JP2011528706A - 生体分子を接合するための新規な試薬及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
一般式:
X−[Q−W−(CH=CH)n−(CH2)2−L]m (I)
(式中、
Xはポリマーを表し;
Qは連結基を表し;
Wは電子求引基を表し;
nは0又は1乃至4の整数を表し;
Lは脱離基を表し;そして
mは1乃至8の整数を表す。)で表される化合物。該化合物は生体分子の接合における使用を見出した。
【選択図】なし
Description
X−[Q−W−(CH=CH)n−(CH2)2−L]m (I)
(式中、
Xはポリマーを表し;
Qは連結基を表し;
Wは電子求引基を表し;
nは0又は1乃至4の整数を表し;
Lは脱離基を表し;そして
mは1乃至8の整数を表す。)で表される化合物と前記分子の反応を含む。
X−[Q−W−(CH=CH)n−(CH2)2−Z]m (IIa)
(式中、
X、Q、W、n及びmは上述した意味であり、そして
Zはチオール基又はアミノ基を介して接合された前記分子を表す。)によって一般的に表され得る。必要に応じて、この式(IIa)で表される得られる化合物は他の望ましい生成物に変換され得る。
特に、一般式(IIa)で表される得られる化合物は一般式II
X−[Q−W’−(CH=CH)n−(CH2)2−Z]m (II)
(式中、W‘は電子求引性部分又は電子求引性部分の還元によって調製できる部分を表す。)
で表される化合物に変換され得る。
ゼのO−グリカンレセプター部位が使用される場合、次の酵素反応の基質又はターゲットの取り込みを可能にする。ポリグルタミン酸又はポリグリシンのようなポリ(アミノ酸)もまた、サッカリド又はアミノ酸のような天然モノマー及びエチレンオキシド又はメタクリル酸のような合成モノマーから誘導されるハイブリッドポリマーとして使用され得る。
ましくはC1-6アルキル−フェニル基)を表す。)、ケト基、−O−CO−基、−CO−
O−基、−O−CO−O、−O−CO−NR−、−NR−CO−O−、−CO−NR−及
び/又は−NR.CO−基によって終端又は中断され得るものある。そのようなアリール基及びヘテロアリール基Qは発明の1つの好ましい実施形態を形成する。適切なアリール基としてはフェニル基及びナフチル基が挙げられ、一方、適切なヘテロアリール基としては、ピリジン基、ピロール基、フラン基、ピラン基、イミダゾール基、ピラゾール基、オキサゾール基、ピリダジン基、ピリミジン基及びプリン基が挙げられる。特に適切な連結基Qはヘテロアリール基又は、特に、アリール基、特にフェニル基であって、−NR.CO−基によって隣接したポリマーXを終端化したものである。ポリマーへの結合は加水分解に不安定な結合、又は非不安定な結合を介してでもよい。
OR、−OCOR、−OCO2R、−SR、−SOR、−SO2R、−NHCOR、−NRCOR、NHCO2R、−NR.CO2R、−NO、−NHOH、−NR.OH、−C=N−NHCOR、−C=N−NR.COR、−N+R3、−N+H3、−N+HR2、−N+H2R、ハロゲン原子、例えばフッ素原子又は塩素原子、−C≡CR、−C=CR2及び−C=
CHR(ここで、各Rは独立してハロゲン原子又はアルキル基(好ましくはC1-6アルキ
ル基)、アリール基(好ましくはフェニル基)、又はアルキル−アリール基(好ましくはC1-6アルキル−フェニル基)を表す。)から選ばれる1つ以上の同一又は異なった置換
基が挙げられる。電子求引置換基の存在が特に好ましい。好ましい置換基は例えばCN、NO2、−OR、−OCOR、−SR、−NHCOR、−NR.COR、−NHOH及び
−NR.COR.が挙げられる。
そしてW’はそのような基又は例えばCH.OH基、エーテル基CH.OR、エステル基CH.O.C(O)R、アミン基CH.NH2、CH.NHR又はCH.NR2、またはアミドCH.NHC(O)R又はCH.N(C(O)R)2の還元によって得られる基を表
す。
H2R、ハロゲン原子、又は−Oθを表す(ここで、Rは上述した意味であり、そしてθ
は置換アリール基、特に少なくとも1つの電子求引置換基を含むフェニル基を表すものであって、該電子求引置換基としては、例えば、−CN、−NO2、−CO2R、−COH、−CH2OH、−COR、−OR、−OCOR、−OCO2R、−SR、−SOR、−SO2R、−NHCOR、−NRCOR、−NHCO2R、−NR’CO2R、−NO、−NH
OH、−NR’OH、−C=N−NHCOR、−C=N−NR’COR、−N+R3、−N+HR2、−N+H2R、ハロゲン原子、特に塩素原子、又は特にフッ素原子、−C≡CR、−C=CR2及び−C=CHRであり、各Rは独立して上述した意味の一つである。)。
X−[NH−CO−Ar−W−(CH=CH)n−(CH2)2−SO2R’]m (Ia)
(式中、
Arは未置換の又は置換アリール基、特にフェニル基を表すものであって、任意の置換基は連結基Qに含まれるアリール基に対する上記のものから選ばれ;
R’は水素原子又は随意に置換されたアルキル基(好ましくはC1-6アルキル基)、ア
リール基(好ましくはフェニル基)、又はアルキル−アリール基(好ましくはC1-6アル
キル−フェニル基)を表し;そして
W及びmは上述した意味を有する。)で表される試薬を使用して、
一般式
X−[NH−CO−Ar−W’−(CH=CH)n−(CH2)2−Z]m (IIb)
で表される新規な接合体を製造する。
これらの好ましい化合物Ia及びIIbでは、好ましくはnは0であり、そして好ましくはmは1乃至4の整数、特に1を表す。好ましくはそれぞれのWはCO基を表し、そしてW’はCO基又はCH.OH基を表す。好ましくはR’は随意に置換されたアルキル基、例えば−CH2CH2OHのような随意にヒドロキシ置換されたC1-4アルキル基、又は
、特に、C1-4アルキル−アリール基、特にp−トルイル基を表す。好ましくはArは未
置換のフェニル基である。好ましくはXはポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコールである。
X−[Q−W−(CH=CH)n−CH=CH2]m V
(式中、X、Q、W、n、及びmは上述した意味を有する。)
で表される中間化合物の形成を介して進行すると考えられる。
残基の短鎖、例えばタンパク質への合成方法により付着されるヒスチジン残基を最高で12個、ただし一般的には5又は6個の残基を含んでいる、his−タグ(his−tag)の方法によって導入され得る。His−タグはニッケル及びコバルトと強く結合し、His−タグを固定化金属アフィニティークロマトグラフィーとして知られている分離方法に使用されるニッケル−又はコバルト−含有カラムと結合させることを可能とする。ポリヒスチジンタグは幅広く使用され、広範囲のタンパク質及びペプチドに付着して、タンパク質及びペプチド又はそれらから誘導される生成物が、将来、混合物から分離されるようにする。
315−365によって開示されたアレルゲンタンパク質である。アレルゲンのうち、開示されたものはブタクサ抗原E、ミツバチ毒、ダニ・アレルゲンなどである。
であって、それらは診断及び治療目的で臨床医学において使用される。抗体は単独で使用され得又は放射性同位体又は細胞毒性/抗感染症薬のような別の原子又は分子と共有結合(投入“loaded”)され得る。エピトープは予防接種のために使用され得、免疫原性ポリマー―タンパク質接合体を生産する。
、又はトリス―カルボキシエチルホスフィンで還元され得る。
ての、ホウ化水素、例えばホウ化水素ナトリウム、シアノホウ化水素ナトリウム、ホウ化水素カリウム又はトリアセトキシホウ化水素ナトリウムの使用は特に好ましい。使用され得る他の還元剤としては、例えば塩化スズ(II)、アルミニウムアルコキシドのようなアルコキシド、及び水素化リチウムアルミニウムが挙げられる。
一般式
A−Q−W−(CH=CH)n−(CH2)2−L (III)
(式中、Q、W、n及びLは上述した意味を有する。)で表される化合物を、
一般式
X−Bm (IV)
(式中、Xはポリマーを表す。)で表される化合物
と反応させることによって調製され得る;A及びBは(III)及び(IV)で表される化合物が共に反応して、式(I)で表される所望の化合物を生じるように選ばれた基である。
第一工程:p−カルボキシ−3−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロリド2の合成
本工程に対する反応スキームを図1に示す。
250mLの丸底フラスコにp−アセチル安息香酸(15.0g,1)、ピペリジンヒドロクロリド11.11g及びパラホルムアルデヒド8.23gを入れた。無水エタノール(90mL)及び濃塩酸(1mL)をその後加え、そして得られた懸濁液をアルゴン雰囲気下撹拌しながら10時間加熱還流した。還流終了後、アセトン(150mL)を加え、そして反応混合物を室温まで冷却した。得られた白色の沈殿物をガラスフィルター(G3)で単離し、そして冷やしたアセトンで2回洗浄した。固形物をその後真空下で乾燥し、白色の結晶粉末(2,9.72g)を得た。
1H NMR(400MHz、DMSO−d6)δ1.79,2.96,3.45(brm,ピペリジン部分のCH2),3.36(t,2H,COCH2),3.74(t,2H,NCH2),8.09(m,4H,ArH)。
本工程に対する反応スキームを図2に示す。
p−カルボキシ−3−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロリド2(1.0g)及び4−メチルベンゼンチオール(417mg,3)を無水エタノール(7.5mL)及びメタノール(5mL)の混合液で懸濁した。ピペリジン(50μL)をその後加え、そして懸濁液をアルゴン雰囲気中で6時間撹拌しながら加熱還流した。室温まで冷却後得られた白色の沈殿物をガラスフィルター(G3)でろ過し、冷やしたアセトンで注意深く洗浄し、そして真空中で乾燥させて5(614mg)を得た。
1H NMR(400MHz、DMSO−d6)δ2.27(s,3H,フェニル−CH3),3.24,3.39(t,2×2H,CH2),7.14,7.26(d,2×2H,トリル部分のArH),8.03(m,4H,カルボン酸部分のArH)。
本工程に対する反応スキームを図3に示す。
4−(3−(p−トリルチオ)プロパノイル)安息香酸5(160mg)を水(10mL)及びメタノール(10mL)の混合液で懸濁した。氷浴で冷却後、オキソン(720mg、アルドリッチ(Aldrich))を加え、そして反応混合物を一晩(15時間)撹拌しながら室温まで温めた。得られた懸濁液を追加の水(40mL)で希釈して懸濁液をほぼ均一にし、混合物をその後クロロホルム(合計100mL)で3回抽出した。溜まったクロロホルム抽出物を塩水で洗浄しその後MgSO4で乾燥した。30℃、真空下で
の揮発性物質の蒸発により白色の固形物6(149mg)を得た。
1H NMR(400MHz、DMSO−d6)δ2.41(s,3H,フェニル−CH3),3.42(t,2H,CO−CH2),3.64(t,2H,SO2−CH2),7.46,7.82(d,2×2H,トリル部分のArH),8.03(m,4H,カルボン酸部分のArH)。
本工程に対する反応スキームを図4に示す。
4−(3−トシルプロパノイル)安息香酸6(133mg)及びО−(2−アミノエチル)−O’−メチル―PEG8(MW 10kDa,502mg,バイオベクトラ(BioVectra))を乾燥トルエン(5mL)に溶解した。溶媒を加熱しないで真空下で除去し、乾燥固形残渣をその後アルゴン雰囲気下、乾燥ジクロロメタン(15mL)に再溶解した。氷浴で冷却した、得られた溶液に、アルゴン雰囲気下、ゆっくりとジイソプロピルカルボジイミド(DIPC,60mg)を加えた。反応混合物をその後室温で一晩(15時間)撹拌し続けた。揮発性物質をその後真空下(30℃、水浴)で除去し、アセトン(20mL)中微温(35℃)で再溶解した固体残渣を得た。溶液を非吸収性コットンウールでろ過し、不溶性物質を除去した。溶液をその後乾燥氷浴で冷却し、遠心分離(4600rpm、30分間)によって分離された白色の沈殿物を得た。液相をデカントし、この沈殿操作を3回繰り返した。その後得られた灰色がかった白色の固形物を真空下で乾燥し、PEG試薬9(437mg)を得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3)δ2.46(s,3H,フェニル−CH3)
,3.38(s,3H,PEG−OCH3),3.44−3.82(br m,PEG)
,7.38,7.83(d,2×2H,トリル部分のArH),7.95(m,4H,カルボン酸部分のArH)。
1H NMR(400MHz、CDCl3)δ2.46(s,3H,フェニル−CH3)
,3.38(s,3H,PEG−OCH3),3.44−3.82(br m,PEG)
,7.38,7.83(d,2×2H,トリル部分のArH),7.95(m,4H,カルボン酸部分のArH)。
Fab溶液(アブカム(Abcam)cat.no.AB6520、1mg/mL)100μLにDTT原液(脱イオン水中100mM)5μLを加え、そして得られた溶液を30分間、室温で放置した。溶液をpH7.8,50mMリン酸緩衝液95μL、0.15M NaCl及び10mM EDTAで200μLに希釈し、そしてその後illustra NAP−5 column(GEヘルスケア(GE Healthcare)cat.No.17−0854−01)に投入し、pH7.8,50mMリン酸緩衝液、0.15M NaCl及び10mM EDTAで前平衡(pre−equilibrate)した。NAP−5 columnは未乾燥のpH7.8リン酸緩衝液の5×300μLで溶離される。還元Fabは主に画分3で特定され、タンパク質濃度は0.23mg/mLであると推定されるとすぐ、280nmでのUV吸光度を全ての画分用に測定した。
Lを得た。反応溶液を12時間、4℃でインキュベートした。
Invitrogen) cat.No.NP0321BOX)及びニューページ MES SDSランニングバッファー(NuPAGE MES SDS running buffer)(インビトロジェン(Invitrogen) cat.No.NP002)を使用しながら、SDS−PAGE分析をその後反応溶液で行った。ゲルはインスタントブルー(イクスぺドン(Expedon)cat.NoISB1L)で染色した。以下の図5に結果を示す。SDS−PAGE分析のPEGは、タンパク質マーカーに対してその本当の大きさのおよそ2倍になったので、5kDaは10kDaのようになった。Fabはおよそ50kDaのタンパク質であり、非還元或いは還元形態に対する約25kDaでのバンド又は2つのバンドのような場合、SDS−PAGEゲル上において約50kDaでのいずれかの単一バンドのようになった。これらは重くて明るい鎖であり、該鎖はSDSを用いた還元及びインキュベーション時にヒンジジスルフィドによってもはや結合していない。それ故、Fabはジ−PEG化されるが、それによって単一のPEGを溶液中還元ヒンジジスルフィドの2つのシステインのそれぞれに付着し、SDS−PAGE分析は25kDaの重くて明るい鎖のモノPEG化を示す。標識1が付されたレーンはタンパク質マーカーである(ノヴェックス シャープ タンパク質スタンダード(Novex Sharp protein standards、インビトロジェン(Invitrogen)cat.No.LC5800)。レーン2はFabを示す。標識4が付されたレーンはDTT(約25kDa)で還元されたFabを示す。レーン5はPEG化Fabに相当する35kDaにおいて一次生成物であるバンドと5kDa PEG化結果を示す。少量の還元Fabは25kDaにとどまり、FabがほとんどPEG化されたことを示している。レーン6は10kDa PEG化Fabに相当する40kDaマーカーを超えた一次生成物であるバンドと10kDa PEG化結果を示す。レーン7は20kDa PEG化Fabに相当する60kDaマーカーを超えた一次生成物であるバンドと20kDa PEG化結果を示す。レーン3は事前の還元工程なしで試みられたPEG化結果を示す:PEG化の反応部位が還元ジスルフィド結合であるということをPEG化生成物は示さないという事実。
pH7.8において150mM NaCl及び5mM EDTAを含んでいる20mMリン酸ナトリム緩衝液中でアスパラギナーゼの1mg/mL溶液(シグマ(Sigma)cat.no A3809)1mLを、DTT(15.4mg)に加えそして数秒間ボルテックス(vortex)した後、得られた溶液を40分間、室温で放置した。ロード画分(load fraction)として溶離液を集めながら、溶液1mLをその後pH7.8 20mMリン酸ナトリウム緩衝液で前平衡(pre−equilibrate)されたPD−10カラム(GEヘルスケア(GE Healthcare)cat.No.17−0851−01)に加え、該緩衝液は150mM NaCl及び5mM EDTAを含んでいる。カラムはその後未乾燥のリン酸緩衝液の5×1mLで溶離された。画分3及び4を混ぜ合わせて、2mLとした。
5kDa PEG試薬9の溶液10mg/mLを脱イオン水で調製し、2.0μL(遊離チオールに対して1.5当量のPEG)を還元アスパラギナーゼ100μLに加えた。その溶液を数秒間ボルテックス(vortex)し、その次に一晩4℃で置き、その後サンプルをSDS−PAGE分析した。その結果を図6に示す。レーン1はMWを推定するために使用したタンパク質マーカーであり、レーン2はPEG化前のアスパラギナーゼでありそしてレーン3は5kDa PEG試薬による還元アスパラギナーゼの反応溶液を示す。両方のシステインのPEG化に相当する強いバンドが60kDaタンパク質マーカー
の真上に一次生成物として見られた。第二のより低いMWバンドは50kDaタンパク質マーカーの真上に存在し、該マーカーは2つのシステインの1つのみのPEG化に相当する。30と40kDaの間には還元アスパラギナーゼに相当するごくかすかなバンドのみがあり、ほとんど全てのタンパク質はPEG試薬9でPEG化されていることを示す。
GCSF原液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液中0.66mg/mL、pH6.2、150mM NaCl及び10mM EDTAを含む)を各々100μLの5つの画分(PEG化反応に対して天然G−CSF及び4つの画分)に分けた。その画分をG−CSFに対して1モル当量のPEG試薬と共に4℃で一晩インキュベートした。5kDa PEG試薬9及び5kDa PEGマレイミド(フルカ(Fluka)cat.no.63187)に対して、脱イオン水中で5mg/mL PEG試薬3.5μLを加えた。10kDa PEG試薬9に対して、脱イオン水中で5mg/mL PEG溶液7μLを加えた。20kDa PEG試薬9に対して脱イオン水中で5mg/mL 溶液14.0μLを加えた。PEG化反応をSDS−PAGE(ニューページ[登録商標] ノーべックス 4−12% ビス−トリスゲル、MESバッファー(全てインビトロジェン)(NuPAGE Novex 4−12% Bis−Tris gels,MES buffer,
all from Invitrogen)、及びインスタントブルーステイン(イクスペデオン(Expedeon) cat.No.ISB1L))によって分析した。添加されたPEG試薬を用いていないG−CSFは15と20kDaタンパク質マーカーの間にバンドとして現れた。9による5kDa PEG化に対し、5kDa モノPEG化GCSFに相当する約30kDaにおいてバンドは可視的である。9による10kDa PEG化に対し、40kDaより下のバンドは10kDa モノPEG化GCSFに相当して可視的である。20kDa PEG結果に対し、20kDa モノPEG化G−CSFに相当する50と60kDaの間のバンドは可視的である。5kDa PEGマレイミド反応に対し、未反応のG−CSF以外にバンドは見られなく、反応は本試薬とでは起きなかったことを示す。
IFN α―2b(2mM EDTA及び150mM NaClを含んでいる10mM
リン酸ナトリウム緩衝液中1.13mg/mL、pH7.5)の20μL溶液に1モル当量の10kDa PEG試薬9(脱イオン水中6mg/mL溶液の1.8μL)を加え、得られた溶液を室温で一晩インキュベートした。1モル当量の20kDa PEG試薬9(脱イオン水中6.6mg/mL溶液の3.3μL)でも繰り返し行った。両サンプルをその後SDS−PAGE(ニューページ[登録商標] ノーべックス 4−12% ビス−トリスゲル、MESランニングバッファー(全てインビトロジェン)(NuPAGE
Novex 4−12% Bis−Tris gels,MES running b
uffer,all from Invitrogen)、及びインスタントブルーステイン(イクスペデオン(Expedeon) cat.No.ISB1L)によって分析した。その結果を図7に示す。標識1が付されたレーンはタンパク質マーカーである。レーン2は出発IFNのみである。レーン3は10kDa PEG試薬9反応の結果を示す。接合された1乃至5個のPEG鎖を有するIFNに相当する30と160kDa タンパク質マーカーの間に5つのはっきりと区別できるバンドがある。レーン4は20kDa
PEG試薬9反応の結果を示す。接合された1乃至3つのPEG鎖を有するIFNに相
当する60から110kDa タンパク質マーカーの間に3つのはっきりと区別できるバンドがある。標識5が付されたレーンは染色していない20kDa PEG試薬であり、そのためどのバンドも可視的ではない。標識6が付されたレーンは染色していない10kDa PEG試薬であり、そのためどのバンドも可視的ではない。
レプチンフラグメント116−130アミドマウス(シグマ(Sigma)cat.no.L6788)1mgをpH7.8で150mM NaCl及び10mM EDTAを含んでいる50mM リン酸ナトリウム緩衝液1mLに溶解した。5kDa PEG試薬9の5mg/mL溶液をpH7.8で同じ緩衝液で調製した。レプチンフラグメント溶液50μLを50μL緩衝液及びPEG溶液(システイン上の遊離チオールに対して3モル当量のPEG)96.1μLに加えた。溶液を数秒間ボルテックス(vortex)し、その次に一晩4℃で置いた、その後サンプルをRP−HPLC分析した。RP−HPLCはJASCO HPLCシステムに取り付けられた分析カラム Source 5RPC
4.6/150(アマシャム バイオサイエンス(Amersham bioscience)cat.no.17511601)から構成した。緩衝液Aは水+0.05%トリフルオロ酢酸(フィッシャーサイエンティフィック HPLCグレード(Fisher
scientific HPLC grade)であり、また緩衝液Bはアセトニトリル(フィッシャーサイエンティフィック HPLCグレード(Fisher scientific HPLC grade))であった。この方法は1mL/minの流速で30分以上かけて緩衝液Aの100%緩衝液を0%にしたものである。HPLCプロファイルを214nm及び280nmの下で観察した。レプチンフラグメント、PEG試薬及び反応溶液に対する結果を図8に示す。
レプチンフラグメントは11.4分の保持時間である。反応混合液ではこのピークは消失して16.5分におけるピークに置き換わり、これはフラグメントがうまく誘導体化されたことを示している。
抗TNFアルファドメイン抗体フラグメント溶液(図12においてTAR1−5−19に記載された配列のように特許国際公開2005/035572号パンフレットから抜粋され、そしてタンパク質のC末端上の6個のヒスチジンタグで表わされるタンパク質配列、50mM リン酸ナトリウム、150m塩化ナトリウム及び350mMイミダゾール中1.5mg/mL、pH7.5)2.7mLを脱イオン水(40mg/mL、タンパク質に対して1.9モル当量)中でPEG試薬の溶液0.3mLに加えた。この溶液をD−Tube dialyzer(ノバジェン(Novagen),cat.No.71508−3)に移し、16時間以上4℃で1L pH6.2緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、20mM EDTA)に対して透析した。直線的濃度勾配法(linear gradient)(30分以上かけて、20mM酢酸ナトリウム、pH4.5を、700mM塩化ナトリウムを含む20mM酢酸ナトリウム、pH4.5へとする)を用いながらこの反応溶液をResource Sカラム(GEヘルスケア(GE Healthcare),cat.No.17−1178−01)で精製した。
Invitrogen) cat.No.NP0321BOX)及びニューページ ME
S SDSランニングバッファー(NuPAGE MES SDS running buffer)(インビトロジェン(Invitrogen) cat.No.NP002)を使用し、ゲルをインスタントブルー(イクスぺドン(Expedon)cat.No.ISB1L)で染色した。SDS−PAGE分析のPEGは、タンパク質マーカーに対してその本当の大きさのほぼ2倍になったので、20kDa PEGは40kDaタンパク質のようになった。ドメイン抗体フラグメントはおそよ12.7kDaのタンパク質である。標識1が付されたレーンはタンパク質マーカーである(ノヴェックス シャープ タンパク質スタンダード(Novex Sharp protein standards)、インビトロジェン(Invitrogen)cat.No.LC5800)。レーン2はタンパク質のみを示す。標識3が付されたレーンは反応溶液である。53kDaにおけるバンドはモノPEG化タンパク質に相当する。ジPEG−タンパク質が約80kDaのバンド付近に現れ、レーンの上部に少量のマルチPEG化されたタンパク質が存在する。レーン4は未PEG化タンパク質からの混入がない単一のバンドとして精製されたモノPEG化ドメイン抗体フラグメントを示す。
pH7.8において150mM NaCl及び20mM EDTAを含んでいる50mMリン酸緩衝液中で抗−TNF アルファ アフィボディ(アフィボディ AB(Affibody AB)cat.no 10.0841.01)の1mg/mL溶液1mLを、DTT(3.0mg)に加えて任意のジスルフィド結合を還元し、数秒間ボルテックス(vortex)した後、得られた溶液を30分間室温で放置した。この溶液1mLをその後pH6.2リン酸緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl及び20mM EDTA)で前平衡(pre−equilibrate)されたPD−10カラム(GEヘルスケア(GE Healthcare)cat.no.17−0851−01)に投入した。カラムはその後未乾燥のpH6.2 リン酸緩衝液の5×1mLで溶離される。A280nm測定は画分3及び4が還元タンパク質を含むこと、また混ぜ合わせて2mLとなることを示した。このタンパク質溶液に飽和水溶性ヒドロキノン溶液10μLを加え、そしてよくかき混ぜた。20KDa PEG試薬9の20mg/mL溶液を脱イオン水で調製し、73μL(遊離システインチオールに対して1モル当量のPEG)をDTT処理されたアフィボディに加えた。この溶液を数秒間ボルテックス(vortex)し、そしてその次に3時間室温で置き、その後サンプルをSDS−PAGE分析した。
TNF−α(15mM Na2CO3、34.9mM NaHCO3、pH9.6中10
μg/mL)を100μL/wellで96穴マイクロプレート(96−well microtitre plate)(Maxisorp、Nunc)に加え、一晩4℃でインキュベートした。TNF−αをその後取り除き、PBS/1% BSAを100μL/wellで加え、そして室温で1時間インキュベートした。PBS/1% BSAをその後取り除き、PEG化抗TNF−α アフィボディ(PBS/1% BSA中0.026、0.13、0.65、3.25ug/mL)を加え、そして室温で1時間インキュベートした。PEG化アフィボディを対照穴に加えなかった。このプレートをその後PBS/0.1%Tween20(PBS/T) 300μL/wellで3回洗浄した。抗PEGウサギ抗体(エピトミクス(Epitomics),cat.no.2061−1;1% BSA/PBS中1:1000)をその後100μL/wellで加え、そして室温で1時間インキュベートした。PBS/Tで3回洗浄した後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ−接合抗ウサギ抗体(アブカム(Abcam),cat.no.ab6721;PBS/1%BSA中1:1000)を100μL/wellで加え、そして室温で1時間インキュベートした。穴をその後PBS/Tで3回洗浄し、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン基質(シグマ−アルドリッチ(Sigma−Aldrich),cat.no.T0440)を100μL/wellで加えた。暗闇において15分間のインキュベート後、停止試薬(シグマ−アルドリッチ(Sigma−Aldrich),cat.no.S5689)を100μL/wellで加え、650nmでの吸光度を読み取った。
N−末端上に8個のヒスチジン配列を持つIFN α−2bの溶液(150mM NaClを含んでいる50mMリン酸ナトリウム緩衝液中1.07mg/mL、pH7.4)4.67mLを2.6モル当量の20kDa PEG試薬9(脱イオン水中60mg/mL溶液217μL)に加え、得られた溶液を室温で一晩インキュベートした。SDS−PAGE(ニューページ[登録商標]ノーべックス 4−12% ビス−トリスゲル、MESランニングバッファー(全てインビトロジェン)(NuPAGE Novex 4−1
2% Bis−Tris gels,MES running buffer,all from Invitrogen)、及びインスタントブルー(イクスぺドン(Expedon)cat.NoISB1L)染色による分析後、反応サンプルを高性能陰イオン交換クロマトグラフィー(Jasco HPLCシステムに接続された、東ソー DEAEカラム、S TSKgel DESE−5PW、スペルコ(Supelco)cat no.8−07164)にかけて、モノPEG化IFN α−2bを精製した。イオン交換カラムから得られた画分(各1mL)をSDS−PAGEによって分析した。主にモノPEG化IFNを含んでいる画分を凍結乾燥した。凍結乾燥後に得られた残渣を150mM
NaCl及び2mM ホウ化水素ナトリウムを含んでいる50mM リン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、室温で1時間放置した。得られた溶液をその後サイズ排除クロマトグラ
フィー(HiLoad 16/60、Superdex 200、溶離液として50mM
PBS、1.6mL/min 流速及び215nmでの検出)にかけて、モノPEG化IFNを単離した。単離されたサンプルをSDS−PAGEによって分析し、その結果を図12に示す。図12の標識1が付されたレーンはタンパク質マーカーである。標識2が付されたレーンは出発IFNのみを示す。レーン3は精製された20kDaモノPEG化IFN α−2bに相当する50と60kDaタンパク質マーカー間の単一のバンドを示す。
no.198099)で染色した。プレートをその後PBS 300μL/wellで2回洗浄し、空気乾燥させた。染料を2% SDS溶液(50μL/well)で可溶化し、吸光度を570nmで測定した。(A)ホウ化水素ナトリウムで処理されていない、又は(B)処理された20kDa PEG化IFN−α2bはそれぞれ、64pg/mL及び68pg/mLの活性を示した。
PEG試薬9(5kDa及び20kDa試料)の安定性をpH7.4における核磁気共鳴(NMR)分光学によってメトキシポリ(エチレングリコール)マレイミドプロピオンアミド(カイロテックテクノロジーリミテッド(Chirotech Technology Ltd),cat.no.008−008,lot no.223126001)及びα−メトキシ−ω−エチル−マレイミドポリエチレングリコール(アイリスバイオテック(Iris Biotech)cat.no.PEG1146,lot no.128512)と比較した。pH7.4において150mM NaCl及び20mM EDTAを含んでいる50mM リン酸ナトリウム水溶液を最初に凍結乾燥し、そして酸化ジュウテリウムで同体積にもどすことでpH7.4 D2O溶液を製造した。基準としてアセ
トンを3mLにつき1.0μLで緩衝液に加えた。PEG試薬のサンプルを緩衝液0.75mL中1μモルで溶解し、400MHz NMR分光学によって4時間後及び25.5時間後分析した。PEGマレイミドサンプルの安定性を2.17ppmにおけるアセトン基準に対する積分を使用して標準化した後、6.86ppmにおける積分を比較することによって決定した。PEG試薬9の安定性は2.21ppmにおけるアセトン基準に対する積分を使用して標準化した後、7.31、7.40、7.47、7.73、及び8.03ppmにおけるシグナルに対する全積分を比較して決定した。7.31、7.47及び8.03ppmにおけるピークはPEG試薬9から予想通りに形成されたタンパク質活性PEG試薬10(図14)からのものである。実験中、9の10に対する比率は両方のサンプル1及び2に対し1.46から1.77乃至1までの幅がある。安定性研究結果を表1に示す。PEGマレイミドサンプルはpH7.4において21.5時間以上で19から55%まで分解したが、一方PEG試薬9サンプルは同じ条件下では分解しなかった。
Lamβ1925-933は合成直鎖非ペプチド(Cys−Asp−Pro−Gly−Tyr
−Ile−Gly−Ser−Arg−NH2)(シグマ(Sigma)cat.no.C
0668)であり、それはラミニンB1鎖の残基925−933に相当し、単一のシステインチオールを含む。
様々なpHでのPEG試薬9を用いたPEG化:凍結乾燥されたLamβ1925-933ペ
プチド(1mg)を脱イオン水500μLに溶解し、2mg/mL原液を得た。ボルテックス(vortex)した後、ペプチド原液を未乾燥で使用し又はアリコートし、そして使用するまで−80℃で保存した。Lamβ1925-933原液を2倍に希釈し、PEG化反
応混合液中で最終濃度1mg/mL(1mM)を得た。5kDa PEG試薬9(5mg)を脱イオン水200μLに溶解し、25mg/mL原液を得た。ボルテックス(vortex)した後、ペプチド原液を未乾燥で使用し又はアリコートし、そして使用するまで−80℃で保存した。PEG原液を5倍に希釈し、PEG化反応混合液中で最終濃度5mg/mL(1mM)を得た。緩衝原液はpH6.0−8.0の範囲に対し1Mリン酸ナトリウム緩衝液及びpH8.5−10.0の範囲に対し0.1mM 炭酸―重炭酸ソーダを含む。全てのpH値に対し、緩衝原液もまた10mM EDTA及びヒドロキノン381μMを含む。緩衝原液を10倍に希釈し、最終濃度が100mMの緩衝剤(リン酸ナトリウム又は炭酸―重炭酸ソーダ)、1mMのEDTA及び38μMのヒドロキノンを得た。
溶液(PEG試薬対Lamβ1925-933型ペプチドのモル比率1:1に相当)2μL及び
脱イオン水2μLを含み、全反応容積を10μLとした。数秒間ボルテックス(vortex)した後、続けて簡潔な遠心分離(5,000×gで30秒)を行い、チューブの底に溶液を集め、この反応混合液を室温のまま0.25、0.5、1、2、4、16及び24時間インキュベートした。室温でのインキュベート後、反応混合液を含んでいるチューブを−80℃に置き、逆相クロマトグラフィーによって分析するまで保存した。
GEヘルスケア(GE Healthcare),cat.no.17−5116−01)カラムを使用した。PC及びレオダイン7725iマニュアルインジェクターバルブ(Rheodyne 7725i manual injector valve)に接続するため、カラムをJasco PU−980 インテリジェントポンプ(Intelligent Pump)、Jasco LG−980−02 ターナリ―グラジエントユニット(Ternary Gradient Unit)、Jasco デガッシ ポピュライレ デガッシング ユニット(Degassys Populaire Degassing Unit)、Jasco UV−970 4−λ インテリジェント(Intelligent) UV ディテクター(Detector)、Jasco LC−NetII/ADC インターフェース(Interface)からなるJasco HPLCシステムに接続した。EZchrom SI バージョン3.2.1 ビルド3.2.1.34 クロマトグラフィーソフトウエアパッケージ(アジレント・テクノロジー(Agilent Technologies))を使用しながら、コンピュータによってHPLCシステムを制御した。クロマトグラム分析及びデータのエクスポートもまたEZchrom SIクロマトグラフィーデータシステムを使用しながら行った。
UV、HPLCグレード、フィッシャー cat.no.A/0627/17)及び0.065%トリフルオロ酢酸(TFA)(アクロス(Acros)cat.no.139721000)を含む。溶離液Bはアセトニトリル中に0.075% TFAを含むが一方、溶離液Cは100%アセトニトリルである。溶離液を使用前に超音波処理によって脱気した。溶離プログラムは20分間の、0−64% B勾配を含み、続いて100%アセトニトリルで洗浄し、溶離液Aで前平衡(pre−equilibrate)した(表2)。実行中、一定の流速1mL/minを保持した。215、250、280及び350nmにおける吸光度を実行中記録した。各サンプル(10μL)を解凍し、上澄み5μLを逆相クロマトグラフィーカラムに注入する前に速やかに簡潔に遠心分離機にかけた(14,000gで1分)。
クが現れた:PEG反応性ペプチドLamβ1925-933(ピーク1);ジスルフィド形成
を経て形成された未反応のペプチド二量体(ピーク2);PEG試薬9スルホン酸脱離基(ピーク3、図14中の化合物11);PEG化ペプチド生成物(5kDa PEG−Lamβ1925-933接合体)に相当するピーク(ピーク4)及びPEG試薬9(ピーク6、
未反応形態)。
た、それ故対応するピーク(ピーク2)は実験中、未変化のままであった。この結果は還元ペプチドを発生しながらシステインチオールPEG化と一致する。
チド(ピーク1)から5kDa PEG化Lamβ1925-933生成物(ピーク4)への変
換を測定することによって推定した。ペプチドピーク結果を100の値を各PEG化反応に使用されたペプチドの全量に相当する較正されたピークエリアに割り当てることによって標準化した、一方生成物ピーク結果をペプチドの生成物への全変換に相当する推定される最大生成物ピークエリアを用いて標準化した。変換(%)を反応に用いられたペプチドの初期量と比較してPEG化ペプチドの割合として定義した。その結果を図15に示す。pH6.0、6.5、7.0、7.5及び8.0において、全てのペプチドがPEG化された。終了速度はpHによって左右され、より高いpH程より速い速度であり、異なったpHにおいて反応性構造10(図14)の形成の異なった速度を示す。
実施例11のLamβ1925-933ペプチドに対するPEG試薬9の反応性を商業的に入
手可能なチオール反応性PEG試薬、PEGマレイミド(O−(2−マレイミドエチル)−Ω’−メチル−ポリエチレングリコール5,000、フルカ(Fluka)cat.no.63187)と比較した。PEG試薬9が実験時間スケールにおいて反応に速やかに使用できるようにするため、試薬をpH7.5でインキュベートすること(2時間、4℃)によってチオール反応性形態(試薬10、図14)を最初に形成し、そして試薬10をペプチド接合する前にRPクロマトグラフィーにより単離した。全てのペプチド反応は新規に溶解したPEG試薬を用いて行った。一時的に、PEG化反応溶液(反応スケール10μL)は100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0−8.0)又は100mM炭酸―重炭酸ソーダ(pH8.5−10.0)及び1mM EDTA中で10μg Lamβ1925-933、PEG(5kDa)試薬50μg(PEG試薬対Lamβ1925-933型ペプチドのモル比率1:1に相当)を含んでいた。室温でのインキュベーション後、反応混合液を実施例11で述べたように逆相クロマトグラフィーによって分析した。その結果を図16に示す。PEG試薬9(pH9.0乃至10)及び10(pH6.0乃至8.0)に対し、ペプチドのPEG化形態への完全な変換は15分以内にpH6.0とpH10の間で達成された。
PEG試薬9から製造された精製Lamβ1925-933ペプチド接合体及び実施例12か
らのPEGマレイミドの安定性を12日間以上比較した。接合体の安定性は実施例11で述べたように逆相クロマトグラフィーを用いてPEG−ペプチドピークの領域を測定することによって決定した。
PEG試薬9を用いたPEG化Lamβ1925-933の合成:接合体は実施例11の修正
法を用いて調製した(最終ペプチド濃度1.6mg/mL及びペプチド0.4mgを用いてpH6.0)。生成物をRP−クロマトグラフィーで単離した。Lamβ1925-933−
PEG接合体に相当する溶離ピークを集め、凍結乾燥しそしてその後脱イオン水中で再懸濁した。最終的に、2mM水素化ホウ素ナトリウム(アクロスオルガニクス(Acros
Organics),cat.no.200050250)を加え、サンプルを室温で30分間インキュベートした後、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を加えた。
PEGマレイミドを用いたPEG化Lamβ1925-933の合成:Lamβ1925-933(0.4mg)を5kDa PEGマレイミド(5kDa、フルカ(Fluka)cat.no.63187)試薬と共にPEG化用に使用した。一時的に、10×緩衝原液(1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)及び10mM EDTAを含んでいる)20μL及びPEG試薬原液(脱イオン水中25mg/mL)40μLをペプチド原液(脱イオン水中2mg/mL)200μLに加えた。室温での1.5時間のインキュベーション後、生成物を実施例11で述べたようにRP−クロマトグラフィーを用いて精製した。溶離ピークサンプルを乾燥凍結し、そしてその次に脱イオン水で再懸濁しその後50mMのリン酸ナトリウム緩衝液をpHを8.0に調節するために加えた。両方のPEG−ペプチド溶液の濃度がおおよそ等しいことを確認するためにRP−クロマトグラフィーを使用した。
μL)、10×緩衝原液(1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、381μMヒドロキノン及び10mM EDTAを含んでいる)2μL及びPEG試薬12(25mg/mL)2μLをLamβ1925-933原液(脱イオン水中2mg/mL)10μLに加えた
。これは1:0.375モデルペプチド対PEG試薬のモル比率に相当する。反応溶液(5μL)を室温で2.5時間インキュベーションした後に(実施例11で述べたように)分析用RPCによって分析した。反応溶液の全ての成分が別個のピークとして溶出した:Lamβ1925-933単量体は8.1分で溶出した、酸化Lamβ1925-933二量体は8.9分で溶出した、不活性PEG試薬は17.3分で溶出した、活性PEG試薬は15.7分で溶出しそして脱離基11は10.1分であった。生成物ピークは14.2分で溶出した。2.5時間後、反応溶液中に存在(試薬12に対する86%反応)する遊離Lamβ1925-933の65%は接合され、PEG試薬12の両方の反応性末端が反応すること及びこ
の二官能性試薬はPEG分子の両末端で1つのペプチド分子に付着するのにうまく使用され得ることを示す。
PVP試薬の調製(3工程):
工程1:末端アミノ基を有するPVP:
圧力管にシステアミン(0.028g)、ジオキサン(8mL)及びマグネチック撹拌子を入れた。溶液を形成するために穏やかな加熱後、この溶液をアルゴンと共に5分間室温でパージした。パージしながら、1−ビニル−2−ピロリドン(2.0g)をその後加え、さらに5分後次にこれに2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオニトリル)を加えた(0.089g)。さらに2分後、圧力管をアルゴン雰囲気下スクリューキャップで封をし、撹拌しながら17時間60℃のオイルバス中に置いた。管及び内容物を室温まで冷却した後、ポリマー生成物の沈殿物を得るためにジエチルエーテル(15mL)を加えた。液相をデカントし固形残渣をアセトン(3mL)に再溶解した。得られたアセトン溶液をその後迅速に撹拌されているジエチルエーテル(25mL)に滴下し沈殿物を真空のほんの僅かなバーストと共にno.2 焼結ガラス漏斗で単離した。固形物を未乾燥のジエチルエーテル(10mL)で洗浄し、その後室温で真空下乾燥させた(質量=1.44g、白色の固体)。
工程2:PVP−アミンへのタンパク質反応末端基の接合:
PVP−アミン(500mg)、4−(3−トシルプロパノイル)安息香酸(図3中の構造6、166mg)、及び4−ジメチルアミノピリジン(6mg)をアルゴン雰囲気下、無水ジクロロメタン(10mL)で混合し、その後撹拌しながら、1,3−ジイソプロピルカルボジイミド(155μL)を加えた。得られた混合物を室温で週末を通して撹拌した。週末の間揮発性物質は蒸発したので、固形残渣をジクロロメタン(10mL)中に再溶解し、そして非吸収性コットン−ウールを通してろ過した。その後ろ液にジエチルエーテル(30mL)を加え、得られた沈殿物を遠心分離(4,600rpm、−9℃、10分)によって単離した。液相をデカントし、残りの残渣をジクロロメタン(10mL)中に再溶解した。ジエチルエーテル沈殿精製方法を2回以上繰り返し、残渣を真空下乾燥させた(513mg)。リンカー基を接合させたPVPに対する特徴的なNMRシグナルはCDCl3において7.97、7.82、7.59及び7.38に現れた。
工程3:PVP試薬の分別:
上述の段階で得られた固形物の一部(120mg)を水溶性の20mM酢酸ナトリウム緩衝液、150mM NaCl、pH 4.0で混合し、その後澄明な液が可視的になるまで13,000rpmで遠心分離機にかけ、そして液相0.45μmをろ過した。ろ液をその後溶出ピークの間1分ごとに留分を集めることにより1mL/minにおいて20mM酢酸ナトリウム緩衝液、150mM、pH4.0を稼動させながら、HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade size exclusion column(GEヘルスケア(GE Healthcare))で分別した(1.9mL加えた)。73.9乃至74.9分の間に溶出している画分を凍結乾燥後にタンパク質接合用に使用した。ペプチド反応を1mM EDTA、38μMヒドロキノン、1.03mM Lamβ1925-933及び過剰のPVP試薬を含んでいる100mMリン
酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)中で行った。反応混合液を実施例11で述べたように分析用RPCによって分析した。室温での1時間のインキュベーション後、反応混合液中に存在する遊離Lamβ1925-933モデルペプチドのおよそ60%がLamβ1925-933−PVP接合体(11.3分のRPC保持時間)に変換され、これはPEG以外のポリマーが使用され得ることをうまく証明している。
9に特徴的なシグナルがあった。
実施例11のLamβ1925-933モデルペプチドとの反応:反応を1mM EDTA、
38μMヒドロキノン、1.03mM Lamβ1925-933及び3モル当量のPEG試薬
13を含んでいる100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)中で行った。反応混合液を実施例11で述べたように分析用RPCによって分析した。単量体Lamβ1925-933は8.1分で溶出し、二量化Lamβ1925-933は8.9分で溶出し、アミン脱離基は9.3分で溶出し、アミン脱離基を有さないPEG試薬13は15.2分、PEG試薬13は15.75分、そして生成物のピークは14.2分であった。室温での1時間のインキュベーション後、反応混合液中に存在する遊離Lamβ1925-933モデルペプチドのお
よそ10%がLamβ1925-933−PEG接合体に変換した。
ヒトインターロイキン−1−レセプターアンタゴニスト(IL−1−Ra)の組み換え非グルコシル化形態をモデルタンパク質として使用した。IL−1−Raは153アミノ酸、2つのジスルフィド結合(Cys69/Cys116及びCys66/Cys122)からなり、17.3kDaの分子量を有しそしてN−末端のヘキサヒスチジンタグを含む。
一連のチオールPEG化は50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0及び7.5)中で1−4モル当量の10kDa PEG試薬9を使用して行った。発現されたタンパク質は還元したので、PEG化前にジスルフィドの還元は必要ではなかった。タンパク質濃度は0.1mg/mLであった。4℃での1時間のインキュベーション後、サンプルをSDS−PAGE分析し、その結果を図18に示した。pH6.0のみならず7.5においても、1モル当量のPEG試薬を使用した場合、PEG化反応の主な生成物はモノ−PEG化IL−1−Raであった。ジ−PEG化生成物に相当するかすかなバンドもまた見られ、同様に未PEG化IL1−Raに相当するバンドも見られた。反応に使用されたPEGのモル当量を増加させるとジ−、トリ−及びテトラ−PEG化された種が増加した。pH6.0でのより大きなスケールのPEG化をその後20mM EDTAを含んでいる50mMリン酸ナトリム緩衝液pH6.0中でIR−1−Ra(0.2mg/mL)1.5mg及び1.5モル当量の20kDa PEG試薬9を使用して行った。溶液を少しの間ボルテックス(vortex)し、2時間4℃で置いた。PEG化IL−1−Raを固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。IMAC前に、アミコウルトラ−4(Amicon ultra−4) 3,000Da MWCO 限外ろ過遠心装置(ultrafiltration
centrifugal device)(ミリポア(Millipore)、cat.no.UFC800324)を使用しながら、EDTAを未乾燥のリン酸緩衝液pH7.4を用いて濃縮と希釈の繰り返しサイクルによって取り除いた。最終的に、サンプルを4mLに濃縮し室温で30分間、2mMホウ化水素ナトリウムで処理し、続けてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.4で前平衡(pre−equilibrate)させたHisTrap HP(1mL)カラム(GEヘルスケア(GE Healthcare),cat.no.17−5247−01)に投入した。カラムを20mL PBSで洗浄し、溶離は40分かけてPBSを500mMイミダゾールを含んでいるPBSにする勾配を含む。溶出液の画分(1mL)を集め、各画分のアリコートをSDS−PAGEによって分析して、PEG化生成物を含んでいる画分を特定した。その後、PEG化生成物を含んでいる画分を溜めて限外ろ過(Amicon ultra−4 3,000Da MWCO)によって最終容積0.6mLに濃縮した。濃縮されたIMAC画分をPBS pH7.4で前平衡(pre−equilibrate)させたHiLoad Superdex 200 16/60カラム(GEヘルスケア(GE Healthcare),cat.no.17−1069−01)に投入した。流速は実行中1mL/minに保ち、モノ−PEG化生成物は約62分で溶出した。画分(1mL)を溶出ピーク周辺で集め、各画分のアリコートをSDS−PAGEによって分析した。純粋なモノ−PEG化生成
物を含んでいる画分を限外ろ過によって濃縮しそしてSDS−PAGEによって再分析して、純度を確認した。その結果を図19のレーン2に示した。ゲルはモノ−PEG化タンパク質に相当する単一のバンドを示し、遊離タンパク質は可視的ではなかった。
以下のようなPEG化反応前に硫酸銅を用いてタンパク質遊離システインを酸化してジスルフィドにした後、実施例17のIL−1Raをポリヒスチジンタグ上でPEG化した;硫酸銅(1mM)を200mM NaClを含んでいる50mM Tris・HCl(pH8.0)においてIL−1Ra(0.6mg/mL、1.5mg IL−1−Ra)の2.5mL溶液に加えた。4℃で16時間のインキュベーション後、25mM EDTAを加え、サンプルを20mM EDTAを含んでいる50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5で前平衡(pre−equilibrate)されたPD−10カラム(GEヘルスケア(GE Healthcare))に投入した。カラムをその後未乾燥のリン酸緩衝液3.5μLで溶出した。PEG化に使用されたタンパク質濃度は0.43mg/mL及びpH7.4でありそして4℃で16時間インキュベートした。PEG試薬9(20kDa)はタンパク質に対して1.5モル当量である。反応は4℃で16時間インキュベートした。モノPEG化種をホウ化水素ナトリウム処理と共に実施例17で述べたように同じクロマトグラフィーを使用しながら単離した。生成物のSDS−PAGE結果を図19のレーン2に示した、レーン2には遊離タンパク質は見ることができなかった。生成物の生物活性は実施例17で述べたようにMG−63細胞中のIL−1β−依存的IL−6放出の抑制を測定することによって評価し、その結果を図20に示した。PEG化IL−1Raは分析結果において阻害活性を有していた。
PEG化4−(3−(2−ヒドロキシエチルスルホニル)プロパノイル)安息香酸試薬15を図21に示されているように、実施例1中のPEG化4−(3−トシルプロパノイル)安息香酸9の合成で記載されたのと類似の方法で4−(3−(2−ヒドロキシエチルスルホニル)プロパノイル)安息香酸14から調製した。最初に、4−(3−(2−ヒドロキシエチルスルホニル)プロパノイル)安息香酸14を4−(3−トシルプロパノイル)安息香酸と類似の方法で4−メチルベンゼンチオールの替わりにメルカプトエタノールを使用して調製した(工程2、実施例1)。
NMR 14(400MHz)δ3.35(t,2H,COCH2),3.5(重なり
m,4H,CH2SO2CH2),3.8(t,2H,CH2OH),5.2(br s,CH2OH),8.05(m,4H,芳香族CH),13.4(br s,1H,COO
H)。
PEG接合工程に対し、スルホン14(143mg)及びO−(2−アミノエチル)−O’−メチル−PEG(MW 10kDa,1g,バイオべクトラ(BioVectra))を乾燥トルエン(5mL)に溶解した。溶媒を加熱しないで真空下で取り除き、乾燥固形残渣をその後アルゴン雰囲気下、乾燥ジクロロメタン(10mL)に再溶解した。氷浴で冷却した、得られた溶液にアルゴン雰囲気下でジイソプロピルカルボジイミド(DIPC,87mg)をゆっくりと加えた。反応混合液をその後一晩(15時間)、室温で撹拌し続けた。揮発性物質をその後真空下(30℃、水浴)で取り除いて、アセトン中(45mL)で微温(35℃)で再溶解させた固形残渣を得た。溶液を非吸収性コットンウールでろ過して不溶性物質を取り除いた。この溶液をその後、ドライアイス浴で冷却して、遠心分離(4600rpm、30分間)により分離された白色の沈殿物を得た。液相をデカントし、この沈殿操作を3回繰り返した。その後、得られた灰色がかった白色の固体を真空下で乾燥して、PEG試薬15(1g)を得た。
1H NMR(400 MHz、CDCl3)δ3.30(t,2H,COCH2),δ
3.40(s,3H,PEG−OCH3),δ3.40−3.85(br m,PEG)
,δ3.50(重なり m,2×2H,CH2SO2CH2),δ3.80(t,2H,C
H2OH),δ7.95,δ8.05(2×d,2×2H,カルボン酸部位のArH)。
PEG試薬17を次のようにPEG試薬9から調製した(図22):PEG試薬9(10kDa,75mg)をおよそ18時間、脱イオン水中でメルカプトコハク酸(6mg)及び炭酸水素ナトリウム(20mg)と一緒にかき混ぜた。揮発性物質をその後ロータリーエバポレーターで取り除き、非吸収性コットン−ウールを通してろ過により取り除いた不溶物と共に固形残渣を温めたアセトン(4mL)に再溶解した。その後溶液をドライアイス浴で冷却することによって生成物をアセトンから沈殿させ、そして液相をデカントすることによって単離し続いて遠心分離した。アセトン沈殿物をさらに3回繰り返し、固形物をその後真空下で乾燥して16(51mg)を得た。化合物16をおよそ18時間、1:1 メタノール:水(1mL)中でオキソンと混合することによってその後スルホン形態17に酸化した。この混合液をアセトン(10mL)で希釈し、不溶物をその後非吸収性コットン−ウールを通して重力ろ過によって取り除いた。均一なろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固しそして添加された1NHCl 2滴を含むアセトン(2mL)に再溶解し、その後16( mg)に対して述べられたように同一のアセトン沈殿によって単離した。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.24−3.08(重なり m,CH2
CH、COCH2),3.38(s、PEG−OCH3),3.44−3.84(br s,重なり m,PEG & CH2SO2),4.44(dd,SO2CH),7.45(
br s,NH),7.98 & 8.06(2×d,4H,カルボン酸部位のArH)。
Claims (20)
- 一般式:
X−[Q−W−(CH=CH)n−(CH2)2−L]m (I)
(式中、
Xはポリマーを表し;
Qは連結基を表し;
Wは電子求引基を表し;
nは0又は1乃至4の整数を表し;
Lは脱離基を表し;そして
mは1乃至8の整数を表す。)で表される化合物。 - 前記Qは直接結合、アルキレン基又は随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基であって、これらのうちどれでも1つ以上の酸素原子、硫黄原子、−NR基(Rはハロゲン原子又はアルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。)、ケト基、−O−CO−基、−CO−O−基及び/又は−NR.CO−基によって終端又は中断され得る、請求項1に記載の化合物。
- 前記Qは随意に置換されたヘテロアリール基又はアリール基であって、−NR.CO−基によって隣接した前記ポリマーXが終端されている、請求項2に記載の化合物。
- 前記Xはポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、HPMAコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ(オルトエステル)、ポリカーボネート、ポリ(イミノカーボネート)、ポリアミド、ジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマー、多糖、又はタンパク質である、前記いずれかの請求項のうち1項に記載の化合物。
- 前記Xはポリアルキレングリコールである、請求項4に記載の化合物。
- 前記Xはポリエチレングリコールである、請求項5に記載の化合物。
- Wはケト基CO、エステル基−O−CO−又はスルホン基−SO2−を表す、前記いず
れかの請求項のうち1項に記載の化合物。 - 前記nは0である、前記いずれかの請求項のうち1項に記載の化合物。
- 前記Lは−SR、−SO2R、−OSO2R、−N+R3、−N+HR2、−N+H2R、ハロゲン原子、又は−Oθ(Rはハロゲン原子又はアルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表し、そしてθは少なくとも1つの電子求引置換基を含む置換アリール基を表す。)である、前記いずれかの請求項のうち1項に記載の化合物。
- 一般式:
X−[NH−CO−Ar−W−(CH=CH)n−(CH2)2−SO2R’]m (Ia)
(式中、
Arは未置換の又は置換アリール基を表し、そして
R’は水素原子又は未置換又は置換アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。)である、前記いずれかの請求項のうち1項に記載の化合物。 - 前記Arはアルキル基、−CN、−NO2、−CO2R、−COH、−CH2OH、−C
OR、−OR、−OCOR、−OCO2R、−SR、−SOR、−SO2R、−NHCOR、−NRCOR、−NHCO2R、−NR.CO2R、−NO、−NHOH、−NR.OH、−C=N−NHCOR、−C=N−NR.COR、−N+R3、−N+H3、−N+HR2、−N+H2R、ハロゲン原子、−C≡CR、−C=CR2及び−C=CHR(各Rは独立し
てハロゲン原子又アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。)から選ばれる1つ以上の同一又は異なった置換基によって随意に置換されたフェニル基を表す、請求項10に記載の化合物。 - 前記Arはフェニル基を表し、そしてR’はp−トリル基を表す、請求項11に記載の化合物。
- ポリマーにチオール基又はアミノ基を含んでいる分子の接合方法であって、該方法は前記分子を前記いずれかの請求項のうち1項に記載の化合物と反応させることを含む方法。
- 前記分子はペプチド又はタンパク質である、請求項13に記載の方法。
- 一般式:
X−[Q−W’−(CH=CH)n−(CH2)2−Z]m (II)
(式中、
X、Q、W、n及びmは前記いずれかの請求項の1項における意味であり、
Zはチオール基又はアミノ基を介して接合された分子を表し、そして
W’は電子求引性部分又は電子求引性部分の還元によって調製できる部分を表す) で表される化合物。 - 一般式
X−[NH−CO−Ar−W’−(CH=CH)n−(CH2)2−Z]m (IIa)
(式中、Arは未置換の又は置換アリール基を表す。)である、請求項15に記載の化合物。 - 前記Arがアルキル基、−CN、−NO2、−CO2R、−COH、−CH2OH、−C
OR、−OR、−OCOR、−OCO2R、−SR、−SOR、−SO2R、−NHCOR、−NRCOR、−NHCO2R、−NR.CO2R、−NO、−NHOH、−NR.OH、−C=N−NHCOR、−C=N−NR.COR、−N+R3、−N+H3、−N+HR2、−N+H2R、ハロゲン原子、−C≡CR、−C=CR2及び−C=CHR(各Rは独立し
てハロゲン原子又アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。)から選ばれる1つ以上の同一又は異なった置換基によって随意に置換されたフェニル基を表す、請求項16に記載の化合物。 - 前記Arはフェニル基を表す、請求項17に記載の化合物。
- 前記Zがペプチド又はタンパク質である、請求項17又は請求項18のいずれかに記載の化合物。
- 薬学的に許容されるキャリヤーと共に請求項15乃至19のいずれかのうち1項に記載の化合物を含む医薬組成物。
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Cited By (2)
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JP2019509041A (ja) * | 2016-03-01 | 2019-04-04 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ イリノイThe Board Of Trustees Of The University Of Illinois | 低減されたl−グルタミナーゼ活性および増強された安定性を有するl−アスパラギナーゼ変異体および融合タンパク質 |
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GB201007357D0 (en) * | 2010-04-30 | 2010-06-16 | Leverton Licence Holdings Ltd | Conjugated factor VIII |
CA2811869A1 (en) * | 2010-09-21 | 2012-03-29 | Cristal Delivery B.V. | Tunable, biodegradable linker molecules for transient conjugation of components in drug delivery systems, and drug delivery systems prepared therewith |
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JP6560681B2 (ja) | 2013-12-27 | 2019-08-14 | ザイムワークス インコーポレイティド | 薬物結合体のためのスルホンアミド含有連結系 |
JP6632984B2 (ja) | 2014-03-11 | 2020-01-22 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | 抗EGFRvIII抗体およびその使用 |
IL287645B2 (en) | 2014-09-17 | 2024-04-01 | Zymeworks Bc Inc | Cytotoxic and anti-mitotic compounds and methods for their use |
JP2017534612A (ja) | 2014-10-14 | 2017-11-24 | ポリセリックス・リミテッド | Pegの部分を含めた脱離基を含む試薬を用いるペプチド又はタンパク質のコンジュゲーションのための方法 |
EP3273998B1 (en) | 2015-03-27 | 2019-09-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use |
JP6993958B2 (ja) | 2015-07-06 | 2022-02-04 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 多重特異性抗原結合分子およびその使用 |
MA43416A (fr) | 2015-12-11 | 2018-10-17 | Regeneron Pharma | Méthodes pour ralentir ou empêcher la croissance de tumeurs résistantes au blocage de l'egfr et/ou d'erbb3 |
AU2017211120C1 (en) | 2016-01-25 | 2021-10-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use |
EP3448891A1 (en) | 2016-04-28 | 2019-03-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making multispecific antigen-binding molecules |
TW201811376A (zh) | 2016-07-01 | 2018-04-01 | 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產權有限公司 | 抗體-藥物結合物及使用其之治療方法 |
US10772972B2 (en) | 2016-09-23 | 2020-09-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-STEAP2 antibody drug conjugates, and compositions and uses thereof |
JP7066691B2 (ja) | 2016-09-23 | 2022-05-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 二重特異性抗muc16-cd3抗体および抗muc16薬物複合体 |
AU2017359043B2 (en) | 2016-11-08 | 2022-06-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Steroids and protein-conjugates thereof |
TWI782930B (zh) | 2016-11-16 | 2022-11-11 | 美商再生元醫藥公司 | 抗met抗體,結合met之雙特異性抗原結合分子及其使用方法 |
AU2018270784B2 (en) | 2017-05-18 | 2024-05-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Cyclodextrin protein drug conjugates |
AU2019205542A1 (en) | 2018-01-08 | 2020-07-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Steroids and antibody-conjugates thereof |
MX2020011487A (es) | 2018-04-30 | 2020-12-07 | Regeneron Pharma | Anticuerpos y moleculas biespecificas de union al antigeno que se unen a her2 y/o aplp2, conjugados y usos de estos. |
MX2020011546A (es) | 2018-05-09 | 2021-01-29 | Regeneron Pharma | Anticuerpos anti-msr1 y metodos de uso de los mismos. |
KR20210010916A (ko) | 2018-05-17 | 2021-01-28 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 항-cd63 항체, 콘쥬게이트, 및 이의 용도 |
US11666658B2 (en) | 2018-12-21 | 2023-06-06 | Regeneran Pharmaceuticals, Inc. | Rifamycin analogs and antibody-drug conjugates thereof |
MX2021010114A (es) | 2019-02-21 | 2021-12-10 | Regeneron Pharma | Métodos para tratar el cáncer ocular mediante el uso de anticuerpos anti-met y moléculas de unión a antígeno bispecíficas que se unen a met. |
EP4031574A1 (en) | 2019-09-16 | 2022-07-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Radiolabeled met binding proteins for immuno-pet imaging |
US11814428B2 (en) | 2019-09-19 | 2023-11-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-PTCRA antibody-drug conjugates and uses thereof |
JP2023515941A (ja) | 2020-02-28 | 2023-04-17 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Her2に結合する二重特異性抗原結合分子およびその使用方法 |
CA3179154A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Diels-alder conjugation methods |
IL299153A (en) | 2020-07-13 | 2023-02-01 | Regeneron Pharma | Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in protein, and their uses |
US20220096648A1 (en) | 2020-09-14 | 2022-03-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Antibody-drug conjugates comprising glp1 peptidomimetics and uses thereof |
IL301702A (en) | 2020-10-22 | 2023-05-01 | Regeneron Pharma | Anti-FGFR2 antibodies and methods of using them |
CN113461929B (zh) * | 2021-07-13 | 2023-04-21 | 浙江倍合德制药有限公司 | 一种tpgs系列产品的精制提纯方法 |
CA3241734A1 (en) | 2022-01-12 | 2023-07-20 | Amy Han | Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in a protein, and their use |
US20230330254A1 (en) | 2022-03-11 | 2023-10-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-glp1r antibody-tethered drug conjugates comprising glp1 peptidomimetics and uses thereof |
US20240218011A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-07-04 | Firefly Bio, Inc. | Glucocorticoid receptor agonists and conjugates thereof |
WO2024138000A1 (en) | 2022-12-21 | 2024-06-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Prodrugs of topoisomerase i inhibitor for adc conjugations and methods of use thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09508926A (ja) * | 1993-11-12 | 1997-09-09 | シアウォーター・ポリマーズ,インコーポレイテッド | 表面及び分子の変性に用いる単離可能で水溶性で加水分解に対して安定なポリ(エチレングリコール)と関連ポリマーの活性スルホン類 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US147443A (en) * | 1874-02-10 | Improvement in lamp-extinguishers | ||
US6552170B1 (en) | 1990-04-06 | 2003-04-22 | Amgen Inc. | PEGylation reagents and compounds formed therewith |
US5414135A (en) | 1991-12-30 | 1995-05-09 | Sterling Winthrop Inc. | Vinyl sulfone coupling of polyoxyalkylenes to proteins |
US5877224A (en) | 1995-07-28 | 1999-03-02 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Polymeric drug formulations |
GB9713979D0 (en) | 1997-07-03 | 1997-09-10 | Univ Nottingham | Method for attaching peg to macromolecules |
US6958212B1 (en) * | 1999-02-01 | 2005-10-25 | Eidgenossische Technische Hochschule Zurich | Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds |
US6828412B1 (en) | 1999-09-03 | 2004-12-07 | School Of Pharmacy, University Of London | Degradable polymers |
ATE297954T1 (de) | 1999-09-08 | 2005-07-15 | Polytherics Ltd | Polymere mit uniformem molekulargewicht |
JP4490290B2 (ja) | 2002-12-31 | 2010-06-23 | ネクター セラピューティクス アラバマ,コーポレイション | 加水分解安定性マレイミド末端ポリマー |
JP4009721B2 (ja) * | 2003-05-23 | 2007-11-21 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | イオン結合性ポリマー含有基板、該基板を含有する検出用センサー及び病原菌又は病原菌が生産する毒素の検出方法 |
GB0316294D0 (en) * | 2003-07-11 | 2003-08-13 | Polytherics Ltd | Conjugated biological molecules and their preparation |
EP1828244A2 (en) | 2004-12-22 | 2007-09-05 | Kuros Biosurgery AG | Michael-type addition reaction functionalised peg hydrogels with factor xiiia incorporated biofactors |
BRPI0818288A2 (pt) | 2007-10-09 | 2015-04-14 | Polytherics Ltd | Proteínas conjugadas e peptídeos. |
JP5622117B2 (ja) | 2008-07-21 | 2014-11-12 | ポリテリクスリミテッド | 生体分子を接合するための新規な試薬及び方法 |
GB0912485D0 (en) | 2009-07-17 | 2009-08-26 | Polytherics Ltd | Improved conjugation method |
EP2403538B1 (en) * | 2009-03-04 | 2017-10-04 | Polytherics Limited | Conjugated proteins and peptides |
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2015
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09508926A (ja) * | 1993-11-12 | 1997-09-09 | シアウォーター・ポリマーズ,インコーポレイテッド | 表面及び分子の変性に用いる単離可能で水溶性で加水分解に対して安定なポリ(エチレングリコール)と関連ポリマーの活性スルホン類 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6013057698; SHAUNAK, S. et al: 'Site-specific PEGylation of protein disulfide bonds using a three-carbon bridge' Bioconjug. Chem. Vol.18, No.1, 2007, p.61-76 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015521667A (ja) * | 2012-06-18 | 2015-07-30 | ポリセリックス・リミテッド | 複合体化試薬 |
JP2019509041A (ja) * | 2016-03-01 | 2019-04-04 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ イリノイThe Board Of Trustees Of The University Of Illinois | 低減されたl−グルタミナーゼ活性および増強された安定性を有するl−アスパラギナーゼ変異体および融合タンパク質 |
JP7091248B2 (ja) | 2016-03-01 | 2022-06-27 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ イリノイ | 低減されたl-グルタミナーゼ活性および増強された安定性を有するl-アスパラギナーゼ変異体および融合タンパク質 |
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