JP7069043B2 - コンジュゲート及びコンジュゲート試薬 - Google Patents
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Description
を有するタンパク質又はペプチド結合部分を含み、リンカーはシクロデキストリンも含む。
の基であり、ここでリンカーは、シクロデキストリンも含む。
シクロデキストリンは、α-D-グルコピラノシド単位の環式オリゴマーである。環式グルコース単位は、それらの1,4位で一緒に結合されている。様々なサイズの環が可能であり、最も一般的なのは、環内に6つの糖部分を有するα-シクロデキストリン;環内に7つの糖部分を有するβ-シクロデキストリン;及び環内に8つの糖部分を有するγ-シクロデキストリンである。これらのシクロデキストリンは天然型であり、下記に示されている:
本発明のコンジュゲート及び試薬は、治療剤、診断剤又は標識化剤であるペイロードを保有する。このペイロードは、シクロデキストリンに及びリンカーを介してタンパク質又はペプチドに共有結合されている。治療剤、診断剤又は標識化剤の単一分子が存在し得るか、又は2つ以上の分子が存在し得る。1つ又は複数の薬物分子、例えば細胞毒性剤又は毒素の包含が好ましい。オーリスタチン、メイタンシノイド及びデュオカルマイシンは、典型的な細胞毒性薬である。薬物コンジュゲート、特に抗体薬物コンジュゲートは、該薬物の複数のコピーを含有するべきであることがしばしば好ましい。標識化剤(これは、画像化剤を含むと理解されるべきである)としては、例えば、放射性核種、蛍光薬剤(例えば、5-ジメチルアミノナフタレン-1-(N-(2-アミノエチル)等のアミン誘導体化蛍光プローブ)スルホンアミド-ダンシルエチレンジアミン、Oregon Green(登録商標)488カダベリン(カタログ番号O-10465、Molecular Probes)、ダンシルカダベリン、N-(2-アミノエチル)-4-アミノ-3,6-ジスルホ-1,8-ナフタルイミド、二カリウム塩(ルシファーイエローエチレンジアミン)、又はローダミンBエチレンジアミン(カタログ番号L2424、Molecular Probes)、又はチオール誘導体化蛍光プローブ、例えばBODIPY(登録商標)FL L-シスチン(カタログ番号B-20340、Molecular Probes)が挙げられ得る。ビオチンも使用することができる。
このセクション及び他所における便宜上、「タンパク質」は、文脈が他の意味を必要としている場合を除いて、「タンパク質及びペプチド」を含むと理解されるべきである。
本発明のコンジュゲート試薬は、WO 2005/007197及びWO 2010/100430に開示されている一般の型である。官能グルーピングII及びII'は、互いの化学的等価物である。グループIIを含有する試薬がタンパク質と反応する場合、第1の脱離基Lが失われてグループII'を含有するコンジュゲート試薬をインサイチュで形成し、これは第1の求核試薬と反応する。第2の脱離基Lが次いで失われ、第2の求核試薬との反応が起きる。したがって、出発材料として官能グルーピングIIを含有する試薬を使用する代替として、官能グルーピングII'を含有する試薬が出発材料として使用され得る。
「脱離基は、例えば、-(CH2CH2O)n-R1を含むことができ、ここでR1はキャッピング基である。非常に広い範囲のキャッピング基が使用され得る。R1は、例えば、水素原子、アルキル基、殊にC1~4アルキル基、特にメチル基、又は任意選択により置換されているアリール基、例えば任意選択により置換されているフェニル基、例えばトリル基であってよい。代替として、キャッピング基は、カルボキシル基又はアミン基等の官能基を含むことができる。こうしたキャッピング基は、例えば、式-CH2CH2CO2H又は-CH2CH2NH2を有することができ、-(CH2CH2O)n-鎖の末端単位を官能化することによって調製することができる。代替として、キャッピング基によって終端されるよりもむしろ、-(CH2CH2O)n-基は、コンジュゲート試薬内に2つの付着点を有することができることで、2個の脱離基の化学的等価物が存在し、2個の求核試薬と反応することができる。
脱離基の-(CH2CH2O)n-部分は、PEG、ポリエチレングリコールに基づく。PEGは直鎖又は分岐であってよく、それは、任意のやり方で誘導体化又は官能化することができる。nは、2以上の数、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である。例えば、nは5から9であってよい。代替として、nは10以上の数であってよい。nについて特別な上限はない。nは、例えば150以下、例えば120以下、例えば100以下であってよい。例えばnは、2から150、例えば7から150、例えば7から120であってよい。脱離基のPEG部分-(CH2CH2O)n-は、例えば、1kDaから5kDaの分子量を有することができ;それは例えば、1kDa、2kDa、3kDa、4kDa又は5kDaであってよい。脱離基は、所望であれば、1つ又は複数のスペーサーによって隔てられている2つ以上の-(CH2CH2O)n-部分を含有することができる。
本発明によるコンジュゲート試薬における脱離基は、適当には、式-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P、-N+PR2R3であり、ここで、Pは、-(CH2CH2O)n-部分を含む基であり、R2及びR3の各々は独立して、水素原子、C1~4アルキル基又はP基を表す。好ましくは、R2及びR3の各々は、C1~4アルキル基、殊にメチル基、又は殊に水素原子を表す。代替として、コンジュゲート試薬は、式-S-P-S-; -O-P-O-; -SO2-P-SO2-; -OSO2-P-OSO2-;及び-N+R2R3-P-N+R2R3-の基を含むことができる。この型の特定の基としては、-S-(CH2CH2O)n-S-、-O-(CH2CH2O)n-O-; -SO2-(CH2CH2O)n-SO2-; -OSO2-(CH2CH2O)n-OSO2-;又は-N+R2R3-(CH2CH2O)n-N+R2R3-が挙げられる。それらは、型:
本発明のコンジュゲート中のタンパク質又はペプチド結合部分に又は本発明のコンジュゲート試薬中の官能グルーピングに、治療剤、診断剤又は標識化剤を接続するリンカーは、上に記載されている通りの1つ又は複数のシクロデキストリンを含まなければならない。それは、任意の他の所望の基、特に、この分野において共通して見出される従来の基のいずれかを含有することもできる。
を形成することができる。
~CHs[(CH2)tO~]3~s~
の使用によって導入することができ、ここで、sは0、1又は2であり、tは1から4である。例えば、特定の一実施形態において、3つのペンダントポリペプチド鎖は、構造:
~C[CH2O-(CH2)2-CO-NH~CD]3
の使用によって組み込むことができる。
本発明によるコンジュゲート試薬は、タンパク質又はペプチドと反応させることで、本発明によるコンジュゲートを形成することができ、こうした反応は、本発明のさらなる態様を形成する。したがって、官能グルーピングII又はII'を含めたコンジュゲート試薬は、タンパク質又はペプチドと反応させることで、グルーピングIを含めたコンジュゲートを形成する。コンジュゲーション方法の即時生成物は、電子吸引性基Wを含有するコンジュゲートである。しかしながら、コンジュゲーション方法は、適当な条件下で可逆的である。これは、一部の用途にとって、例えばタンパク質の急速な放出が必要とされる場合に望ましいことがあるが、他の用途にとって、タンパク質の急速な放出が望ましくないことがある。そのため、電子吸引性部分Wの還元によってコンジュゲートを安定化させることで、タンパク質の放出を防止する部分を得ることが望ましくあり得る。したがって、上に記載されている方法は、コンジュゲート中の電子求引基Wを還元する追加の任意選択のステップを含むことができる。還元剤としての水素化ホウ素、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム又はトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムの使用が特に好ましい。使用することができる他の還元剤としては、例えば塩化スズ(II)、アルコキシド、例えばアルミニウムアルコキシド、及び水素化アルミニウムリチウムが挙げられる。
ペイロードが治療剤である本発明によるコンジュゲートは、ペイロードの性質に依存して様々な病状の処置において有用性を見出す。典型的に、ペイロードは細胞毒性剤であり、本発明はがんの処置において有用性を見出す。したがって、本発明は、本発明によるコンジュゲート、特に、ペイロードが治療剤であるコンジュゲート、詳細には、薬学的に許容される担体と一緒の、及び任意選択によりさらなる活性成分と一緒の抗体-薬物コンジュゲートを更に提供する。本発明は、治療におけるこうしたコンジュゲートの使用を更に提供し、本発明によるコンジュゲート又は医薬組成物を患者に投与することを含む、患者の処置の方法において有用性を見出す。本発明は、例えばがんの処置のための医薬の製造における本発明によるコンジュゲートの使用を更に提供する。
DMF(250μL)中の試薬5(6.3mg)の溶液に、HATU(2.6mg)を添加し、溶液を0℃で20分間撹拌した。NMM(0.5μL)を溶液に添加し、これを更に10分間室温で撹拌した。DMF(250μL)中の化合物3(15mg)の別の溶液に、NMM(0.75μL)を添加し、溶液を10分間0℃で撹拌した。2つの溶液を次いで合わせ、追加分量のHATU(2.6mg)及びNMM(0.75μL)を添加した後に、反応混合物を室温で2時間の間放置撹拌させておいた。反応溶液を真空中で濃縮し、残渣を、緩衝液A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬1を白色の固体として得た(13mg)。m/z [M+2H]2+ (1659、70%)、[M+3H]3+ (1106、100%)。
DMF(250μL)中の化合物14(18mg)の撹拌溶液に、不活性なアルゴン雰囲気下にて室温で、HATU(6mg)を添加した。1時間後、追加のHATU(6mg)及びNMM(1.1μL)を添加し、溶液を更に0.5時間の間放置撹拌させておいた。DMF(100μL)中のVal-Ala-PAB-AHX-DMl.TFA塩(Levena Biopharma社、7.5mg)及びNMM(1.7μL)の別の溶液を調製し、20分間室温で撹拌した後に、2つの溶液を合わせた。追加のHATU(6mg)及びNMM(1.7μL)を添加し、溶液を室温で撹拌した。2時間後、追加のHATU(6mg)を添加し、溶液を更に4時間の間室温で放置撹拌させておいた後に、追加のNMM(1.7μL)を添加した。3.5時間後、揮発分を真空中で除去し、結果として得られた残渣を、緩衝液A(v/v):水:5%アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬11を得た(2.7mg)。m/z [M+Na+2H]3+ (1100、65%)。[M+3H]3+ (1094、100%)。
DMF(400μL)中の化合物19(6mg)の溶液に、試薬5(3mg)及びHATU(3.3mg)を添加した。撹拌溶液を0℃に冷却した後に、NMM(1μL)を添加した。1時間後、追加のHATU(0.6mg)及びNMM(0.2μL)を反応混合物に添加し、これを更に30分間撹拌した。反応混合物を次いで、緩衝液A(v/v):水:0.05%トリフルオロ酢酸及び緩衝液B(v/v):アセトニトリル:0.05%トリフルオロ酢酸(100:0 v/vから0:100 v/v)で溶出する逆相C18カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去することで、試薬15を黄色の固体として得た(3.7mg)。m/z [M+2H]2+ (1495、100%)、[M+Na+2H]3+ (1005、30%)。
20mMのリン酸ナトリウム、pH7.5(150mMのNaCl及び20mMのEDTAを含有する)中5.2mg/mLの濃度の抗体を、40℃に加熱ブロック中で15分間加熱した。TCEP(1mAb当たり6当量)をmAb溶液に添加し、穏やかに混合し、40℃で1時間の間インキュベートした後に、22℃に冷却させておいた。コンジュゲーション試薬1、6、7、8、9、10、11及び15をDMF中に溶解させることで、1.5mMの溶液を得た。還元されたmAb溶液を4.4mg/mLに、20mMのリン酸ナトリウム、pH7.5(150mMのNaCl及び20mMのEDTAを含有する)で希釈した。コンジュゲーション試薬(1mAb当たり5.6当量)をmAb溶液に添加し、反応物を穏やかに混合し、22℃で6から22時間の間インキュベートした。この後、反応物を50mMのN-アセチル-L-システイン(試薬を20当量超える)にて22℃で1時間の間処理した。粗製のコンジュゲーション混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分析した。粗製反応物を、50mMのリン酸ナトリウム、pH7(4MのNaCl)の等体積と混合し、結果として得られた溶液を、50mMのリン酸ナトリウム、pH7(2MのNaCl)で平衡化されたToyoPearl社 Phenyl-650S HICカラムにロードした。ADCをカラムから、50mMのリン酸ナトリウムの勾配、pH7(20%イソプロパノール)で溶出した。DAR 4 ADCを含有する画分をプールし、濃縮した(Vivaspin 20、10kDa PES膜)。濃縮試料をPBS、pH7.1~7.5へと緩衝液交換し、滅菌濾過した(0.22μmのPVDF膜)。DAR割り当ては、A248/A280吸収比に基づいた。コンジュゲートの平均DARを、280nmでのHIC分析に続いて個々のDAR種の相対的ピーク面積から算出した。コンジュゲーション試薬1、6、7、8、9、10及び15とのブレンツキシマブ抗体のコンジュゲーションは、DAR 4コンジュゲート20、21、22、23、24、25及び26をそれぞれ生成した。試薬11との抗PSMA抗体のコンジュゲーションは、DAR 4コンジュゲート27を生成した。
実施例9において調製された抗体薬物コンジュゲート20、21、22、23、24、25、26及び27のインビトロ効力を、がん細胞株を過剰発現する標的の細胞成長に対するそれらの阻害効果を測定することによって決定した。
17.5gの平均体重を有する健康な雌性CB17-SCIDマウス(CBySmn.CB17-Prkdcscid/J、Charles River Laboratories社)を細胞接種(0日目)のために使用した。腫瘍細胞注射より24時間から72時間前に、マウスにγ-照射(1.44Gy、60Co)した。動物をSPF健康状態にFELASAガイドラインに従って住居室に制御環境条件下で維持した。
ADC試料20、21、22、23、24及び25を、0.5mg/mLでDPBS pH7.1~7.5を用いる希釈によって各々調製した。
Claims (21)
- リンカーを介して治療剤、診断剤又は標識化剤にコンジュゲートされているタンパク質又はペプチドのコンジュゲートであって、前記リンカーが、一般式:
Prは、前記タンパク質又はペプチドを表し、
各Nuは、前記タンパク質若しくはペプチド中に存在する又は前記タンパク質若しくはペプチドに付着している硫黄原子又はアミン基を表し、
A及びBの各々は独立して、C1~4アルキレン又はアルケニレン鎖を表し、
W'は、ケト基-CO-、エステル基-O-CO-、スルホン基-SO 2 -、又はこれらの基のうちの1つの還元によって得られる基を表す)
を有するタンパク質又はペプチド結合部分を含み、
前記リンカーが、シクロデキストリンも含み、前記シクロデキストリンが、前記リンカーの骨格に繋がれているペンダント基として存在する、コンジュゲート。 - 前記シクロデキストリンが、α-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン又はγ-シクロデキストリンである、請求項1に記載のコンジュゲート。
- 前記シクロデキストリンが、3位又は6位を介して前記リンカーの残りに結合されている、請求項1又は2に記載のコンジュゲート。
- 前記シクロデキストリンが、単環式である、請求項1から3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 治療剤を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記タンパク質又はペプチドが、抗体又は抗体断片である、請求項1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 各Nuが、前記タンパク質又はペプチド中に存在するシステイン残基中に存在する硫黄原子を表す、請求項1から9のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 請求項2から6のいずれか一項に規定の特徴を含む、請求項13に記載のコンジュゲート試薬。
- タンパク質又はペプチドを請求項13から18のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬と反応させることを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載のコンジュゲートの調製のための方法。
- ペイロードが治療剤である請求項1から12のいずれか一項に記載のコンジュゲートを、薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬組成物。
- ペイロードが治療剤である請求項1から12のいずれか一項に記載のコンジュゲートを、薬学的に許容される担体及びさらなる活性成分と一緒に含む、請求項20に記載の医薬組成物。
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