウム、pH7(20%イソプロパノール)の勾配で溶出した。DAR 4 ADCを含有する画分をプールし、濃縮(Vivaspin 20、30kDa PES膜)した後に、PBS、pH7.1～7.5へと緩衝液交換し、滅菌濾過(0.22μmのPVDF膜)した。Superdex 200pg SECカラムを使用し、PBS、pH7.1～7.5(10又は20%イソプロパノール)を用いる均一溶媒溶出によって、試料を更に精製した。DAR 4 ADCを含有する画分をプールし、濃縮(Vivaspin 20、30kDa PES膜)した後に、PBS、pH7.1～7.5へと緩衝液交換し、滅菌濾過(0.22μmのPVDF膜)した。
オーリスタチン細胞毒性ペイロード、MMAEを含むコンジュゲーション試薬40の合成。
Figure 0007038663000101
ステップ1:化合物41の合成。
Figure 0007038663000102
無水DMF(8mL)中のFmoc-Glu(OtBu)-OH(469mg)の溶液に、0℃で、HATU(419mg)を添加し混合物を0℃で20分間撹拌した。NMM(121μL)を次いで添加し、溶液を0℃で更に15分間撹拌した。無水DMF(2mL)中の2-アミノメチル-15-クラウン-5(250mg)の別の溶液に、NMM(121μL)を添加し、溶液を0℃で20分間撹拌した。2つの溶液を次いで合わせ、追加分量のHATU(419mg)及びNMM(121μL)を添加し、混合物を室温で3時間の間撹拌した。反応溶液を次いで、真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(95:5 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、Fmoc-L-Glu(OtBu)-アミドメチル-15-クラウン-5を白色の固体として得た(440mg)。m/z [M+Na]+ (679、25%)、[M+H]+ (657、30%)、[M+H-tBu]+ (601、100%)。ジクロロメタン(20mL)中のFmoc-L-Glu(OtBu)-アミドメチル-15-クラウン-5(440mg)の溶液に、ピペリジン(463μL)を添加し、溶液を室温で3.5時間の間撹拌した。追加のピペリジン(198μL)を添加し、混合物を室温で更に1.5時間の間撹拌した。反応混合物を次いで真空中で濃縮し、残渣をアセトニトリル(4mL)中に懸濁した。アセトニトリル混合物をヘキサン(50mL)で抽出した後に、アセトニトリル層を真空中で還元することで、油性残渣を得た。残渣を次いで、緩衝液A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(95:5 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬41を得た。m/z [M+Na]+ (457、10%)、[M+H]+ (435、100%)、[M+H-tBu]+ (379、30%)。
ステップ2:試薬42の合成。
Figure 0007038663000103
無水DMF(2mL)中の化合物24(82mg)の溶液に、化合物41(50mg)及びNMM(12.7μL)を添加し、混合物を室温でアルゴン雰囲気下にて2時間の間撹拌した。反応溶液を次いで真空中で濃縮し、残渣をアセトニトリル(500μL)中に溶解させ、緩衝液A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル: 0.05%トリフルオロ酢酸(70:30 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬42を白色の固体として得た(37.4mg)。m/z [M+Na]+ (939、80%)、[M+H]+ (917、100%)、[M+H-tBu]+ (861、50%)。
ステップ3:試薬43の合成。
Figure 0007038663000104
無水ジクロロメタン(2mL)中の試薬42(36mg)の溶液に、トリフルオロ酢酸(1mL)を添加した。溶液を室温で80分間撹拌した後に、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣を次いで、アセトニトリル:水(1:2 v/v、1.5mL)中に溶解させ、溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬43を白色の固体として得た(想定された定量的収量)。m/z [M+Na]+ (883、75%)、[M+H]+ (861、100%)。
ステップ4:試薬40の合成。
無水DMF(300μL)中の試薬43(5.6mg)の溶液に、0℃で、HATU(2.4mg)を添加し、混合物を0℃で20分間撹拌した。NMM(1μL)を添加し、溶液を0℃で更に10分間撹拌した。無水DMF(300μL)中のVal-Cit-PAB-MMAE.TFA塩(6.6mg)の別の溶液に、0℃で、NMM(1μL)を添加し、溶液を0℃で30分間撹拌した。2つの溶液を次いで合わせ、追加分量のHATU(2.4mg)及びNMM(1μL)を添加し、混合物を撹拌下で3.25時間の間、室温に加温させておいた。反応溶液を次いで真空中で濃縮し、残渣をアセトニトリル:DMSO(6:1 v:v、350μL)中に溶解させ、緩衝液A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(70:30 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬40を白色の固体として得た(7mg)。m/z [M+Na]+ (1989、20%)、[M+H]+ (1967、30%)、[M+2Na]2+ (1006、30%)、[M+H+Na]2+ (995、90%)、[M+2H]2+ (984、100%)。
オーリスタチン細胞毒性ペイロード、MMAEを含むコンジュゲーション試薬44の合成。
Figure 0007038663000105
ステップ1:化合物45の合成。
Figure 0007038663000106
無水DMF(8mL)中のFmoc-Glu(OtBu)-OH(216mg)の溶液に、0℃で、HATU(193mg)を添加し、混合物を0℃で20分間撹拌した。NMM(56μL)を添加し、溶液を室温で更に15分間撹拌した。無水DMF(2mL)中の化合物12(284mg)の別の溶液に、NMM(56μL)添加し、溶液を0℃で20分間撹拌した。2つの溶液を次いで合わせ、追加分量のHATU(192mg)及びNMM(56μL)を添加し、混合物を3.5時間の間室温で撹拌した。反応溶液を次いで真空中で濃縮した後に、残渣を酢酸エチル(50mL)中に溶解した。溶液を次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液(2×10mL)で、続いて飽和ブライン溶液(10mL)で洗浄した。有機相を次いで真空中で濃縮することで、粗製Fmoc-L-Glu(OtBu)-アザ-42-クラウン-14を得た。m/z [M+Na]+ (1046、20%)、[M+H]+ (1023、100%)。DMF(7mL)中の粗製Fmoc-L-Glu(OtBu)-アザ-42-クラウン-14の溶液に、ピペリジン(320μL)を添加し、溶液を室温で2時間の間撹拌した。反応混合物を次いで真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(95:5 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去した。固体残渣を次いでヘキサン(3×10mL)でトリチュレートし、固体を濾過によって単離し、次いで真空中で乾燥させることで、化合物45をオフホワイトの固体として得た(201mg)。m/z [M+H]+ (801、100%)。
ステップ2:試薬46の合成。
Figure 0007038663000107
無水ジクロロメタン(3mL)中の化合物45(86mg)の溶液に、N-スクシンイミジル6-マレイミドヘキサノエート(47mg)を添加し、溶液を室温で撹拌した。DIPEA(3×19μL)を反応溶液に17.5時間後、22.5時間後及び24時間後に添加した。溶液を次いで、更に18時間の間室温で撹拌した後に、反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をアセトニトリル:DMSO(2:1 v/v)中に溶解させ、緩衝液A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(90:10 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬46を白色の固体として得た(38mg)。m/z [M+Na]+ (1016、30%)、[M+H]+ (994、20%)。
ステップ3:試薬47の合成。
Figure 0007038663000108
無水ジクロロメタン(1.4mL)中の試薬46(32mg)の溶液に、トリフルオロ酢酸(375μL)を添加し、溶液を室温で2.5時間の間撹拌した。追加のトリフルオロ酢酸(375μL)を次いで添加し、溶液を室温で更に2時間の間撹拌した後に、溶液を真空中で濃縮し、残渣を高真空下で18時間の間乾燥させた。残渣を次いで水(1mL)中に溶解させ、溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬47を無色の固体として得た(想定された定量的収量)。m/z [M+Na]+ (960、20%)、[M+H]+ (938、20%)。
ステップ4:試薬44の合成。
無水DMF(750μL)中の試薬47(33.3mg)の溶液に、0℃で、HATU(14.8mg)を添加し、混合物を0℃で20分間撹拌した。NMM(4.3μL)を添加し、溶液を0℃で更に15分間撹拌した。無水DMF(500μL)中のVal-Cit-PAB-MMAE.TFA塩(45.7mg)の別の溶液に、0℃で、NMM(4.3μL)を添加し、溶液を0℃で25分間撹拌した。2つの溶液を次いで合わせ、追加分量のHATU(14.8mg)及びNMM(4.3μL)を添加し、混合物を室温に撹拌下で3.5時間の間加温させておいた。溶液を次いで真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル: 0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬44を白色の固体として得た(48.3mg)。m/z [M+Na]+ (2066、20%)、[M+H]+ (2044、25%)、[M+H+Na]2+ (1033、50%)、[M+2H]2+ (1022、100%)。
オーリスタチン細胞毒性ペイロード、MMAEを含むコンジュゲーション試薬48の合成。
Figure 0007038663000109
無水DMF(500μL)中の化合物13(21.8mg)の撹拌溶液に、NMM(7.8μL)を添加した。この溶液を次いで滴下により20分の期間をかけて、無水DMF(1.5mL)中のスベリン酸ビス(N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)(43.8mg)の撹拌溶液に、室温でアルゴン雰囲気下にて添加した。反応混合物を次いで室温で20時間の間撹拌した後に、溶液を真空中で濃縮し、緩衝液A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(90:10 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬48を白色の固体として得た(15.2mg)。m/z [M+Na]+ (2126、10%)、[M+H]+ (2104、20%)、[M+2Na]2+ (1074、50%)、[M+Na+H]2+ (1063、50%) [M+2H]2+ (1052、100%)。
DAR 4.6との抗体薬物コンジュゲート(ADC)49を生成するための、ブレンツキシマブへの試薬44のコンジュゲーション。
実施例6内に記載されているに類似した方法を使用して、コンジュゲーション試薬44をブレンツキシマブにコンジュゲートして、ADC 49を生じさせた。簡潔には、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5中のブレンツキシマブを、TCEP(1mAb当たり2当量)にて40℃で1時間の間還元した。試薬44(1mAb当たり6当量)との還元抗体のコンジュゲーションを次いで行った。試薬44をアセトニトリル中に溶解することで、4.8mMのストック溶液を得た。還元mAb溶液を4.2mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5で希釈した。試薬44及び追加のアセトニトリルをmAb溶液に添加することで、4mg/mLの最終抗体濃度を得た。溶液を穏やかに混合し、22℃で1時間の間インキュベートした。過剰の試薬44をN-アセチル-L-システイン(試薬を20当量超える)でクエンチし、10mMのリン酸ナトリウム、pH6.7で平衡化されたヒドロキシアパタイトカラムを使用して粗反応混合物を精製した。ADCをカラムから、10mMのリン酸ナトリウム、2MのNaCl、pH6.7の勾配で溶出した。ADCを含有する画分をプールし、濃縮(Vivaspin 20、30kDa PES膜)し、濃縮試料をDPBS、pH7.1～7.5へと緩衝液交換し、滅菌濾過した。実施例3に記載されている方法を使用して、4.6の平均DARをコンジュゲートに割り当てた。
抗体薬物コンジュゲート(ADC) 50を生成するための、ブレンツキシマブへの試薬48のコンジュゲーション。
コンジュゲーション試薬48をブレンツキシマブにコンジュゲートして、ADC 50を生じさせた。簡潔には、試薬48をDMF中に溶解することで、5.3mMのストック溶液を得た。ブレンツキシマブ溶液(20mMのリン酸ナトリウム緩衝液、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5中の4.4mg/mL)に、試薬48(1mAb当たり10当量)及び追加のDMFを添加することで、4mg/mLの最終抗体濃度を得た。溶液を穏やかに混合し、22℃で1時間の間インキュベートした。10mMのリン酸ナトリウム、pH6.7で平衡化されたヒドロキシアパタイトカラムを使用して、粗製反応溶液を精製した。ADCをカラムから、10mMのリン酸ナトリウム、2MのNaCl、pH6.7の勾配で溶出した。ADCを含有する画分をプールし、濃縮(Vivaspin 20、30kDa PES膜)し、濃縮試料をDPBS、pH7.1～7.5へと緩衝液交換し、滅菌濾過した。コンジュゲートについて4.1の平均DARを、質量分光分析法に続く個々DAR種の相対的ピーク強度から算出した。
DAR 4との抗体薬物コンジュゲート(ADC)51を生成するための、ブレンツキシマブへの試薬40のコンジュゲーション。
実施例3に記載されている方法に類似した方法を使用して、コンジュゲーション試薬40をブレンツキシマブにコンジュゲートして、ADC 51を生じさせた。簡潔には、ブレンツキシマブ(20mMのリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、20mMのEDTA、pH7.5中5.2mg/mL)を40℃に加熱ブロック中で15分間加熱した。TCEP(1mAb当たり6当量)をmAb溶液に添加し、穏やかに混合し、40℃で1時間の間インキュベートした後に、22℃に冷却させておいた。コンジュゲーション試薬40をDMF中に溶解することで、1.5mMの溶液を得た。試薬40(1mAb当たり5.6当量)をmAb溶液に添加し、反応物を穏やかに混合し、22℃で16時間の間インキュベートした。粗反応混合物を、50mMのリン酸ナトリウム、4MのNaCl、pH7の緩衝液の等体積と混合し、結果として得られた溶液を、50mMのリン酸ナトリウム、2MのNaCl、pH7で平衡化されたToyoPearl社 Phenyl-650S HICカラムにロードした。ADCをカラムから、50mMのリン酸ナトリウム、pH7(20%イソプロパノール)の勾配で溶出した。DAR 4 ADCを含有する画分をプールし、濃縮(Vivaspin 20、30kDa PES膜)した後に、濃縮試料をPBS、pH7.1～7.5へと緩衝液交換し、滅菌濾過した(0.22μmのPVDF膜)。
インビトロ細胞生存能アッセイによるADC 31の分析。
ペイロードMMAEを含有するブレンツキシマブコンジュゲート31を、実施例12内に記載されている通りに調製した。Karpas-299細胞を使用する細胞生存能アッセイを、実施例9内に記載されている通りに行った。使用された濃度範囲は、Table 5(表6)に記載されている。得られたIC50値は、Table 6(表7)にリストされている。
Figure 0007038663000110
Figure 0007038663000111
コンジュゲート31について得られたIC50値は、本発明のADCがインビトロにおいて強力な細胞死滅特性を有することを示している。
インビトロ細胞生存能アッセイによるADC 38の分析。
デュオカルマイシンペイロードを含有するブレンツキシマブコンジュゲート38を、実施例15内に記載されている通りに調製した。Karpas-299細胞を使用する細胞生存能アッセイを、実施例9内に記載されている通りに行った。コンジュゲートのために使用された濃度範囲は50nM～0.6pMであり、得られたIC50値は0.14nMであった。
コンジュゲート38について得られたIC50値は、本発明のADCがインビトロにおいて強力な細胞死滅特性を有することを示している。
インビトロ細胞生存能アッセイによるADC 49、50及び51の分析。
ペイロードMMAEを含有するブレンツキシマブコンジュゲート49、50及び51を、実施例19、20及び21内に記載されている通りにそれぞれ調製した。Karpas-299細胞を使用する細胞生存能アッセイを、実施例9内に記載されている通りに行った。各コンジュゲートのために使用された濃度範囲は、Table 7(表8)に記載されている。各コンジュゲートについて得られたIC50値は、Table 8(表9)にリストされている。
Figure 0007038663000112
Figure 0007038663000113
得られたIC50値は、本発明のADCがインビトロにおいて強力な細胞死滅特性を有していることを示している。
ブレンツキシマブ-薬物コンジュゲート14、31、32(比較用)及びAdcetris(登録商標)(比較用)を比較するKarpas-299マウス異種移植片研究。
18.1gの平均体重を有する健康な雌性CB17-SCIDマウス(CBySmn.CB17-Prkdcscid/J、Charles River Laboratories社)を細胞接種(0日目)のために使用した。腫瘍細胞注射より24時間から72時間前に、マウスにγ-照射(1.44Gy、60Co)した。動物をSPF健康状態にFELASAガイドラインに従って住居室に制御環境条件下で維持した。
右側腹部への、200μLのRPMI 1640中の107 Karpas-299細胞(T未分化大細胞リンパ腫、ALCL)の皮下注射によって、腫瘍を誘発した。腫瘍をノギスで週2回測定し、式:
Figure 0007038663000114
を使用して体積を概算した。
腫瘍移植の12日後(12日目)、Vivo manager(登録商標)ソフトウェアを使用して、動物を8匹のマウス群にランダム化し(211mm3の平均腫瘍体積)、処置を開始した。ビヒクル群からの動物は、PBSの単一の静脈内(i.v.)注射を受けた。処置群に、0.8mg/kgでADCの単一のi.v.注射、又は1mg/kgでAdcetris(登録商標)(ブレンツキシマブベドチン)を投薬した。
隔週の体重測定及び処置関連副作用の臨床的兆候についての毎日の観察によって、処置耐容性を判定した。人道的エンドポイントに達した時(例えば、1,600mm3の腫瘍体積)又は投薬後の最大9週後、マウスを安楽死させた。グラフ内のアスタリスクは、動物が安楽死したことを示す。
各処置についての平均腫瘍体積±標準誤差は、図2a、図3a、図4a及び図5aに表されており、一方、各処置についての個々の腫瘍体積は、図2b、図3b、図4b及び図5bに表されている。全ての化合物が良好な耐容性を示した。
マウスに0.8mg/kgのADC 14、31若しくは32又は1mg/kgのAdcetris(登録商標)を、腫瘍誘発後12日目に投薬した。腫瘍体積の低減がこの群について観察され得ることを確実にするため、Adcetris(登録商標)をより高い用量で使用した。投薬された各コホートは、最大およそ20日目まで腫瘍体積の初期低減を示した。しかしながら、20日目後、Adcetris(登録商標)(比較用)を投薬された動物は、図2a及び図2bにおいて増加された平均腫瘍体積及び個々の腫瘍体積によってそれぞれ示されている通り、7/8匹の動物において腫瘍再成長を呈した。1600mm3よりも大きい腫瘍体積により、認容されている慣例に従って、動物の半分を安楽死させた場合、このコホートについて平均腫瘍体積を示すグラフ(図2a)をもはやプロットしなかった。この群において、1/8匹の動物だけは、71日目に研究の終わりまで測定可能な腫瘍を有していなかった。
ADC 32(比較用)について、4/8匹の動物は、腫瘍誘発後の22日目後、腫瘍再成長を有した。これは、22日目から71日目に平均及び個々の腫瘍体積の増加を呈している図3a及び図3bに示されている。この群内において、2匹のマウスは、それらの腫瘍体積がこのモデルについて最大許容可能なサイズに達した場合に、41日目及び68日目に安楽死させた(アスタリスクによって示されている通り)。4/8匹の動物だけが、71日目に測定可能な腫瘍を呈していなかった。
ADC 14について、応答率は、ADC 32(比較用)よりも顕著に良好であり、7/8匹の動物は、71日目に研究の終わりに測定可能な腫瘍体積を示さなかった(図4a及び図4bを参照されたい)。1匹のマウスだけは、任意の腫瘍再成長を示し、腫瘍誘発後48日目に安楽死させた(アスタリスクによって示されている通り)。いっそう印象的に、ADC 31を投薬されたコホートについて、いずれの動物も、投薬した後に任意の腫瘍再成長を全く示さなかった。8/8匹の動物は、測定可能な腫瘍を有さないで71日目に研究の終わりまで生存した(図5a及び図5bを参照されたい)。
これらの研究から、本発明のADCは、従来技術の比較用ADCよりも効力があることは明らかであり、14及び31の両方は、32及びAdcetris(登録商標)よりも良好な腫瘍死滅効力を呈する。
さらなる発明態様
この分野において作業しながら、本発明者らは、治療剤、診断剤及び標識化剤をペプチド又はタンパク質にコンジュゲートするためのコンジュゲーション技術の特別な形態を使用する場合に特に有利な結果が得られ得ることを見出した。したがって、本明細書において開示されているのは、以下の項目によって記載されている発明である。
1. リンカーを介して治療剤、診断剤又は標識化剤にコンジュゲートされているタンパク質又はペプチドを含むコンジュゲートであって、リンカーが環内に少なくとも2個の～(CH2-CH2-O-)～単位を含み、部分:
Figure 0007038663000115
も含むことを特徴とし、式中、W'は、電子求引基又は電子求引基の還元によって得られる基を表し、A及びBの各々は独立して、C1～5アルキレン鎖又はアルケニレン鎖を表し、Prは、求核試薬Nuを介してA及びBに結合された前記タンパク質又はペプチドを表すコンジュゲート。
2. 部分:
Figure 0007038663000116
を含む、項目1に記載されている通りのコンジュゲート。
3. 各Nuが、タンパク質若しくはペプチドPrにおけるシステイン残基中に存在する硫黄原子を表するか;又は各Nuが、タンパク質又はペプチドPrに結合されているポリヒスチジンタグ中に存在するイミダゾール基を表す、項目1又は項目2のいずれかに記載されている通りのコンジュゲート。
4. W'が-CO-基又は-CH(OH)-基を表す、先行する項目のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲート。
5. 前記環内に式～(CH2-CH2-O-)x～の単位を含み、ここでxは少なくとも2の数である、先行する項目のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲート。
6. xが2から50である、項目5に記載されている通りのコンジュゲート。
7. 環が、環内の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で若しくは2つ以上の点で結合されているか;又は環が、環内の2個以上のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で若しくは2つ以上の点で結合されている、先行する項目のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲート。
8. 前記環が、式:
Figure 0007038663000117
を有する、請求項7に記載のコンジュゲート。
9. 環が、環内の2個以上のテザリング原子を介してリンカーの残部に2つ以上の点で結合されている、項目7に記載されている通りのコンジュゲート。
10. 前記環が、式:
Figure 0007038663000118
を有する、項目9に記載されている通りのコンジュゲート。
11. 式III又はIIIaの基に直に隣接する任意選択により置換されているアリール基又はヘテロアリール基を含み;このリンカーが、前記アリール基又はヘテロアリール基に隣接する-NRa.C(O)-基又は-C(O).NRa-基も含み;ここでRaがC1～4アルキル又は水素を表す、先行する項目のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲート。
12. 治療剤を含む、先行する項目のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲート。
13. タンパク質又はペプチドが抗体又は抗体断片である、先行する項目のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲート。
14. タンパク質又はペプチドと反応できる官能基を含むコンジュゲート試薬であって、治療剤、診断剤又は標識化剤及び環内に少なくとも2個の～(CH2-CH2-O-)～単位を含むリンカーも含み、前記官能基が、式:
Figure 0007038663000119
(式中、Wは、電子吸引性基を表し;A及びBの各々は独立して、C1～5アルキレン鎖又はアルケニレン鎖を表し;各Lは独立して脱離基を表す又は両方のLは一緒になって1個の脱離基を表すのいずれかである);又は
Figure 0007038663000120
(式中、W及びAは、上記に示されている意味を有し、Lは脱離基を表し、mは0から4である)
を有する。
15. 前記官能基が、式:
Figure 0007038663000121
である、項目14に記載されている通りのコンジュゲート試薬。
16. Wが-CO-基を表す、項目14又は項目15のいずれかに記載されている通りのコンジュゲート試薬。
17. 項目2から11のいずれか1つによる特色を含む、項目14から16のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲート試薬。
18. 前記脱離基又は各脱離基が-(CH2CH2O)n-部分を含み、ここでnは2以上の数である、項目14から17のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲート試薬。
19. 前記脱離基又は各脱離基が式-SP又は-SO2Pを有し、ここでPは、-(CH2CH2O)n-部分を含む基を表し、ここでnは2以上の数である、項目18に記載されている通りのコンジュゲート試薬。
20. 項目14から19のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲート試薬とタンパク質又はペプチドを反応させることを含む、項目1から13のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲートの調製のための方法。
21. ペイロードが治療剤である項目1から13のいずれか1つに記載されている通りのコンジュゲートを、薬学的に許容される担体と一緒に及び任意選択によりさらなる活性成分と一緒に含む医薬組成物。
この発明態様の詳細な記載
本発明の試薬は、式:
Figure 0007038663000122
によってスキーム的に表すことができ、式中、Dは、治療剤、診断剤又は標識化剤を表し、Fは、タンパク質又はペプチドに結合できる官能グルーピングを表し、
Figure 0007038663000123
は、少なくとも2個のエチレングリコール、～(CH2-CH2-O-)～単位を含む環を表す。官能グルーピングFは、より詳細に下記で説明されている通り、タンパク質又はペプチドと反応できる。
本発明のコンジュゲートは、式:
Figure 0007038663000124
によってスキーム的に表すことができ、式中、Dは、治療剤、診断剤又は標識化剤を表し、F'は、リンカーの一部を結合するタンパク質又はペプチドを介してコンジュゲートの残部に結合されているタンパク質又はペプチドを表し、
Figure 0007038663000125
は、少なくとも2個のエチレングリコール、～(CH2-CH2-O-)～単位を含む環を表す。
ポリエチレングリコール環
全体にわたって、「ポリエチレングリコール環」は、少なくとも2個のエチレングリコール、～(CH2-CH2-O-)～単位を含む環を意味すると理解されるべきである。該環は、2個以上の別々の～(CH2-CH2-O-)～単位を含むことができるか、又はそれは式～(CH2-CH2-O-)x～の1個又は複数の単位を含むことができ、ここで、xは少なくとも2の数である。該環は、環構造を完成するために1個又は複数の追加原子を含有することができる。追加原子は、例えば、窒素原子、炭素原子、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子及び/又はリン原子であってよい。
該環は、環内の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合され得るか、又はそれは2つ以上の点で結合され得る。代替として、該環は、環内の2個以上のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合され得るか、又はそれは2つ以上の点で結合され得る。テザリング原子は、例えば、窒素原子、炭素原子、リン原子又はケイ素原子、殊に窒素原子及び/又は炭素原子であってよく、結合点でリンカーの残部に存在する原子は、例えば、窒素原子又は炭素原子であってよい。
以下は、本発明のコンジュゲート又は試薬におけるリンカーの残部への環の結合の可能な形態のスキーム図であり、Tは、環中のテザリング原子を表し、PEGは、少なくとも2個の～(CH2-CH2-O-)～単位を表す:
Figure 0007038663000126
適当な環の具体例としては、以下が挙げられ、式中、記号～は、リンカーへの環の組み込み点を示す:
Figure 0007038663000127
好ましくは、該環は、環中の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合されている。別の好ましい実施形態において、環は、環内の2個以上のテザリング原子を介してリンカーの残部に2つ以上の点で結合されている。
該環は、例えば～(CH2-CH2-O-)x～単位からなっていてよく、ここで、xは少なくとも2、好ましくは2から20である。代替として、該環は、xが少なくとも2、好ましくは2から50、殊に2から20である～(CH2-CH2-O-)x～単位を含有することができるが、上に記述されている通りの1つ又は複数の追加原子も含むことができるか、又は一部の他のやり方で誘導体化することができる。
コンジュゲート及び試薬は、クラウンエーテルから容易に合成することができる。クラウンエーテルは、エチレングリコールの環状オリゴマーであり、多くの異なるクラウンエーテルが知られており、これらの一部は全体がエチレングリコール単位からなるとともにこれらの一部は環内に追加原子を含有する。例えば、アザ-クラウンエーテルは窒素原子を含有し、一方、ジアザ-クラウンエーテルは2個の窒素原子を含有する。多くのクラウンエーテルは市販されており、これらは、本発明によるコンジュゲート及び試薬の合成にとって好都合な出発点を提供する。クラウンエーテルが他の化合物と反応することができる官能基を保有するクラウンエーテルは知られており、例えばカルボキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基又はアルデヒド基を保有するクラウンエーテルは、任意選択によりカルボキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、イソシアネート基、ニトロ基又はアルデヒド基等の官能基を保有するベンゼン環に縮合されているクラウンエーテルと同様に知られている。
クラウンエーテルは、カチオンをキレート化することが知られており、ペルフルオロクラウンエーテルは、MRIにおける使用のためにUS 4,838,274内に記載されている。そのため、本発明のコンジュゲートは、MRI又はPET等の画像化技術内の用途において使用することができる。
本発明によるコンジュゲート及び試薬に組み込むことができる典型的なクラウンエーテルとしては、下記に示されている構造が挙げられる。
Figure 0007038663000128
これらは、環内に存在する原子、殊に窒素原子を介する、又は側鎖上に存在する基、例えばヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アルデヒド基、イソシアネート基若しくはニトロ基を介する反応によって、本発明のコンジュゲート及び試薬のリンカーに組み込むことができる。2個の官能基又は原子を有する環は、本発明のコンジュゲート及び試薬のリンカーの残部に2つの別々の結合点で結合されていてよく、それゆえに、リンカーの骨格に組み込まれる。典型的な連結は、下記に示されている通りである:
Figure 0007038663000129
クラウンエーテルから誘導される環に加えて、クリプタンドから誘導される環が本発明において使用され得る。こうした環は、例えばUS 2014/0072900に記載されており、以下が挙げられる:
Figure 0007038663000130
クラウンエーテル又はクリプタンドから出発する本発明のコンジュゲート及び試薬を合成する代替として、一方の端部でリンカーの残部に結合されているPEG鎖を有するコンジュゲート又は試薬を調製し、次いで、従来化学を使用して、鎖の自由な端部を、リンカー上の他所に存在する官能基と反応させることが可能である。なお別の代替合成方法において、2つのペンダントPEG鎖を含有するコンジュゲート又は試薬を調製し、次いで、鎖の各々上での適切な反応性基の反応によってループを作り出すことが可能である。アルケン及びアルキン閉環メタセシスが例えば使用され得る。合成の全てのこうした方法は、当技術者に知られており、環がリンカーの骨格に組み込まれているものを含めて、本発明による非常に広い範囲のコンジュゲート及び試薬の調製を可能にする。
本発明のコンジュゲート及び試薬は、少なくとも2個の～(CH2-CH2-O-)～単位を含む1個の環を含有することができるか、又はそれらは2個以上のこうした環を含有することができる。該環は単環式であってよいか、又はそれは二環式若しくは多環式であってよい。2個以上の環は、リンカーの骨格に結合されている若しくは組み込まれていてよいか、又はそれらは互いに結合されており、したがって:
Figure 0007038663000131
であり得る。
環の多くの異なるサイズ及び構造が可能であると理解される。本発明の重要な特色は、PEG鎖が環構造の一部を形成し:この鎖がリンカーの骨格の一部を形成する直鎖状PEG鎖ではなく、一方の端部でリンカーに繋がれているが繋がれていない遊離端部を有するペンダントPEG鎖でもないことである。
好ましい一実施形態において、本発明によるコンジュゲート又は試薬におけるPEGの全ては、1個又は複数の環内に存在する。別の実施形態において、PEGは、リンカーにおける他所で、具体的には、リンカーの骨格の中に又は環をリンカーの骨格に連結する基の中に存在することもでき、これは、より詳細に下記で考察されている。
本発明のコンジュゲート及び試薬中に存在する～(CH2-CH2-O-)～単位の総数は、当然、意図される用途に依存する。一部の用途のため、高分子量PEGが使用されることがあり、例えば、数平均分子量は、最大約75,000g/モルまで、例えば最大50,000g/モル、40,000g/モル又は30,000g/モルまでであってよい。例えば、数平均分子量は、500g/モルから約75,000g/モルの範囲であってよい。しかしながら、より小さいPEG部分が一部の用途にとって好ましいことがある。
本発明のコンジュゲート又は試薬中に存在するPEGの合計分量と同様に、環中に存在する～(CH2-CH2-O-)～単位の数は、意図される用途に依存する。例えば、環状PEG部分は、最大3,000g/モルまでの分子量を有することができる。しかしながら、わずか2個のエチレングリコール単位、例えば、2個から50個のエチレングリコール単位を含有する環式基が一部の用途について有用であり、本発明の好ましい一実施形態において、環状PEG基として存在する。2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個若しくは20個の反復単位、又は24個、36個、40個若しくは48個の反復単位を有するPEG含有環が、例えば使用され得る。
コンジュゲート試薬及び方法
本発明によるコンジュゲート試薬は、2個の求核試薬と反応できる。2個以上の脱離基が存在するならば、これらは、同じ又は異なっていてよい。代替として、コンジュゲート試薬は、2個の脱離基と化学的に等価である単一の基を含有することができ、この単一の基は2個の求核試薬と反応できる。
求核基としては、硫黄原子及びアミン基が挙げられ、タンパク質における求核基は、例えば、システイン残基、リジン残基又はヒスチジン残基によって提供される。本発明の好ましい一実施形態において、求核基は、タンパク質中に存在するシステイン残基中に存在する硫黄原子である。こうした構造は、タンパク質中に存在するジスルフィド結合の還元によって得ることができる。別の実施形態において、求核基は、タンパク質に結合されているポリヒスチジンタグ中に存在するヒスチジン残基中に存在するイミダゾール基であり得る。
コンジュゲート試薬は、官能グルーピングF:
Figure 0007038663000132
を含有し、式中、Wは、電子吸引性基、例えばケト基、エステル基-O-CO-、又はスルホン基-SO2-を表し;A及びBの各々は独立して、C1～5アルキレン鎖又はアルケニレン鎖を表し;各Lは独立して脱離基を表す又は両方のLは一緒になって1個の脱離基を表すのいずれかである。こうした基を含有する試薬がタンパク質と反応する場合、第1の脱離基Lが失われて、式:
Figure 0007038663000133
(式中、mは、0から4である)
の官能グルーピングを含有するコンジュゲート試薬をインサイチュで形成し、これは、第1の求核試薬と反応する。第2の脱離基Lが次いで失われ、第2の求核試薬との反応が起きる。出発材料として官能グルーピングIを含有する試薬を使用する代替として、官能グルーピングIIを含有する試薬が使用され得るが、これは、官能グルーピングI及びIIが互いの化学的等価物だからである。
本発明のこれらのコンジュゲート試薬は、WO 2005/007197及びWO 2010/100430に開示されている一般の型である。こうした試薬は、例えば、タンパク質中のジスルフィド結合の還元によって得られる2個の硫黄原子、又はタンパク質に結合されているポリヒスチジンタグ中に存在するヒスチジン残基中に存在するイミダゾール基を標的化するために使用することができる。この型の試薬への本発明による環状PEG基の組み込みは、特に良好な結果を与え、コンジュゲーション反応が、高程度の均質性を有する安定なコンジュゲートを生成するのに効果的に起きることが見出された。
脱離基Lは、例えば-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P、-N+PR2R3、ハロゲン又は-OΦであってよく、ここでPは、水素原子又はアルキル(好ましくはC1～6アルキル)基、アリール(好ましくはフェニル)基若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1～6アルキル-フェニル)基を表すか、或いは-(CH2CH2O)n-部分を含む基であり、ここで、nは2以上の数であり、R2及びR3の各々は独立して、水素原子、C1～4アルキル基又はP基を表し、Φは、少なくとも1個の置換基、例えば-CN、CF3、-NO2、-CO2Ra、-COH、-CH2OH、-CORa、-ORa、-OCORa、-OCO2Ra、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-NHCORa、-NRaCORa、-NHCO2Ra、-NRaCO2Ra、-NO、-NHOH、-NRaOH、-CH=N-NRaCORa、-N+Ra 3、-、ハロゲン、殊に塩素又は殊にフッ素、-C≡CRa、及び-CH=CRa 2を含有する置換アリール基、殊にフェニル基を表し、ここで、各Raは独立して、水素原子又はアルキル(好ましくはC1～6アルキル)基、アリール(好ましくはフェニル)基若しくはアルキル-アリール(好ましくはC1～6アルキル-フェニル)基を表す。電子吸引性置換基の存在が好ましい。
Pが、-(CH2CH2O)n-部分を含む基を表すとともにnが2以上の数であるコンジュゲート試薬は、WO 2016/059377として公開されている本発明者らの同時係属出願GB 1418186の対象であり、上に記載されている。
本発明による新規なコンジュゲート試薬中に存在する殊に好ましい脱離基Lは、-SP又は-SO2P、殊に-SO2Pである。この基内において、好ましい一実施形態は、Pがフェニル基又は殊にトリル基を表す場合である。別の好ましい実施形態は、Pが、-(CH2CH2O)n-部分を含む基、殊にnが上に記述されている値の1つ、殊に7を有する該基を表す場合である。殊に好ましい脱離基Lは、-SO2-(CH2CH2O)n-H/Me、殊に-SO2-(CH2CH2O)7-H/Meである。この明細書の全体にわたって、脱離基Lへのいずれの言及も、これらの好ましい基、殊に-SO2-(CH2CH2O)n-H/Me、及びより殊に-SO2-(CH2CH2O)7-H/Meへの具体的な言及を含むと理解されるべきである。
好ましくは、Wはケト基を表す。好ましくは、A及びBの各々は-CH2-を表す。
上記の式I及びIIの試薬は、グルーピングF':
Figure 0007038663000134
を含むコンジュゲートを形成し、式中、W'は、電子求引基又は電子求引基の還元によって得られる基を表し、Prは、求核試薬Nuを介してA及びBに結合されているタンパク質又はペプチドを表す。該コンジュゲーション方法(より詳細に下記で記載されている通り)の即時生成物は、電子吸引性基Wを含有するコンジュゲートである。しかしながら、該コンジュゲーション方法は、適当な条件下で可逆的である。これは、一部の用途にとって、例えばタンパク質の急速な放出が必要とされる場合に望ましいことがあるが、他の用途にとって、タンパク質の急速な放出が望ましくないことがある。そのため、電子吸引性部分の還元によってコンジュゲートを安定化させることで、タンパク質の放出を防止する部分を得ることが望ましくあり得る。したがって、該コンジュゲーション方法は、コンジュゲート中の電子求引基を還元する追加の任意選択のステップを含むことができる。還元剤として、水素化ホウ素、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム又はトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムの使用が特に好ましい。使用することができる他の還元剤としては、例えば、塩化スズ(II)、アルコキシド、例えばアルミニウムアルコキシド、及び水素化アルミニウムリチウムが挙げられる。
したがって、例えば、ケト基を含有するW部分は、CH(OH)基を含有する部分に還元することができ;エーテル基CH.ORaは、エーテル化剤とのヒドロキシ基の反応によって得ることができ;エステル基CH.O.C(O)Raは、アシル化剤とのヒドロキシ基の反応によって得ることができ;アミン基CH.NH2、CH.NHRa若しくはCH.NRa 2は、還元的アミノ化によってケトンから調製することができ;又はアミドCH.NHC(O)Ra若しくはCH.N(C(O)Ra)2は、アミンのアシル化によって形成することができる。スルホンは、スルホキシドエーテル、スルフィドエーテル又はチオールエーテルに還元することができる。
好ましくは、グルーピングF'及びFは、式:
Figure 0007038663000135
殊に
Figure 0007038663000136
を有する。
上記式において、好ましい脱離基は、上に記載されている通りである。好ましくは、各Nuは硫黄原子である。
本発明によるコンジュゲート試薬は、タンパク質との反応のための1個超の官能グルーピングを含有することができる。例えば、試薬は、好ましくは式I又はIIの官能グルーピングを分子の一方の端部に、及び1つ又は複数の追加の官能グルーピングを分子における他所に含有することができる。こうした構造は、例えばBelchevaら、J. Biomater. Sci Polymer Edn. 9(3)、207～226頁に記載されており、複数のタンパク質を含有するコンジュゲートの合成は有用である。
本発明の新規なコンジュゲート試薬は、公知の方法に類似した方法によって調製することができる。具体的な反応が実施例に例示されている。
本発明によるコンジュゲート試薬は、タンパク質又はペプチドと反応させることで、本発明によるコンジュゲートを形成することができ、こうした反応は、本発明のさらなる態様を形成する。
式I又はIIのコンジュゲート試薬を使用する重要な特色は、α-メチレン脱離基及び二重結合が、マイケル活性化性部分として働く電子求引性官能基とクロスコンジュゲートされることである。脱離基が、直接的置き換えよりもむしろクロス官能性試薬において脱離しやすく、電子吸引性基がマイケル反応にとって適当な活性化性部分であるならば、逐次の分子内ビス-アルキル化は、連続したマイケル反応及びレトロマイケル反応によって起きることができる。官能グルーピングIを含有する試薬において、脱離基は、第1のアルキル化が起きることで官能グルーピングIIを含む試薬を得た後まで曝露されない潜在的な共役二重結合をマスクする働きをし、ビス-アルキル化は、逐次の及び相互作用的なマイケル反応及びレトロマイケル反応に起因する。クロス官能性アルキル化剤は、二重結合に又は脱離基と電子求引基との間でコンジュゲートされている多重結合を含有することができる。
タンパク質への結合が、タンパク質中のジスルフィド結合から誘導される2個の硫黄原子を介する場合、該方法は、ジスルフィド結合を還元することによって実施することができ、これに続いて、還元生成物は本発明による試薬と反応する。好ましくは、ジスルフィド結合は還元され、任意の過剰の還元剤が例えば緩衝液交換によって除去された後に、コンジュゲート試薬が導入される。ジスルフィド結合は、例えば、従来の方法を使用してジチオスレイトール、メルカプトエタノール又はトリス-カルボキシエチルホスフィンで還元することができる。
コンジュゲーション反応は、WO 2005/007197、WO 2009/047500、WO 2014/064423、WO 2014/064424及びWO 2015/057699に開示されている条件を含めて、公知のコンジュゲーション方法と同様の条件下で実施することができる。該方法は、例えば、全ての反応物が可溶である溶媒又は溶媒混合物中で実施することができる。例えば、タンパク質は、水性反応媒体中でポリマーコンジュゲート試薬と直接的に反応させることができる。この反応媒体は、求核試薬のpH要件に依存して、緩衝することもできる。該反応のための最適なpHは、一般に少なくとも4.5、典型的に約5.0から約8.5、好ましくは約6.0から7.5の間である。最適な反応条件は、当然、用いられる特定の反応物に依存する。
3～40℃の間の反応温度は、一般に、水性反応媒体を使用する場合に適当である。有機媒体(例えばTHF、酢酸エチル、アセトン、DMSO、DMF、MeCN)中で行われる反応は、典型的に、最大室温までの温度で行われる。好ましい一実施形態において、該反応は、有機溶媒のある割合、例えば有機溶媒の体積により最大20%まで、典型的には有機溶媒の体積により5%から20%を含有することができる緩衝水溶液中で実施される。
タンパク質は、化学量論的当量又はわずかに過剰のコンジュゲート試薬を使用して、有効にコンジュゲートすることができる。しかしながら、過剰の化学量論のコンジュゲート試薬を用いてコンジュゲーション反応を行うことも可能であり、これは、一部のタンパク質にとって望ましいことがある。過剰の試薬は、例えばイオン交換クロマトグラフィー又はHPLCによって、コンジュゲートの後続の精製中に、簡便に除去することができる。
当然、1個超のコンジュゲート試薬がタンパク質にコンジュゲートされることは可能であり、ここで、タンパク質は、十分な適当な結合点を含有する。例えば、2個の異なるジスルフィド結合を含有するタンパク質において、又は1個のジスルフィド結合を含有するとともにポリヒスチジンタグも保有するタンパク質において、タンパク質の1分子当たり試薬の2個の分子をコンジュゲートすることが可能であり、こうしたコンジュゲートは本発明の一部を形成する。
ペイロード、タンパク質、リンカー、並びに医薬組成物及び有用性
上記の「ペイロード」、「タンパク質」、「リンカー」及び「医薬組成物及び有用性」のセクション中に存在する全ての材料は、本発明のこの態様に適用する。

Claims (27)

  1. リンカーを介して治療剤、診断剤又は標識化剤にコンジュゲートされているタンパク質又はペプチドを含むコンジュゲートであって、リンカーが環内に少なくとも2個の～(CH2-CH2-O-)～単位を含むことを特徴とし、前記環が環内の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に結合されている又は前記環が環内の2個のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合されており、
    前記リンカーが、前記環を前記リンカーに組み込む、下記式
    Figure 0007038663000137
     (式中、bは1もしくは4である)、又は
    Figure 0007038663000138
     (式中、bは1、2又は3である)
    のうちの1つである分岐状要素を含み、
    下記式
    Figure 0007038663000139
     のうちの1つによってスキーム的に表される
    (Dは、前記治療剤、診断剤又は標識化剤を表し、各Tは、独立して窒素原子、炭素原子、リン原子又はケイ素原子を表し、F'は、リンカーのタンパク質又はペプチド結合部分を介してコンジュゲートの残部に結合されているタンパク質又はペプチドを表す)、
    コンジュゲート。
  2. 前記環内に式～(CH2-CH2-O-)x～の単位を含み、ここでxは少なくとも2の数である、請求項1に記載のコンジュゲート。
  3. xが2から50である、請求項2に記載のコンジュゲート。
  4. 前記環が、環中の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合されている、請求項1から3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  5. 前記環が、式:
    Figure 0007038663000140
     を有する、請求項4に記載のコンジュゲート。
  6. 治療剤を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  7. タンパク質又はペプチドが抗体又は抗体断片である、請求項1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  8. 部分:
    Figure 0007038663000141
     を含み、式中、W'は、電子求引基又は電子求引基の還元によって得られる基を表し、A及びBの各々は独立して、C1～5アルキレン鎖又はアルケニレン鎖を表し、Prは、求核試薬Nuを介してA及びBに結合された前記タンパク質又はペプチドを表す、請求項1から7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  9. 部分:
    Figure 0007038663000142
     を含む、請求項8に記載のコンジュゲート。
  10. 式III又はIIIaの基に直に隣接する任意選択により置換されているアリール基又はヘテロアリール基を含み;リンカーが、前記アリール基又はヘテロアリール基に隣接する-NRa.C(O)-基又は-C(O).NRa-基も含み;ここでRaは、C1～4アルキル又は水素を表す、請求項8又は請求項9に記載のコンジュゲート。
  11. 部分:
    ～W'-(CH=CH)p-(CH2)2-Nu-Pr
    を含み、ここで、W'は、電子求引基又は電子求引基の還元によって得られる基を表し、pは、0又は1から4の整数であり、Prは、求核試薬Nuを介して分子の残りに結合された前記タンパク質又はペプチドを表す、請求項1から7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  12. 各Nuが、タンパク質若しくはペプチドPrにおけるシステイン残基中に存在する硫黄原子を表すか;又は各Nuが、タンパク質若しくはペプチドPrに結合されているポリヒスチジンタグ中に存在するイミダゾール基を表す、請求項8から11のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  13. 式:
    Figure 0007038663000143
     を有し、式中、Dは、前記治療剤、診断剤又は標識化剤を表し、
    Figure 0007038663000144
     は、前記環を表し、F'は、リンカーの一部に結合するタンパク質又はペプチドを介してコンジュゲートの残部に結合された前記タンパク質又はペプチドを表す、請求項1から12のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  14. タンパク質又はペプチドと反応できる官能基を含むコンジュゲート試薬であって、試薬が、治療剤、診断剤又は標識化剤、及び環内に少なくとも2個の～(CH2-CH2-O-)～単位を含むリンカーも含み、前記環が環内の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に結合されている又は前記環が環内の2個のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合されており、前記リンカーが、前記環を前記リンカーに組み込む、下記式
    Figure 0007038663000145
     (式中、bは1もしくは4である)、又は
    Figure 0007038663000146
     (式中、bは1、2又は3である)
    のうちの1つである分岐状要素を含み、及び
    下記式
    Figure 0007038663000147
     のうちの1つによってスキーム的に表される
    (Dは、前記治療剤、診断剤又は標識化剤を表し、各Tは、独立して窒素原子、炭素原子、リン原子又はケイ素原子を表し、Fは、タンパク質又はペプチドと反応できる官能基を表す)、
    コンジュゲート試薬。
  15. 前記環内に、～(CH2-CH2-O-)x～単位(xは少なくとも2の数である)を含む、請求項14に記載のコンジュゲート試薬。
  16. xが2から50である、請求項15に記載のコンジュゲート試薬。
  17. 前記環は、環内の単一のテザリング原子を介してリンカーの残部に単一の点で結合されている、請求項14～16のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
  18. 前記環は、式
    Figure 0007038663000148
     を有する、請求項17に記載のコンジュゲート試薬。
  19. 治療剤を含む、請求項14～18のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
  20. 前記官能基が、式:
    Figure 0007038663000149
     (式中、Wは電子吸引性基を表し; A及びBの各々は独立してC1～5アルキレン鎖又はアルケニレン鎖を表し;各Lは独立して脱離基を表す又は両Lは一緒になって1個の脱離基を表す、のいずれかである)
    又は
    Figure 0007038663000150
     (式中、W及びAは、上記に示されている意味を有し、Lは脱離基を表し、mは0から4である)
    を有する、請求項14～19のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
  21. 前記官能基が、式:
    Figure 0007038663000151
     を有する、請求項20に記載のコンジュゲート試薬。
  22. 前記官能基が、式:
    ～W-(CH=CH)p-(CH2)2-L (V)又は
    ～W-(CH=CH)p-CH=CH2 (VI)
    を有し、ここで、Wは電子求引基を表し、pは0又は1から4の整数を表し、Lは脱離基を表す、請求項14～20のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
  23. 前記脱離基又は各脱離基が-(CH2CH2O)n-部分を含み、ここで、nは2以上の数である、請求項20から22のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
  24. 前記脱離基又は各脱離基が、式-SP又は-SO2Pを有し、ここで、Pは、-(CH2CH2O)n-部分を含む基を表し、ここで、nは2以上の数である、請求項23に記載のコンジュゲート試薬。
  25. 式:
    Figure 0007038663000152
     を有し、式中、Dは、前記治療剤、診断剤又は標識化剤を表し、
    Figure 0007038663000153
     は、前記環を表し、Fは、タンパク質又はペプチドと反応できる前記官能基を表す、請求項14から24のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
  26. タンパク質又はペプチドを請求項14から25のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬と反応させることを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載のコンジュゲートの調製のための方法。
  27. Dが治療剤である請求項1から13のいずれか一項に記載のコンジュゲートを、薬学的に許容される担体と一緒に、任意選択によりさらなる活性成分と一緒に含む医薬組成物。
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