JPH09508926A - 表面及び分子の変性に用いる単離可能で水溶性で加水分解に対して安定なポリ（エチレングリコール）と関連ポリマーの活性スルホン類 - Google Patents

表面及び分子の変性に用いる単離可能で水溶性で加水分解に対して安定なポリ（エチレングリコール）と関連ポリマーの活性スルホン類

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JPH09508926A JP7514031A JP51403195A JPH09508926A JP H09508926 A JPH09508926 A JP H09508926A JP 7514031 A JP7514031 A JP 7514031A JP 51403195 A JP51403195 A JP 51403195A JP H09508926 A JPH09508926 A JP H09508926A
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Abstract

(57)【要約】 スルホン部分によって活性化されて、分子及び表面のチオール部分に選択的に付着するポリ（エチレングリコール）誘導体（ＰＥＧ）を開示する。このように活性化されたＰＥＧは、水溶性で、加水分解に対して長期間安定で、チオール部分と加水分解に対して安定な結合を形成する。この結合は一般に、還元環境においても可逆的ではない。ＰＥＧ誘導体は、生物学的に活性な分子及び表面を変性して生体適合とする場合を含め、物質の特性の変更に有用である。活性ＰＥＧの合成方法、及び、生物学的に活性な物質を含む、活性なＰＥＧと他の物質の複合体の製造方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 表面及び分子の変性に用いる単離可能で水溶性で加水分解に対して 安定なポリ（エチレングリコール）と関連ポリマーの活性スルホン類 技術分野 本発明は、表面と分子の特性を変性する場合に用いる、ポリ（エチレングリコ ール）及びこれに関連する親水性ポリマーの活性誘導体、ならびにこれら化合物 の合成方法に関する。 背景技術 これまでポリ（エチレングリコール）（以下、「ＰＥＧ」ともいう。）を、医 薬品、人工移植、及び生体適合性が重要である他の用途に使用することを目的と する研究が行われてきた。その結果、各種のポリ（エチレングリコール）誘導体 （以下、「ＰＥＧ誘導体」ともいう。）が提案され、一般に、該ＰＥＧ誘導体の 活性部位によって医薬品、移植片、分子や表面にＰＥＧを付着させて、分子や表 面の物理特性や化学特性を変性させるようになった。 例えば、湿潤や帯電を制御するためにＰＥＧを表面に結合させたり、あるいは 、タンパク質やタンパク質残基を含む他の型の分子を表面に付着させるためのＰ ＥＧ誘導体が提案されている。より詳しくは、プラスチックコンタクトレンズの 表面に付着させて、タンパク質の付着と視野の曇りを削減するＰＥＧ誘導体が提 案されている。また、人工血管に付着させてタンパク質の蓄積と閉塞の危険を削 減するＰＥＧ誘導体も提案されている。さらに、化学反応における酵素触媒のよ うに、タンパク質を表面に固定するＰＥＧ誘導体も提案されている。 さらに例をあげると、タンパク質を始めとする分子に付着させて、化学的攻撃 からこの分子を保護して、好ましからざるこの分子の副作用の発現を防いだり、 あるいは分子の大きさを大きくすることによって、一面では医療利益があるが、 他の面では有用性がないばかりか生物に有害となるような有用な物質を開発でき る可能性があるＰＥＧ誘導体も提案されている。通常は腎臓から排出されてしま う小さな分子を、生体適合性をもつＰＥＧ誘導体に付着させることによって分子 の大きさを大きくすれば、血流中に保持することができる。注射されると免疫反 応を起こすタンパク質やその他の物質を、ＰＥＧ分子をタンパク質に結合させる ことによって免疫系からある程度隠蔽してしまうこともできる。 また、親和力によって、例えば細胞塊から酵素を分離してしまうＰＥＧ誘導体 も提案されている。ＰＥＧ誘導体には、細胞塊に含有されている酵素と可逆的に 結合することのできる官能基があって、親和力による分離を行うことができる。 細胞塊からＰＥＧと酵素の複合体を分離した後、所望の場合には、酵素をＰＥＧ 誘導体から分離する。 タンパク質へのＰＥＧ誘導体の結合において、ＰＥＧを表面や分子に付着させ る上でいくつかの問題がある。すなわち、多くの表面や分子にとって、ＰＥＧ誘 導体との結合反応のために使うことのできる部位の数が、ある程度限られている 。例えば、タンパク質が結合に使える反応部位は、典型的には、数に限りがあり 、またタイプもはっきりと決っている。もっと問題なのは、酵素がいくつかの化 学反応を触媒するときのように、タンパク質の生物学的な活性がいくつかの反応 部位に起因すると思われることである。ＰＥＧ誘導体を充分な数の部位に付着さ せたために、タンパク質の活性が悪影響を受けるかもしれない。 ＰＥＧ誘導体がタンパク質に付着するための座を形成する反応部位は、タンパ ク質の構造によって決定される。酵素を始めとするタンパク質は、Ｈ2Ｎ−ＣＨ Ｒ−ＣＯＯＨなる一般構造を持つ、α−アミノ酸のいろいろな配列からなってい る。一つのアミノ酸のαアミノ部分（Ｈ2Ｎ−）が、隣のアミノ酸のカルボキシ ル部分(−ＣＯＯＨ)と結びついてアミド結合を形成する。このアミド結合は、− (ＮＨ −ＣＨＲ−ＣＯ)nで表され、式中、ｎは何百でも、何千でもよい。Ｒで表される フラグメント中に反応部位が含有されていて、これによってタンパク質が生物活 性を持つことができ、ＰＥＧ誘導体が付着することができる。 例えば、ほとんどのタンパク質の主鎖の部分を形成するアミノ酸であるリジン では、-ＮＨ2部分がα位置とε位置とに存在している。εの-ＮＨ2はアルカリ性 ｐＨの条件下では反応しない。これまで、当業者の多くは、タンパク質のリジン フラクションのε-ＮＨ2部分に付着するＰＥＧ誘導体を開発する方向に進んでい た。これらのＰＥＧ誘導体は典型的に、リジンがタンパク質の活性に重要である にも拘らず、共通してタンパク質のリジンアミノ酸フラクションが失活している と言う欠点がある。 アメリカ合衆国特許第５，１２２，６１４号（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）公報では、 ＰＥＧ分子をオキシカルボニル−Ｎ−ジカルボキシイミド官能基によって活性化 すると、このＰＥＧ分子を水性アルカリ性の条件下でウレタン結合によってポリ ペプチドのアミン基に付着させることができることを開示している。ＰＥＧ−Ｎ −炭酸スクシンイミドを活性化すると、アミン基との間で、安定で、加水分解に 抵抗性を示すウレタン結合を形成すると言われている。アミン基は、約８．０〜 ９．５のアルカリ性ｐＨでは反応性が高く、ｐＨが下がるにつれて反応性が大き く低下することが示されている。しかしながら、結合していないＰＥＧ誘導体の 加水分解も、ｐＨ８．０〜９．５で急激に活発になる。ザリプスキー(Zalipsky) 氏は、過剰のＰＥＧ誘導体を用いてタンパク質表面に結合させることによって、 未結合のＰＥＧ誘導体と水との反応速度の上昇を抑えている。過剰に使うことに よって、加水分解されて反応性を失う機会をＰＥＧ誘導体に与える前に、充分な 反応性のεアミノ部位がＰＥＧ誘導体と結び付いてタンパク質が変性する。 ザリプスキー氏の方法は、タンパク質のリジンフラクションが、ＰＥＧ誘導体 上の一つの活性部位でＰＥＧ誘導体に付着する場合に適している。しかしながら 、 ＰＥＧ誘導体の加水分解速度がかなり速い場合、単純な過剰だけでは加水分解速 度を低下させることができないから、ＰＥＧ分子上における複数の活性部位での 付着が問題となり得る。 例えば、両末端に活性部位を持つ直鎖ＰＥＧが、末端の一つでタンパク質に付 着しても、加水分解速度が速すぎる場合には、もう一つの末端では水と反応して 、構造が−ＯＨで表される比較的に反応性のないヒドロキシル部分でキャップさ れてしまい、両末端がタンパク質、または所望の基と付着した「ダンベル型」分 子構造とは異なるものになってしまう。ＰＥＧカップリング剤（PEG linking ag ent）で分子を表面に結合しようとする場合にも、同様の問題が起きる。なぜな らば、ＰＥＧは先ず表面に付着するか、あるいは分子と結合し、ＰＥＧ誘導体の 反対側はその後の反応のために活性のままに残して置かなければならないからで ある。仮に、加水分解が問題となった場合、反対側の末端が典型的には失活して しまう。 ザリプスキー氏の米国特許第５，１２２，６１４号公報はさらに、先行特許か ら上記とは異なるＰＥＧ誘導体を数個引用している。ＰＥＧ−スクシノイル−Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドエステルは、水性媒体中で安定性を制限するエステ ル結合を形成すると言われ、したがって、この誘導体は半減期が短くて好ましく ない。ＰＥＧ−塩化シアヌルは好ましからざる毒性があり、タンパク質上の特定 官能基との反応に非特異的であると言われている。したがって、ＰＥＧ−塩化シ アヌル誘導体には好ましからざる副作用があるかもしれず、しかも各種の反応部 位で数多くの異なるタイプのアミノ酸に付着して、タンパク質の活性を低下させ る可能性がある。また、ＰＥＧ−炭酸フェニルは、タンパク質に親和力を持つ、 毒性の疎水性フェノール残基を産出すると言われている。さらに、カルボニルジ イミダゾールで活性化したＰＥＧは、タンパク質の官能基との反応が遅すぎ、タ ンパク質を充分に変性させるためには、長い反応時間が必要であると言われてい る。 この他にも、リジンのε−ＮＨ2以外のアミノ酸上の官能基に付着するＰＥＧ 誘導体が提案されている。ヒスチジンは、構造が−Ｎ（Ｈ）−である反応性イミ ノ部分を含有しているが、ε−ＮＨ2と反応する誘導体の多くは−Ｎ（Ｈ）−と も反応する。システインは、構造が−ＳＨである反応性チオール部分を含有して いるが、この部分と反応するＰＥＧ誘導体マレイミドは加水分解される。 以上の少ない例示からも分かるように、特に、各種タンパク質のリジンアミノ 酸フラクション上の−ＮＨ2部分に付着する各種のＰＥＧ誘導体の開発に従来か らかなりの努力が傾注されてきた。しかしながら、これらの誘導体の多くは、合 成にも用途にも問題があることが判明した。あるものは、加水分解に曝される、 タンパク質の不安定な結合を形成するため、血流のような水性環境下であまり長 く存在することができない。あるものは、安定な結合を形成するものの、結合が 形成される前に加水分解してしまい、ＰＥＧ誘導体上の反応基が、タンパク質に 付着する前に失活してしまう。あるものには毒性があり、生体内で使用するには 適当でない。あるものは反応が遅すぎて、実用上の有用性がない。あるものは、 タンパク質の活性の起因である部位に付着して、タンパク質の活性を得ることが できない。あるものは、付着する部位に特異性がないため、所望の活性を得るこ とができず、また結果の再現性に乏しい。 発明の要旨 本発明は、一つ以上の活性スルホン部分を有する、加水分解に対して安定なポ リ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマーの誘導体及び関連の親水性ポリマ ーを提供する。活性スルホン部分を持つこれらのポリマー誘導体は、特にｐＨ約 ９以下で、分子上及び表面上のアミノ部分の代わりに、チオール部分と結合する 高い選択性を有する。スルホン部分、ポリマーとスルホン部分の間の結合、及び チオール部分とスルホン部分の間の結合は、一般的には還元環境下で可逆的では なく、ｐＨ約１１以下の水性環境では加水分解に対して長期間安定である。した がって、 活性スルホンポリマー誘導体によって、過酷な水性条件下で多くの種類の物質の 物理的及び化学的な特性を変えることができる。 例えば、生物学的に活性な物質の変性条件を至適化して、高水準の生物活性を 保持することができる。アスピリンからペニシリンまでの医薬品を、変性してチ オール部分を含有させて、活性スルホンポリマー誘導体に付着させて、有用性を 持つように変性させることができる。活性チオール部分を持つシステイン単位を 含有する大きなタンパク質もまた、変性して有用性を持たせることができる。組 換えＤＮＡ技術（遺伝子工学）を用いて、システイン基をタンパク質中の所望の 場所に導入することができる。これらのシステインを活性スルホンポリマー誘導 体と結合させて、通常はシステイン単位を含まない種々のタンパク質上に、加水 分解に対して安定な結合を作ることができる。 本発明の活性化ポリマーに対する特定のスルホン部分は、少なくとも炭素原子 ２個がスルホン基−ＳＯ2−に結び付き、スルホン基から数えて２番目の炭素上 のチオールに特異的な結合反応のための反応部位を有するスルホン部分である。 より詳しくは、活性スルホン部分は、ビニルスルホン、ハロエチルスルホンを 含む活性エチルスルホン、及びチオールに特異性を有するこれらスルホンの活性 誘導体からなる。ビニルスルホン部分は、構造が−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2で表され る。活性エチルスルホン部分は、構造が−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｚで表され、 式中、Ｚはハロゲンまたはチオールで置換してスルホン及びチオール結合−ＳＯ2 −ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｗ（式中、Ｗは生物学的に活性な分子、表面、またはそ の他の物質を表す。）を形成することができるその他の脱離基である。ビニル及 びエチルのスルホンは、２番目の炭素上の反応部位の水溶性とチオールに特異的 な反応性を維持する限り、他の置換基を含有してもよい。 また本発明は、チオール部分を持つ物質と活性スルホン部分をもつポリマー誘 導体との、加水分解に対して安定な複合体を含む。例えば、水溶性のスルホンで 活性化したＰＥＧポリマーは、生物学的に活性な分子と反応性チオール部位にお いて結合することができる。ＰＥＧと生物学的に活性な分子を結び付けている結 合には、チオール部分と結合しているスルホン部分が含まれていて、ＰＥＧ−Ｓ Ｏ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｗ（式中、Ｗは生物学的に活性な分子である。）で表 される構造を持っている。この場合、ＰＥＧと結合する前のスルホン部分は、ビ ニルスルホンでもよいし、活性エチルスルホンでもよい。 さらに、本発明は、一つ以上の活性なチオール部位を持つ表面と、スルホン及 びチオールとの結合によりこの表面と結び付いている、スルホンで活性化された 水溶性の一つ以上の本発明のポリマーからなる生体適合物質を含む。これらの生 体適合物質及びその他の物質は、スルホン及びチオール結合以外の従来からのア ミノ結合のような結合によっても、スルホンで活性化されたポリマー誘導体と結 合して、加水分解に対して安定な活性化基であるスルホン部分を作り、その後の 反応に使うことができる。 また本発明は、本発明の活性化されたポリマーの合成方法を含む。硫黄含有部 分を、ポリマーの炭素原子に直接結合した後、活性スルホン部分に転換する。代 わりに、末端の一つにスルホン部分を持つカップリング剤を、従来からの活性化 ポリマーに付着して、末端にスルホン部分を有するポリマーを製造して、スルホ ン部分を調製することができる。 より詳しくは、少なくとも一つの活性ヒドロキシル部分を持つ水溶性ポリマー を反応させて、反応性がより高い部分を持つ置換ポリマーを作る。この置換ポリ マーを反応させて、この反応性が高い部分を、少なくとも２個の炭素原子を持ち 硫黄含有部分中の硫黄がポリマーの炭素１個と直接結合している硫黄含有部分と 置換させる。この硫黄含有部分を反応させて、硫黄−Ｓ−を酸化して、スルホン −ＳＯ2−とし、さらに硫黄含有部分の二番目の炭素原子上の、結合の形成のた め に充分に反応性がある部位に、チオール含有部分を提供する。 さらに詳しくは、本発明の活性化ポリマーの合成方法は、ポリ（エチレングリ コール）をヒドロキシル活性化化合物と反応させてエステルを形成させるか、ま たはハロゲン含有誘導体と反応させて、ハロゲンで置換されたＰＥＧを形成させ ることからなる。このようにして得た活性化ＰＥＧは、メルカプトエタノールと 反応させ、エステル部分またはハロゲン化物をメルカプトエタノールラジカルで 置換する。メルカプトエタノール部分中の硫黄は、酸化してスルホンにする。エ タノールスルホンは、ヒドロキシル部分を活性化するか、またはハロゲンなどの 反応性がより強い部分でヒドロキシル部分を置換することによって、活性化され る。このようにした後、所望の場合には、活性化ヒドロキシルなどの活性部分を 開裂し、スルホン基−ＳＯ2−の隣に炭素−炭素二重結合を導入することによっ て、ＰＥＧの活性エチルスルホンをビニルスルホンに転換することができる。 また本発明は、物質と活性スルホン部分を持つポリマー誘導体との複合体の製 造方法を含む。この方法は、スルホン部分とチオール部分との間に存在し得る、 ポリマー誘導体と物質の間の結合を形成する工程を含む。 したがって、本発明は、反応性が特異的であり、水中で安定で、還元環境中で 安定であり、したがって表面や、生物学的に活性な分子を始めとする分子と、従 来品よりも安定した結合を形成する活性化ポリマーを提供する。この活性化ポリ マーを用いて、生物適合性が重要である分野で表面特性や分子特性を変えること ができる。この活性化ポリマーは水性条件下で安定であり、チオール部分と安定 な結合を形成するので、最も好ましい反応条件を選んで、生物学的に活性な物質 の活性を保存したり、ポリマー結合の反応速度を至適化することができる。 発明の詳細な説明 ポリ（エチレングリコール）及び関連ポリマーの活性スルホンの製造経路は、 硫黄をポリマー分子に結合して、一連の反応により活性スルホン官能基に転換す る少なくとも４つの工程からなる。出発原料であるＰＥＧポリマー分子には、化 学反応に関与することのできる、「活性化」ヒドロキシル部分であると考えられ る少なくとも一つのヒドロキシル部分−ＯＨがある。ＰＥＧ分子は、後述するよ うに、化学反応に関与することのできる複数の活性ヒドロキシル部分を持つこと ができる。ところが、これらの活性ヒドロキシル部分は、実際には比較的に反応 性がないため、合成の第一工程は、反応性がより高い部分をもつＰＥＧを製造す る工程である。 反応性がより高い部分は、典型的には、ヒドロキシルの活性化またはヒドロキ シルの置換の二つの経路のうちの一つによって形成される。当業者にとって明ら かなように、上記とは異なる方法もあるが、ヒドロキシルの活性化とヒドロキシ ルの置換の二つが最も使用頻度が高い。ヒドロキシルの活性化では、ヒドロキシ ル部分−ＯＨの水素原子−Ｈを、活性がより強い基で置換する。典型的には、酸 または酸ハロゲン化物などの酸誘導体をＰＥＧと反応させて、ＰＥＧと酸部分と がエステル結合で結ばれている反応性エステルを形成する。酸部分は、一般にヒ ドロキシル部分よりも反応性が高い。典型的なエステルとしては、スルホン酸エ ステル、カルボン酸エステル、及びリン酸エステルが挙げられる。 本発明の実施に好適に使用することのできるスルホニル酸ハロゲン化物には、 メタンスルホニルクロリド、及びｐ−トルエンスルホニルクロリドが含まれる。 メタンスルホニルクロリドの構造はＣＨ3ＳＯ2Ｃｌで表され、別名をメシルクロ リドとも言われている。メタンスルホニルエステルは、別名をメシラートと呼ば れている。パラ−トルエンスルホニルクロリドの構造はＨ3ＣＣ6Ｈ4ＳＯ2Ｃｌで 表され、別名をトシルクロリドとしても知られている。トルエンスルホニルエス テルは、別名をトシラートと言う。 置換反応では、ＰＥＧのすべての−ＯＨ基を反応性がより高い部分、代表的に はハロゲン化物で置換する。例えば、塩化チオニルの構造はＳＯＣｌ2で表され 、 ＰＥＧと反応して、反応性がより高い塩素で置換したＰＥＧを形成する。当業者 は、ヒドロキシル部分を他の部分で置換することをヒドロキシルの活性化と呼ん でいる。本明細書で用いる「ヒドロキシルの活性化」なる語は、置換やエステル 化などによるヒドロキシルの活性化を意味する。 「基」、「官能基」、「部分」、「活性部分」、「反応性部位」、及び「ラジ カル」なる語は、化学用語としてはある程度同義な用語として、当業者間及び本 明細書中において、分子中の異なる限定可能な部分または単位や、ある機能や活 性を示して他の分子や分子中の部分との反応性を有する単位を指す語句として用 いられる。この意味において、タンパク質またはタンパク質残基がポリマーと結 合すると、分子、または官能基もしくは部分と見なすことができる。 「ＰＥＧ」なる語は、当業者間及び本明細書中において、構造が一般式Ｈ（Ｏ ＣＨ2ＣＨ2）nＯＨで表される、エチレングリコールのいくつかの縮合重合体の いずれかを指す。ＰＥＧは、ポリオキシエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリ グリコール、及びポリエーテルグリコールとしても知られている。ＰＥＧは、エ チレンオキシドと他の多くのモノマーとのコポリマーとして製造することができ る。 ポリ（エチレングリコール）は、強く所望されている特性を持っているため生 物学的な用途で使用され、また、生物学的な用途や生物技術用途で一般的に是認 されている。ＰＥＧの特徴としては、澄明、無色、無臭で、水に溶け、熱に対し て安定で、多くの化学薬品に対して不活性で、加水分解も劣化もしないし、毒性 もない。ポリ（エチレングリコール）は生体適合性がある。つまり、ＰＥＧは、 生組織や生体に害を与えることなく共存することができる。より詳しくは、ＰＥ Ｇは免疫を生じない。すなわち、ＰＥＧには体内で免疫反応を起こす作用がない 。体内で所望されている機能を持つ部分に付着すると、ＰＥＧはこの部分をマス クし、免疫反応を軽減したり排除して、生体にこの部分の存在を寛容させる作用 がある。したがって、本発明のスルホンにより活性化したＰＥＧには実質的に毒 性 がなく、また、実質的に免疫反応を呈したり、あるいは凝血を起こしたりするな どの好ましからざる副作用を起こすことがない。 合成第二工程においては、同様の反応特性を持つエチルスルホンまたはエチル スルホン誘導体に転換できる形で、硫黄をポリマーの炭素原子に直接結合する。 「エチル」とは、炭素原子２個が結合していることを同定することができる基を 持つ部分を指す。活性スルホンＰＥＧ誘導体では、分子鎖上でスルホン基から数 えて二番目の炭素原子が反応性部位となって、チオール部分とスルホンとを結合 させなければならない。このことは次のようにして実現する。上記の第一工程で 製造した活性部分（代表例としてはエステルまたはハロゲン化物で置換したＰＥ Ｇがある。）を、エチル基、すなわち、チオエタノール部分に付着している反応 性チオール部分を含有するアルコールと置換反応させることによって実現する。 チオール部分は、酸化してスルホンとなり、エチル基のスルホンから数えて二番 目の炭素は反応性部位に転換する。 チオール部分−ＳＨを含有する化合物は、チオール内において少なくとも一つ のヒドロキシル部分の酸素が硫黄によって置換されていることを除き、ヒドロキ シル部分−ＯＨを含有するアルコールに似ている有機化合物である。第一工程の 反応で得られたＰＥＧ誘導体の活性化部分（代表例としてハロゲン化物またはエ ステルの酸部分を挙げることができる。）は、ポリマーから開裂されて、チオエ タノール化合物のアルコールラジカルによって置換される。アルコールのチオー ル部分中の硫黄は、ポリマーの炭素に直接結合する。 ポリマー鎖の炭素に直接付着するチオエタノール部分を提供したり、あるいは チオエタノール部分または同様な反応性をもつ置換された部分に容易に転換する ことのできるのは、上記アルコールである。このようなアルコールの例として、 構造がＨＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨで表わされ、別名をチオエタノールと呼ばれているメ ルカプトエタノールを挙げることができる。 合成第三工程においては、酸化剤を用いて、炭素に付着した硫黄を転換してス ルホン基−ＳＯ2にする。過酸化水素や過ホウ酸ナトリウムを始めとして、数多 くの酸化剤がある。タングステン酸のような触媒も有用である。しかしながら、 形成されているスルホンは、チオール選択性反応に活性を持つスルホンではない ので、第二工程の置換反応で付加された比較的に反応性のないヒドロキシル部分 をアルコールから取り除くことが必要である。 第四工程は、第二工程においてアルコールに付加されたヒドロキシル部分を、 第一工程の反応系列と同じように、ヒドロキシル基を活性化するか、またはヒド ロキシル基を反応性がより強い基で置換することによって、反応性がより強い形 態に転換する工程である。置換は、典型的にはハロゲン化物を用いて行われ、ス ルホン部分から二番目の炭素上の反応性部位を持つ、ハロエチルスルホンまたは その誘導体を形成する。典型的にはエチル基上の二番目の炭素は、塩素または臭 素のハロゲンによって活性化される。ヒドロキシルが活性化すると、スルホン酸 エステルなどと同様な反応性を持つ部位ができる。好適な反応体としては、酸、 酸ハロゲン化物、及び反応の第一工程に関連して上述した他の物質、特に、ヒド ロキシル基を塩素原子で置換するための塩化チオニルが挙げられる。 このようにして得られたポリマー性の活性化されたエチルスルホンは、安定で 、単離可能で、チオール選択性結合反応に好適である。後述の実施例で示すよう に、ＰＥＧクロロエチルスルホンは、ｐＨ値約７以下の水に安定でありながら、 ｐＨ値が少なくとも約９までのアルカリ性ｐＨの条件下でチオール選択性結合反 応に役立つように利用することができる。 チオール結合反応では、次の反応のようにチオール部分が塩化物を置換するこ とができる。 ＰＥＧ−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃｌ＋Ｗ−Ｓ−Ｈ →ＰＥＧ−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｗ 式中、Ｗは、チオール部分ＳＨが結合する部分を表し、生物学的に活性な分子 、表面、またはその他の物質であってもよい。しかしながら、理論に束縛された くはないが、実施例３で示すような反応速度を観察すると、クロロエチルなどの 活性化エチルスルホン及び反応性誘導体は、ＰＥＧビニルスルホンに転換するこ と、及び、チオール部分に実際に結合するのは、このＰＥＧビニルスルフォンま たはその誘導体であることが確信される。しかしながら、このようにして得られ たスルホン及びチオール結合は、活性ＰＥＧエチルスルホンから形成しても、あ るいはＰＥＧビニルスルホンから形成しても、区別することができない。したが って、活性エチルスルホンをｐＨ７以上で使用して、チオール基と結合させるこ とができる。 ＰＥＧビニルスルホンもまた、安定かつ単離可能で、後で述べるようにハロエ チルスルホンなどの活性化エチルスルホンよりも遙かに速い反応速度で、チオー ル選択性の加水分解に対して安定な結合を形成することができる。 上記合成に追加することのできる第五工程においては、活性化エチルスルホン を各種塩基のいずれか、例えば水酸化ナトリウムまたはトリエチルアミンと反応 させて、ＰＥＧビニルスルホンまたはその活性誘導体を形成して、チオール選択 性結合反応に使用する。 後述の実施例、特に実施例３に示すように、ＰＥＧビニルスルホンはチオール 部分と迅速に反応し、加水分解に対してｐＨ約１１以下の水に少なくとも数日間 は安定である。反応は次で表される： ＰＥＧ−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2＋Ｗ−Ｓ−Ｈ →ＰＥＧ−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｗ チオール部分は、「二重結合を横切って」付加されると言われている。Ｗ−Ｓ 部分はスルホン基ＳＯ2から二番目の炭素である、二重結合の末端のＣＨ2に付加 される。水素Ｈは二重結合のＣＨに付加される。しかしながら、ｐＨ値約９以上 では、スルホン部分のチオールに対する選択性が低下し、スルホン部分はアミノ 基との反応性がある程度強くなる。 上記の合成の代わりに、スルホン部分を持つカップリング剤を、異なる官能基 で活性化したＰＥＧに付着させることによって、スルホン活性化ＰＥＧ誘導体を 製造することができる。例えば、アミノ活性化ＰＥＧであるＰＥＧ−ＮＨ2をｐ Ｈ値約９以下の好ましい条件下で、末端の１つにスクシンイミジル活性エステル 部分ＮＨＳ−Ｏ2Ｃ−を持ち、他の末端にスルホン部分、すなわちビニルスルホ ン−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2を持つ小さな分子と反応させる。このアミノ活性化ＰＥ Ｇは、スクシンイミジルエステルと安定な結合を形成する。このようにして得ら れるＰＥＧは、末端のビニルスルホン部分によって活性化され、加水分解に対し て安定である。反応とこのようにして得られるビニルスルホン活性化ＰＥＧの構 造は次のように表される。 ＰＥＧ−ＮＨ2＋ＮＨＳ−Ｏ2Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2 →ＰＥＧ−ＮＨ−ＯＣ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2 スクシンイミジル活性エステルＰＥＧ、ＰＥＧ−ＣＯ2−ＮＨＳなどのアミン 活性化ＰＥＧを、末端の一つにアミン部分を持ち他の末端にビニルスルホン部分 を持つ小さな分子とを反応させることにより、同様の活性化ＰＥＧを得ることが できる。スクシンイミジルエステルは、アミン部分と次のような安定な結合を形 成する。 ＰＥＧ−ＣＯ2−ＮＨＳ＋ＮＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2 →ＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2 本発明の活性ＰＥＧスルホンは、いかなる分子量でもよく、また直鎖でもよい し、アームが何百とついている枝分かれ鎖でもよい。このＰＥＧは、少なくとも 一つの反応性部位がスルホン部分の置換に使えさえすれば、ＰＥＧ自体は置換さ れていても、置換されていなくともよい。ＰＥＧの典型的な平均分子量は、２０ ０〜１００，０００であり、その生物学的特性は、分子量や枝分かれの度合や置 換の度合によって異なり、これらの誘導体全てが生物学的用途や生物技術用途に 有用であることはできない。ほとんどの生物学的用途及び生物技術用途では、実 質的に直線型で直鎖のＰＥＧビニルスルホンまたはビスビニルスルホンまたは活 性化エチルスルホンが用いられており、ビニルスルホン部分またはエチルスルホ ン部分、所望の場合に追加される官能基を除き、実質的に置換されていないもの が使用される。また、多くの生物学的用途や生物技術用途においては、置換基は 水素Ｈ−や、メチルＣＨ3−（「ｍ−ＰＥＧ」）などの反応性がない基であるの が典型的である。 ＰＥＧにはビニルスルホン部分、または先駆物質部分が１以上付着していても 良いし、またＰＥＧの末端の一つが、メチルラジカル−ＣＨ3などの比較的反応 性のない部分によって、キャップされていてもよい。キャップされている形態は 、例えば、ポリマー鎖をタンパク質の鎖に沿う各種チオール部位に単に付着させ ることを所望する場合に、有用である。ＰＥＧ分子をタンパク質や他の医薬品等 の生物学的に活性な分子や表面に付着させることは、別名を「ＰＥＧ化」（PEGy lation）と言う場合がある。 両末端に活性ヒドロキシルを持つ直線型ＰＥＧは、両末端にビニルスルホン、 またはその先駆物質または同様の反応性を持つ誘導体を付着させて二官能性とす ることによって、活性化することができる。二官能性構造である、例えば、ＰＥ Ｇビスビニルスルホンは、別名をダンベル型構造と言い、例えば、生物学的に活 性な分子を表面に付着させたり、あるいはこのような一つ以上の生物学的に活性 な分子をＰＥＧ分子に付着させるリンカーまたはスペーサーとして使用すること ができる。スルホン部分は加水分解に対して安定であるので、二官能性用途また はヘテロ二官能性用途において特に有用である。 ＰＥＧビニルスルホン及びその先駆物質のもう一つの用途として、ＰＥＧの複 数のアームが中心核構造に付着しているデンドライト活性化ＰＥＧがある。デン ドライトＰＥＧ構造は、枝分かれの程度が高くて、通常は「星型」分子と言われ ているものである。星型分子は、米国特許第５，１７１，２６４号（Ｍｅｒｒｉ ｌｌ）で一般的に説明されている。この特許の内容は、引用することによって本 明細書の一部とする。スルホン部分は、コアから伸びるＰＥＧ鎖の末端で活性官 能基となり、星型分子のアームに官能基を結合するためのリンカーとして使用さ れる。 ＰＥＧビニルスルホン及びその先駆物質と誘導体は、チオール部分を持つ表面 や分子に直接付着するために使用される。しかしながら、より典型的には、末端 の一つにスルホン部分を持ち、反対の末端基に異なる官能部分を持つヘテロ二官 能性ＰＥＧ誘導体を、異なる部分によって表面または分子に付着させている。こ のヘテロ二官能性ＰＥＧダンベル型構造は、異なる活性部分の１つで置換してお き、例えば、末端の一つではスルホン結合、もう一つの末端ではアミン結合など の異なる結合によって、タンパク質その他の生物学的に活性な分子を担持して、 二つの異なる活性を持つ分子を造出することができる。末端の一つにスルホン部 分を持ち、他の末端にアミン特異性の部分を持つヘテロ二官能性ＰＥＧは、タン パク質のシステインフラクションとリジンフラクションの両方に付着することが できる。このようにすれば、安定なアミン結合を形成することができるし、また 加水分解に対して安定な未反応のスルホン部分を、所望によってその後のチオー ル特異性反応に使うことができる。 ヘテロ二官能性スルホン活性化ＰＥＧに用いる活性基は、この他にも広い範囲 の各種化合物から選択することができる。生物学的な用途や生物技術用途に用い る置換基の典型例としては、ＰＥＧの化学でＰＥＧを活性化するのに典型的に用 いられる反応性部分、例えば、アルデヒド、別名をトレシラートを言うトリフル オロエチルスルホネート、ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル、シアヌル 酸クロリド、シアヌル酸フルオリド、アシルアジド、スクシネート、ｐ−ジアゾ ベンジル基、３−（ｐ−ジアゾフェニルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルオキ シ基、及びその他が挙げられる。 スルホン以外の活性部分の例としては次の各種特許に示されているものがある 。米国特許第４，１７９，３３７号（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ）、米国特許第４ ，２９６，０９７号及び第４，４３０，２６０号（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ）、米国 特許第４，６７０，４１７号（Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ）、米国特許第４， ７６６，１０６号、第４，９１７，８８８号、及び第４，９３１，５４４号（Ｋ ａｔｒｅ ｅｔ ａｌ）、米国特許第４，７９１，１９２号（Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ）、米国特許第４，９０２，５０２号及び第５，０８９，２６１号 （Ｎｉｔｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ）、米国特許第５，０８０，８９１号（Ｓａｉｆ ｅｒ）、米国特許第５，１２２，６１４号（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）、米国特許第５ ，１５３，２６５号（Ｓｈａｄｌｅ ｅｔ ａｌ）、米国特許第５，１６２，４ ３０号（Ｒｈｅｅ ｅｔ ａｌ）、欧州特許出願公告第０ ２４７ ８６０号、 及びＰＣＴ国際出願ＵＳ８６／０１２５２号、ＧＢ８９／０１２６１号、ＧＢ８ ９／０１２６２号、ＧＢ８９／０１２６３号、ＵＳ９０／０３２５２号、ＵＳ９ ０／０６８４３号、ＵＳ９１／０６１０３号、ＵＳ９２／００４３２号、及びＵ Ｓ９２／０２０４７号である。これら特許の内容は引用することにより本明細書 の一部とする。 上記で述べたダンベル型構造は、広い範囲の各種置換基及び置換基の組合せを 担持するために使用できることを、当業者は明白に理解している。アスピリン、 ビタミン、ペニシリン、その他多数有りすぎて記述できないほどの医薬品、ポリ ペプチドまたはタンパク質及び各種官能価（functionalities）のタンパク質フ ラグメント、さらには分子量、各種タイプの細胞、生体適合物質の表面等、大抵 のどの物質でも変性することができるであろう。本発明で用いる「タンパク質」 な る語は、アミノ酸のポリマーであるペプチド及びポリペプチドを含むものとして 理解しなければならない。「生体適合物質」なる語は、典型的には合成品であっ て、しばしばプラスチック製であり、生体に移植して外傷または疾患を修復する のに好適な材料を指す。 生物学的用途及び生物技術用途に使用する、本発明の１直鎖型ＰＥＧ誘導体の 基本的な構造はＲ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−Ｙで表される。ＰＥＧモノマーＯＣＨ2 ＣＨ2は、実質的に置換されていないこと、及び、ポリマーの主鎖に沿った領域 では枝分かれしていないことが好ましい。下付き文字の「ｎ」は約５〜３，００ ０である。より典型的な範囲としては、約５〜２，２００であり、これは分子量 に換算すると約２２０〜１００，０００である。より典型的な範囲は、約３４〜 １，１００であり、これを分子量に換算すると約１，５００〜５０，０００であ る。ほとんどの用途では、２，０００〜５，０００に近い分子量が使用されてい て、これはｎ価に直すと４５〜１１０である。 上記の構造でＹは−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2または−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｘで 表わされ、この式中Ｘはハロゲンである。ＲはＹと同じかまたは異なる基を表し ている。ＲはＨ−、Ｈ3Ｃ−、ＣＨ2＝ＣＨ−ＳＯ2−、Ｃｌ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ Ｏ2−のいずれでもよいし、または上記の特許及び公開特許出願で言及されてい るＣＨ2＝ＣＨ−ＳＯ2−、Ｃｌ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−以外のポリマー活性化 基であってもよい。 これらの活性ポリマー誘導体は、水溶性で、加水分解に対して安定であり、か つチオール基と共に水溶性で加水分解に対して安定な結合を形成する。これらの 誘導体は、無限に水に溶ける、あるいは無限の溶解度に近いと考えられており、 また、誘導体と複合させることによって不溶の分子を溶解させることができる。 誘導体が加水分解に対して安定であることは、ポリマーとスルホン部分との結 合が水に対して安定であること、及び、下記実施例３で示すように、ビニルスル ホン部分はｐＨ値約１１以下で少なくとも数日間の長期間、可能性としては無限 に、水と反応しないことを意味する。活性化エチルスルホンはアルカリ性ｐＨ条 件下で、安定性はそのままに保持しながら、ビニルスルホンに転換することがで きる。チオール結合が加水分解に対して安定であることは、活性化ポリマーとチ オール部分を持つ物質の複合体が、スルホン−チオール結合において、ｐＨ値約 １１以下の水性環境下で長期間安定であることを意味する。ほとんどのタンパク 質は、１１以上の苛性ｐＨ値では活性を失うと考えられるので、活性スルホンＰ ＥＧ誘導体の多くの用途では、スルホン部分はより高いｐＨ値でも安定であるに も拘らず、１１以下のｐＨ値であることを、当業者は明白に理解している。 スルホンがタンパク質やその他の物質の変性に有用であるためには、スルホン がタンパク質やその他の物質の反応性チオール部分と反応するまでの充分に長い 時間、安定でなくてはならない。スルホン部分とチオールとの反応速度は、後述 の実施例２で示すように、ｐＨ次第で約２分間〜３０分間の範囲で変化するが、 これは加水分解の反応速度より遙かに早い。ビニルスルホンは長時間安定で、し たがって、チオールとの反応速度の範囲はかなり広い。また、後述の実施例３で 示すように、クロロエチルスルホンはアルカリ性ｐＨでは加水分解しないで、ビ ニルスルホンに転換してしまう。このビニルスルホンは数日間安定で、しかもチ オール基との反応性がより強い。したがって、物質の特性を変性する目的では、 活性エチルスルホンも、広いｐＨ範囲で、加水分解に対して長時間安定であると 考えることができる。 ＰＥＧ以外の水溶性ポリマーも、活性スルホン部分により同様の変性と活性化 を行うのに好適であると信じられる。これらの他のポリマーとしては、ポリ（ビ ニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）などの 前述以外のポリ（アルキレンオキシド）、及びポリ（オキシエチレーテッドグリ セロール）、ポリ（オキシエチレーテッドソルビトール）、ポリ（オキシエチレ ーテッドグルコース）などのポリ（オキシエチレーテッドポリオール）その他を 挙げることができる。本発明のポリマーは、上記したポリマーのモノマーに基づ くホモポリマー、もしくはランダムまたはブロックコポリマーあるいはターポリ マーのいずれでもよい。また直鎖でも、枝分かれ鎖でもよいし、また、ＰＥＧの 場合のように置換していてもよく、置換していなくともよい。ただし、どの場合 でも、少なくとも一つの活性部位が、反応してスルホン部分を形成するのに使う ことができるようでなければならない。 次の実施例１において、ポリ（エチレングリコール）クロロエチルスルホンの 合成、単離、及びキャラクタリゼーション、及びその後のクロロエチルスルホン を出発原料とするポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンの製造を説明する 。スルホン基から数えて二番目の炭素上に活性部位を有する他のポリマー性スル ホンの製造も同様であって、当業者は下記の実施例１と上記で列記したポリマー に基づいて製造工程を明白に知ることができる。 実施例 １ 合成 反応工程の構造式は次の通りである。 （１）ＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ3ＳＯ2Ｃｌ →ＰＥＧ−ＯＳＯ2ＣＨ3 （２）ＰＥＧ−ＯＳＯ2ＣＨ3＋ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨ →ＰＥＧ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨ （３）ＰＥＧ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨ＋Ｈ2Ｏ2 →ＰＥＧ−ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ （４）ＰＥＧ−ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ＋ＳＯＣｌ2 →ＰＥＧ−ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ （５）ＰＥＧ−ＳＯ2−ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ＋ＮａＯＨ →ＰＥＧ−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2＋ＨＣｌ 上記反応の各々を以下に詳細に説明する。反応 １ 反応１は、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホニルエステル（別名が ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホネートまたはメシラートである。） の製造である。同様の方法により、トシラート及びハロゲン化物も製造すること ができるが、これは当業者にとって明白であると信じる。 メシラートを製造するため、分子量３４００のＰＥＧ２５ｇを、トルエン１５ ０ml中で共沸蒸留を行って乾燥した。このＰＥＧの乾燥のため、トルエンの約半 分が蒸留除去された。乾燥ジクロロメタン４０mlを、トルエン及びＰＥＧの溶液 に添加した後、氷浴中で冷却した。冷却した溶液に、ＰＥＧヒドロキシル基の１ ．０６当量にあたる蒸留したメタンスルホニルクロリド１．２３０ml、及びＰＥ Ｇヒドロキシル基の１．３当量にあたる乾燥トリエチルアミン２．６６４mlを添 加した。本発明で用いる「当量」なる語は、結合する量と考えられ、１当量のＰ ＥＧヒドロキシル基と反応する化合物の重量を指す。 反応を一晩放置して、反応温度を室温まで上昇させた。トリエチルアンモニウ ム塩酸塩が沈澱したので、濾過して沈澱物を取り除いた。その後、回転蒸発によ り容量を２０mlに減量した。メシラートを低温乾燥エチルエーテル１００mlに加 えて、沈澱させた。核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析では、ヒドロキシル基が１００％ メシラート基に転換したことを示していた。反応 ２ 反応２ではメシラートをメルカプトエタノールに反応させて、ポリ（エチレン グリコール）メルカプトエタノールを形成する。反応によりメタンスルホネート ラジカルがＰＥＧから置換される。メルカプトエタノールラジカル中の硫黄は、 ＰＥＧの炭素−炭素主鎖中の炭素に直接付着する。 反応１のメシラート２０ｇを蒸留水１５０mlに溶解した。メシラートの水溶液 を氷浴に浸漬して冷却した。冷却した溶液に、ＰＥＧヒドロキシル基の３等量に 当たるメルカプトエタノール２．３６６mlを添加した。さらに、２ＮのＮＡＯＨ 塩基１６．８６mlを添加した。反応は３時間還流させた。すなわち、この間反応 で発生した蒸気を連続的に凝縮し、反応に流し戻した。 ポリ（エチレングリコール）メルカプトエタノール生成物は、毎回ジクロロメ タン約２５mlづつを用いて、ジクロロメタンで三回抽出した。有機フラクション を集めて、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。容量を２０mlに減量し、生成 物を低温乾燥エーテル１５０mlに添加して沈澱させた。 ｄ6−ＤＭＳＯジメチルスルホキシドを用いるＮＭＲ分析で、次のようなＰＥ Ｇ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨのピークが観察された。２．５７ｐｐｍ，三重項、−ＣＨ2 −Ｓ−；２．６５ｐｐｍ，三重項、−Ｓ−ＣＨ2−；３．５ｐｐｍ、主鎖一重項 ；及び４．７６ｐｐｍ，三重項、−ＯＨ。４．７６ｐｐｍのヒドロキシルピーク は８１％の置換を示していた。しかしながら、２．６５ｐｐｍの−Ｓ−ＣＨ2− のピークは、１００％の置換を示していた。ヒドロキシルのピークは置換をパー セントで表示すると、頻繁に低い数値を示す。一方、２．６５ｐｐｍの−Ｓ−Ｃ Ｈ2−のピークは、より信頼性が高いと考えられ、１００％の置換を示していた 。 反応 ３ 反応３では、ポリ（エチレングリコール）メルカプトエタノール生成物を過酸 化物で酸化して、硫黄ＳをスルホンＳＯ2に転換させる。ＰＥＧエタノールスル ホンを生成する。 ＰＥＧ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨ２５ｇを、０．１２３Ｍのタングステン酸溶液３０ mlに溶解して、氷浴で冷却した。タングステン酸溶液は、この酸をｐＨ１１．５ の水酸化ナトリウム溶液中に溶解して、氷酢酸でｐＨを５．６に調整することに より調製した。蒸留水２０ml、及びヒドロキシル基の２．５当量に当たる３０％ 過酸化水素２．８７６mlを、タングステン酸とポリ（エチレングリコール）メル カプトエタノールとの溶液に添加して、反応を一晩放置して、この間に反応温度 を室温に上昇させた。 酸化生成物を毎回ジクロロメタン２５mlづつを用いて、ジクロロメタンで三回 抽出した。有機フラクションを集め、希釈した水性重炭酸ナトリウムで洗い、無 水硫酸マグネシウムで乾燥した。容量を２０mlに減量した。ＰＥＧエタノールス ルホン生成物は、低温乾燥エチルエーテル中に添加して沈澱させた。 ｄ6−ＤＭＳＯジメチルスルホキシドを用いるＮＭＲ分析で、次のようなＰＥ Ｇ−ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨのピークが観察された。３．２５ｐｐｍ、三重項、− ＣＨ2−ＳＯ2−；３．３７ｐｐｍ，三重項、−ＳＯ2−ＣＨ2−；３．５０ｐｐｍ 、主鎖；３．７７ｐｐｍ、三重項、−ＣＨ2ＯＨ−；５．０４ｐｐｍ、三重項、 −ＯＨ。５．０４ｐｐｍのヒドロキシルピークは、８５％の置換を示していた。 しかしながら、３．３７ｐｐｍの−ＳＯ2−ＣＨ2−のピークは、１００％の置換 を示し、信頼性もより高いと考えられた。 反応 ４ 反応４は、ポリ（エチレングリコール）クロロエチルスルホンの合成、単離、 及びキャラクタリゼーションの最終工程である。 生成物の合成のため、ＰＥＧ−ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨポリ（エチレングリコー ル）エタノールスルホン２０ｇを、新しく蒸留した塩化チオニル１００ml中に溶 解して、この溶液を一晩還流させた。塩化チオニルはキノリンで蒸留した。過剰 の塩化チオニルは、蒸留除去した。トルエン５０mlとジクロロエタン５０mlを加 えて、蒸留で除去した。 生成物を単離するため、ＰＥＧクロロエチルスルホンをジクロロメタン２０ml に溶解し、低温乾燥エチルエーテル１００mlに添加して沈澱させた。沈澱物は酢 酸エチル５０mlから再結晶させて、生成物を単離した。 核磁気共鳴により生成物のキャラクタリゼーションを行った。ｄ6−ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシドを用いるＮＭＲ分析で、次のようなＰＥＧ−ＳＯ2ＣＨ2Ｃ Ｈ2Ｃｌのピークが観察された。３．５０ｐｐｍ、主鎖；３．６４ｐｐｍ、三重 項、−ＣＨ2ＳＯ2−；３．８０ｐｐｍ、三重項、−ＳＯ2−ＣＨ2−。３．９４ｐ ｐｍでは、小さなヒドロキシル不純物による三重項が現れた。このスペクトルで は、重要なピークが非常に大きな主鎖のピークと接近しているため、置換のパー セントを計算するのが困難であった。 反応 ５ 反応５では、工程４のポリ（エチレングリコール）クロロエチルスルホンを、 ポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンに転換し、ビニルスルホン生成物の 単離とキャラクタリゼーションを行う。 固体ＰＥＧクロロエチルスルホンをジクロロメタン溶媒に溶解した後、ＮａＯ Ｈ塩基２当量を加えることにより、ＰＥＧビニルスルホンを容易に製造すること ができた。溶液を濾過して塩基を取り除き、溶媒を蒸発して、最終生成物ＰＥＧ −ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2（ＰＥＧビニルスルホン）を単離した。 ｄ6−ＤＭＳＯジメチルスルホキシドを用いるＮＭＲ分析により、ＰＥＧビニ ルスルホンのキャラクタリゼーションを行った。ＮＭＲ分析では次のピークが観 察された：３．５０ｐｐｍ、主鎖；３．７３ｐｐｍ、三重項、−ＣＨ2−ＳＯ2− ；６．２１ｐｐｍ、三重項、＝ＣＨ2；６．９７ｐｐｍ、二重項の二重項(double t of doublets)、−ＳＯ2−ＣＨ−。６．９７ｐｐｍによる−ＳＯ2−ＣＨ−のピ ークは、置換８４％を示していた。６．２１ｐｐｍによる＝ＣＨ2のピークは置 換９４％を示していた。メルカプトエタノール及び２、２’−ジチオジピリジン による滴定では置換９５％を示していた。 実施例 ２： チオール選択性反応 実施例２では、ＰＥＧビニルスルホン及びその先駆物質ＰＥＧクロロエチルス ルホンのチオール基（−ＳＨ）との反応性が、アミノ基（−ＮＨ2）またはイミ ノ 基（−ＮＨ−）よりも顕著に強いことを証明する。チオール基を含有する化合物 は、チオールではヒドロキシル基の酸素が硫黄によって置換されている点を除き 、ヒドロキシル基−ＯＨを含有するアルコールに似た有機化合物である。チオー ルはスルフヒドリルまたはメルカプタンの別名がある。ＰＥＧビニルスルホンは ビニルスルホン基−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2を含有している。ＰＥＧクロロエチルス ルホンは、クロロエチルスルホン基−ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌを含有している。 チオールに対する選択性は、システイン単位（−ＳＨを含有する）がリジン単 位（−ＮＨ2を含有している）やヒスチジン単位（−ＮＨ−を含有している）よ りも優先して変性すると言う意味で、タンパク質の変性上重要である。また、Ｐ ＥＧビニルスルホンのチオールに対する選択性は、ＰＥＧが選択的にシステイン 単位に付着するため、特定のタンパク質のタンパク質活性を保持して、タンパク 質に付着するＰＥＧ分子の数を制御することを意味する。 ＰＥＧビニルスルホンのチオール及びアミノ基に対する相対的な反応性は、Ｐ ＥＧビニルスルホンとＮ−α−アセチルリジンメチルエステルとの間の反応速度 、及びＰＥＧビニルスルホンとメルカプトエタノールとの間の反応速度を測定し て決定する。Ｎ−α−アセチルリジンメチルエステルは、アミノ基を含有するリ ジンモデルで、略称はＬｙｓ−ＮＨ2である。メルカプトエタノールはチオール 基を含有するシステインモデルの役割を果たしており、略称はＣｙｓ−ＳＨであ る。ＰＥＧクロロエチルスルホンの相対的反応性も同様にして決定する。この分 子は酸に対して安定であるが、塩基が添加されるとＰＥＧビニルスルホンに転換 するので、ビニルスルホンの「被保護」形態である。 ＰＥＧビニルスルホンに対する反応性、及びＰＥＧクロロエチルスルホン先駆 物質に対する反応性を、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０及びｐＨ９．５で実験した。ｐ Ｈを制御する緩衝液は、ｐＨ８．０には０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ９．０とｐＨ９ ．５には０．１Ｍホウ酸塩を用いた。メルカプトエタノールの反応性を測定する 目 的で、両方の緩衝液に５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加して、 チオールがジスルフィドに転換するのを遅滞させた。 本発明のＰＥＧ誘導体とＬｙｓ−ＮＨ2との反応について、Ｌｙｓ−ＮＨ2の０ ．３ｍＭ溶液とアルカリ性ｐＨの３つのレベルの各々に対応する緩衝液との混液 に、ＰＥＧ誘導体の３ｍＭ溶液を攪拌しながら添加した。また、反応溶液にはフ ルオレサミンを添加し、残留アミノ基との反応から蛍光誘導体を産出させて、反 応をモニターした。モニターは、反応混液５０μＬをｐＨ８．０のリン酸緩衝液 １．９５０ｍＬに加えた後、フルオレサミン溶液１．０ｍＬを激しく攪伴しなが ら添加して実施した。フルオレサミン溶液は、アセトン１ｍＬ当りフルオロレサ ミン０．３ｍｇの割合で混合したものである。 混合後蛍光を１０分間測定した。励起は波長３９０ｎｍで、発光は４７５ｎｍ で認められた。ｐＨ８．０では２４時間以内に、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ クロロエチルスルホンのいずれも反応を観察することはできなかった。ｐＨ９． ５では、反応は遅かったが、数日経過後もアミノ基すべてが反応していた。 ＰＥＧビニルスルホン及びＰＥＧクロロエチルスルホンの前駆物質とＣｙｓ− ＳＨとの反応について、ＰＥＧ誘導体の２ｍＭ溶液を、Ｃｙｓ−ＳＨの０．２ｍ Ｍ溶液とアルカリ性ｐＨの３つのレベルの各々に対応する適当な緩衝液との混液 に添加した。反応溶液に４−ジチオピリジンを添加して、反応をモニターした。 ４−ジチオピリジン化合物はＣｙｓ−ＳＨと反応して、４−チオピリドンを産出 し、この化合物が紫外線を吸収する。 反応混液５０μＬを、ｐＨが８．０で５ｍＭのＥＤＴＡを含有している０．１ Ｍリン酸緩衝液０．９５０ｍＬに添加した後、２ｍＭの４−ジチオピリジン１ｍ Ｌを上記の緩衝液に加えて、反応のモニターを行った。 ４−チオピリドンの吸光度は３２４ｎｍで測定した。ＰＥＧビニルスルホンと ＰＥＧクロロエチルスルホンはいずれもＣｙｓ−ＳＨに反応性を示したが、ＰＥ Ｇビニルスルホンの反応性の方が大きかった。ｐＨ９．０では、ビニルスルホン の場合は２分間、クロロエチルスルホンの場合は１５分間で、反応が完了した。 しかしながら、反応が早すぎて正確な速度定数を決定することはできなかった。 ｐＨ８．０では反応が遅くなったが、それでもビニルスルホンでは一時間、クロ ロエチルスルホンでは三時間で反応は完了した。また、クロロエチルスルホンが ビニルスルホンに転換する速度は、ビニルスルホンとＣｙｓ−ＳＨとの間の反応 速度より著しく遅かった。したがって、クロロエチルスルホンとＣｙｓ−ＳＨと の反応速度は、クロロエチルスルホンがビニルスルホンに転換する速度に依存し ているように見える。しかしながら、これらの反応速度は、Ｌｙｓ−ＮＨ2との 反応よりも非常に早かった。 上記の反応速度実験は次の点を明らかにしている。ＰＥＧビニルスルホンはチ オール基との反応性がアミノ基よりも遙かに強く、ＰＥＧビニルスルホンがシス テイン基とリジン基の両方を含有するタンパク質に付着すると、主としてシステ インとの反応に進んで行くことを示している。また、アミノ基との反応性はイミ ノ基と同様であるので、ヒスチジンサブユニットの反応性はシステインサブユニ ットとの反応性よりも大幅に低い。また、ｐＨ値が低くなると、ＰＥＧクロロエ チルスルホンの反応性はやや低下するものの、ＰＥＧクロロエチルスルホンとＰ ＥＧビニルスルホンに対するチオール基への選択性は強くなる。 ＰＥＧ誘導体の多くは、水との反応速度が大きく、これらの誘導体を水性条件 下で各種分子や表面に付着させようとしても妨害してしまうので、有用性が限ら れている。次の実施例３では、ＰＥＧビニルスルホンとＰＥＧクロロエチルスル ホンが水に対して安定であることを立証する。 実施例 ３： 加水分解に対する安定性 ＰＥＧビニルスルホンを重水、すなわちＤ2Ｏ酸化ジュウテリウム中に溶解し て、ＮＭＲでモニターした。反応は起こらなかった。ＰＥＧクロロエチルスルホ ン溶 液は、ホウ酸緩衝液でｐＨを９．０に調整した重水中で、ＰＥＧビニルスルホン を生成した。ＮＭＲによるモニターでは、ＰＥＧビニルスルホンは一旦生成する と重水中で３日間安定であることを示した。 ＰＥＧクロロエチルスルホンは、溶液がアルカリ性となるまでは水に安定であ って、アルカリ下ではビニルスルホンに転換する。ＰＥＧクロロエチルスルホン をｐＨ７の水とｐＨ９のホウ酸緩衝液に溶解すると、ビニルスルホンに転換する ことが確認された。ＰＥＧ誘導体を塩化メチレン中に抽出した。塩化メチレンを 取り除いて、ＮＭＲ分析すると、ＰＥＧクロロエチルスルホンはｐＨ７の中性で は安定で、塩基と反応してＰＥＧビニルスルホンを生成することを示した。 ビニルスルホンは水に対して、たとえアルカリ性ｐＨ下であっても、数日間は 安定である。ＰＥＧビニルスルホン及びその前駆体が加水分解に対して安定性が 高く、チオールに特異的な反応性を持っていることは、ＰＥＧビニルスルホンと その先駆物質が下記の実施例４で示すように、水性条件下で分子及び表面を変性 するのに有用であることを示している。 実施例 ４： タンパク質複合体 ＰＥＧ誘導体を二つの異なる方法により、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に付 着させて、タンパク質の変性を立証した。ＢＳＡはタンパク質である。天然の変 性していないＢＳＡは、チオール基を含まないシステインを含有している。シス テイン単位はジスルフィド結合Ｓ−Ｓとして結合している。 第一の方法では、分子量５，０００のｍ−ＰＥＧビニルスルホンを、ｐＨ９． ５の０．１Ｍホウ酸緩衝液中で未変性のＢＳＡと室温で２４時間反応させた。こ の溶液は、溶液１ml当り、ＢＳＡ１ｍｇと、分子量５，０００のｍ−ＰＥＧビニ ルスルホン１ｍｇの比率で調製した。実施例２のモデル化合物の実験結果では、 リジンサブユニット（及び恐らくはヒスチジンサブユニット）は、このような相 対的なアルカリ条件下で、しかも反応に使える遊離チオール基がない状態でも変 性できることを示していた。 リジンサブユニットに対する付着は二つの手段で証明した。第一の手段は、サ イズ排除クロマトグラフィで、タンパク質の分子量が約５０％増加し、これはタ ンパク質にＰＥＧが約１０個付着したためであることを立証した。第二の手段は 、フルオレサミン分析により、ＢＳＡ分子のリジン基の数が約１０個減っている ことが解った。 第二の方法としては、ＢＳＡをトリブチルホスフィンと反応させて、反応に使 うためのチオール基−ＳＨに対するジスルフィドＳ−Ｓ結合を削減した。その後 、この変性ＢＳＡは０．１Ｍリン酸緩衝液中で、ｐＨ８．０、室温でＰＥＧクロ ロエチルスルホンと１時間反応させた。この溶液は、溶液１ml当り、変性ＢＳＡ １ｍｇと分子量５，０００のｍ−ＰＥＧクロロエチルスルホン１ｍｇを含んでい た。結果は、リジン基がこの条件下では無反応であったことを示していた。しか し、チオール基は反応した。 サイズ排除クロマトグラフィでは、タンパク質の分子量が約２５％増加し、Ｐ ＥＧがタンパク質に付着したことを証明していた。ところが、フルオレサミン分 析では、タンパク質中のリジンサブユニットの数は変わってはおらず、ＰＥＧは リジンサブユニット上には付着しなかったことが確認された。したがって、チオ ール基の置換が確認された。 特定の実施例を例示するために本発明を説明した。しかしながら、上述の説明 は、本発明をここに例示された実施例にのみ限定するためになされたものではな い。さらに、当業者は、上述の明細書で説明されている本発明の精神と範囲内で 、変法を造出することは可能であることを認識しなくてはならない。以上とは別 に、後述の請求の範囲で定められている本発明の精神及び範囲内で、代替、変更 及び均等物の全てを本発明に含めるものである。
【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１１月９日 【補正内容】 ＰＥＧと反応して、反応性がより高い塩素で置換したＰＥＧを形成する。当業者 は、ヒドロキシル部分を他の部分で置換することをヒドロキシルの活性化と呼ん でいる。本明細書で用いる「ヒドロキシルの活性化」なる語は、置換やエステル 化などによるヒドロキシルの活性化を意味する。 「基」、「官能基」、「部分」、「活性部分」、「反応性部位」、及び「ラジ カル」なる語は、化学用語としてはある程度同義な用語として、当業者間及び本 明細書中において、分子中の異なる限定可能な部分または単位や、ある機能や活 性を示して他の分子や分子中の部分との反応性を有する単位を指す語句として用 いられる。この意味において、タンパク質またはタンパク質残基がポリマーと結 合すると、分子、または官能基もしくは部分と見なすことができる。 「ＰＥＧ」なる語は、当業者間及び本明細書中において、構造が一般式Ｈ（Ｏ ＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ（または、ＨＯ−ＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＨ）で 表される、エチレングリコールのいくつかの縮合重合体のいずれかを指す。ＰＥ Ｇは、ポリオキシエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール、及びポリ エーテルグリコールとしても知られている。ＰＥＧは、エチレンオキシドと他の 多くのモノマーとのコポリマーとして製造することができる。 ポリ（エチレングリコール）は、強く所望されている特性を持っているため生 物学的な用途で使用され、また、生物学的な用途や生物技術用途で一般的に是認 されている。ＰＥＧの特徴としては、澄明、無色、無臭で、水に溶け、熱に対し て安定で、多くの化学薬品に対して不活性で、加水分解も劣化もしないし、毒性 もない。ポリ（エチレングリコール）は生体適合性がある。つまり、ＰＥＧは、 生組織や生体に害を与えることなく共存することができる。より詳しくは、ＰＥ Ｇは免疫を生じない。すなわち、ＰＥＧには体内で免疫反応を起こす作用がない 。体内で所望されている機能を持つ部分に付着すると、ＰＥＧはこの部分をマス クし、免疫反応を軽減したり排除して、生体にこの部分の存在を寛容させる作用 が ある。したがって、本発明のスルホンにより活性化したＰＥＧには実質的に毒性 る語は、アミノ酸のポリマーであるペプチド及びポリペプチドを含むものとして 理解しなければならない。「生体適合物質」なる語は、典型的には合成品であっ て、しばしばプラスチック製であり、生体に移植して外傷または疾患を修復する のに好適な材料を指す。 生物学的用途及び生物技術用途に使用する、本発明の１直鎖型ＰＥＧ誘導体の 基本的な構造はＲ−ＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−Ｙで表される。ＰＥＧモ ノマーＯＣＨ2ＣＨ2は、実質的に置換されていないこと、及び、ポリマーの主鎖 に沿った領域では枝分かれしていないことが好ましい。下付き文字の「ｎ」は約 ５〜３，０００である。より典型的な範囲としては、約５〜２，２００であり、 これは分子量に換算すると約２２０〜１００，０００である。より典型的な範囲 は、約３４〜１，１００であり、これを分子量に換算すると約１，５００〜５０ ，０００である。ほとんどの用途では、２，０００〜５，０００に近い分子量が 使用されていて、これはｎ価に直すと４５〜１１０である。 上記の構造でＹは−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2または−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｘで 表わされ、この式中Ｘはハロゲンである。ＲはＹと同じかまたは異なる基を表し ている。ＲはＨ−、Ｈ3Ｃ−、ＣＨ2＝ＣＨ−ＳＯ2−、Ｃｌ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ Ｏ2−のいずれでもよいし、または上記の特許及び公開特許出願で言及されてい るＣＨ2＝ＣＨ−ＳＯ2−、Ｃｌ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−以外のポリマー活性化 基であってもよい。 これらの活性ポリマー誘導体は、水溶性で、加水分解に対して安定であり、か つチオール基と共に水溶性で加水分解に対して安定な結合を形成する。これらの 誘導体は、無限に水に溶ける、あるいは無限の溶解度に近いと考えられており、 また、誘導体と複合させることによって不溶の分子を溶解させることができる。 誘導体が加水分解に対して安定であることは、ポリマーとスルホン部分との結 合が水に対して安定であること、及び、下記実施例３で示すように、ビニルスル 請求の範囲（補正） １． 加水分解に対して安定な水溶性の単離可能な活性化ポリマーであって、 該ポリマーがポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチレーテッドポリオ ール）及びポリ（オレフィンアルコール）からなる群より選ばれ、少なくとも一 つの活性スルホン部分を有する活性化ポリマー。 ２． 上記少なくとも一つの活性スルホン部分が、少なくとも二つの炭素原子 をもつスルホン基からなり、該スルホン基から数えて二番目の炭素原子に活性部 位が位置する請求項１に記載の活性化ポリマー。 ３． 上記少なくとも一つのスルホン部分が、ビニルスルホン、活性エチルス ルホン、ビニルスルホン及びエチルスルホンの活性誘導体及びこれらの組合せか らなる群より選ばれる請求項２に記載の活性化ポリマー。 ４． 上記ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）であり、上記少なくとも 一つのスルホン部分が、ビニルスルホンとハロエチルスルホンからなる群より選 ばれる請求項３に記載の活性化ポリマー。 ５． 上記ポリマーがポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンである請求 項１に記載の活性化ポリマー。 ６． 上記ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリ コール）、ポリ（オキシエチレーテッドグリセロール）、ポリ（オキシエチレー テッドソルビトール）、ポリ（オキシエチレーテッドグルコース）、及びポリ（ ビニルアルコール）からなる群より選ばれる請求項１に記載の活性化ポリマー。 ７． 上記ポリマーがポリ（エチレングリコール）である請求項１に記載の活 性化ポリマー。 ８． 上記ポリマーが実質的に直鎖である請求項１に記載の活性化ポリマー。 ９． 上記直鎖のポリマーが、上記活性スルホン部分以外の他の置換基を持た ない請求項８に記載の活性化ポリマー。 １０． 上記ポリマーがランダムまたはブロックコポリマーまたはターポリマー である請求項１に記載の活性化ポリマー。 １１． 上記ポリマーがポリマー主鎖末端の少なくとも一方に上記活性部分を持 ち、ポリマー主鎖の他方の末端に上記活性部分と同じかまたは異なる活性部分を 持つダンベル型構造である請求項１に記載の活性化ポリマー。 １２． 上記ポリマー主鎖の他方の末端に、アミノ部分と反応する異なる活性部 分を含む請求項１１に記載の活性化ポリマー。 １３． 上記ポリマーが枝分かれ分子構造の少なくとも一つのアームを含む請求 項１に記載の活性化ポリマー。 １４． 上記枝分かれ分子構造がデンドライトである請求項１３に記載の活性化 ポリマー。 １５． 上記少なくとも一つの活性スルホン部分が、表面または分子中の反応性 部分と結合を形成している請求項１に記載の活性化ポリマー。 １６． 上記反応性部分がチオール部分である請求項１５に記載の活性化ポリマ ー。 １７． 上記活性スルホン部分が、リンカー部分を含有する結合によって上記ポ リマーと結合し、上記ポリマーが、上記リンカー部分と結合するために上記活性 スルホン部分とは異なる活性部分を含有する請求項１に記載の活性化ポリマー。 １８． 上記他の活性部分がアミンに特異性を持ち、上記リンカー部分が活性ア ミノ部分を含む請求項１７に記載の活性化ポリマー。 １９． 上記活性化ポリマーがポリ（エチレングリコール）であり、上記他の活 性部分がアミノ部分であり、上記リンカーがＮＨＳ−Ｏ2Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ Ｏ2−ＣＨ＝ＣＨ2構造を持ち、及び上記活性化ポリマーがＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ− ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2構造を持つ請求項１７に記載の活性化ポリマ ー。 ２０． １１以下のｐＨの水性環境中において安定である請求項１に記載の活性 化ポリマー。 ２１． 約９以下のｐＨ条件下でチオール部分との反応に選択的である請求項１ に記載の活性化ポリマー。 ２２． 還元環境において安定である請求項１に記載の活性化ポリマー。 ２３． 上記活性化ポリマーが無限に水に溶ける請求項１に記載の活性化ポリマ ー。 ２４． 次の構造： Ｒ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−Ｙ （式中、ｎは５〜３，０００であり、Ｙは−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2及び−ＳＯ2− ＣＨ2−ＣＨ2−Ｘ（Ｘはハロゲンまたはその誘導体である。）からなる群より選 ばれ、ＲはＹと同じでも異なっていてもよい。） を有する活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体。 ２５． 上記ｎが約５〜２，２００である請求項２４に記載の活性化ポリ（エチ レングリコール）誘導体。 ２６． 上記ｎが約３４〜１，１００である請求項２４に記載の活性化ポリ（エ チレングリコール）誘導体。 ２７． 上記ｎが約４５〜１１０である請求項２４に記載の活性化ポリ（エチレ ングリコール）誘導体。 ２８． Ｒが、Ｈ−、Ｈ3Ｃ−、ＣＨ2＝ＣＨ−ＳＯ2−、Ｘ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ Ｏ2−及びこれらの誘導体からなる群より選ばれるか、またはＣＨ2＝ＣＨ−ＳＯ2 −またはＸ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−及びこれらの誘導体以外のポリ（エチレン グリコール）活性化部分である請求項２４に記載の活性化ポリ（エチレングリコ ール）誘導体。 ２９． 反応性チオール部分を持つ生物学的に活性な分子、及び該チオール部分 との結合を形成する活性スルホン部分を持つ水溶性ポリマー誘導体を含む加水分 解に対して安定な生物学的に活性な複合体。 ３０． 上記生物学的に活性な分子がタンパク質であって、上記反応性チオール 部分が上記タンパク質のシステイン部分中に含有されている請求項２９に記載の 複合体。 ３１． 上記ポリマー誘導体が、加水分解に対して安定であり、ポリ（アルキレ ンオキシド）、ポリ（オキシエチレーテッドポリオール）、及びポリ（オレフィ ンアルコール）からなる群より選ばれる請求項２９に記載の複合体。 ３２． 次の構造： ＰＥＧ−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｗ （式中、Ｗは生物学的に活性な分子である。） を有する請求項２９に記載の複合体。 ３３． 加水分解に対して安定な生物学的に活性な複合体であって、該複合体は 、同じかまたは異なる二つの生物学的に活性な部分と、水溶性ダンベル型ポリマ ー誘導体とを含み、該生物学的に活性な部分の少なくとも一つは、反応性チオー ル部分を持ち、該水溶性ダンベル型ポリマー誘導体は、その両末端の各々に反応 性部分を持ち、該反応性部分の少なくとも一つは、活性スルホン部分であって、 少なくとも一つの該生物学的に活性な部分のチオール部分と結合を形成し、他方 の該生物学的に活性な部分は、該ポリマー上の該反応性部分の他方と結合を形成 する複合体。 ３４． 上記生物学的に活性な部分が、タンパク質、医薬品、細胞、ビタミン及 びこれらの組合せからなる群より選ばれる請求項３３に記載の複合体。 ３５． 上記活性スルホン部分が、ビニルスルホンまたはハロエチルスルホンで あり、上記ポリマー誘導体上の上記他の反応性部分が、アミノ基との反応に選択 性を持つ請求項３３に記載の複合体。 ３６． 生物学的に活性な複合体であって、該複合体は、 チオール部分との反応に選択性のある少なくとも一つの活性スルホン部分と、 アミノ部分との反応に選択性のある少なくとも一つの他の部分とを有する水溶性 活性化ポリマーと、 チオール部分が該ポリマーの該スルホン部分と加水分解に対して安定な結合を 形成している、該チオール部分を持つ第一のタンパク質と、 アミノ部分が該ポリマーの該他の部分と結合を形成している、該アミノ部分を 持つ第二のタンパク質とからなる複合体。 ３７． 上記第一のタンパク質がシステイン単位を含有し、上記第二のタンパク 質がリジン単位を含有する請求項３６に記載の複合体。 ３８． 表面と、該表面に結合する少なくとも一つの水溶性ポリマー誘導体から なり、該ポリマー誘導体が、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチレ ーテッドポリオール）、及びポリ（オレフィンアルコール）からなる群より選ば れ、かつ、少なくとも一つの活性スルホン部分を持つ生体適合物質。 ３９． 上記表面が、表面上に少なくとも一つの反応性部分を持ち、上記ポリマ ー誘導体が、上記表面上の上記反応性部分と結合している一方の末端上の部分を 持つヘテロ二官能性ダンベル型構造であり、該ダンベルが他方の末端に活性スル ホン部分を持つ請求項３８に記載の生体適合物質。 ４０． 上記反応性部分がアミン部分であり、該アミン部分に結合している上記 ポリマー誘導体の上記部分がアミン選択性の部分である請求項３９に記載の生体 適合物質。 ４１． 上記活性スルホン部分が、ビニルスルホン、活性エチルスルホン、及び これらの誘導体からなる群より選ばれる請求項３８に記載の生体適合物質。 ４２． 上記ポリマー誘導体がＰＥＧポリマーからなる請求項３８に記載の生体 適合物質。 ４３． ポリマーとスルホン部分との間の結合が加水分解に対して安定である、 活性スルホン部分を持つ単離可能な水溶性活性化有機ポリマーの合成方法であっ て、硫黄含有部分をポリマーの炭素原子に結合した後、該硫黄含有部分を活性ス ルホン部分に転換する工程を含む方法。 ４４． 上記活性スルホン部分を持つ上記活性化ポリマーを単離する工程をさら に含む請求項４３に記載の方法。 ４５． 硫黄含有部分をポリマーの炭素原子に直接結合する工程が、ポリマーの 活性化可能な少なくとも一つのヒドロキシル部分を活性化し、それによって得た 化合物をチオール部分を含有するアルコールと反応させて、硫黄をポリマーの炭 素−炭素鎖に直接結合する工程からなる請求項４３に記載の方法。 ４６． 少なくとも一つの活性化可能なヒドロキシル部分を活性化する工程が、 ヒドロキシルを置換することからなる工程、及びヒドロキシルの水素を反応性が より強い部分と交換することからなる工程から選ばれる請求項４５に記載の方法 。 ４７． チオール部分を含有するアルコールがメルカプトエタノールである請求 項４５に記載の方法。 ４８． 硫黄含有部分中の硫黄を酸化してスルホンとし、生成物をヒドロキシル 活性化部分またはヒドロキシル置換部分と反応させる工程によって、チオール部 分を含有するアルコールを活性スルホン部分に転換する請求項４５に記載の方法 。 ４９． 上記スルホンが活性エチルスルホンであり、活性エチルスルホンを強塩 基と反応させることによってポリマー上にビニルスルホン部分を形成させる工程 をさらに含む請求項４８に記載の方法。 ５０． （ａ）少なくとも一つの活性ヒドロキシル部分を持つポリ（エチレング リコール）を、エステル置換ポリ（エチレングリコール）またはハロゲン化物置 換ポリ（エチレングリコール）を形成する化合物と反応させる工程と、 （ｂ）工程（ａ）のエステル置換ポリ（エチレングリコール）またはハ ロゲン化物置換ポリ（エチレングリコール）を、メルカプトエタノールと反応さ せて、エステル部分またはハロゲン化物の部分をメルカプトエタノールラジカル と置換する工程と、 （ｃ）工程（ｂ）のメルカプトエタノール置換ポリ（エチレングリコー ル）を、酸化剤と反応させて、メルカプトエタノール部分の硫黄を酸化してスル ホンとする工程と、 （ｄ）工程（ｃ）のスルホンを、メルカプトエタノール部分のヒドロキ シルをエステル部分またはハロゲン化物部分に転換させる化合物と反応させる工 程と、 （ｅ）工程（ｄ）のエチルスルホンを塩基と反応させて、ポリ（エチレ ングリコール）ビニルスルホンを形成させる工程とを含む、単離可能なポリ（エ チレングリコール）ビニルスルホンの製造方法。 ５１． ポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンを単離する工程をさらに含 む請求項５０に記載の方法。 ５２． 工程（ｄ）のハロゲン化物が塩素であり、工程（ｄ）の生成物がポリ（ エチレングリコール）クロロエチルスルホンであり、上記方法がさらに、クロロ エチルスルホンをジクロロメタン中に溶解し、クロロエチルスルホンをエチルエ ーテル中で沈澱させ、沈澱物を酢酸エチルで再結晶することによって、ポリ（エ チレングリコール）クロロエチルスルホンを単離する工程を含む請求項５０に記 載の方法。 ５３． 塩基と反応させてポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンを形成す る工程の前に、ポリ（エチレングリコール）クロロエチルスルホンの結晶を有機 溶媒に溶解した後、濾過して塩基を取り除き、溶媒を蒸発させることによって、 ポリ（エチレングルコール）ビニルスルホン生成物を単離する工程をさらに含む 請求項５２に記載の方法。 ５４． ポリマーとスルホン部分との間の結合が加水分解に対して安定な、活性 スルホン部分を持つ単離可能な水溶性活性化有機ポリマーの合成方法であって、 活性スルホン部分と他の活性部分を含有する結合部分を、スルホン部分とは異な る官能基を持つポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチレーテッドポリ オール）、及びポリ（オレフィニックアルコール）からなる群より選ばれ、かつ 、該官能基が該結合部分上の他の活性部分に対して選択的であるポリマー誘導体 に付着させる工程を含む方法。 ５５． 上記ポリマー誘導体の官能基が、アミノ部分との反応に対して選択的で あり、上記結合部分の他の活性部分が、活性アミノ部分を含有している請求項５ ４に記載の方法。 ５６． 上記ポリマー誘導体が、ＰＥＧスクシンイミジル活性エステルであり、 上記結合部分が、ＮＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2構造を持つ請求項 ５４に記載の方法。 ５７． アミノ部分に対して選択的である官能基を持つポリ（エチレングリコー ル）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（オキシエチレーテッドグリセロー ル）、ポリ（オキシエチレーテッドソルビトール）、ポリ（オキシエチレーテッ ドグルコース）及びポリ（ビニルアルコール）からなる群より選ばれるポリマー 誘導体を調製し、アミノ部分とスルホン部分を含有する上記結合部分を調製し、 上記結合部分のアミノ部分を、ポリマー誘導体のアミノ選択性の部分と結合させ る工程をさらに含む請求項５４に記載の方法。 ５８． 物質と、少なくとも一つのスルホン部分を持つポリ（アルキレンオキシ ド）、ポリ（オキシエチレーテッドポリオール）、及びポリ（オレフィンアルコ ール）からなる群より選ばれる水溶性活性化ポリマーとの複合体を製造する方法 であって、該物質を、活性スルホン部分を持つ活性化ポリマーと反応させて、該 物質と該ポリマー誘導体の間の結合を形成させる工程を含む方法。 ５９． 上記物質が、活性チオール部分を含有し、上記結合が、該チオール部分 と上記スルホン部分の間に存在する請求項５８に記載の方法。 ６０． 上記物質が、活性アミノ部分を含有し、上記ポリマー誘導体が、アミノ 選択性の部分を含有し、上記結合が、該アミノ部分と該アミノ選択性の部分の間 に形成される請求項５８に記載の方法。 ６１． 上記活性化ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレ ングリコール）、ポリ（オキシエチレーテッドグリセロール）、ポリ（オキシエ チレーテッドソルビトール）、ポリ（オキシエチレーテッドグルコース）、及び ポリ（ビニルアルコール）からなる群より選ばれる請求項５８に記載の方法。 ６２． 上記物質が、生体適合物質のための合成物、タンパク質、医薬品、細胞 、及びビタミンからなる群より選ばれる請求項５８に記載の方法。 ６３． 生物学的に活性な分子とポリ（エチレングリコール）の活性な誘導体の 複合体を製造する方法であって、反応性チオール部分を持つ生物学的に活性な分 子を、活性スルホン部分を持つポリ（エチレングリコール）誘導体と反応させて 、該チオール部分と該活性スルホン部分の間の結合を形成する工程を含む方法。 ６４． 生物学的に活性な分子をポリ（エチレングリコール）誘導体と反応させ る工程が、約１１以下のｐＨの条件下で行われる請求項６３に記載の方法。 ６５． 生物学的に活性な分子をポリ（エチレングリコール）誘導体と反応させ る工程が、約９以下のｐＨの条件下で行われる請求項６３に記載の方法。 ６６． 上記活性スルホン部分が、ビニルスルホン、活性エチルスルホン、及び これらの活性誘導体からなる群より選ばれる請求項６３に記載の方法。 ６７． 次の構造： ＣＨ3−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2 （式中、ｎは５〜３，０００である。） を持つ活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体。 ６８． 次の構造： ＣＨ2＝ＣＨ−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2 （式中、ｎは５〜３，０００である。） を持つ活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体。 ６９． 加水分解に対して安定な生物学的に活性な複合体であって、 １）Ｗ−ＳＨ構造（Ｗは生物学的に活性な部分であり、ＳＨは反応性チオール 部分である。）を持つ少なくとも一つの生物学的に活性な分子と、 ２） Ｒ−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−Ｙ （ｎは５〜３，０００であり、Ｙは−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2であり、ＲはＨＯ−、 Ｈ3ＣＯ−、Ｘ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2（Ｘはハロゲンである。）及びＣＨ2＝Ｃ Ｈ−ＳＯ2−からなる群より選ばれる。） で表される構造を持ち、一以上のスルホン部分で活性化されたポリ（エチレング リコール）誘導体との反応生成物であって、 該反応性チオール部分が、該少なくとも一つの活性スルホン部分と結合してい る複合体。 ７０． 上記生物学的に活性な分子が、タンパク質であって、上記反応性チオー ル部分が、上記タンパク質のシステイン部分中に含有されている請求項６９に記 載の複合体。 ７１． 次の構造： Ｒ−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｗ （式中、ｎは５〜３，０００であり、ＲはＨＯ−及びＨ3ＣＯ−からなる群より 選択される。） で表される請求項６９に記載の複合体。 ７２． 次の構造： Ｗ−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＳＯ2 −ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｗ （式中、ｎは５〜３，０００である。） で表される請求項６９に記載の生物学的に活性な複合体。 ７３． 次の構造： Ｒ−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−タンパク質 （式中、ｎは５〜３，０００であり、ＲはＨＯ−及びＨ3ＣＯ−からなる群より 選ばれる。） で表される請求項６９に記載の生物学的に活性な複合体。 ７４． 次の構造： タンパク質−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n −ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−タンパク質 （式中、ｎは５〜３，０００である。） で表される請求項６９に記載の生物学的に活性な複合体。 ７５． Ｗ−ＳＨ構造（Ｗは生物学的に活性な部分であり、ＳＨは活性チオール 部分である。）を持つ少なくとも一つの生物学的に活性な分子と、 次の構造： Ｒ−ＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−Ｙ （ｎは５〜３，０００であり、Ｙは−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2であり、ＲはＨＯ−、 Ｈ3ＣＯ−、Ｘ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−（Ｘはハロゲンである。）及びＣＨ2＝ ＣＨ−ＳＯ2−からなる群より選ばれる。） で表される構造を持ち、少なくとも一つの活性なスルホン部分を持つ活性化ポリ （エチレングリコール）誘導体とからなる生物学的に活性な複合体の製造方法で あって、生物学的に活性な分子を活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体と反 応させて、該活性チオール部分とポリ（エチレングリコール）の少なくとも一つ の活性スルホン部分の間の結合を形成させる工程を含む方法。 ７６． 上記Ｗがタンパク質である請求項７５に記載の方法。 ７７． 次の構造： タンパク質−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n− ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−タンパク質 （ｎは５〜３，０００である。） で表される構造を持つ生物学的に活性な複合体の製造方法であって、 １）活性チオール部分を持つ少なくとも一つのタンパク質を、 Ｒ−ＣＨ2ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2 （Ｒは、ＣＨ2＝ＣＨ−ＳＯ2−、Ｘ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−（Ｘはハロゲンで ある。）からなる群より選ばれる。） で表せられる構造を持つスルホン活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体と反 応させる工程と、 ２）該タンパク質の該活性チオール部分と該活性化ポリマーの該活性スルホン 部分の間の結合を形成させる工程とを含む方法。 ７８． 次の構造： Ｈ3ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−タン パク質 （ｎは５〜３，０００である。） で表される構造を持つ生物学的に活性な複合体の製造方法であって、 １）活性チオール部分を持つタンパク質を、 Ｈ3ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2 で表される構造を持つ活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体と反応させる工 程と、 ２）該タンパク質の該活性チオール部分と該活性化ポリマーの該活性スルホン 部分の間の結合を生成させる工程とを含む方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 加水分解に対して安定な水溶性活性化ポリマーであって、該ポリマーが ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチレーテッドポリオール）及びポ リ（オレフィンアルコール）からなる群より選ばれ、少なくとも一つの活性スル ホン部分を有する活性化ポリマー。 ２． 上記少なくとも一つの活性スルホン部分が、少なくとも二つの炭素原子 をもつスルホン基からなり、該スルホン基から数えて二番目の炭素原子に活性部 位が位置する請求項１に記載の活性化ポリマー。 ３． 上記少なくとも一つのスルホン部分が、ビニルスルホン、活性エチルス ルホン、ビニルスルホン及びエチルスルホンの活性誘導体及びこれらの組合せか らなる群より選ばれる請求項２に記載の活性化ポリマー。 ４． 上記ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）であり、上記少なくとも 一つのスルホン部分が、ビニルスルホンとハロエチルスルホンからなる群より選 ばれる請求項３に記載の活性化ポリマー。 ５． 上記ポリマーがポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンである請求 項１に記載の活性化ポリマー。 ６． 上記ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリ コール）、ポリ（オキシエチレーテッドグリセロール）、ポリ（オキシエチレー テッドソルビトール）、ポリ（オキシエチレーテッドグルコース）、及びポリ（ ビニルアルコール）からなる群より選ばれる請求項１に記載の活性化ポリマー。 ７． 上記ポリマーがポリ（エチレングリコール）である請求項１に記載の活 性化ポリマー。 ８． 上記ポリマーが、生物技術用途に好適で、実質的に直鎖である請求項１ に記載の活性化ポリマー。 ９． 上記実質的に直鎖のポリマーが活性スルホン部分を除いては実質的に置 換されていない請求項８に記載の活性化ポリマー。 １０． 上記ポリマーがランダムまたはブロックコポリマーまたはターポリマー である請求項１に記載の活性化ポリマー。 １１． 上記ポリマーがポリマー主鎖末端の少なくとも一方に上記活性部分を持 ち、ポリマー主鎖の他方の末端に上記活性部分と同じかまたは異なる活性部分を 持つダンベル型構造である請求項１に記載の活性化ポリマー。 １２． 上記ポリマー主鎖の他方の末端に、アミノ部分と反応する異なる活性部 分を含む請求項１１に記載の活性化ポリマー。 １３． 上記ポリマーが枝分かれ分子構造の少なくとも一つのアームを含む請求 項１に記載の活性化ポリマー。 １４． 上記枝分かれ分子構造がデンドライトである請求項１３に記載の活性化 ポリマー。 １５． 上記少なくとも一つの活性スルホン部分が、表面または分子中の反応性 部分と結合を形成している請求項１に記載の活性化ポリマー。 １６． 上記反応性部分がチオール部分である請求項１５に記載の活性化ポリマ ー。 １７． 上記活性スルホン部分が、リンカー部分を含有する結合によって上記ポ リマーと結合し、上記ポリマーが、上記リンカー部分と結合するために上記活性 スルホン部分とは異なる活性部分を含有する請求項１に記載の活性化ポリマー。 １８． 上記他の活性部分がアミンに特異性を持ち、上記リンカー部分が活性ア ミノ部分を含む請求項１７に記載の活性化ポリマー。 １９． 上記活性化ポリマーがポリ（エチレングリコール）であり、上記他の活 性部分がアミノ部分であり、上記リンカーがＮＨＳ−Ｏ2Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ Ｏ2−ＣＨ＝ＣＨ2構造を持ち、及び上記活性化ポリマーがＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ− Ｃ Ｈ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2構造を持つ請求項１７に記載の活性化ポリマー 。 ２０． 約１１以下のｐＨの水性環境中において安定である請求項１に記載の活 性化ポリマー。 ２１． 約９以下のｐＨ条件下でチオール部分との反応に選択的である請求項１ に記載の活性化ポリマー。 ２２． 還元環境において安定である請求項１に記載の活性化ポリマー。 ２３． 上記活性化ポリマーが無限に水に溶ける請求項１に記載の活性化ポリマ ー。 ２４． 次の構造： Ｒ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−Ｙ （式中、ｎは５〜３，０００であり、Ｙは−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2及び−ＳＯ2− ＣＨ2−ＣＨ2−Ｘ（Ｘはハロゲンまたはその誘導体である。）からなる群より選 ばれ、ＲはＹと同じでも異なっていてもよい。） を有する活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体。 ２５． 上記ｎが約５〜２，２００である請求項２４に記載の活性化ポリ（エチ レングリコール）誘導体。 ２６． 上記ｎが約３４〜１，１００である請求項２４に記載の活性化ポリ（エ チレングリコール）誘導体。 ２７． 上記ｎが約４５〜１１０である請求項２４に記載の活性化ポリ（エチレ ングリコール）誘導体。 ２８． Ｒが、Ｈ−、Ｈ3Ｃ−、ＣＨ2＝ＣＨ−ＳＯ2−、Ｘ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ Ｏ2−及びこれらの誘導体からなる群より選ばれるか、またはＣＨ2＝ＣＨ−ＳＯ2 −またはＸ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−及びこれらの誘導体以外のポリ（エチレン グリコール）活性化部分である請求項２４に記載の活性化ポリ（エチレングリコ ール）誘導体。 ２９． 反応性チオール部分を持つ生物学的に活性な分子、及び該チオール部分 との結合を形成する活性スルホン部分を持つ水溶性ポリマー誘導体を含む加水分 解に対して安定な生物学的に活性な複合体。 ３０． 上記生物学的に活性な分子がタンパク質であって、上記反応性チオール 部分が上記タンパク質のシステイン部分中に含有されている請求項２９に記載の 複合体。 ３１． 上記ポリマー誘導体が、加水分解に対して安定であり、ポリ（アルキレ ンオキシド）、ポリ（オキシエチレーテッドポリオール）、及びポリ（オレフィ ンアルコール）からなる群より選ばれる請求項２９に記載の複合体。 ３２． 次の構造： ＰＥＧ−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｗ （式中、Ｗは生物学的に活性な分子である。） を有する請求項２９に記載の複合体。 ３３． 加水分解に対して安定な生物学的に活性な複合体であって、該複合体は 、同じかまたは異なる二つの生物学的に活性な部分と、水溶性ダンベル型ポリマ ー誘導体とを含み、該生物学的に活性な部分の少なくとも一つは、反応性チオー ル部分を持ち、該水溶性ダンベル型ポリマー誘導体は、その両末端の各々に反応 性部分を持ち、該反応性部分の少なくとも一つは、活性スルホン部分であって、 少なくとも一つの該生物学的に活性な部分のチオール部分と結合を形成し、他方 の該生物学的に活性な部分は、該ポリマー上の該反応性部分の他方と結合を形成 する複合体。 ３４． 上記生物学的に活性な部分が、タンパク質、医薬品、細胞、ビタミン及 びこれらの組合せからなる群より選ばれる請求項３３に記載の複合体。 ３５． 上記活性スルホン部分が、ビニルスルホンまたはハロエチルスルホンで あり、上記ポリマー誘導体上の上記他の反応性部分が、アミノ基との反応に選択 性を持つ請求項３３に記載の複合体。 ３６． 生物学的に活性な複合体であって、該複合体は、 チオール部分との反応に選択性のある少なくとも一つの活性スルホン部分と、 アミノ部分との反応に選択性のある少なくとも一つの他の部分とを有する水溶性 活性化ポリマーと、 チオール部分が該ポリマーの該スルホン部分と加水分解に対して安定な結合を 形成している、該チオール部分を持つ第一のタンパク質と、 アミノ部分が該ポリマーの該他の部分と結合を形成している、該アミノ部分を 持つ第二のタンパク質とからなる複合体。 ３７． 上記第一のタンパク質がシステイン単位を含有し、上記第二のタンパク 質がリジン単位を含有する請求項３６に記載の複合体。 ３８． 表面と、該表面に結合する少なくとも一つの水溶性ポリマー誘導体から なり、該ポリマー誘導体が、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチレ ーテッドポリオール）、及びポリ（オレフィンアルコール）からなる群より選ば れ、かつ、少なくとも一つの活性スルホン部分を持つ生体適合物質。 ３９． 上記表面が、表面上に少なくとも一つの反応性部分を持ち、上記ポリマ ー誘導体が、上記表面上の上記反応性部分と結合している一方の末端上の部分を 持つヘテロ二官能性ダンベル型構造であり、該ダンベルが他方の末端に活性スル ホン部分を持つ請求項３８に記載の生体適合物質。 ４０． 上記反応性部分がアミン部分であり、該アミン部分に結合している上記 ポリマー誘導体の上記部分がアミン選択性の部分である請求項３９に記載の生体 適合物質。 ４１． 上記活性スルホン部分が、ビニルスルホン、活性エチルスルホン、及び これらの誘導体からなる群より選ばれる請求項３８に記載の生体適合物質。 ４２． 上記ポリマー誘導体がＰＥＧポリマーからなる請求項３８に記載の生体 適合物質。 ４３． ポリマーとスルホン部分との間の結合が加水分解に対して安定である、 活性スルホン部分を持つ水溶性活性化有機ポリマーの合成方法であって、硫黄含 有部分をポリマーの炭素原子に直接結合した後、該硫黄含有部分を活性スルホン 部分に転換する工程を含む方法。 ４４． 上記活性スルホン部分を持つ上記活性化ポリマーを単離する工程をさら に含む請求項４３に記載の方法。 ４５． 硫黄含有部分をポリマーの炭素原子に直接結合する工程が、ポリマーの 活性化可能な少なくとも一つのヒドロキシル部分を活性化し、それによって得た 化合物をチオール部分を含有するアルコールと反応させて、硫黄をポリマーの炭 素−炭素鎖に直接結合する工程からなる請求項４３に記載の方法。 ４６． 少なくとも一つの活性化可能なヒドロキシル部分を活性化する工程が、 ヒドロキシルを置換することからなる工程、及びヒドロキシルの水素を反応性が より強い部分と交換することからなる工程から選ばれる請求項４５に記載の方法 。 ４７． チオール部分を含有するアルコールがメルカプトエタノールである請求 項４５に記載の方法。 ４８． 硫黄含有部分中の硫黄を酸化してスルホンとし、生成物をヒドロキシル 活性化部分またはヒドロキシル置換部分と反応させる工程によって、チオール部 分を含有するアルコールを活性スルホン部分に転換する請求項４５に記載の方法 。 ４９． 上記スルホンが活性エチルスルホンであり、活性エチルスルホンを強塩 基と反応させることによってポリマー上にビニルスルホン部分を形成させる工程 をさらに含む請求項４８に記載の方法。 ５０． （ａ）少なくとも一つの活性ヒドロキシル部分を持つポリ（エチレング リコール）を、エステル置換ポリ（エチレングリコール）またはハロゲン化物置 換ポリ（エチレングリコール）を形成する化合物と反応させる工程と、 （ｂ）工程（ａ）のエステル置換ポリ（エチレングリコール）またはハ ロゲン化物置換ポリ（エチレングリコール）を、メルカプトエタノールと反応さ せて、エステル部分またはハロゲン化物の部分をメルカプトエタノールラジカル と置換する工程と、 （ｃ）工程（ｂ）のメルカプトエタノール置換ポリ（エチレングリコー ル）を、酸化剤と反応させて、メルカプトエタノール部分の硫黄を酸化してスル ホンとする工程と、 （ｄ）工程（ｃ）のスルホンを、メルカプトエタノール部分のヒドロキ シルをエステル部分またはハロゲン化物部分に転換させる化合物と反応させる工 程と、 （ｅ）工程（ｄ）のエチルスルホンを塩基と反応させて、ポリ（エチレ ングリコール）ビニルスルホンを形成させる工程とを含む、ポリ（エチレングリ コール）ビニルスルホンの製造方法。 ５１． ポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンを単離する工程をさらに含 む請求項５０に記載の方法。 ５２． 工程（ｄ）のハロゲン化物が塩素であり、工程（ｄ）の生成物がポリ（ エチレングリコール）クロロエチルスルホンであり、上記方法がさらに、クロロ エチルスルホンをジクロロメタン中に溶解し、クロロエチルスルホンをエチルエ ーテル中で沈澱させ、沈澱物を酢酸エチルで再結晶することによって、ポリ（エ チレングリコール）クロロエチルスルホンを単離する工程を含む請求項５０に記 載の方法。 ５３． 塩基と反応させてポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンを形成す る工程の前に、ポリ（エチレングリコール）クロロエチルスルホンの結晶を有機 溶媒に溶解した後、濾過して塩基を取り除き、溶媒を蒸発させることによって、 ポリ（エチレングルコール）ビニルスルホン生成物を単離する工程をさらに含む 請求項５２に記載の方法。 ５４． ポリマーとスルホン部分との間の結合が加水分解に対して安定な、活性 スルホン部分を持つ水溶性活性化有機ポリマーの合成方法であって、活性スルホ ン部分と他の活性部分を含有する結合部分を、スルホン部分とは異なる官能基を 持つポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチレーテッドポリオール）、 及びポリ（オレフィニックアルコール）からなる群より選ばれ、かつ、該官能基 が該結合部分上の他の活性部分に対して選択的であるポリマー誘導体に付着させ る工程を含む方法。 ５５． 上記ポリマー誘導体の官能基が、アミノ部分との反応に対して選択的で あり、上記結合部分の他の活性部分が、活性アミノ部分を含有している請求項５ ４に記載の方法。 ５６． 上記ポリマー誘導体が、ＰＥＧスクシンイミジル活性エステルであり、 上記結合部分が、ＮＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ＝ＣＨ2構造を持つ請求項 ５４に記載の方法。 ５７． アミノ部分に対して選択的である官能基を持つポリ（エチレングリコー ル）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（オキシエチレーテッドグリセロー ル）、ポリ（オキシエチレーテッドソルビトール）、ポリ（オキシエチレーテッ ドグルコース）及びポリ（ビニルアルコール）からなる群より選ばれるポリマー 誘導体を調製し、アミノ部分とスルホン部分を含有する上記結合部分を調製し、 上記結合部分のアミノ部分を、ポリマー誘導体のアミノ選択性の部分と結合させ る工程をさらに含む請求項５４に記載の方法。 ５８． 物質と、少なくとも一つのスルホン部分を持つポリ（アルキレンオキシ ド）、ポリ（オキシエチレーテッドポリオール）、及びポリ（オレフィンアルコ ール）からなる群より選ばれる水溶性活性化ポリマーとの複合体を製造する方法 であって、該物質を、活性スルホン部分を持つ活性化ポリマーと反応させて、該 物質と該ポリマー誘導体の間の結合を形成させる工程を含む方法。 ５９． 上記物質が、活性チオール部分を含有し、上記結合が、該チオール部分 と上記スルホン部分の間に存在する請求項５８に記載の方法。 ６０． 上記物質が、活性アミノ部分を含有し、上記ポリマー誘導体が、アミノ 選択性の部分を含有し、上記結合が、該アミノ部分と該アミノ選択性の部分の間 に形成される請求項５８に記載の方法。 ６１． 上記活性化ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレ ングリコール）、ポリ（オキシエチレーテッドグリセロール）、ポリ（オキシエ チレーテッドソルビトール）、ポリ（オキシエチレーテッドグルコース）、及び ポリ（ビニルアルコール）からなる群より選ばれる請求項５８に記載の方法。 ６２． 上記物質が、生体適合物質のための合成物、タンパク質、医薬品、細胞 、及びビタミンからなる群より選ばれる請求項５８に記載の方法。 ６３． 生物学的に活性な分子とポリ（エチレングリコール）の活性な誘導体の 複合体を製造する方法であって、反応性チオール部分を持つ生物学的に活性な分 子を、活性スルホン部分を持つポリ（エチレングリコール）誘導体と反応させて 、該チオール部分と該活性スルホン部分の間の結合を形成する工程を含む方法。 ６４． 生物学的に活性な分子をポリ（エチレングリコール）誘導体と反応させ る工程が、約１１以下のｐＨの条件下で行われる請求項６３に記載の方法。 ６５． 生物学的に活性な分子をポリ（エチレングリコール）誘導体と反応させ る工程が、約９以下のｐＨの条件下で行われる請求項６３に記載の方法。 ６６． 上記活性スルホン部分が、ビニルスルホン、活性エチルスルホン、及び これらの活性誘導体からなる群より選ばれる請求項６３に記載の方法。
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