ES2967128T3 - Preparación farmacéutica de conjugado de anticuerpo anti-Her2 y fármaco - Google Patents

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Abstract

Una preparación farmacéutica que comprende una mezcla de un azúcar no reductor, un conjugado de anticuerpo monoclonal anti-Her2 humanizado-MMAE y un tensioactivo. La preparación farmacéutica tiene las características de reducir las partículas, reducir la formación de agregados, mejorar la estabilidad de un conjugado, mejorar la apariencia del polvo liofilizado, etc. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Preparación farmacéutica de conjugado de anticuerpo anti-Her2 y fármaco
Campo
La presente invención se refiere a una formulación farmacéutica de conjugado anticuerpo contra Her2-fármaco, que pertenece al campo de los fármacos antitumorales.
Antecedentes
La bioterapia dirigida a tumores ha atraído cada vez más atención en la investigación del tratamiento del cáncer. Entre ellas, la terapia con anticuerpos monoclonales tiene una gran especificidad contra la diana y escasos efectos secundarios, pero tiene una eficacia relativamente limitada cuando se usa sola. Actualmente, los fármacos de anticuerpos monoclonales antitumorales más satisfactorios son los dirigidos contra los tumores linfocíticos, tales como el linfoma no Hodgkin (LNH), la leucemia linfocítica crónica (LLC), etc.
ErbB2, también conocido como Her2/neu, es el segundo miembro de la familia de EGFR, que desempeña una función biológica al formar un heterodímero con los otros tres miembros de la familia de EGFR. El gen neu que codifica ErbB2 se aisló por primera vez de un neuroblastoma de rata. El gen homólogo del gen neu en las células somáticas humanas, denominado Her2, se ubica en el brazo largo del cromosoma 17 (17q21.1). ErbB2, el producto codificado por Her2, consiste en 1255 aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 185 kDa, en cuyas posiciones 720-987 se encuentra el dominio activo tirosina cinasa. Además de actuar a través de las vías de señalización de PI3K y MAPK, ErbB2 puede reducir la expresión de ciclina D y c-myc, reduciendo de este modo la expresión del inhibidor de cinasas dependientes de ciclinas (CDK) p27kipl. Se inhibe la actividad de CDK2, conduciendo a la proliferación celular. Con la investigación continua y en profundidad, se ha descubierto que HER2 se expresa y sobreexpresa en una diversidad de tumores. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de fármacos dirigidos contra HER2 para tratar eficazmente los tumores malignos. Actualmente existen tres anticuerpos monoclonales dirigidos contra Her2 en el mercado (véase la Tabla 1).
T l 1 An i r m n l n l ^ r r l FDA iri i nr H r2
Basándose en las características del direccionamiento de los anticuerpos, ha surgido una nueva generación de fármacos de acción biológica, conjugado anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés). El ADC consiste en tres partes: anticuerpo, citotoxina, y un enlazador que conecta ambos. Después de conjugar el anticuerpo monoclonal con la citotoxina, el conjugado anticuerpo-fármaco utiliza el direccionamiento del anticuerpo monoclonal para reconocer específicamente el receptor en la superficie de la célula cancerosa, se une al receptor, y después entra en la célula y libera una sustancia citotóxica a través de la proteasa intracelular para impedir que las células cancerosas se reproduzcan y destruirlas. En la técnica anterior, generalmente se usa un cultivo de células de mamífero para producir un anticuerpo, y el anticuerpo altamente purificado se conjuga con la citotoxina tal como MMAE a través de un enlazador para obtener el conjugado anticuerpo-fármaco (ADC). La tecnología de conjugación anticuerpo-fármaco integra un fármaco de toxina de molécula pequeña y una proteína biológica, para que posea las ventajas de ambos, convirtiéndose en una nueva generación de productos terapéuticos, que potencia enormemente la eficacia del fármaco reduciendo al mismo tiempo los efectos tóxicos y secundarios. Actualmente, existen cuatro fármacos ADC en el mercado aprobados por la FDA de los EE.UU. (véase la Tabla 2).
Tabla 2 Cuatro fármacos ADC en el mercado
Como otros fármacos de biomacromoléculas, los ADC son propensos a la degradación tal como la oxidación, desamidación y fragmentación, o la formación de micropartículas y agregados. Además, la propia conjugación puede reducir la estabilidad y cambiar las propiedades fisicoquímicas del anticuerpo. Por ejemplo, la conjugación de DM1 con el anticuerpo anti-HER2 trastuzumab da como resultado la pérdida de estabilidad del dominio CH2 del anticuerpo (Referencia 1:Physicochemical Stability of the Antibody-Drug Conjúgate Trastuzumab-DMI: Changes due to Modification and Conjugation Processes.Aditya A. Wakankaret al., Bioconjugate Chemistry2010: 21 (9), 1588-1595). El fármaco ADC es generalmente hidrófobo y en su conjunto puede ser más insoluble que un anticuerpo no conjugado, y por lo tanto ser más propenso a la agregación, formando micropartículas o adsorción superficial. Con el fin de proporcionar fármacos ADC que sean estables durante el transporte y el almacenamiento, cada ingrediente adyuvante de la formulación farmacéutica debe seleccionarse cuidadosamente. Los ingredientes adyuvantes de los ADC actualmente en el mercado son los que se muestran en la Tabla 3. Puesto que los tipos de ingrediente adyuvante utilizados en la formulación de ADC actualmente en el mercado son muy limitados y hay muchas opciones del ingrediente relacionado de la formulación, el desarrollo de una combinación de adyuvantes para la formulación de ADC que sean estables durante el transporte y el almacenamiento implica el cribado de un gran número de ingredientes adyuvantes, además, la determinación de la concentración adecuada requiere mucho esfuerzo y tiempo.
T l In r i n v n l AD n l m r
También se desprende de los ingredientes adyuvantes de las cuatro formulaciones de ADC anteriores que cada formulación es única en cuanto a los ingredientes adyuvantes utilizados. Debido a la escasa estabilidad y a la complicada estructura de los fármacos de anticuerpos monoclonales, es extremadamente difícil fabricar y almacenar dichos fármacos. Debido a la estructura heterogénea de los anticuerpos, en particular las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y la glicosilación de Fc, el desarrollo de diferentes formulaciones de anticuerpos monoclonales debe realizarse individualmente basándose en el caso (Referencia 2:Monoclonal antibodies: formulations of marketed products and recent advances in novel delivery system,Yanan Cuiet al., Drug Development and Industrial Pharmacy,Volumen 43, N.° 4, Páginas 519-530, 2017). Además, el desarrollo de formulaciones para ADC es más singular debido a la mayor implicación de la conjugación y una molécula de toxina.
La solicitud de patente WO2014143765 desvela una formulación que comprende un conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC) anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), un azúcar, histidina y un tensioactivo, en donde dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 5-7, y en donde dicho ADC anti-EGFR comprende un anticuerpo anti-EGFR, o una porción de unión a antígeno del mismo, conjugado con una auristatina. La solicitud de patente (CN105008398A o WO2015074528A1) desvela un conjugado anticuerpo RC48 humanizado-fármaco, en donde el anticuerpo RC48 humanizado es un anticuerpo monoclonal dirigido contra Her2 (un anticuerpo secretado por las células de ovario de hámster (células CHO) que se depositaron en el Centro de China para la Colección de Cultivos Tipo con el número de depósito C2013170 o un anticuerpo derivado de las mismas) y la citotoxina es Monometil Auristatina E (MMAE), que es un derivado de la dolastatina. El enlazador en este ADC es Maleimido-Caproil-Valina-Citrulina-p-AminoBenciloxi (mc-VC-PAB) y el conjugado anticuerpo monoclonal contra Her2 recombinante humanizado-MMAE está formado por el anticuerpo monoclonal y MMAE unidos al enlazador a través de cisteína. El fármaco ha conseguido buenos efectos terapéuticos en tumores positivos para Her2.
Los experimentos preliminares mostraron que, después de la purificación, el conjugado anticuerpo monoclonal anti-Her2 humanizado recombinante-MMAE tiene una solubilidad deficiente en el tampón convencional, y aparecerán micropartículas insolubles visibles, lo que no cumple las normas convencionales para inyección. Sin embargo, si se quiere conseguir una dosis terapéutica clínicamente eficaz, la concentración de proteínas debe ser superior a 5 mg/ml. Por lo tanto, es necesario resolver el problema de las partículas insolubles garantizando al mismo tiempo una determinada concentración eficaz. Además, cuando la solución de proteína se liofiliza al vacío, es necesario añadir un lioprotector para proteger la proteína de su destrucción durante la liofilización y, al mismo tiempo, garantizar que el polvo liofilizado tenga un buen aspecto. Para evitar la degradación lenta del polvo liofilizado de la proteína durante el almacenamiento a largo plazo, es necesario añadir un estabilizador de proteínas adecuado. Se necesitan muchos experimentos para desarrollar y determinar el estabilizador de proteínas adecuado.
Por lo tanto, el propósito de la presente invención es desarrollar una combinación de adyuvantes para el conjugado anticuerpo monoclonal anti-Her2-MMAE a través de un cribado de gama amplia y un cribado de intervalo de concentración para conseguir los siguientes efectos técnicos: el conjugado anticuerpo monoclonal anti-Her2-MMAE puede disolverse bien antes y después de la liofilización, y tanto las micropartículas insolubles como los precipitados visibles cumplen las normas para inyección humana; además, el conjugado puede ser estable durante mucho tiempo durante la liofilización y el almacenamiento, no se polimeriza ni se degrada fácilmente después de la reconstitución y sigue manteniendo una buena actividad biológica.
Sumario
La presente invención proporciona una formulación farmacéutica líquida acuosa de un conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con las reivindicaciones, en donde la formulación comprende el conjugado anticuerpo-fármaco, un azúcar no reductor, un aminoácido y un solubilizante; en donde el azúcar no reductor se selecciona de manitol, sacarosa y una combinación de los mismos; el aminoácido se selecciona de histidina y un clorhidrato de la misma, y el solubilizante es polisorbato 80 (Tween 80).
En algunas realizaciones, la concentración del manitol es de 100-300 mmol/l, preferentemente 190-300 mmol/l, más preferentemente 200-260 mmol/l, mucho más preferentemente 240-260 mmol/l. La concentración de la sacarosa es de 0-100 mmol/l, preferentemente 40-100 mmol/L, más preferentemente 60-100 mmol/L, mucho más preferentemente 40-60 mmol/L.
En algunas realizaciones, la histidina es clorhidrato de histidina a una concentración de 0-100 mmol/l, preferentemente 5-50 mmol/L, más preferentemente 5-20 mmol/L, mucho más preferentemente 10 mmol/l.
En algunas realizaciones, el porcentaje en masa de Tween 80 es del 0,02 % (p/v).
Además, el anticuerpo del conjugado anticuerpo-fármaco es un anticuerpo monoclonal anti-HER2; y el fármaco con el que se conjuga el anticuerpo es MMAE.
Además, el conjugado anticuerpo anti-HER2-fármaco es un anticuerpo monoclonal anti-HER2-vc-MMAE, en donde el anticuerpo monoclonal anti-HER2 está conectado a MMAE a través de un enlazador vc y la estructura formada por la conexión del enlazador y MMAE es:
Además, el anticuerpo monoclonal anti-HER2 comprende una cadena pesada y una cadena ligera,
(i) la cadena pesada comprende las CDR 1-3 que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 1, 2 y 3, respectivamente; y
(ii) la cadena ligera comprende las CDR 1-3 que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 4, 5 y 6, respectivamente.
Además, el anticuerpo monoclonal es preferentemente un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
En algunas realizaciones, la concentración del anticuerpo monoclonal anti-HER2-vc-MMAE es de 5-30 mg/ml.
En algunas realizaciones, el azúcar no reductor es 240-260 mmol/l de manitol y/o 40 mmol/l-60 mmol/l de sacarosa, el aminoácido es 8-12 mmol/l de clorhidrato de histidina y el solubilizante es el 0,02 % (p/v) de Tween 80.
En algunas realizaciones, en donde el azúcar no reductor es aproximadamente 260 mmol/l de manitol y aproximadamente 40 mmol/l de sacarosa, el aminoácido es aproximadamente 10 mmol/l de clorhidrato de histidina, la concentración del conjugado anticuerpo-fármaco es de aproximadamente 10 mg/ml y el solubilizante es de aproximadamente el 0,02 % (p/v) de Tween 80.
En algunas realizaciones, en donde el azúcar no reductor es aproximadamente 240 mmol/L de manitol y aproximadamente 60 mmol/L de sacarosa, el aminoácido es aproximadamente 10 mmol/l de clorhidrato de histidina, la concentración del conjugado anticuerpo-fármaco es de aproximadamente 10 mg/ml y el solubilizante es de aproximadamente el 0,02 % (p/v) de Tween 80.
Además, la formulación tiene un pH de 4,5-7, preferentemente 5,6-6,8, más preferentemente 5,6-6,5, 5,6-6,4, 5,6-6,3, 6,1-6,4 o 6,1-6,3.
El pH de la formulación se ajusta con NaOH o ácido clorhídrico.
En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica liofilizada se obtiene mediante liofilización de la formulación farmacéutica líquida acuosa anterior.
Además, antes de la liofilización, la formulación farmacéutica líquida acuosa comprende aproximadamente 260 mmol/l de manitol, aproximadamente 40 mmol/l de sacarosa, aproximadamente 10 mmol/l de clorhidrato de histidina, aproximadamente el 0,02 % (p/v) de Tween 80 y aproximadamente 10 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-HER2-vc-MMAE, y tiene un pH de 5,6-6,8.
Además, antes de la liofilización, la formulación farmacéutica líquida acuosa comprende aproximadamente 240 mmol/L de manitol, aproximadamente 60 mmol/L de sacarosa, aproximadamente 10 mmol/l de clorhidrato de histidina, el 0,02 % de Tween 80 y aproximadamente 10 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-HER2-vc-MMAE, y tiene un pH de 5,6-6,8.
Además, antes de la liofilización, los azúcares no reductores comprendidos en la formulación farmacéutica líquida acuosa son manitol y sacarosa en concentraciones de aproximadamente 47,36 mg/ml y aproximadamente 13,69 mg/ml, respectivamente, y el aminoácido es clorhidrato de histidina a una concentración de aproximadamente 2.10 mg/ml, y el solubilizante es Tween 80 en un contenido de aproximadamente el 0,02 % (p/v).
Además, antes de la liofilización, los azúcares no reductores comprendidos en la formulación farmacéutica líquida acuosa son manitol y sacarosa en concentraciones de aproximadamente 43,72 mg/ml y aproximadamente 20,54 mg/ml, respectivamente, y el aminoácido es clorhidrato de histidina a una concentración de aproximadamente 2.10 mg/ml, y el solubilizante es Tween 80 en un contenido de aproximadamente el 0,02 % (p/v).
La presente invención proporciona además el uso de las formulaciones farmacéuticas anteriores en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad provocada por la expresión anormal de Her2, preferentemente cáncer; preferentemente cáncer positivo para Her2; preferentemente cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer urotelial, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer de endometrio, cáncer de pulmón o cáncer de vejiga (Referencia 3:Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) in Cancers: Overexpression and Therapeutic Implications,Nida Iqbal y Naveed Iqbal,Molecular Biology International,Volumen 2014, ID de artículo 852748; y Referencia 4: CN201810998055.4).
La presente invención proporciona además un método para preparar una formulación farmacéutica para un conjugado anticuerpo-fármaco, que comprende:
(1) preparar la formulación de uno cualquiera de los anteriores; y
(2) evaluar la estabilidad del conjugado anticuerpo-fármaco en la formulación.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la electroforesis por SDS-PAGE del anticuerpo desnudo después de la purificación, en la que, 1-2: electroforesis no reductora; y 3-4: electroforesis reductora. El resultado de la Figura 1 muestra que la pureza del anticuerpo monoclonal obtenido en el experimento cumple los requisitos de experimentos adicionales.
La Figura 2 muestra la electroforesis por SDS al 10 %-PAGE del ADC después de la conjugación, en la que, Na: electroforesis no reductora; Nb: electroforesis no reductora después de reducir el anticuerpo con TCEP; Ra: electroforesis reductora de RC48-vc-MMAE; y Rb: electroforesis reductora después de reducir el anticuerpo con TCEP. El resultado de la Figura 2 muestra que la pureza del ADC obtenido después de la conjugación cumple los requisitos de experimentos adicionales.
Ejemplos
Ejemplo 1 Purificación del anticuerpo
El anticuerpo monoclonal mRC48 derivado de murino y el anticuerpo humanizado RC48 relacionado se obtuvieron basándose en los métodos desvelados en el Ejemplo de la solicitud de patente (CN105008398A o WO2015074528A1), en donde RC48 comprendía la región constante de cadena pesada de IgGlK humana y la región variable de cadena pesada RC48-VH, y la región constante de cadena ligera de IgG1 k humana y la región variable de cadena ligera RC48-VL. Cada uno de los fragmentos anteriores se amplificó y después se subclonó en el vector de expresión pcDNA3.0, respectivamente. Los plásmidos construidos se transfectaron en células CHO en suspensión (Invitrogen). Las células se cultivaron en condiciones convencionales. Cuando los nutrientes del medio se agotaron y las células dejaron de crecer, se recogió la mezcla de cultivo. Después, las células se separaron por centrifugación o filtración, y el sobrenadante que contenía la proteína del anticuerpo se recogió y se cargó en la columna de cromatografía de afinidad de proteína A para la primera purificación. La proteína diana eluida se cargó en una columna cromatográfica rellena con empaquetamiento catiónico para la segunda purificación. La proteína diana se recogió y después se cargó en la tercera columna para la tercera purificación en un modo de penetración de proteína diana. La proteína purificada que ha superado el ensayo con diversos indicadores después se concentró por ultrafiltración para obtener una proteína con una concentración de aproximadamente 20-30 mg/ml, que era la solución madre de proteína de anticuerpo y puede almacenarse a -80 °C durante mucho tiempo.
En donde, la secuencia CDR del anticuerpo RC48 es la siguiente.
Tabla 4 Secuencias CDR del anticuer o RC48
Ejemplo 2 Conjugación del Anticuerpo con MMAE
Conjugación del anticuerpo humanizado RC48 con moléculas de fármaco
En primer lugar, las soluciones madre de TCEP (Tris-2-carboxietil-fosfina) y DTPA (ácido dietilentriaminopentacetato) se disolvieron/diluyeron en el tampón de conjugación respectivamente y después se mezclaron con el anticuerpo monoclonal en una relación de volumen de 1:1 (v:v = 1:1), en la que la relación molar de la concentración final de TCEP con respecto al anticuerpo fue de 1,9:1, la concentración final de DTPA fue de 1 mmol/l y la reacción se realizó con agitación a 25 °C durante 2 h. La reacción reductora con TCEP tuvo una buena reproducibilidad y las cifras de tiol libre pudieron alcanzar 3,5-4,5 después de la reducción.
Después de la reducción con TCEP, el anticuerpo puede someterse directamente a una conjugación posterior. Se disolvieron fármacos (vc-MMAE, vc-MMAF, mc-MMAF) en DMSO (dimetilsulfóxido) a una concentración de 10 mmol/l. Los fármacos se añadieron lentamente en la relación molar del fármaco al tiol de 1,1: 1 con respecto al anticuerpo, y la reacción se realizó con agitación a 25 °C durante 2 h. La concentración de tiol libre se detectó a 412 nm mediante el método de DTNB (próximo a cero), los fármacos residuales sin reaccionar y las moléculas pequeñas libres, tales como el DMSO, se retiraron mediante purificación, y el resultado de la conjugación se determinó mediante electroforesis por SDS-PAGE, Métodos de SEC y HPLC. La reacción de conjugación tuvo una buena reproducibilidad y el tiol libre abierto puede conjugarse totalmente con un grado de conjugación de 3,5-4,5.
Ejemplo 3 Efecto del pH sobre la disolución y la pureza del conjugado de anticuerpo contra Her-2 recombinante humanizado-MMAE (RC48-vc-MMAE)
Procedimiento experimental
Se ultrafiltraron 2 g de conjugado anticuerpo monoclonal anti-Her2 humanizado recombinante-MMAE para inyección y se dializaron en un tampón que contenía ácido cítrico 0,1 mol/l, trihidroximetil aminometano 0,02 mol/l, dihidrogenofosfato de sodio 0,02 mol/l y cloruro de sodio 0,15 mol/l en una relación de diálisis no inferior a 104 veces.
La solución obtenida se dividió en 13 partes por igual, y cada parte se concentró hasta una concentración de proteína de 10 mg/ml mediante un tubo de ultrafiltración centrífuga con un tamaño de poro de 30 kDa, y después se ajustó el pH a 4,2, 4,6, 5,0, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0 o 7,4 con solución de ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Se observó la transparencia y se detectó el cambio en la concentración (los resultados son los que se muestran en la Tabla 5). Las muestras se filtraron respectivamente en frascos estériles de penicilina de 20 ml con un filtro de jeringa estéril con un tamaño de poro de la membrana de 0,22 micrómetros en la mesa superlimpia, con 3 frascos de cada valor de pH. Cada frasco se cerró con un tapón de goma estéril y se ató con una tapa de aluminio, y se almacenó a 25 °C. Se tomaron muestras con una jeringa estéril a las 0 horas, 1 día, 3 días y 7 días para el análisis por SEC-HPLC y los resultados son los que se muestran en la Tabla 6.
Los estudios han descubierto que el pH de la proteína en condiciones experimentales tiene un gran impacto en la disolución de la proteína. La proteína precipitó por debajo de pH 5,4 y se disolvió bien por encima de pH 5,6; y los agregados proteicos no aumentaron después de 3 días y aumentaron ligeramente después de 7 días cuando se almacenaron por debajo de pH 6,8, aumentaron con el tiempo por encima de pH 7,0, y cuanto mayor era el pH, más agregados había (véanse la Tabla 5 y la Tabla 6).
Ejemplo 4 Cribado de adyuvantes
A través del análisis de una gran cantidad de información y el cribado a través de experimentos en la fase inicial, se identificaron preliminarmente sacarosa, manitol, glicerol, histidina, arginina, polisorbato 80 (es decir, Tween 80) y similares como adyuvantes candidatos para su posterior cribado, y se sometieron a los siguientes ensayos.
Tabla 8 Trans arencia de la in ección de RC48-vc-MMAE
T l P r z l in i n R 4 -v -MMAE
De los resultados anteriores se desprende que la adición de arginina no tuvo ningún efecto evidente sobre la eliminación de los precipitados visibles de la proteína. Mientras que la adición de sacarosa, glicerol y polisorbato 80 puede mejorar el estado de la proteína. Por lo tanto, se determinó que puede añadirse una cantidad adecuada de sacarosa a la formulación para proteger la proteína, y pueden añadirse glicerol y polisorbato 80 para promover la disolución de la proteína.
Ejemplo 5 Secado por congelación al vacío
La solución madre de proteínas se sacó del frigorífico a -80 °C, se descongeló, se diluyó con precisión con "tampón de formulación 1*" a una concentración de proteína de 10 mg/ml, y se subacondicionó en un frasco estéril convencional de 20 ml de penicilina liofilizada apirógena, 6 ml por frasco, y después se sometió a secado por congelación al vacío.
Condiciones de secado por congelación
Precongelación: -45 °C durante 5 horas;
Secado primario: -26 °C durante 40 horas, a un grado de vacío de 10-15 Pa; y
Secado secundario: 25 °C durante 10 horas, a un grado de vacío de 10-15 Pa.
Después de la liofilización, el frasco se cerró al vacío con un tapón de goma, se sacó del liofilizador y se le puso un tapón de aluminio.
Ejemplo 6: Fórmulas de cribado
Basándose en las fórmulas diseñadas en la Tabla 10, se examinaron el aspecto y la estabilidad de forma de los polvos liofilizados de las formulaciones. Después de la liofilización, las muestras se almacenaron a 4 °C y 37 °C. El aspecto de las muestras se observó los días 0, 1, 3 y 7, respectivamente, y se cribaron las fórmulas correspondientes con mejor aspecto y forma. Los resultados se muestran en la Tabla 11.
Tabla 10 Lista de fórmulas de tampón para la inyección de RC48-vc-MMAE (muestras B2, B4, B6, B8, B10, B12 están de acuerdo con las reivindicaciones
continuación
T l 11 rv i n l l lv li filiz
Ejemplo 7 Determinación de la fórmula y ensayo de estabilidad de los polvos liofilizados
Las fórmulas B7-B12 se eliminaron después de la inspección del aspecto de los polvos liofilizados. Los adyuvantes de las fórmulas B1-B6 se cribaron adicionalmente a través de la inspección del contenido de humedad, precipitados visibles, micropartículas insolubles y la estabilidad.
Los polvos liofilizados de cada fórmula se almacenaron a 37 °C, 25 °C y 4 °C, y después se tomaron muestras a diferentes tiempos y se sometieron a ensayos de SDS-PAGE, HPLC en fase inversa, ensayo de unión a ligando, actividad biológica, contenido de humedad, aspecto, valor de pH, precipitados visibles, micropartículas insolubles y similares.
T l 12 rv i n l l lv li filiz
De la Tabla 12 se desprende que el aspecto de los polvos liofilizados de las fórmulas B1-B6 cumple todos los requisitos convencionales.
Se tomaron tres muestras de cada fórmula y se sometieron a ensayo para determinar el contenido de humedad de acuerdo con el método prescrito. Se calculó el valor promedio del contenido de humedad y los resultados se muestran en la Tabla 12.
El contenido de humedad de las fórmulas B1, B2, B3, B4, B5 y B6 fue inferior al 3 %, lo que se calificó.
Se eligieron aleatoriamente cinco muestras por fórmula y se inspeccionaron los precipitados visibles después de redisolver la muestra de acuerdo con el método prescrito. Después, se tomaron tres de las cinco muestras por fórmula y las micropartículas insolubles se midieron de acuerdo con el método prescrito. Los resultados se muestran en la Tabla 13.
T l 1 Pr i i vi i l mir rí l in l l l r i l i n l lv li filiz
De los resultados de precipitados visibles y micropartículas insolubles se desprende que las fórmulas B1, B3 y B5 no cumplían los requisitos, por lo que se excluyeron.
��
�� De los resultados anteriores se desprende que los productos de las fórmulas B2 y B4 tienen mejor estabilidad a diferentes temperaturas (4 °C, 25 °C, 37 °C), mientras que el producto de fórmula B6 tiene muchas partículas insolubles, por lo que se excluyó. De los ensayos anteriores se desprende que los polvos liofilizados de las fórmulas B2 y B4 presentan un excelente rendimiento en términos de aspecto, contenido de humedad, precipitados visibles y micropartículas insolubles después de la redisolución del polvo liofilizado, y estabilidad.
Basándose en las pruebas experimentales anteriores, puede observarse que la selección de adyuvantes específicos en una clase de sustancias tales como los azúcares no reductores, aminoácidos y solubilizante tiene un efecto impredecible sobre la formulación final. Para el conjugado anticuerpo monoclonal contra Her2-fármaco de la presente invención, se necesita un gran número de experimentos para someter a ensayo diversas propiedades con el fin de obtener finalmente una buena combinación de ingredientes. Por ejemplo, la adición de arginina no tiene ningún efecto evidente sobre la eliminación de los precipitados visibles de la proteína, y la adición de sacarosa, glicerol y polisorbato 80 puede reducir la agregación de la proteína. Sin embargo, la adición de glicerol hará que el producto liofilizado sea propenso a mostrar una contracción y un colapso evidentes en el aspecto de la solución acuosa reconstituida después de la reconstitución. Además, una concentración demasiado alta de sacarosa o demasiado baja de manosa conducirá a un aumento de la materia insoluble después de la reconstrucción. Estos resultados eran difíciles de predecir para los expertos en la materia antes de realizar los ensayos pertinentes. Además, puesto que la formulación de ADC implica el uso combinado de múltiples adyuvantes, ensayos de estabilidad a largo plazo y otros factores, esto dificulta bastante el desarrollo de una formulación de ADC. A través de un gran número de experimentos, los presentes inventores han determinado la combinación de la formulación de ADC contra Her2 con un excelente rendimiento en todos los aspectos. El conjugado anticuerpo monoclonal anti-Her2-MMAE puede disolverse bien antes y después de la liofilización, y tanto las micropartículas insolubles como los precipitados visibles cumplen las normas para inyección humana; al mismo tiempo, el conjugado puede mantenerse estable durante mucho tiempo durante la liofilización y el almacenamiento, especialmente, sigue manteniendo una buena estabilidad después de un almacenamiento a largo plazo a una temperatura elevada de 25 °C o 37 °C. Además, la formulación de ADC no se polimeriza ni se degrada fácilmente después de la reconstitución y mantiene una buena actividad biológica.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una formulación farmacéutica líquida acuosa de un conjugado anticuerpo-fármaco, en donde la formulación comprende el conjugado anticuerpo-fármaco, un azúcar no reductor, un aminoácido y un solubilizante, el azúcar no reductor se selecciona de manitol, sacarosa y una combinación de los mismos, el aminoácido se selecciona de histidina y un clorhidrato de la misma, y el solubilizante es polisorbato 80; en donde el conjugado anticuerpo-fármaco es un anticuerpo monoclonal anti-HER2-vc-MMAE, en donde el anticuerpo monoclonal anti-HER2 se conecta a MMAE a través de un enlazador vc, y la estructura del enlazador y MMAE después de la conexión es:
    y en donde el anticuerpo del conjugado anticuerpo-fármaco comprende una cadena pesada y una cadena ligera, la cadena pesada comprende las CDR 1-3 que tienen secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 1, 2 y 3, respectivamente, y en donde la cadena ligera comprende las CDR 1-3 que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 4, 5 y 6, respectivamente.
  2. 2. La formulación farmacéutica líquida acuosa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la concentración del manitol es de 100-300 mmol/l, preferentemente 190-300 mmol/l, más preferentemente 200-260 mmol/l y mucho más preferentemente 240-260 mmol/l; la concentración de la sacarosa es de 0-100 mmol/l, preferentemente 40 100 mmol/L, más preferentemente 60-100 mmol/l y mucho más preferentemente 40-60 mmol/l.
  3. 3. La formulación farmacéutica líquida acuosa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la histidina es clorhidrato de histidina a una concentración de 0-100 mmol/l, preferentemente 5-50 mmol/L, más preferentemente 5 20 mmol/l y mucho más preferentemente 10 mmol/l.
  4. 4. La formulación farmacéutica líquida acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el porcentaje en masa de polisorbato 80 es del 0,02 % (p/v).
  5. 5. La formulación farmacéutica líquida acuosa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
  6. 6. La formulación farmacéutica líquida acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la concentración del anticuerpo monoclonal anti-HER2-vc-MMAE es de 5-30 mg/ml.
  7. 7. La formulación farmacéutica líquida acuosa de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el azúcar no reductor es 240-260 mmol/l de manitol y/o 40-60 mmol/l de sacarosa, el aminoácido es 8-12 mmol/l de clorhidrato de histidina y el solubilizante es el 0,02 % (p/v) de polisorbato 80; preferentemente, el azúcar no reductor es aproximadamente 260 mmol/l de manitol y aproximadamente 40 mmol/l de sacarosa, el aminoácido es aproximadamente 10 mmol/l de clorhidrato de histidina, la concentración del conjugado anticuerpo-fármaco es de aproximadamente 10 mg/ml y el solubilizante es del 0,02 % (p/v) de polisorbato 80; o preferentemente, el azúcar no reductor es aproximadamente 240 mmol/L de manitol y aproximadamente 60 mmol/L de sacarosa, el aminoácido es aproximadamente 10 mmol/l de clorhidrato de histidina, la concentración del conjugado anticuerpo-fármaco es de aproximadamente 10 mg/ml y el solubilizante es de aproximadamente el 0,02%(p/v) de polisorbato 80.
  8. 8. La formulación farmacéutica líquida acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la formulación tiene un pH de 4,5-7, preferentemente 5,6-6,8, más preferentemente 5,6-6,5, 5,6-6,4, 5,6-6,3, 6,1-6,4 o 6,1-6,3.
  9. 9. Una formulación farmacéutica liofilizada de un conjugado anticuerpo-fármaco, en donde la formulación farmacéutica liofilizada se obtiene mediante liofilización de la formulación farmacéutica líquida acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8; preferentemente, la formulación farmacéutica líquida acuosa comprende aproximadamente 260 mmol/l de manitol, aproximadamente 40 mmol/l de sacarosa, aproximadamente 10 mmol/l de clorhidrato de histidina, aproximadamente el 0,02 % (p/v) de polisorbato 80 y aproximadamente 10 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-HER2-vc-MMAE, y la formulación farmacéutica líquida acuosa tiene un pH de 5,6-6,8; o preferentemente, la formulación farmacéutica líquida acuosa comprende aproximadamente 240 mmol/L de manitol, aproximadamente 60 mmol/L de sacarosa, aproximadamente 10 mmol/l de clorhidrato de histidina, aproximadamente el 0,02 % de polisorbato 80 y aproximadamente 10 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-HER2-vc-MMAE, y la formulación farmacéutica líquida acuosa tiene un pH de 5,6-6,8.
  10. 10. La formulación farmacéutica liofilizada de acuerdo con la reivindicación 9, en donde los azúcares no reductores en la formulación farmacéutica líquida acuosa son manitol y sacarosa en concentraciones de aproximadamente 47,36 mg/ml y aproximadamente 13,69 mg/ml, respectivamente, y el aminoácido es clorhidrato de histidina a una concentración de aproximadamente 2,10 mg/ml, y el solubilizante es polisorbato 80 en un contenido de aproximadamente el 0,02 % (p/v).
  11. 11. La formulación farmacéutica liofilizada de acuerdo con la reivindicación 9, en donde los azúcares no reductores en la formulación farmacéutica líquida acuosa son manitol y sacarosa en concentraciones de aproximadamente 43,72 mg/ml y aproximadamente 20,54 mg/ml, respectivamente, y el aminoácido es clorhidrato de histidina a una concentración de aproximadamente 2,10 mg/ml, y el solubilizante es polisorbato 80 en un contenido de aproximadamente el 0,02 % (p/v).
  12. 12. La formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en el tratamiento de una enfermedad provocada por la expresión anormal de Her2, preferentemente cáncer, más preferentemente cáncer Her2 positivo y mucho más preferentemente cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer urotelial, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer de endometrio, cáncer de pulmón o cáncer de vejiga.
  13. 13. Un método para preparar una formulación farmacéutica de un conjugado anticuerpo-fármaco, que comprende: (1) preparar la formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11; y (2) evaluar la estabilidad del conjugado anticuerpo-fármaco en la formulación.
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