CZ3393A3 - Technologie výroby cflené, konjugované makromolekuly s degrsdabilní peptidovou spojkou - Google Patents

Abstract

Zp&sob výroby konjugované makromolekulám! farmakologické komposice, při němž vytváří: a) degradabilní peptidový řetčzce jako základní nosič bioaktivních molekul, kde prvotní spojovací aminokyselinou jsou -Gly-,-Phe-,-Leu-,- Ala-,-Tyr-,-Val-, a navazuje na vnitřní řetčzec složený z aminokyselin Gly, Ala, Ser, Cys, Met, Val, Leu, Ile, Thr, Cm, Lys, Arg, Asp, Asp-NHz, Glu, GIu-NHí, Phe, Tyr, His, Trp a b) na obou stranách degrabilního peptidovčho nosiče jsou umístžny biooaktivní molekuly, jedna jako léčiva, druhá jako cílový targmt neboli determinant.

Description

Předmětem vynálezu Je technologie výroby honjugcvsných bioaktivních molekul, spojených degradabilním poptidem. Dosud se používají léčiva nízkomolekulární o mnohými negativními účinky na základě neomezeného působení na všech, úrovních organismu. Teto je dobře patrno ns příkladech protináóorové chem:

•pie, jejíž ne zcela uspokojivé výsledky mohou být přičteny hlavně tomu, že cytc-toxické látky nepůsobí v organismu pouze na tkáň tumoru, nýbrž i na normální buňky. Výšeuvedené nevýhody jsou odstraněné předmětem vynálezu, kdo je dvojí regulace Činnosti a účinku konjugováné makromolekuly.

Vývoj kcnjugovaných makromolekulcvých látek se ubíral dvěmi cestami, a to s nosičem a bez nosiče. Použitím nosiče kopolymerů HPMA / N - /2 hydroxypr opyl/ methakrylamid /, čímž se -zabýval Ústav makromolekulární chemie ČSAV Praha, jsou problémy v samém organismu s jeho- likvidací.

Použitím degradabilního peptidu jako nosiče pro bioaktivní molekulu, například cytostatikum a cílené molekuly schopné interakce s receptory na povrchu určitého typu buněk, například tumorových.

Takto sestavená makromolekula má potřebné vlastnosti, které mohou být využity jako cíleně směrovaná pretinádorová léčiva i jako účinná imunosupresiva.

Hlavním Článkem konjugované makromolekuly je degradabilita peptidové spojky na lysosomální enzýrny, například Cathepsin B, H,L a jiné, a jeho stálost v krevním řečišti.

v,.<

Táórese.·*.-.··- iw. .

• ....».· ·_%. .

•-’ζ· rf'

Hlavní sledované parametry jsou :

a, rychlost průniku čo buňky / pinocytosou / b, biokompatibilits . .. c, osud jednotlivých částí v organismu d, . degradabilita e, .cytotoxicita in vivo f, stabilita v krevním řečišti

Jako targetu bylo použito monoklonální protilátky, hormony, nukleové kyseliny, galaktosaminy, fukosylaminy a jiných cílených molekul. Musí být netoxické a po absorbci do buněk /cílených / se pak rozloží na monomery bez antigeniéity.

Hlavní Část degradabilní peptidové spojky musí obsahovat nejméně jedno aktivní místo degradabilních dvojic / sekvenci / reagující na příslušný nitrobuněčný enzym.

Jednu z možných technologií uvádíme jako příklad :

- antiboóy - peptid - bioaktivní molekula B - bioaktivní molekula / například cytostatikum /

JPEP - N - peptid / např. Gly - Phe - Leu - Gly /

CL - CH_x-CH₂ θ 0

CH_z-CH₂-CH₂-C-0-* + NH_z'MAb

CL - CH_Z-CH_Z'

A°C r - CO-NH- MA I» ,H Ci~CH_z-CH_z

II

B-PEP-N 4^XH CL-CH₂-CH₂

23° C _B,_pEp_ZZ₁-^hcH_i-CH₁-CH₁-CO-NH-MAb

saiaKsaasaitauacaa^

Příklad metodického postupu je zpracován bez kvantifikace bioaktivní molekuly, jelikož lze použít různých bioaktivních molekul- jako např. Adriblastin / Doxorubicin /, Daunomycin,

Epirubicin atd.

Příklad postupu u : 3 - PEP - ANTIBODY

B - bioaktivní molekula / Daunomycin /

PEP - oligopeptid

- Gly - Phe - Leu - Gly - + N - hydroxysuccinimidyl ester kyseliny 4 - bis / 2 - chloroetyl / amino benzenbutánové.

ANTIBODY - M A b

- 2 mg N - hydroxysuccinimidyl esterů kyseliny 4 - fbis / 2 - chloretyl / aminoj benzénbutanové se rozpustí v 1 ml dimetylsulfoxidu a přidá se k 60 mg protilátky MA b rozpuštěné v 6 ml tlumivého roztoku A.

- Tlumivý roztok A - 0,1' mM kyselina boritá, 0,6 M chlorid sodný, 0,5 % n - butanol', pH 9,0.

- Roztok se misí v ledové koupeli 1,5 hod. a potom se nanese na kolonu Sephaúexu G - 25 / 1,6 krát 36 cm /, obalenou tepelně izolačním materiálem, která byla předem stabilizována přemýváním chladěným tlumivým roztokem A s teplotou 4°C.

- Vzorek z kolony se vymývá chladěným tlumivým roztokem A, přičemž frakce derivatizováných protilátek, která se eluuje jako první, se ihned zachytává do roztoku peptidu / 10 mg v 10 ml tlumivého roztoku A / s bioaktivní molekulou Daunomycin, který je chlazený ledem.

- Konjugační směs s výsledným objemem okolo 40 ml + Daunomycín, se ultrafiltrací přes membránu PM 10 v chlazeném filtračním zařízení AMICON zkoncentruje na 5 ml a nechá se inkubovat při laboratorní teplotě během 60 hodin.

- Konjugační směs se rozdělí gelovou filtrací ns sloupci

Sephacrylu S - 200 /2,6 krát 80 cm / elucií s tlumivým roztokem A. C/

- 4 · -~ν·- ·

------— ..

y^y'·. *·

- Purifikovaný konjugát může být skladovaný při teplotě 4°C po předcházející sterilizaci filtrací pres Líillipcre GS filtr / 0,22 yon /, bez pozorovatelných změn v aktivitě během několika měsíců.

--Vzorek: konjugátu může také být prudce zmrazen ve směsi pev’ ného CC₂ s etanolem nebo v tekutém dusíku ε skladován při

......teplotě - 70°C a níže. Tato metoda je výhodná pro dlouhodobé skladování.

Výsledný vzorec je :

daunomxcin PEPTID- N

CH^-CHt-CO-NH- MAL

Glu,Glu-NH j,Phe,Tyr, His,Trp,

Daunomycin

.........Konjugované léčivo má minimální molekulovou váhu 5 000 a nej·. výhodnější se jeví molekulová váha 20 000 - 40 000. Jedná se

... ϊ o. makromolekuly.

......, ^. Je^ známo, . že makromolekuly neprocházejí biologickými membránami, ale zůstávají v tělesném komportmenetu, do něhož byly zavedeny. Dostávají se do buněk procesem endocytczy, představovaným invaginací membrány, které se nakonec uzavírají

...... za vzniku vakuoly obsahující pohlcenou makromolekulu.

.-Pinocytické vazikuly se v cytoplazmě spojují s buněčnými organelami nazvanými lysosomy. Hydrolytické enzymy jsou schopné štěpit vazby léčiva v místě peptióových dvojic aminokyselin, takto uvolněná bioaktivní molekula, neboli léčivo, se potom dostává difúzí přes membránu do ostatních buněčných komportmentů, kde teprve vyvolává žádaný efekt.

Claims (2)

1. T, Předmětem vynálezu je konjugace molekul v makrcmolekúlární farmakologickcu komposici vyznačující se tím, že vytváří :

   a, degradebilní peptióový řetězec jako základní nosič bioaktivních molekul, kde prvotní spojovací aminokyselinou jsou -Gly-, -Pho-, -I,eu-, -Ala-, -Tyr-, -Val-, a navazuje na vnitřní řetězec složený z aminokyselin Gly, Ale, Ser, Gys, Ivíet, Val, Leu, Zle, Thr, Crn, Lys, Arg, Asp, Asp - NH₂, Glu, Glu - NH_?, Phe, Tyr, His, Trp.

   ..... b, na obou stranách dcgredabilního peptidového nosiče jsou 'ÚL umístěné bioaktivní molekuly, jedna jako léčivo, druhá jako cílový target neboli determinant.
2. 2, Konjugovaná makromolekulární farmakologická komposice podle bodu 1 a, b vyznačená tím, že se N - hyóroxysuccinimidyl esteru kyseliny 4 -Jbis / 2 - chloretyl / amino] benzenbutanové rozpustí v dimetylsulfoxidu a přidá se tsrget / protilátka MA. b / rozpuštěná v tlumivém roztoku A / kyselina boritá, chlorid sodný, n - butal.cn, pH 5,0 /, itoztok se míchá v ledové koupeli 1 - 2 hodiny a potom se nanese na kolonu Sephadexu G - 25 při teplotě 4°C, vzorek se vymývá chlazeným tlumivým roztokem A, přičemž frakce derivatizovaných protilátek, která se eluuje jako první, se ihned zachytává do roztoku peptidů s bioaktivní molekulou s tlumivým roztokem A, a po ultrafiltraci přes membránu PM ve filtračním zařízení se koncentruje $ nechává se inkubovat okolo 60 hodin, pak se kenjugát rozdělí gelovou filtra-