PT2136850E - Selante tecidual polimérico - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "SELANTE TECIDUAL POLIMÉRICO"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a biomateriais, especialmente selantes teciduais poliméricos e moléculas precursoras capazes de formar biomateriais, especialmente selantes teciduais poliméricos e métodos de preparação e uso dos mesmos. Em particular, a presente invenção refere-se a biomateriais para selagem ou bloqueio de dilacerações, cortes, ou abrasões de tecido.

Antecedentes da invenção

Enquanto realiza procedimentos médicos como parte de uma intervenção cirúrgica ou tratamento de ferimentos, um médico tem de lidar frequentemente com a extravasação de fluidos corporais, tais como fluidos cerebroespinhais durante a cirurgia cerebral ou espinhal, ou com sangue, resultante de um ferimento, doença ou distúrbio ou de um procedimento cirúrgico. A restauração do tecido e a integridade circulatória são importantes para um resultado positivo de um tratamento independentemente de o dano ser resultado de um ferimento ou de um procedimento cirúrgico. 0 método mais antigo de juntar tecidos danificados é o uso de prendedores mecânicos como pregadores, grampos, ou suturas. Os prendedores de tecidos mecânicos apresentam uma série de limitações. Os prendedores mecânicos exigem habilidade significativa, é necessário tempo para a sua aplicação e podem vazar ao longo da linha de junção, o que pode em si causar trauma adicional ao tecido circundante. Além disso, os prendedores mecânicos podem ser ineficazes em vá- 2 rios órgãos altamente vascularizados. Estas desvantagens tornam ainda mais lento o procedimento cirúrgico e o tempo de cicatrização.

Tentativas para superar estas desvantagens resultaram no desenvolvimento de adesivos, colas ou selantes capazes de unirem rapidamente superfícies de tecidos, quer sozinhos, ou em combinação com fixação mecânica, ao mesmo tempo promovendo, ou pelo menos não inibindo, a cicatrização normal, e reduzindo ou prevenindo a perda de fluidos corporais .

Uma classe comum de adesivos teciduais é a de materiais com bases em fibrina, que contêm um concentrado de fibrino-génio e trombina. Os adesivos de fibrina são tipicamente adesivos de dois componentes que quando misturados com uma fonte de cálcio reagem para simular os últimos estádios da cascata de formação de coágulo de sangue de ocorrência natural. 0 coágulo resultante adere ao tecido e liga tecidos, aberturas e tecido de selagem até ocorrer cicatrização. No entanto, adesivos com bases em fibrina tiveram sucesso limitado devido à baixa resistência dos materiais de selagem e ao risco de transfecção associado ao uso de produtos derivados de sangue humano.

Colas com bases em gelatina reticulada com um aldeído também tiveram sucesso limitado. Representantes desta classe de colas são gelatina-resorcinol reticulado com formal-deído (GRF) ou glutaraldeído (GRFG). Embora colas com bases em gelatina tenham sido extensivamente estudadas e mostrado ser eficazes, de maneira geral, estas composições tiveram sucesso limitado devido ao uso de soluções quentes de gela- 3 tina, à irritação de tecido associada ao aldeído e à criti-calidade dos procedimentos de manuseio necessários para a obtenção de reticulação apropriada no local da junção.

Devido às limitações descritas acima, um esforço de desenvolvimento considerável foi direcionado para a descoberta de uma composição sintética adequada para utilização como colas ou selantes teciduais. Para isso, cianoacrilatos, poliuretanos, polimetilmetacrilatos e polietileno glicóis, entre outros polímeros sintéticos,foram investigados como colas ou selantes teciduais com sucesso limitado. Existem poucas colas ou composições selantes teciduais que satisfazem as exigências de resistência mecânica e biocompatibili-dade, além de propriedades de manuseio consistentes com uma grande variedade de fixações cirúrgicas.

Entretanto, estas composições apresentam desvantagens no que concerne ao manuseio e propriedades mecânicas como a dilatação do biomaterial. Assim, existe uma necessidade de um biomaterial que possa ser aplicado como uma cola ou se-lante tecidual que não seja somente biocompatível, mas que tenha também uma cura bem definida e apresente uma combinação das propriedades mecânicas requeridas. É, portanto, um objeto da presente invenção prover composições, métodos e Kits adequados para formar biomateriais sintéticos para uso como selante tecidual. É ainda outro objeto da invenção, prover um biomaterial sintético para uso como selante tecidual que apresente baixo aumento de volume devido à absorção de água. É ainda, outro objeto da invenção prover um biomaterial sintético para uso como selante tecidual, que seja completamente ressorvível ao longo do tempo. É ainda outro objeto da invenção prover um bioma- 4 terial sintético com boa resistência mecânica para uso como selante tecidual. É ainda, outro objeto da invenção prover um biomaterial sintético que possa servir potencialmente como um auxílio para a reparação por sutura de lesão durai durante a cirurgia craniana e reduzir ou evitar vazamento de fluido cerebroespinhal para o ambiente externo.

Sumário da Invenção

Composições e métodos para o fabrico de biomateriais para uso como selantes teciduais, Kits contendo moléculas precursoras para a formação de biomateriais, e o uso de biomateriais em fixações cirúrgicas são aqui descritos. As composições, que são usadas para o fabrico de biomateriais, incluem pelo menos uma primeira e uma segunda molécula precursora. A primeira molécula precursora contém pelo menos dois grupos nucleofílicos, e a segunda molécula precursora contém pelo menos dois grupos eletrofílicos. Os grupos nu-cleofílico e eletrofílico da primeira e da segunda moléculas precursoras são capazes de formar ligações covalentes uns com os outros em condições fisiológicas. A reticulação ocorre preferencialmente em água em condições básicas. As moléculas precursoras são selecionadas com base nas propriedades desejadas do biomaterial. Numa forma de realização, a primeira molécula precursora é um polímero com base em poli(etileno glicol) tendo x grupos nucleofílicos selecionados a partir do grupo que consiste em grupos tiol ou ami-no, em que x é maior ou igual a 2. Preferencialmente, os x grupos nucleofílicos são grupos tiol. Preferencialmente a segunda molécula precursora é um copolímero em bloco poli (óxido de etileno-óxido de polipropileno) (PEO-PPO) mul-tirramifiçado funcionalizado em cada uma das suas ramificações com grupos insaturados conjugados e a segunda molécula precursora é da fórmula geral I: 5 A— [ (C3H60) n— (C2H4O) m—B] i (Fórmula I) em que m e n são inteiros de 1 a 200, i é superior a 2, preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, A é um ponto de ramificação, B é um grupo conjugado insaturado, por exemplo, acrilato

Tais polímeros são comercializados pela BASF com a designação comercial de Tetronic®.

Numa forma de realização preferencial, a primeira molécula precursora é um poli(etileno glicol) (PEG) de quatro ramificações funcionalizado em cada uma das suas ramificações por um grupo tiol (pentaeritritol poli(etileno glicol) éter tetrassulfidrila "PEG tetratiol"). Numa forma de realização mais preferencial, pentaeritritol poli(etileno glicol)éter tetrassulfidrila tem um peso molecular compreendido num intervalo de cerca de 2 a 20 kD, mais preferencialmente num intervalo de cerca de 3 a 11 kD e ainda mais preferencialmente num intervalo de cerca de 5 a 10 kD. Noutra forma de realização, os grupos insaturados conjugados B da segunda molécula precursora são grupos acrilato. Preferencialmente, o ponto de ramificação A da segunda molécula precursora é selecionado a partir do grupo que consiste em carbono, glicerol, pentaeritritol, dipentaeritritol e eti-leno diamina. Mais preferencialmente, o ponto de ramificação A da segunda molécula precursora é etileno diamina. A segunda molécula precursora de fórmula I tem um peso molecular compreendido num intervalo de cerca de 10 a 25 kD, mais preferencialmente um intervalo de cerca de 12 a 20 kD e ainda mais preferencialmente num intervalo de cerca de 14 a 18 kD. Preferencialmente, cada uma das ramificações da primeira ou segunda molécula precursora possui o mesmo grau β de polimerização. Isto significa que cada ramificação da primeira ou da segunda molécula precursora possui um peso molecular idêntico. A escolha de moléculas precursoras em que a soma do número de grupos nucleofilicos e grupos eletrofilicos é superior ou igual a cinco, resulta na formação de uma rede tridimensional. Opcionalmente, a composição contém um ou mais aditivos, como corantes, agentes tixotrópicos, agentes ra-diopacos, cargas, estabilizantes ou agentes bioativos. Numa forma de realização preferencial, a composição contém um corante selecionado a partir do grupo de azul de metileno, verde de lissamina ou verde rápido. Também opcionalmente, a composição contém uma base. Numa forma de realização, a base é carbonato de sódio. Na forma de realização preferencial, os biomateriais formados a partir das composições são usados para reduzir, inibir, ou conter a perda de fluidos corporais, como perda de fluido cerebroespinhal após cirurgia cerebral ou espinhal. Numa forma de realização preferencial, as composições são usadas como selante médico. Numa outra forma de realização preferencial, as composições são usadas para revestir a superfície de um tecido. Numa outra forma de realização, as composições são usadas para o fabrico de um medicamento para efetuar a fixação não-cirúrgica de uma primeira superfície e de uma segunda superfície .

Para a preparação dos biomateriais da presente invenção, o método para o fabrico do biomaterial compreende as etapas de: i) prover uma primeira molécula precursora ii) prover uma segunda molécula precursora iii) reagir as duas moléculas precursoras na pre- 7 sença de uma solução básica para formar uma rede tridimensional reticulada.

Preferecialmente a solução básica tem um pH compreendido num intervalo de 9 a 14, mais preferencialmente num intervalo de 10 a 13 e ainda mais preferencialmente num intervalo de 10 a 12. 0 pH da solução resultante de cada uma das etapas i), ii) ou iii) está preferencialmente compreendido num intervalo de 9 a 13, mais preferencialmente entre 9,5 e 11,5 e ainda mais preferencialmente entre 9,8 e 11 para permitir a gelificação rápida. Preferencialmente, a solução básica é uma solução de carbonato de sódio. Após pôr em contato as duas moléculas precursoras e a solução básica, o biomaterial é rapidamente formado; preferencialmente o biomaterial é formado em menos de dois minutos, mais preferecialmente em menos de 10 segundos e ainda mais preferencialmente em menos de 5 segundos.

As moléculas precursoras podem ser armazenadas separadamente como pós secos e/ou em soluções tamponadas, tendo tipicamente um pH ácido. Numa forma de realização preferencial, a primeira molécula precursora é armazenada como pó seco num primeiro recipiente e a segunda molécula precursora é armazenada numa solução aquosa tamponada tendo um pH ácido num segundo recipiente. Opcionalmente, a base pode ser armazenada em solução num terceiro recipiente. As moléculas precursoras podem ficar em contato por minutos ou horas antes da utilização. Numa forma de realização, a primeira molécula precursora e a segunda molécula precursora são mantidas separadas e somente são misturadas antes da transferência da mistura resultante para uma seringa de compartimento duplo. Um compartimento da seringa inclui a mistura das moléculas precursoras e o outro compartimento, a solução básica. Para preparar um biomaterial com as ca-racterísticas exigidas, o controlo da concentração das moléculas precursoras antes da reticulação é um importante parâmetro. Para manter este controlo, a seringa de compartimento duplo pode conter dois compartimentos com uma razão volumétrica predefinida. Preferencialmente a razão volumétrica dos compartimentos é de 1:5 e mais preferencialmente de 1:10. O compartimento maior contém a mistura das moléculas precursoras e o compartimento menor, a solução básica. A seringa de compartimento duplo é equipada com um cabeçote de spray destacável e os conteúdos dos dois compartimentos são pulverizados em conjunto para formar o biomaterial com uma rede tridimensional in situ, no local de necessidade do corpo.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra um gráfico linear de uma comparação de percentagem de dilatação versus tempo de formulações representativas dos biomateriais divulgados e um biomaterial comercialmente disponível quando armazenado em solução salina tamponada com fosfato a 37°C. A figura 2 mostra um gráfico linear de uma comparação de percentagem de dilatação versus tempo de formulações representativas dos biomateriais divulgados e um biomaterial comercialmente disponível quando armazenado em solução salina tamponada com fosfato a 50°C. A figura 3 mostra a influência do tampão no tempo de gelificação para a composição 10 preparada com tampão TEA em pH 7,4, 8 e 8,5. A figura 4 mostra a influência do tampão no tempo de 9 gelificaçao para a composição 13 preparada com um tampão de borato em pH 9,13, 9,32 e 9,47.

Descrição Detalhada da Invenção Definições "Biocompatibilidade" ou "biocompatível", como aqui geralmente utilizado, refere-se à capacidade de um material ter uma resposta apropriada ao hospedeiro numa aplicação especifica. No sentido mais amplo, isto significa uma ausência de efeitos adversos ao corpo de maneira a aumentar o beneficio do material e/ou tratamento para o paciente. "Biomaterial" ou "composição", como aqui geralmente utilizado, refere-se a um material projetado para fazer uma interface com sistemas biológicos para preferencialmente avaliar, tratar, ou selar, qualquer tecido, órgão ou função do corpo. Biomaterial refere-se ao material completo (moléculas precursoras mais todos os aditivos, base ou solventes e agentes bioativos, se houver) no momento e após ter alcançado e passado do seu ponto de gelificação. Composição refere-se ao material completo antes de ter atingido o seu ponto de gelificação. "Concentração de componentes precursores" como aqui utilizado refere-se à percentagem em massa, sendo definida como a massa do soluto em gramas multiplicada por 100 dividida pela massa da solução total em gramas, (isto é, soma de solvente e soluto): % em massa = massa de soluto (100)/massa da solução total. "Ligação insaturada conjugada" pode-se referir à alternância de ligações múltiplas com ligações simples de carbono-carbono, carbono-heteroátomo ou heteroátomo-heteroátomo. 10

Duplas ligações espaçadas por uma unidade de CH ou CH2 são referidas como "duplas ligações homoconjugadas. "Reticulação", como aqui geralmente utilizado, significa a formação de ligações covalentes. "Densidade de reticulação" como aqui utilizado significa o peso molecular médio entre duas reticulações (Mc) das respetivas moléculas. "Grupo eletrofilico" como aqui utilizado refere-se a grupos funcionais que são capazes de aceitar um par de eléctrões de um nucleófilo numa reação de formação de ligação polar. Os termos eletrófilo e grupo eletrofilico são usados como sinónimos. "Funcionalidade" como aqui geralmente utilizado significa o número de sítios reativos numa molécula precursora. "Sítios reativos" referem-se a grupos nucleofílicos e eletrofílicos que são capazes de reagir uns com os outros pelo menos, mas não exclusivamente, nas condições do corpo humano ou de animal. "Gel" refere-se ao estado da matéria entre líquido e sólido. Assim, "um gel" tem algumas das propriedades de um líquido (isto é, a forma é resiliente e deformável) e algumas das propriedades de um sólido (isto é, a forma é discreta o suficiente para manter três dimensões numa superfície bidimensional). "Ponto de gel" como aqui utilizado refere-se ao ponto onde o módulo viscoso e o módulo elástico se cruzam e a 11 viscosidade aumenta. Assim, o ponto de gel é o estádio em que um liquido começa a tomar as caracteristicas semissóli-das de um gel. "Formação in situ" como aqui geralmente utilizado refere-se à capacidade das misturas de moléculas precursoras que são substancialmente não-reticuladas antes e na ocasião da injeção de formarem ligações covalentes umas com as outras a uma temperatura fisiológica no local de injeção no corpo. "Peso molecular" como aqui utilizado refere-se ao peso molecular médio-peso de um número de moléculas em qualquer amostra dada, como usualmente utilizado na técnica. Assim, uma amostra de PEG 5 000 poderia conter uma mistura estatística de moléculas de polímero com peso num intervalo de, por exemplo, 4 000 a 6 000 dalton (Da) com uma molécula diferindo ligeiramente da outra por um intervalo. A especificação de um intervalo de pesos moleculares indica que o peso molecular médio pode ser qualquer valor entre os limites especificados, e pode incluir moléculas singulares fora desses limites. Assim, um intervalo de pesos moleculares de cerca de 2 000 Da a cerca de 20 000 Da indica um peso molecular médio de pelo menos cerca de 2 000 Da, indo até cerca de 20 kD. "Multifuncional" como aqui geralmente utilizado significa mais de um grupo funcional por molécula precursora. "Grupo nucleofílico" como aqui geralmente utilizado re-fere-se a grupos funcionais que são capazes de doar um par de electrões a um eletrófilo numa reação de formação de uma ligação polar. Preferencialmente o nucleófilo é mais nucle- 12 ófilo do que H20 em pH fisiológico. Um exemplo de um nucle-ófilo forte é um tiol e refere-se a moléculas que contêm estes grupos funcionais. Os termos nucleófilo e grupo nu-cleofílico são usados como sinónimos. "Oligómero e polímeros" são usados no sentido usual dos termos. Um oligómero é um polímero de baixo peso molecular. Tipicamente os oligómeros contêm entre duas e dez unidades monoméricas. Como aqui utilizado, os polímeros tipicamente contêm mais de 10 unidades monoméricas. "Polímero com base em poli(etileno glicol)" refere-se a um polímero em que a cadeia ou cadeias poliméricas do polímero são predominante, preferencial e completamente constituídas por poli(etileno glicol). "Fisiológicas" como aqui utilizado significam condições que podem ser encontradas em vertebrados vivos. Em particular, condições fisiológicas referem-se às condições do corpo humano como temperatura, pH, etc. Temperatura fisiológica significa em particular um intervalo de temperaturas de 35°C a 42°C, preferencialmente cerca de 37°C em pressão atmosférica. "Rede polimérica" como aqui utilizado refere-se ao produto de um processo em que substancialmente todos os monó-meros, oligómeros, ou polímeros usados como moléculas precursoras estão ligados por ligações intermoleculares, preferencialmente covalentes, através dos seus grupos funcionais disponíveis para formar uma macromolécula. "Moléculas precursoras" como aqui utilizado refere-se a moléculas que formam a rede polimérica do biomaterial. Além 13 da rede polimérica, o biomaterial pode conter aditivos e agentes ativos biológicos. Moléculas precursoras podem ser selecionadas entre monómeros, oligómeros e polímeros funci-onalizados. "Contraparte respetiva" como aqui utilizado significa o parceiro de reação de uma dada molécula precursora. A contraparte respetiva ao grupo eletrofílico é o grupo nu-cleofílico e vice-versa. "Reação autosseletiva" como aqui geralmente utilizado significa que a primeira molécula precursora da composição reage muito mais rápido com a segunda molécula precursora da composição e vice-versa do que com outros compostos presentes quer na composição e/ou no local da reação. Como aqui utilizado, o grupo nucleofílico da primeira molécula precursora preferencialmente se liga a um grupo eletrofílico da segunda molécula precursora ao invés de a outros compostos biológicos, e um grupo eletrofílico da segunda molécula precursora preferencialmente se liga ao grupo nucleofílico da primeira molécula precursora ao invés de a outros compostos biológicos. "Dilatação" como aqui utilizado refere-se à absorção de água dos biomateriais da presente invenção. Isto é uma função do aumento de massa do biomaterial na dilatação de equilíbrio, tipicamente após colocação do biomaterial num excesso de tampão de PBS (10 mM de solução salina tamponada com fosfato, por exemplo, P3813-pó da Sigma fornece um tampão de fosfato a 0,01 M, cloreto de potássio a 0, 0027 M e cloreto de sódio a 0,138 M, pH 7,4). Tipicamente a dilatação de equilíbrio é alcançada em 2 dias e é definida como o tempo que o biomaterial levou para alcançar a sua massa má- 14 xima antes da sua degradação. A dilatação é medida dividindo a massa do biomaterial na dilatação de equilíbrio pela massa inicial do biomaterial 10 min após a reação de reti-culação. Os termos "absorção de água" e "dilatação" são usados como sinónimos neste pedido. "Resistência coesiva" refere-se à capacidade dos bioma-teriais da presente invenção de permanecerem intactos, isto é, não romper, rasgar ou abrir, quando submetidos a tensões físicas ou condições ambientais. "Resistência coesiva" e "Resistência a rompimento" são usadas como sinónimos neste pedido. "Resistência adesiva" refere-se à capacidade dos bioma-teriais da presente invenção de serem capazes de permanecer fixados aos tecidos no local de administração quando submetidos a tensões físicas ou condições ambientais.

Composições É fornecida uma composição para o fabrico de um biomaterial reticulável ín situ que pode ser preferivelmente usado para reduzir, prevenir ou conter a perda de fluido no corpo humano. A composição contém pelo menos uma primeira e uma segunda moléculas precursoras multifuncionais. Opcionalmente aditivos, corantes e/ou agentes biologicamente ativos podem ser adicionados às moléculas precursoras para formar uma composição. A composição inclui moléculas precursoras mais qualquer aditivo e/ou ativo biológico e as moléculas precursoras podem polimerizar in situ no local de necessidade do corpo para formar a rede polimérica do biomaterial. A estrutura das moléculas precursoras é selecionada com base no tipo de biomaterial que é desejado. 15 A. Precursores A primeira molécula precursora contém pelo menos dois grupos nucleofilicos, e a segunda molécula precursora contém pelo menos dois grupos eletrofilicos. A primeira e a segunda moléculas precursoras são selecionadas de modo que os grupos nucleofilico e eletrofilico sejam capazes de formar ligações covalentes umas com as outras em condições fisiológicas ou em condições básicas. Isto pode ser obtido por diferentes mecanismos de reação. Um mecanismo de reação é uma reação de substituição nucleofilica. Noutra forma de realização, as moléculas precursoras formam ligações covalentes via uma adição de Michael entre grupos ou porções nucleofilicas da primeira molécula precursora e grupos ou porções insaturadas conjugadas da segunda molécula precursora. A reação de adição de Michael envolve a reação de um nucleófilo, como um grupo tiol, amina, ou hidroxila, com uma porção insaturada conjugada, como uma porção contendo carbonila a,β-insaturada.

Exemplos de moléculas precursoras incluem, mas não se limitam a, derivados de poliéter, como polioxialquilenos ou derivados dos mesmos, peptídeos, e polipeptideos, copolime-ros em bloco ou aleatórios poli(vinil pirrolidinona) ("PVP"), e poli(aminoácidos) . Derivados de polioxialquilenos preferidos são polietileno glicol ("PEG"), óxido de po-lipropileno ("PPO"), óxido de polietileno ("PEO"), óxido de polietileno-co-óxido de polipropileno ("PEO-PPO"), copolí-meros aleatórios ou em bloco de co -óxido de polietileno, poloxâmeros, meroxapols, poloxaminas e álcool polivinilico ("PVA"). Copolimeros em bloco ou homopolímeros (quando A=B) podem ser lineares (do tipo AB, ABA, ABABA ou ABCBA) , estrela (AnB ou BAnC, onde B é pelo menos n-valente, e n é 3 a 6) ou ramificados (múltiplos As dependendo de B). Molécu- 16 las precursoras preferidas são selecionadas entre PEGs e copolimeros em bloco PEO-PPO. No máximo da preferência, PEGs e copolimeros em bloco PEO-PPO são aplicados em combinação um com o outro. A primeira molécula precursora preferencial é um polímero com base em poli(etileno glicol) tendo x grupos nucleofílicos selecionados a partir do grupo que consiste em grupos tiol ou amino, em que x é maior ou igual a 2. Preferencialmente, a segunda molécula precursora é um copolímero em bloco multirramifiçado poli(óxido de etileno-óxido de polipropileno) (PEO-PPO) de fórmula geral (I) : A- [ (C3H60) n- (C2H4O) m-B] i (Fórmula I) em que m e n sao inteiros de 1 a 200 i é maior que 2, preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 A é um ponto de ramificação B é um grupo insaturado conjugado.

As moléculas precursoras são monómeros, oligómeros e/ou polímeros multifuncionais. Preferencialmente o peso molecular da primeira molécula precursora fica compreendido num intervalo entre 2 a 20 kD, mais preferencialmente entre 3 a 11 kD, no máximo da preferência de 5 a lOkD. O peso molecular preferencial da segunda molécula precursora fica preferencialmente entre 10 e 25kD, mais preferencialmente entre 12 e 20kD, no máximo da preferência entre 14 e 18kD.

Preferencialmente, o ponto de ramificação A da segunda molécula precursora é selecionado a partir do grupo que consiste em carbono, glicerol, pentaeritritol, dipentaeri-tritol e etileno diamina. Numa forma de realização, o bio-material é formado de um copolímero em bloco multirramifi- 17 cado poli(óxido de etileno-óxido de polipropileno) (PEO-PPO) de fórmula I em que A é uma molécula etileno diamina (isto é, onde i é igual a 4) e B é um grupo acrilato (Te-tronic®-tetra-acrilato). Copolimeros em bloco poli(óxido de etileno-óxido de polipropileno) (PEO-PPO) de quatro ramificações com uma molécula núcleo etileno diamina são vendidos pela BASF com o nome comercial Tetronic®. Numa forma de realização adicional, as composições incluem um tetra-acrilato Tetronic® tendo um peso molecular de cerca de 15 kD (Tetronic® 1107) e um PEG tetratiol com um peso molecular de cerca de 10 kD. Noutra forma de realização, o bioma-terial é formado a partir de tetra-acrilato Tetronic® tendo um peso molecular de cerca de 15 kD e um PEG tetratiol tendo um peso molecular de cerca de 5 kD. Noutra forma de realização preferencial, o biomaterial é formado a partir de um tetra-acrilato Tetronic® tendo um peso molecular de cerca de 15 kD e um PEG-ditiol linear com funcionalização terminal de peso molecular de cerca de 3,4 kD. Ainda noutra forma de realização, o tetra-acrilato Tetronic® é reticulado com ditiotreitol (DTT). Caracteristicas mecânicas do biomaterial (isto é resistência coesiva e resistência adesiva, dilatação e tempo de gelificação) são influenciadas pelo número de ramificações das moléculas precursoras e pelo comprimento dessas ramificações. Um elevado número de ramificações em cada molécula precursora resultará numa rede com reticulação mais densa tendo resistência coesiva maior. Entretanto, a ressorção do biomaterial resultante será mais lenta. O comprimento de cadeia da primeira molécula precursora tem uma influência na dilatação do biomaterial resultante. Cadeias mais longas de poli(etileno gli-col) fornecerão um biomaterial mais dilatável. 18

Preferivelmente as moléculas precursoras são simétricas, o que significa que as ramificações têm o mesmo peso molecular e estrutura. A soma da funcionalidade da primeira e da segunda moléculas precursoras é superior ou igual a cinco. Numa forma de realização, a primeira molécula precursora tem uma funcionalidade de quatro, e a segunda molécula precursora uma funcionalidade de três. Noutra forma de realização, a primeira molécula precursora tem uma funcionalidade de dois, e a segunda molécula precursora uma funcionalidade de quatro. Ainda noutra forma de realização, uma das moléculas precursoras tem uma funcionalidade de oito e a outra de quatro. Ainda noutra forma de realização, ambas as moléculas precursoras possuem uma funcionalidade de quatro ou mais. Uma molécula precursora pequena e compacta formará uma rede po-limérica com maior resistência do que uma molécula precursora extensa, embora a funcionalidade e o parceiro de reação possam ser os mesmos para ambas as moléculas.

Como uma diretriz geral, a razão entre os primeiro e segundo componentes é selecionada de modo que a maioria dos grupos funcionais de ambos os componentes reajam com as respetivas contrapartes. A razão dos grupos funcionais das primeira e segunda moléculas precursoras (isto é a razão de grupos eletrofilicos para grupos nucleofilicos fica compreendida num intervalo entre 0,7 a 1,2, mais preferencialmente entre 0,8 e 1,1 e no máximo da preferência 1 (isto é, razão estequiométrica). a. Grupos nucleofilicos

Os grupos nucleofilicos do primeiro componente precursor são capazes de reagir com grupos eletrofilicos, como 19 grupos insaturados conjugados em vários mecanismos de reação, preferencialmente autosseletivamente no corpo humano, através de uma substituição nucleofílica ou reação de adição de Michael. Os nucleófilos que são úteis são aqueles que são preferencialmente reativos a grupos insaturados conjugados via reações de adição, em particular numa reação de adição de Michael autosseletiva, em condições do corpo humano ou animal. A reatividade do nucleófilo depende da identidade do grupo insaturado. A identidade do grupo insa-turado é primeiramente limitada pela sua reação com água em pH fisiológico. Assim, os nucleófilos úteis são, geralmente, mais nucleofilicos que a água em pH fisiológico. Nucleófilos adequados incluem, mas não se limitam a, -SH, -NH2, -OH, -PH2, e -CO-NH-NH2. A utilidade de nucleófilos particulares depende da situação prevista e da quantidade de autosseletividade desejada. Na forma de realização preferencial, o nucleófilo é um tiol. No entanto, aminas e/ou grupos hidroxila podem também ser nucleófilos efetivos.

Deve-se prestar atenção particular ao pH, já que a ami-na ou tiol desprotonados são nucleófilos muito mais fortes do que a amina ou tiol protonado. Assim, se for dedicada atenção particular ao pK de uma amina ou tiol usado como o nucleófilo forte, autosseletividade substancial pode ser obtida. Condições de reação em que o pH da solução está próximo ao pK das aminas ou tióis das moléculas precursoras favorecem a reação do grupo insaturado conjugado com a amina ou tiol fornecido, ao invés de com outros nucleófilos presentes no sistema.

Os grupos nucleofilicos podem estar contidos em molécu- 20 las com grande flexibilidade na estrutura global. Por exemplo, um nucleófilo difuncional poderia ser apresentado na forma de Nuc-P-Nuc, onde P indica um monómero, oligómero ou polimero e Nuc refere-se ao nucleófilo. Da mesma forma, um polimero ramificado, P, poderia ser derivatizado com vários nucleófilos para criar P-(NuC)i., onde i é maior que 1. O nucleófilo poderia fazer parte da estrutura de repetição, por exemplo (P-NuC)i. Claramente, nem todos os P ou os nucleófilos dessa estrutura precisam ser iguais.

Polietileno glicóis e seus derivados podem ser quimicamente modificados para conter grupos amino primário ou tiol múltiplos de acordo com métodos apresentados, por exemplo, no Capitulo 22 de POLY (ETHYILENE GLYCOL) CHEMISTRY: BIOTE-CHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, ed., Plenum Press, NY (1992) . Numa forma de realização mais preferencial, o tiol presente nas extremidades da primeira molécula precursora é introduzido nos polímeros com bases em PEG pela substituição dos grupos hidroxila terminais por um grupo tiol (SH). A molécula precursora assim obtida reage mais rapidamente com a segunda molécula precursora do que com uma molécula precursora em que o grupo tiol é introduzido através de um grupo mercaptopropionato. Várias formas de PEG multiamino são comercialmente disponíveis na Nektar Therapeutics, Inc. de San Carlos, Calif, (através de sua aquisição de Shearwater Polymers of Hunts-ville, Ala.), e da Texaco Chemical Company of Houston, Tex. com o nome "Jeffamine." PEGs multiamino úteis na presente invenção incluem diaminas (série "D") e triaminas (série "T") Jeffamine da Texaco, que contêm dois e três grupos amino primários por molécula, respetivamente. Poliaminas como etilenodiamina (H2N-CH2CH2-NH2) , tetrametilenodiamina 21 (Η2Ν—(CH2) 4-ΝΗ2), pentametilenodiamina (cadaverina) (H2N-(CH2)5-NH2), hexametil-enodiamina (H2N- (CH2) 6-NH2) , bis (2-hidroxietil)amina (HN-(CH2CH2OH)2) , bis(2-aminoetil)amina (HN- (CH2CH2NH2) 2) , e tris (2-aminoetil) amina (N- (CH2CH2NH2) 3) podem também ser usados como o polímero sintético contendo grupos nucleofílicos múltiplos.

Ditiotreitol (HS-CH2-CHOH-CHOH-CH2-SH) podem também ser usados como o polímero sintético contendo grupos nucleofí-licos múltiplos.

Primeiras moléculas precursoras preferenciais

Numa forma de realização preferencial, a primeira molécula precursora é um PEG tetratiol de acordo com a fórmula II:

em que n está compreendido entre 25 e 60. b. Grupos eletrofilicos

Os grupos eletrofilicos da segunda molécula precursora são preferencialmente grupos conjugados insaturados. Estruturas de P e dos grupos conjugados insaturados podem ser similares àquelas descritas acima para os nucleófilos. É somente necessário que um precursor eletrofílico contenha dois ou mais de tais grupos eletrofilicos. Numa forma de realização, os grupos eletrofilicos são grupos insaturados 22 conjugados . É possível realizar reações de adição nucleofílicas, em particular reações de adição de Michael numa ampla variedade de compostos insaturados conjugados. Nas estruturas mostradas abaixo, uma estrutura monomérica, oligomérica ou po-limérica é indicada como P. Várias possibilidades preferenciais para a identidade específica de P são discutidas abaixo. P pode ser acoplado a grupos insaturados conjugados reativos, incluindo, mas não se restringindo, as estruturas numeradas de 1 a 20 na Tabela 1.

23 23

Tabela 1: Estruturas moleculares contendo P e grupos insaturados conjugados

0 V A: X = CH; Y = CH; R= H, W la) B: T r X = N; Y = N; R = Η, P 0 C: 4 X-Y = C = C; R = W-P(W P... ...vV. Ò

O

O ^ A ,w„ o

X, Y = Η, P

P, P P, H P, cadeia alifática P 1o 1 0 ~V° ~ o w o w II 12 =\ <P O Y I w 13 >? I w 14 p !,0 n' A ro

Y = 0, NH X = ião de metal alcalino ou alcalino terroso, P W = P, 1,4-Ph-P

X = halogénio, sulfonato 15

X 24

Duplas ligações reativas podem ser conjugadas a um ou mais grupos carbonila numa estrutura linear de cetona, éster ou amida (la, lb, 2) ou a dois num sistema de anel, como num derivado maleico ou paraquinoide (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10). No último caso, o anel pode ser fundido para fornecer uma naftoquinona (6, 7, 10) ou uma 4,7-benzimidazolodiona (8) e os grupos carbonila podem ser convertidos numa oxima (9, 10). A dupla ligação pode ser conjugada a uma dupla ligação heteroátomo-heteroátomo, como uma sulfona (11), um sulfóxido (12), um sulfonato ou uma sulfonamida (13), ou um fosfonato ou fosfonamida (14). Finalmente, a dupla ligação pode ser conjugada a um sistema aromático deficiente em electrões, como um ião 4-vinilpiridínio (15) . Triplas ligações podem ser usadas em conjugação com ligações múltiplas com bases em carbonila ou heteroátomo (16, 17, 18, 19, 20).

Estruturas como la, lb e 2 são baseadas na conjugação de uma dupla ligação carbono-carbono com um ou dois grupos captadores de electrões. Um deles é sempre uma carbonila, aumentando a reatividade, passando de uma amida para um éster e, em seguida para uma estrutura de fenona. A adição nucleofílica é mais fácil na diminuição do impedimento es- 25 térico, ou no aumento do poder de captação de electrões na posição alfa. Por exemplo, a seguinte relação existe, CH3<H<C00W<CN, onde CH3 tem o menor poder de captação de electrões e CN tem o maior poder de captação de electrões. A reatividade mais alta obtida usando as duas últimas estruturas pode ser modulada variando o volume dos substi-tuintes na posição beta, onde ocorre o ataque nucleofilico; a reatividade decresce na ordem P<W<Ph<H. Assim, a posição de P pode ser usada para modular a reatividade a nucleófi-los. Esta familia de compostos inclui alguns compostos cuja toxicologia e uso em medicina é bastante conhecido. Por exemplo, polímeros solúveis em água com acrilatos e meta-crilatos nas suas extremidades são polimerizados (por mecanismos de radical livre) in vivo. Assim, polímeros contendo acrilato e metacrilato têm sido usados no corpo em produtos clínicos, mas com um esquema de reação química dramaticamente diferente.

As estruturas 3-10 apresentam reatividade muito alta a nucleófilos, devido tanto à configuração cis da dupla ligação quanto à presença de dois grupos captadores de electrões. Cetonas insaturadas reagem mais rápido do que amidas ou imidas, devido à eletronegatividade mais forte destes grupos carbonila. Assim, derivados de ciclopentenodiona reagem mais rápido do que os maleimídicos (3), e paraquinonas reagem mais rápido do que hidrazidas maleicas (4) e ciclo-hexanonas, devido à conjugação mais extensa. As naftoquino-nas (7) apresentam a mais alta reatividade. P pode ser posto em posições onde ele não reduz a reatividade do grupo insaturado, que está na parte oposta do anel (3, 5) , noutro anel (7, 8) ou ligado a O através de uma para-quinona mono-oxima (9, 10). Para reduzir a velocidade da reação de adi- 26 çao nucleofílica, P pode também ser ligado à dupla ligaçao reativa (6, 8). A ativação de duplas ligações para adição nucleofilica pode ser obtida usando grupos captadores de electrões com bases em heteroátomo. Na realidade, análogos contendo hete-roátomo de cetonas (11, 12), ésteres e amidas (13, 14) proporcionam comportamento de captação de electrões similar. A reatividade à adição nucleofilica aumenta com a eletronega-tividade do grupo. Assim, as estruturas possuem a seguinte relação, 11>12>13>14, em que 11 é o mais eletronegativo e 14 é o menos eletronegativo. A reatividade à adição nu-cleofílica é também aumentada pela ligação com um anel aromático. Uma forte ativação de duplas ligações pode também ser obtida, usando grupos captadores de electrões baseados em anéis aromáticos. Qualquer estrutura aromática contendo um catião similar a piridínio (por exemplo, derivados de quinolina, imidazol, pirazina, pirimidina, piridazina, e compostos similares contendo nitrogénio-sp2) polariza fortemente a dupla ligação e torna possível rápidas adições do tipo Michael.

Triplas ligações carbono-carbono conjugadas com grupos captadores de electrões com bases em carbono ou heteroátomo podem facilmente reagir com nucleófilos de enxofre para fornecerem produtos de adição simples e dupla. A reatividade é influenciada pelos substituintes, numa maneira similar a compostos análogos contendo dupla ligação discutidos acima. Numa forma de realização preferencial, os grupos ele-trofílicos são grupos acrilato.

Segundas moléculas precursoras preferidas

Na forma de realização preferencial, a segunda molécula 27 precursora é um monómero, oligómero ou polímero que contém acrilatos. Em particular, o segundo precursor é um composto de acordo com a Fórmula Ia, como uma forma de realização específica da Fórmula I:

(Formula Ia) em que nem sao inteiros de 1 a 200.

Preferivelmente, n está compreendido num intervalo entre 18 e 22 e m está compreendido num intervalo entre 58 e 62.

Tetronic® é um copolímero em bloco tetrafuncional com base em óxido de polietileno e óxido de polipropileno disponível da BASF. Copolímeros em bloco Tetronic® podem ser funcionalizados com grupos insaturados conjugados, como grupos acrilato, reagindo os grupos hidroxila livres do polímero com um excesso de cloreto de acriloíla na presença de uma base. Outro grupo eletrofílico pode ser adicionado de maneira similar. c. Aditivos A composição pode conter adicionalmente aditivos orgânicos e/ou inorgânicos, como agentes tixotrópicos, agentes radiopacos e/ou agentes fluorescentes para acompanhar o de- 28 sempenho da aplicação ou para detetar instantaneamente o vazamento potencial que não for prontamente visível, esta-bilizantes para estabilização das moléculas precursoras para evitar polimerização prematura e/ou cargas que podem resultar num aumento nas propriedades mecânicas (por exemplo, resistência máxima à compressão e módulo de Young E) do bi-omaterial comparado às propriedades mecânicas da rede po-limérica. Exemplos de agentes de estabilização incluem eli-minadores de radical, como hidroxitolueno butilado ou diti-otreitol. Dependendo da aplicação, a composição (e, portanto, o biomaterial) pode conter um corante, preferivelmente um corante orgânico, como um corante. Numa forma de realização é adicionado azul de metileno como corante. Azul de metileno não só age como um corante, mas também pode agir como um estabilizante para as moléculas precursoras contendo acrilato agindo como um agente de redução. Pode também agir como um indicador para formação de dissulfeto (já que ele se torna incolor com a redução). Noutra forma de realização, verde rápido é adicionado como corante. Outro corante preferido é verde de lissamina. Verde de lissamina e verde rápido são corantes que possuem a capacidade de alterar a cor devido ao pH da solução. São verdes em condições ácidas e azul em condições básicas. Portanto, estes dois corantes possuem a vantagem adicional de indicar a boa mistura das soluções de molécula precursora com a solução básica. d. Bases A reticulação in situ das primeira e segunda moléculas precursoras ocorre em condições básicas. Várias bases obedecem aos requisitos de catalisação da reação em condições fisiológicas e de não serem prejudiciais ao corpo do paciente, agindo assim como ativadores na formação do biomate- 29 rial. Bases adequadas incluem, mas não se restringem a, al-quilaminas terciárias, como tributilamina, trietilamina, etildi-isopropilamina, ou N,N- dimetilbutilamina. Para uma dada composição (e principalmente dependente do tipo de moléculas precursoras), o tempo de gelificação é dependente do tipo de base e do pH da solução. Assim, o tempo de gelificação da composição pode ser controlado e ajustado à aplicação desejada variando o pH da solução básica. 0 aumento do pH da solução básica reduzirá o tempo de gelificação, mas também aumentará o tempo de degradação do biomate-rial. Portanto, tem de ser obtido um compromisso entre tempo de gelificação e degradação. Numa forma de realização preferencial, a base, como o ativador da reação de reticu-lação covalente é selecionada de entre soluções tampão aquosas que possuem o seu pH e valor de pK compreendidos no mesmo intervalo. 0 intervalo de pK fica preferencialmente entre 9 e 13. Se a base possui dois valores de pK no intervalo básico, o primeiro fica preferencialmente entre 8,5 e 10 e o segundo entre 10 e 13. Tampões adequados incluem, mas não se restringem a, carbonato de sódio, borato de sódio e glicina. Numa forma de realização, a base preferencial é carbonato de sódio. Preferencialmente, a solução básica tem um pH compreendido num intervalo entre 9 e 14, mais preferencialmente num intervalo entre 10 e 13 e ainda mais preferencialmente num intervalo entre 10 e 12. e. Agentes bioativos 0 biomaterial pode também conter fatores bioativos, como pequenas moléculas ou proteínas peptídeos que se podem difundir vagarosamente a partir do biomaterial ajudando o tecido a regenerar-se e a cicatrizar. Nestes casos, o biomaterial funciona tanto como selante tecidual com propriedades regenerativas de tecido adicionais e como matriz de 30 distribuição de fármaco. Os fatores bioativos e/ou pequenas moléculas podem simplesmente ser misturados no biomaterial ou podem ser covalentemente ligados ao biomaterial pela incorporação de um grupo tiol livre na molécula e libertados por degradação hidrolítica ou enzimática. Os fatores bioativos podem ser fatores de crescimento, preferencialmente aqueles da superfamilia TGF beta e PDGF. II. Biomateriais

Como mencionado acima, os requisitos de biomateriais, e portanto a escolha das moléculas precursoras, estão dependentes da finalidade e sitio de aplicação no corpo. Numa forma de realização preferencial, o biomaterial forma um revestimento, uma barreira ou vedante que evita, reduz, ou contém a perda de fluido. Perda de fluido inclui, mas não se restringe à perda de qualquer fluido biológico ou gás como perda de sangue, perda de fluido cerebroespinhal ou perda de gás dos pulmões. O biomaterial pode ser aplicado internamente ou externamente ao corpo. Para esta finalidade, o biomaterial deve ter boa resistência adesiva e coesiva, um tempo de gelificação rápido adaptável, um baixo aumento de volume devido à absorção de água, bem como uma ressorção completa pelo corpo ao longo do tempo. Enquanto a estabilidade mecânica do biomaterial é essencialmente dependente da densidade de reticulação da rede polimérica, a absorção de água pelo biomaterial é influenciada pela ação reciproca da densidade de reticulação, e da hidrofobicidade da rede polimérica. A densidade de reticulação e natureza hidrofóbica do biomaterial são em grande medida determinadas pela estrutura e razão dos componentes precursores. Portanto, a absorção de água e o desempenho mecânico do biomaterial podem ser controlados e influenciados pela escolha apropriada dos componentes precursores. 31

Características de Biomateriais

Numa forma de realização, o biomaterial é usado para selar a dura máter do cérebro ou espinha após ter sido cortada ou lesionada para evitar ou reduzir o vazamento de fluido cerebroespinhal para o ambiente externo após intervenção cirúrgica. A selagem pode ser feita como um complemento à sutura ou se a lesão à dura máter não for tão grande. 0 biomaterial pode ser usado como o único meio de fechamento para efetuar a fixação não cirúrgica de uma primeira superfície com uma segunda superfície. Na aplicação mais preferencial, a composição é usada como um complemento à sutura na reparação durai após a cirurgia craniana. Um fator que influencia o tempo de reação para formar o biomaterial para uso como um selante durai (referido como "se-lante") é o pH da composição na ocasião da reticulação. As moléculas precursoras são dissolvidas numa solução tampão aquosa com um pH entre 2 e 7,5, mais preferencialmente entre 4 e 5. Numa forma de realização preferencial acetato de sódio com um pK de 4,76, fosfato de sódio com um pKl de 2,15 e um pK2 de 7,2 ou ácido clorídrico (HC1) são empregues para preparar as soluções tamponadas ou para ajustar o pH das soluções de moléculas precursoras. Após ou durante a mistura das moléculas precursoras (e quaisquer aditivos e/ou agentes biologicamente ativos) uma base tem de catalisar a reação como um ativador. Preferencialmente a solução básica é usada como um ativador tendo pelo menos um dos seus valores de pK compreendido num intervalo entre 9 e 13. Os mais preferenciais são carbonato de sódio com um pK2 de 10,33 ou borato de sódio com pKl de 9,23 e pK2 de 12,74. Adicionalmente borato de sódio tem propriedades antissépticas e é também por essa razão vantajosamente usado para aplicações a feridas. Noutra forma de realização a glicina, pode ser usada como ativador com um pK2 de 9,78. Preferen- 32 cialmente, a composição na ocasião da reticulação tem um pH compreendido num intervalo entre 9 e 13, mais preferencialmente num intervalo entre 9,5 e 11,5, ainda mais preferencialmente num intervalo entre 9,8 e 11 e ainda mais preferencialmente num intervalo entre 10,3 e 10,6. A composição usada como selante durai tem de ter um tempo de reticulação muito rápido para ficar no lugar e evitar imediatamente o vazamento. Preferencialmente, a composição reticula em menos de dois minutos, ainda mais preferencialmente em menos de um minuto e no máximo da preferência entre 5 e 20 segundos e ainda mais preferencialmente entre 1 e 5 segundos. A dilatação do biomaterial deve ser limitada já que a dilatação pode resultar em pressão nos tecidos resultando em compressão do nervo ou isquemia. Como definido anterior-mente, a dilatação do selante não deve exceder 1,5 e preferencialmente é menor do que 1, mais preferencialmente menor que 0,5. O mais preferencial é a dilatação que resulta num valor compreendido num intervalo entre 0,1 a 1,5, mais preferencialmente num intervalo entre 0,1 e 1 e ainda mais preferencialmente entre 0,1 e 0,8. Numa forma de realização preferencial, pelo menos uma das moléculas precursoras tem como espinha dorsal uma molécula mais hidrofóbica do que polietileno glicol. Por exemplo, numa forma de realização, a primeira molécula precursora tem uma espinha dorsal de PEG em combinação com um copolímero em bloco PEO/PPO como espinha dorsal da segunda molécula precursora. Preferencialmente ambas as moléculas precursoras possuem um número de ramificações com funcionalidade terminal de três ou mais. No máximo da preferência ambas as moléculas precursoras contêm quatro ramificações com funcionalidade terminal. 33

Preferencialmente a primeira molécula precursora é um PEG tetratiol (Fórmula II) tendo um peso molecular entre 4 kD e 11 kD mais preferencialmente entre 5kD e lOkD. 0 segundo componente precursor preferencialmente é um tetra-acrilato Tetronic® (Fórmula I) tendo um peso molecular entre lOkD e 20kD, mais preferencialmente de cerca de 15kD. Em particular, boas propriedades de um material selante devem ser obtidas combinando um PEG tetratiol de 5kD ou lOkD com um tetra-acrilato Tetronic®. A concentração da segunda molécula precursora (o precursor eletrofílico) que forma o biomate-rial fica compreendido num intervalo entre 8 % e 18% em p/p, mais preferencialmente entre 10% e 16% em p/p e no máximo da preferência entre 12% e 14% em p/p. A concentração da primeira molécula precursora (molécula precursora nu-cleofílica) é calculada e ajustada de acordo com a razão desejada de grupos funcionais entre a primeira e a segunda moléculas precursoras. Os intervalos de concentração das moléculas precursoras também possuem um impacto significativo na dilatação, gelificação e tempo de ressorção do bio-material e por esta razão o intervalo ótimo é de importância para as propriedades finais do selante. O inicio do processo com uma baixa concentração das moléculas precursoras aumentará o tempo de gelificação, mas resultará num bi-omaterial que dilatará menos. Noutra forma de realização, o biomaterial degrada-se in vivo em menos de 12 semanas. III. Métodos de formação de biomateriais A. Armazenamento A primeira e a segunda moléculas precursoras são preferencialmente armazenadas em solução com exclusão de oxigénio e a baixas temperaturas, por exemplo de cerca de +4°C, para evitar decomposição dos grupos funcionais antes do 34 uso. As moléculas precursoras podem ser armazenadas como pó seco ou como solução num tampão. Numa forma de realização, as duas moléculas precursoras são armazenadas como solução num tampão ácido de acetato de sódio. Noutra forma de realização a primeira molécula precursora é armazenada como pó seco e a segunda molécula precursora é armazenada numa solução tendo um pH ácido. B. Preparação de composição para selante tecidual A composição que forma um biomaterial, em particular um selante tecidual pode ser preparada pelo seguinte método geral: a) prover pelo menos uma primeira molécula precursora multifuncional contendo pelo menos dois grupos nucleofíli-cos, preferencialmente quatro grupos nucleofilicos, que opcionalmente inclui aditivos e/ou agentes biologicamente ativos; b) prover pelo menos uma segunda molécula precursora multifuncional contendo pelo menos dois grupos eletrofíli-cos, preferencialmente quatro grupos eletrofilicos capazes de formar ligações covalentes com os grupos nucleofilicos da etapa a) em condições fisiológicas, que opcionalmente inclui aditivos e/ou agentes biologicamente ativos; c) dissolver as moléculas precursoras das etapas a) e b) numa solução tampão, preferencialmente tendo um pH ácido; d) misturar as soluções de moléculas precursoras obtidas na etapa c); e e) adicionar uma solução básica durante a etapa d) ou depois, preferencialmente uma solução tampão aquosa com um valor de pH entre 9 e 13 para iniciar a reação de reticula-ção entre as soluções das primeira e segunda moléculas pre- 35 cursoras.

Numa forma de realização preferencial, um método para a preparação de biomaterial inclui as etapas de: i) prover uma primeira molécula precursora que é um polímero com base em poli(etileno glicol) tendo x grupos terminais tiol, em que x é igual a 2 ou mais que 2, preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8; ii) prover uma segunda molécula precursora da fórmula geral: A- [ (C3H60)n-(C2H40)m—B]i em que m e n são inteiros de 1 a 200; i é maior do que 2, preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ; A é selecionado a partir do grupo que consiste em carbono, glicerol, pentaeritritol, dipentaeritritol e eti-leno diamina; B é um grupo insaturado conjugado; iii) reagir as moléculas precursoras das etapas i) e ii) na presença de uma base para formar uma rede tridimensional reticulada.

Quando as primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas, a reticulação ocorre com baixa velocidade (de 10 minutos a horas) se o pH da solução for ácido. Para evitar que a mistura atinja o ponto de gelificação antes da administração e para formar o biomaterial num tempo rápido predefinido é, portanto, necessário armazenar as moléculas precursoras em solução com um pH ácido. Preferencialmente, o pH da solução está compreendido num intervalo entre 2 a 6 e mais preferencialmente num intervalo entre 2,5 a 5,5. So- 36 luções ácidas preferenciais sao obtidas com uma solução tampão de acetato ou solução de ácido clorídrico.

Numa forma de realização preferencial, as primeira e segunda moléculas precursoras são dissolvidas numa solução tampão tendo um pH ácido. Noutra forma de realização preferencial, a primeira molécula precursora é um pó seco, a segunda molécula precursora é dissolvida numa solução tampão tendo um pH ácido e as duas moléculas precursoras são misturadas antes de entrarem em contato com a base. As primeira e segunda moléculas precursoras e quaisquer aditivos e/ou agentes biologicamente ativos, se presentes, podem opcionalmente ser esterilizados antes da mistura. Isto é feito, preferencialmente, por filtração estéril dos componentes precursores e qualquer outro componente solúvel e por irradiação gama de componentes insolúveis em água. As moléculas precursoras obtidas nas etapas a), b) e/ou a mistura obtida na etapa d) podem ser armazenadas durante um tempo prolongado, preferencialmente em baixas temperaturas. Antes da aplicação, as moléculas precursoras (e outros componentes, se presentes) são misturadas umas com as outras, e em seguida com uma solução básica como ativador. Com a introdução da solução básica, a composição rapidamente se geli-fica. Preferencialmente, a composição, incluindo a solução básica, tem um pH compreendido num intervalo entre 9 a 13, mais preferencialmente num intervalo entre 9,5 a 11,5, ainda mais preferencialmente num intervalo entre 9,8 a 11 e ainda mais preferencialmente num intervalo entre 10,3 a 10,6 para permitir que a gelificação ocorra em menos de 2 minutos, preferencialmente em menos de 10 segundos e mais preferencialmente em menos de 5 segundos. Existem diferentes modos de mistura. Numa forma de realização, três seringas, uma contendo o precursor nucleofilico, outra contendo 37 o precursor eletrofίlico, e a terceira contendo a solução básica, podem ser interconectadas usando um dispositivo co-nector de três vias. Os conteúdos das seringas são misturados sendo pressionados através de um misturador estático na saída do dispositivo conector de três vias. A composição é injetada diretamente num local do corpo com necessidade de tratamento, conectando o misturador estático a uma agulha de injeção. Numa segunda forma de realização, uma das soluções de moléculas precursoras é misturada com a solução básica. Isto é feito, preferencialmente conectando a seringa contendo a solução básica à seringa contendo preferencialmente o precursor eletrofílico (opcionalmente contendo também aditivos e/ou agentes ativos biológicos) por meio de um dispositivo conector, que permite uma mistura seringa a seringa dos respetivos conteúdos. Um misturador estático pode fazer parte do dispositivo conector. A mistura está completa quando é alcançada uma mistura homogénea. Após mistura, uma seringa contém uma mistura de base/molécula precursora e a outra seringa está vazia. Então, a seringa vazia é removida do dispositivo conector e substituída pela seringa contendo a outra molécula precursora opcionalmente contendo também aditivos e/ou agentes ativos biológicos. Novamente, a mistura seringa a seringa é uma maneira de obter uma mistura homogénea dos dois conteúdos. Subsequentemente a seringa contendo a mistura é conectada à agulha de injeção e a composição é injetada no local do corpo que a necessita.

Alternativamente, a seringa contendo a mistura ba-se/precursor e a seringa contendo o outro precursor são ligadas por meio de um dispositivo conector de duas vias contendo um misturador estático na sua saída. 0 dispositivo conector de duas vias pode ser uma seringa de compartimento duplo. Os conteúdos são misturados comprimindo os conteúdos 38 das seringas através do misturador estático. 0 misturador estático é diretamente ligado à agulha de injeção ou a mistura é comprimida numa outra seringa, que é, então ligada à agulha de injeção.

Numa forma de realização preferencial, as soluções das primeira e segunda moléculas precursoras, preferencialmente primeira e segunda moléculas precursoras dissolvidas num tampão de acetato de sódio, são misturadas (juntamente com quaisquer aditivos ou agentes biologicamente ativos, se necessário) e então pulverizadas juntamente com um ativador, uma solução básica, no tecido. IV. Kits para formação in situ de Composições Reticuláveis

Os kits da presente invenção são conjuntos de partes usadas para a formação dos biomateriais da presente invenção. 0 kit contém pelo menos os primeiro e segundo componentes precursores. 0 kit pode também conter um ou mais dispositivos, como seringas ou seringas de compartimento duplo, para administração das primeira e segunda moléculas precursoras mais quaisquer aditivos e/ou agentes biologicamente ativos. 0 kit pode também conter recipientes para armazenar as moléculas precursoras e a solução básica. Os kits também contêm dispositivos sem agulha para transferir os conteúdos dos recipientes de um para o outro ou para transferir os conteúdos dos recipientes para uma seringa de compartimento duplo. Opcionalmente, o Kit também contém uma solução básica. Preferencialmente, a base é armazenada num terceiro recipiente. Opcionalmente, as primeira e/ou segunda moléculas precursoras contêm um ou mais aditivos e/ou agentes biologicamente ativos. As moléculas precursoras podem ser colocadas num ou mais dispositivos antes da administração a um paciente. 0 Kit pode também incluir um co- 39 rante, por exemplo azul de metileno, verde de lissamina ou verde rápido, que podem ser adicionados ao biomaterial para facilitar a visualização do biomaterial. Numa forma de realização preferencial e particularmente adequada para a aplicação de biomateriais, as soluções de moléculas precursoras são armazenadas num dos compartimentos de um dispositivo de compartimento duplo e a solução básica é armazenada no sequndo compartimento do mesmo dispositivo. A saida do dispositivo contém um bico de pulverização que opcionalmente pode ser combinado com um misturador estático para otimizar a mistura da solução básica com as soluções de moléculas precursoras. As soluções de moléculas precursoras (mais quaisquer aditivos ou agentes ativos biológicos, se necessário) podem estar contidas no compartimento, pré-misturadas, ou as moléculas precursoras podem ser separadas no compartimento por uma membrana que permite a mistura das moléculas com a sua remoção ou destruição.

Noutra forma de realização, o Kit compreende um primeiro recipiente (sob vácuo), que pode ser um frasco de vidro, contendo a primeira molécula precursora como um pó seco e um segundo recipiente, que pode ser um frasco de vidro, contendo a segunda molécula precursora dissolvida numa solução aquosa tamponada tendo um pH ácido. Opcionalmente, o primeiro ou o segundo recipiente pode conter um ou mais aditivos selecionados a partir do grupo que consiste em agentes tixotrópicos e agentes radiopacos ou corantes. 0 conteúdo do segundo recipiente é transferido para o primeiro recipiente por meio de um dispositivo de transferência sem agulha (Mix2Vial® 20/20, West). Depois disso, as primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas e dissolvidas numa solução aquosa tamponada tendo um pH ácido. Um terceiro recipiente, que pode ser um frasco de vidro, 40 inclui uma solução básica. Preferencialmente, a seringa de compartimento duplo é equipada com um adaptador de enchimento duplo. Os dois compartimentos da seringa dual podem ter volumes diferentes. Preferencialmente, o volume do compartimento recetor da mistura das moléculas precursoras é dez vezes maior do que o volume do compartimento recetor da solução básica. O recipiente contendo as moléculas precursoras e o recipiente contendo a base são ligados a um meio de ligação e os seus conteúdos são simultaneamente transferidos para os dois compartimentos da seringa puxando os pistões da seringa. O meio de ligação e os dois recipientes são removidos da seringa e a seringa é equipada com um bico de pulverização destacável. A mistura da solução de moléculas precursoras com a solução básica ocorre no bico de pulverização e a mistura intima resultante é pulverizada no local desejado. V. Usos para as Composições

Os componentes precursores multifuncionais são selecionados e ajustados para produzir biomateriais com as propriedades desejadas. As moléculas precursoras são capazes de se reticular in situ em temperatura fisiológica, para atender requisitos específicos de selante. Na forma de realização preferencial, as composições e biomateriais da presente invenção são usados para evitar, reduzir, inibir ou conter perda de fluidos biológicos. Noutra forma de realização, as composições e biomateriais da presente invenção são usados para revestir a superfície de um tecido. A. Selante tecidual

Numa forma de realização, as composições e biomateriais da presente invenção são usados como selantes teciduais. Na forma de realização preferencial, a composição reticulável 41 in situ forma um biomaterial que forma um revestimento, uma barreira ou um selante para reduzir, inibir, ou conter per-da de fluido. Em particular, o biomaterial pode ser usado para inibir, reduzir, ou conter perda de fluido após um procedimento médico. Um procedimento médico preferencial inclui, mas não fica restrito à cirurgia cerebral ou neuro-cirurgia. B.Outras indicações médicas para além da de selante tecidu-al.

Os biomateriais descritos não ficam restritos ao uso em procedimentos cirúrgicos. 0 biomaterial pode ser usado como um curativo de feridas para feridas em qualquer parte do corpo. Numa forma de realização, o biomaterial pode ser usado como uma banda para evitar ou reduzir a perda de sangue resultante de trauma. Noutra forma de realização o biomaterial pode ser usado para reduzir ou evitar antiadesão pós-cirúrgica.

Exemplos

Materiais

Etileno diamina tetraquis(copolimeros em bloco poli (óxido de etileno-óxido de propileno)) (tetronic® 1107 peso molecular 15 kD, BASF) foi término-funcionalizado com grupos acrilato para chegar a etileno diamina tetraquis ((copolimeros em bloco poli(óxido de etileno-óxido de propileno) -acrilato) (tetronic- tetra-acrilato, peso molecular 15 kD) de acordo com o método descrito em Biomateriais 25 (2004) 5115-5124.

Preparação de tampão

Trietanolamina (TEA) a 0,3 M foi preparada dissolvendo-se 1,11 g em 25 ml de água milli-Q e ajustando-se o pH por 42 adição de ácido clorídrico a 5 M. TBS foi preparado dissolvendo-se 8 g de NaCl, 0,2 g de KC1 e 3 g de Tris base em 1 1 de água MilliQ. O pH foi ajustado com NaOH a 5 M.

Tampão Glicina: 7,5 g de Glicina e 5,85 g de NaCl foram dissolvidos em 1 1 de água MilliQ. O pH foi ajustado com NaOH a 5 M.

Tampão de acetato: Tampões de ácido acético a 10 mM e acetato de sódio a 10 mM foram preparados com água MilliQ. Os dois tampões foram misturados numa razão adequada para a obtenção do pH desejado.

Tampão de borato: Tampões de ácido bórico a 100 mM e tetraborato de sódio deca-hidratado a 50 mM foram preparados. Os dois tampões foram misturados numa razão adequada para obtenção do pH desejado.

Tampão de carbonato: Tampões de carbonato de sódio a 100 mM e bicarbonato de sódio a 100 mM foram preparados em água MilliQ. As duas soluções foram misturadas numa razão adequada para obtenção do pH desejado.

Teste de Gelificação

Para avaliar o tempo de gelificação, 50-100 μΐ de montantes especificados de solução de primeira molécula precursora e solução de segunda molécula precursora da Tabela 2 foram pipetados em tubos Eppendorf. Para os materiais de gelificação rápida, as gotas (de igual volume) da respetiva solução de primeira molécula precursora foram colocadas na parede interna para evitar a gelificação prematura sem ter 43 ainda entrado em contato com a solução de segundo precursor. Um cronómetro foi iniciado simultaneamente à colocação do Eppendorf num vórtex, onde as soluções foram então misturadas por exatamente 5 segundos. Imediatamente após a mistura, as soluções combinadas foram testadas com uma agulha e o tempo para "ponto de gel" (quando fios finos permanecem ligados à agulha após a sua retirada) em que fios finos começam a manter-se ligados à agulha quando esta é retirada da solução foi registado como "ponto de gel". Para formulações de rápida gelificação foi registado o estado após teste em 5 segundos (por exemplo fios finos, fios grossos e/ou gel duro). Alternativamente, foi realizada mistura seringa a seringa. Para isso, a solução da primeira molécula precursora e a solução da segunda molécula precursora foram retiradas em seringas, as seringas ligadas a um acoplador e a solução impulsionada para a frente e para trás dez vezes. A mistura foi transferida para um prato de pesagem e o ponto de gel determinado como descrito acima por "teste com agulha". Após uma gelificação inicial, o hi-drogel tipicamente permanece pegajoso até ser obtido um grau maior de reticulação. 0 tempo que o material precisou para se reticular suficientemente (perda do caráter pegajoso) foi registado como "tempo de cura" que reflete o tempo após o qual o material pode ser tocado sem danificar.

Exemplo 1: Composições de Selante tecidual la: Composição 1: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-10

Solução da primeira molécula precursora 235 mg de poli(etileno glicol) tetrassulfidrilaa ("PEG-SH-10") (peso molecular 10 kD) e 0,1 mg de verde de lissa-mina são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato a 10 mM pH 5. 44

Solução da segunda molécula precursora 315 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 1 mL de um tampão de acetato a 10 mM pH 5.

Solução básica 0,22 mL de um tampão de borato a 50 mM pH 9,8 lb: Composição 2: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-5

Solução da primeira molécula precursora 112 mg de poli(etileno glicol) tetrassulfidrilaa ("PEG-SH-5") (peso molecular 5 kD) e 0,1 mg de verde de lissamina são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato a 10 mM pH 5.

Solução da segunda molécula precursora 315 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 1 mL de um tampão de acetato a 10 mM pH 5.

Solução básica 0,22 mL de um tampão de borato a 50 mM pH 10,4 lc: Composição 3: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-5

Solução da primeira molécula precursora 168 mg de poli(etileno glicol) tetrassulfidrilaa ("PEG-SH-5") (peso molecular 5 kD) são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato a 10 mM pH 4,9.

Solução da segunda molécula precursora 472 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 45 kD) sao dissolvidos em 2 mL de um tampão de acetato a 20 mM pH 4,9.

Solução básica 0,3 mL de um tampão de carbonato a 250 mM pH 11,0 ld: Composição 4: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-5

Solução da primeira molécula precursora 192 mg de poli(etileno glicol) tetrassulfidrilaa ("PEG-SH-5") (peso molecular 5 kD) são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato a 5 mM pH 4,9.

Solução da segunda molécula precursora 472 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 1 mL de um tampão de acetato a 15 mM pH 4,9.

Solução básica

0,3 mL de um tampão de carbonato a 250 mM pH 11,0 le: Composição 5: Tetronic-tetra-acrilato e DTT

Solução da primeira molécula precursora 2,5 mg de ditiotreitol (DTT, peso molecular 154 g/mol) são dissolvidos em 500 μL de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

Solução da segunda molécula precursora 120 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 500 μL de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

Ou 46

Solução da primeira molécula precursora 3,15 mg de ditiotreitol são dissolvidos em 500 μί de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

Solução da segunda molécula precursora 150 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 500 μΐϋ de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5. lf: Composição 6: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-3.4 de 2 ramificações

Solução da primeira molécula precursora 156 mg de poli(etileno glicol) dissulfidrila ("PEG-SH-3.4") (peso molecular 3,4 kD) são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato a 10 mM pH 5,5.

Solução da segunda molécula precursora 315 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 1 mL de um tampão de acetato a 10 mM pH 5,5.

Solução básica 0,3 mL de um tampão de carbonato a 250 mM pH 10,0. lg. Composição 7: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-10 de 8 ramificações

Solução da primeira molécula precursora 161 mg de poli(etileno glicol) octassulfidrila de 8 ramificações ("PEG-SH-10 de 8 ramificações") (peso molecular 5 kD) são dissolvidos em 1 ml de acetato a 10 mM de pH 4,9. 47

Segunda molécula precursora 472 mg de tetronic-tetra-acrilato (15 kD) são dissolvidos em 2 ml de acetato a 20 mM de pH 4,9.

Solução básica

0,3 mL de tampão de carbonato de sódio a 0,25 M a pH 11,0 lh: Composição 8: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-5 de 4 ramificações

472 mg de Tetronic-tetra-acrilato, 15 kD

192 mg PEG-tetratiol, 5 kD 0,55 mg Ácido clorídrico 9,5 mg Carbonato de sódio 0,15 mg Azul de metileno hidratado 3,3 g água para injeção

Preparação do Kit A solução padrão de HC1 a 5 mM foi preparada diluindo 5 ml de solução de HC1 a 100 mM em 95 ml de água milli-Q. A solução padrão de azul de metileno, 1 mg/ml em HC1 5 mM foi preparada dissolvendo 20 mg de azul de metileno em 20 ml de solução padrão de HC1. O tampão para reconstituição de tetronic-tetra-acrilato foi preparado a partir de HC1 a 5 mM com 0,05 mg/ml de azul de metileno. Foi diluído com solução padrão de HC1 numa razão de 1:20, o pH foi ajustado no intervalo de 2,3-2,6. O pH da solução básica (tampão de carbonato) foi ajustado para se situar no intervalo de 11,35-11,45. 472 mg de tetronic-tetra-acrilato foram dissolvidos em 3 ml de tampão tetronic tetra-acrilato frio e mantidos em gelo por 5 minutos para facilitar a solubilização. A solução foi centrifugada por 1 minuto a 3000 rpm para remover bolhas de ar e pipetada num frasco contendo 192 mg de PEG- 48 tetratiol sendo dissolvida por agitação branda. Após reconstituição do polimero, 3 ml da mistura foram transferidos para o compartimento maior de uma seringa dupla 1:10. O compartimento menor foi preenchido com 0,4 ml de carbonato de sódio a 300 mM. O êmbolo foi inserido, o ar foi cuidadosamente removido da seringa e o bico de pulverização fixado . li. Preparação de DuraSeal®

DuraSeal® (Confluent Surgical Inc.) foi preparado de acordo com as instruções para uso. lj: Composição 10: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-3.4 de 2 ramificações 133 mg de poli(etileno glicol) dissulfidrila ("PEG-SH-3.4") (peso molecular 3,4 kD) são dissolvidos em 500 μΐϋ de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

Solução da segunda molécula precursora 220 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 500 μΗ de um tampão de trietanolamina 0,3 M a pH 8,5. lk: Composição 11: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH—3.4 de 2 reunificações 107 mg de poli(etileno glicol) dissulfidrila ("PEG-SH-3.4") (peso molecular 3,4 kD) são dissolvidos em 1,5 mL de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

Solução da segunda molécula precursora 220 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 500 μΗ de um tampão de trietanolami- 49 na a 0,3 M em pH 8,5. 11: Composição 12: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-3.4 de 2 ramificações 354 mg de poli(etileno glicol) dissulfidrila ("PEG-SH-3.4") (peso molecular 3,4 kD) são dissolvidos em 1,5 mL de um tampão de trietanolamina a 0,3 M a pH 8,5.

Solução da segunda molécula precursora 240 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 500 μΕ de um tampão de trietanolamina 0,3 M em pH 8,5. lm: Composição 13: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-3.4 de 2 ramificações 140,7 mg de poli(etileno glicol) dissulfidrila ("PEG-SH-3. 4") (peso molecular 3,4 kD) são dissolvidos em 50 μΕ de um tampão de borato a 100 mM tampão em pH 10,1, 9,8 e 9, 6.

Solução da segunda molécula precursora 286 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 50 μΕ de um tampão de borato a 100 mM em pH 8,5.

Exemplo 2a: Estabilidade da mistura da primeira e segunda moléculas precursoras

Solução da primeira molécula precursora 194 mg de poli(etileno glicol) tetrassulfidrilaa ("PEG-SH-5") (peso molecular 5 kD) são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato 10 mM pH 4,9. O tampão é preparado mistu- 50 rando tampão ácido acético 100 mM com tampão de acetato de sódio 100 mM para obter pH 4,90 e diluindo o tampão 1:10 v/v com água.

Solução da segunda molécula precursora 545 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 2 mL de um tampão de acetato a 20 mM pH 4,9. O tampão é preparado misturando um tampão de ácido acético a 100 mM e um tampão de acetato de sódio 100 mM para obter pH 4,90 e diluindo o tampão 1:5 v/v com água.

Solução básica 0,3 mL de um tampão de carbonato a 250 mM pH 11,0

Quando somente a primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas por rotação por 30 s, a gelificação ocorre dentro de 30 min. O tempo de gelificação foi medido mergulhando e retirando uma agulha da solução, o tempo foi medido até o momento em que os fios foram formados indicando um avançado grau de reticulação do material. Numa concentração mais baixa de moléculas precursoras, isto é, para soluções de moléculas precursoras preparadas como descrito no exemplo lc e ld (composição 3 e composição 4), a gelificação somente ocorre após lh. Quando a solução básica é aplicada à mistura de moléculas precursoras, ambas as composições gelificam em segundos (em menos de 10 segundos).

Exemplo 2b: Efeito da razão entre o numero de grupos funcionais acrilato e tiol presentes nos polímeros correspondentes A solução da primeira molécula precursora e a solução da segunda molécula precursora definidas no exemplo l.c são misturadas em diferentes razões volumétricas (0,25:1, 0,375:1, 0,5:1, 0,675:1 e 0,75:1). Estas razões correspon- 51 dem a razões molares de tiol para acrilato de 1:0,5, 1: 0,75, 1:1, 1:1,25 e 1:1,5. A solução da primeira molécula precursora e a solução da segunda molécula precursora foram misturadas por 30 segundos por rotação em vórtex. 0,2 mL de um tampão de borato a 50 mM pH 9 foram, então, adicionados num volume correspondente a um décimo do volume total das soluções de moléculas precursoras. A mistura foi misturada por rotação em vórtex por exatamente 5 segundos. Foi feito um teste, mergulhando uma agulha na solução e retirando-a em seguida, sendo medido o tempo até serem formados fios indicando um grau avançado de reticulação do material. Um tempo de gelificação minimo de 10-11 segundos foi obtido para as amostras com uma razão molar de acrilato para tiol de 1:1 e 1:0,75. 0 tempo de gelificação aumentou para 13-15 segundos para as outras razões.

Exemplo 3: Preparação do biomaterlal 3a: Preparação do biomaterlal a partir das composições 1, 2, 3, 4 e 6

Antes da aplicação da composição farmacêutica no local desejado, as duas seringas distintas são cheias com as soluções das primeira e segunda moléculas precursoras sendo, em seguida conectadas a um acoplador. As soluções das primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas transferindo o material contido numa seringa para a outra seringa (tipicamente, as soluções são impulsionadas para a frente e para trás dez vezes). Embora a mistura permaneça estável por 10-20 minutos após a sua preparação, idealmente a composição farmacêutica deve ser usada dentro de 5 minutos após a sua preparação. O biomaterial é formado in situ no local desejado, pela transferência para o local com deficiência de uma mistura contendo primeira e segunda moléculas precursoras e o ativador usando um dispositivo de dois com- 52 ponentes equipado com uma ponta espalhadora ou uma ponta de pulverização. 0 biomaterial é formado em menos de 1 minuto após a transferência do conteúdo do dispositivo de dois componentes. 3b. Preparação do biomaterial a partir da composição 5r 10, 11, 12 e 13

Duas seringas distintas são cheias com as soluções das primeira e segunda moléculas precursoras sendo, em seguida, conectadas a um acoplador. As soluções das primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas transferindo-se o material contido numa seringa para outra seringa. O ponto de gelificação é atingido na seringa e o biomaterial é ex-trudado da seringa e passado para um molde. 3c. Preparação do biomaterial a partir da composição 7

As duas moléculas precursoras são misturadas no processo de mistura seringa-para-seringa. Sem adição de uma solução básica, as moléculas precursoras gelificam em 30 min. Isto significa que a mistura das moléculas precursoras pode ser armazenada por 30 minutos antes da sua utilização. Quando 300 μΐ de tampão de carbonato de sódio 0,25 M em pH 11,0 foram adicionados, a gelificação ocorreu em poucos segundos (menos de 5 segundos).

Exemplo 4: Dilatação/Degradação do biomaterial

Para avaliar a dilatação e degradação do biomaterial, foram preparados biomateriais a partir de composições como as descritas nos exemplos la e lb.

Antes da aplicação das composições no local desejado, duas seringas distintas são cheias com as soluções das primeira e segunda moléculas precursoras, sendo, então conec- 53 tadas a um acoplador. As soluções das primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas transferindo o material contido numa seringa para a outra seringa (tipicamente, as soluções são impulsionadas para trás e para a frente 10 vezes). Embora a mistura permaneça estável 10-20 minutos após a sua preparação (significando que as misturas não alcançaram o ponto de gelificação antes de 10 a 20 minutos), as composições devem idealmente ser utilizadas 5 minutos após a sua preparação. Os biomateriais são formados in situ no local desejado, por transferência para o local desejado de misturas contendo as primeira e segunda moléculas precursoras e da solução básica usando um dispositivo de dois compartimentos equipado com uma ponta espalhadora ou com uma ponta de pulverização. Os biomateriais são formados em menos de 5 segundos após transferência do conteúdo do dispositivo de dois compartimentos. As composições são espalhadas num prato de pesagem de modo que seja formada uma camada de 1 mm dos biomateriais. O prato de pesagem contendo as soluções reagentes é, então, colocado a 37°C numa atmosfera humidificada e as soluções curadas por 10 min. 3 discos com um diâmetro de 1,2 cm são cortados de cada filme. As amostras são colocadas em tubos contendo solução tamponada com fosfato (PBS) e colocadas numa incubadora a 37°C. Os biomateriais são removidos dos tubos com a ajuda de uma espátula em diferentes instantes de tempo. Os biomateriais são cuidadosamente secos usando lenços de papel para remover qualquer excesso de água e depois são pesados. Os biomateriais são então colocados de volta nos seus respetivos tubos e colocados de volta na incubadora. A dilatação atinge um valor de 0,87 ± 0,11 para o biomaterial formado a partir da composição do exemplo la e 0,32 ± 0,06 % para o biomaterial formado a partir da composição do exem- 54 pio lb após 2 dias em PBS a 37°C. Os dois biomateriais dissolveram-se completamente num período entre os 28 e os 35 dias (Figuras 1 e 2).

Exemplo 5: Teste de Compressão 8 amostras de biomateriais formados a partir da composição 1 como descrito no exemplo la e 8 amostras de biomateriais formados a partir da composição 2 como descrito no exemplo lb foram preparadas enchendo com 100 μΐ das composições 1 e 2 uma seringa de 1 ml cortada. Os biomateriais foram curados por 5-10 min e depois removidos do seu molde. Foram obtidos cilindros com um diâmetro de 5 mm e uma altura de 11,5 mm. Foram colocados quatro biomateriais em PBS a 10 mM em pH 7,4 e foram colocados quatro biomateriais num tubo seco. Os tubos foram incubados a 37°C por 24 h. Como o tempo de gelificação com uma solução básica tendo um pH de 9,8 e 10,4, respetivamente, foi demasiado rápido para formar amostras homogéneas, o pH da solução básica foi reduzido para pH 9,6. As amostras foram medidas com um instrumento "Zwick Materialprufung 1456". O módulo de Young (módulo elástico) foi determinado com uma célula de carga de 50 N, a resistência máxima com uma célula de carga de 20 kN. A velocidade de pré-carga foi aumentada de 0,05 para 0,1 mm/s e o tempo de espera foi reduzido para 3 s. O módulo de Young foi medido a 3% de compressão mas a uma velocidade de 0,08 mm/s. A mesma velocidade foi aplicada com a célula de carga de 20 kN para registo da pressão até a fissura do material. Amostras de cada um dos biomateriais foram comprimidas em estado seco e após 24 h de incubação em PBS. Nenhum dos biomateriais foi destruído no seu estado seco (armazenado em ar a 37°C por 24 h) quando comprimido até 99%. No estado húmido, a pressão em rutura foi de 3,8 ± 2,5 55 N/mm2 para o biomaterial formado a partir da composição 1 e 1,51 ± 0,17 N/mm2 para o biomaterial formado a partir da composição 2. A percentagem de compressão em rutura foi de 91 ± 3% para o biomaterial formado a partir da composição 1 e 88 1 2 % para o biomaterial formado a partir da composição 2. O Módulo de Young foi de 0,125 ± 0,005 para o biomaterial formado a partir da composição 1 e 0,10 ± 0,00 N/mm2 para o biomaterial formado a partir da composição 2 no estado húmido. No estado seco, o módulo de Young do biomaterial formado a partir da composição 2 foi com o valor de 0,561 ± 0,152 N/mm2 maior que o do biomaterial formado a partir da composição 1 que apresentou um módulo de Young de 0,152 ± 0,024 N/mm2.

Exemplo 6: Resistência adesiva e coesiva de biomateriais

As resistências adesiva e coesiva dos biomateriais são examinadas num teste de rutura por pressão (burst test). Foram realizadas medições de teste de rutura de acordo com AS TM F-2329-04 (teste padrão para resistência à rutura de selantes cirúrgicos). Foi usado um sensor de pressão relativa (DeltaOhm TP704-2BGI) com um intervalo de medição de 0-200 KPA (0-2 bar) (sobrepressão máxima de 400 KPA (4 bar)) e uma resolução de 0,01 KPA (0,1 mbar). Foi usada uma bomba seringa com uma vazão constante como bomba de fluido (Alaris, Asena GH) . Para teste de rutura por pressão, a composição 8 e Duraseal® preparados como descrito no exemplo lh e li são aplicados a uma membrana húmida de colagé-nio. Para garantir um formato de amostra igual, uma membrana de colagénio é colocada sob uma máscara através da qual o selante é aplicado. As amostras são então deixadas curar antes de serem removidas cuidadosamente da máscara. Após medição da espessura e peso da amostra, as amostras são fi- 56 xadas com grampos no dispositivo de teste e testadas separadamente. A pressão crescente, que age diretamente no se-lante através de um orifício pré-fabricado no colagénio, é medida constantemente. Após a rutura do selante, a bomba pode ser desligada e pode ser realizada a avaliação dos dados recolhidos. Para permitir uma comparação das resistências a rutura de diferentes amostras, foram medidas as suas espessuras antes do teste e normalizadas a 1 mm. 0 teste de pressão de rutura dos dois selantes cirúrgicos sintéticos demonstrou diferenças claras quanto à resistência à rutura. Embora o biomaterial formado a partir da composição 8 rompa a uma pressão média de 240 mm deHg, o DuraSeal® rompe a uma pressão média de 74 mm de Hg. A taxa de falha coesiva para ambos os selantes foi de 90%, o que demonstra uma boa aderência à membrana de colagénio usada no teste.

Exemplo 7: Selagem cirúrgica de Dura de ovelhas A dura-máter de uma ovelha que tinha sido sacrificada há 3 horas foi dissecada. Para a remoção da pele foi usado um escalpelo e foi feito um corte retangular no crânio com uma lâmina de ossos. O crânio foi levantado e como a dura estava ainda parcialmente fixada ao crânio esta foi cuidadosamente excisada do crânio e colocada de novo no cérebro; as composições 1 e 2 (como descritas nos exemplos la e lb) foram espalhadas como um filme fino na dura e deixadas curar por 1 min. Não foi verificada nenhuma perda de fluidos. Para testar e remover/descascar o material curado da dura foi usada uma espátula redonda plana. A aparência do gel, o tempo de gelificação, e a adesividade foram avaliados quantitativamente numa escala de 1-5. Quanto à aparência do gel, o grau 1 corresponde a um gel não homogéneo. O grau 2 corresponde a um gel que é principalmente bruto, o grau 3 a um gel que tem algumas partes brutas, desiguais, e o grau 5 57 a um gel liso homogéneo. Para tempo de gelificação, o grau 1 corresponde a cerca de 50-100% da composição em ponto de escorrimento. 0 grau 2 corresponde a cerca de 25-50% da composição em ponto de escorrimento, o grau 3 a cerca de 5-10% da composição em ponto de escorrimento e o grau 5 a cerca de 0-5% da composição em ponto de escorrimento. Para adesividade, o grau 1 significa que o gel é retirado por descascamento sem nenhuma força, o grau 2 que o gel é retirado por descascamento com pouca força, o grau 3 que é necessária a aplicação de uma força média para remover o gel, o grau 4 que muito pouco do gel é retirado por descascamento, e o grau 5 que nada do gel é removido. Para a composição 2 o pH foi aumentado para 10,4 para reduzir o tempo de gelificação. Para comparação, as composições foram também aplicadas às membranas de colagénio húmidas, bem como diretamente ao cérebro. Os dois biomateriais formados a partir das composições mostraram uma capacidade de aderência à dura máter muito boa (biomaterial formado a partir da composição 1-grau 4, biomaterial formado a partir da composição 2-grau 3). A adesividade do biomaterial à dura máter revelou ser muito melhor do que a adesividade às membranas de colagénio. Pelo contrário, quando aplicado o biomaterial a cérebro de ovino (coberto com as camadas pia máter e ara-quinóide) este pôde ser removido por descascamento facilmente. A composição 1 gelificou rapidamente (grau 4) e, portanto, no final da aplicação algumas partes desiguais foram criadas devido ao facto de o material semigelifiçado ter entrado em contato com o espalhador (grau 4 para aparência de gel), a composição 2, por outro lado, gelificou bastante lentamente (grau 2), mesmo quando o pH da solução básica foi aumentado para 10,4 e nem todo o produto permaneceu no local de aplicação mas escorreu para o lado, especialmente se a dura não era horizontal. Apesar disso, onde 58 o material foi aplicado, permaneceu uma fina camada de material. Em 30 s, o material formou um hidrogel firme e não-pegajoso (grau 5 para aparência de gel).

Exemplo 8: Modelo de durotomia de ovelhas A dura máter de uma ovelha anestesiada foi exposta e foi feita uma incisão de 2 cm na dura e na araquinóide, de modo que ocorreu perda de fluido cerebroespinhal. A lesão foi reparada frouxamente usando sutura de polipropileno 4/0 mas deixando um espaço de 1 mm. A composição 8 descrita no exemplo lh foi usada com o seguinte método.

Esterilização dos componentes

Todos os componentes do aplicador, bolsas, frascos de vidro e fechamentos foram esterilizados por irradiação gama a uma dose de 21,8 kGy. Depois disso, qualquer manuseio de material estéril foi realizado numa capela estéril. Tampões e a solução de tetronic-tetra-acrilato foram esterilmente filtradas através de filtros seringa PES de 0,22 μπι. PEG-SH-5 foi fornecido não-estéril no Kit e filtrado através de um filtro seringa PES de 0,22 μιη após reconstituição com tetronic-tetra-acrilato durante a preparação do Kit.

Preparação de tampões A solução básica foi preparada dissolvendo-se 1,59 g de carbonato de sódio em 50 ml de água para injeção. O pH registado foi de 11,38. A solução de Tetronic-acrilato foi preparada dissolven-do-se 471 mg de tetronic-tetra-acrilato em 3 ml de HC1 a 5 mM contendo 0,05 mg/ml de azul de metileno. A reconstituição foi realizada por rotação em vórtex durante 10-20 s, 59 armazenando-se a solução a 4°C por 10 min e centrifugando-se por 5 min a 2500 rpm. A solução de HC1 a 5 mM foi preparada a partir da solução de HC1 a 100 mM por diluição com água para injeção. Azul de metileno foi preparado como uma solução a 10 mg/ml de azul de metileno em HC1 a 5 mM e depois diluído com HC1 a 5 mM.

Enchimento assético e embalagem do Kit A seringa dupla foi montada com pistões antes da esterilização. 400 μΐ de carbonato de sódio foram colocados no compartimento menor da seringa que foi embalada junto com 4 cabeçotes do tipo spray e um êmbolo na bolsa 1. O componente PEG-SH-5 foi preparado pesando 192 mg de polímero num pequeno frasco de vidro. O frasco de vidro foi agitado com etanol e o pó despejado no frasco de vidro estéril sem tocar o lado de fora. O frasco foi fechado com uma tampa de engate por pressão. A solução de tetronic-tetra-acrilato foi retirada para uma seringa de 20 ml e 3,3 ml foram transferidos para uma seringa de 5 ml via um acoplador seringa a seringa. A seringa foi fechada com um fechamento do tipo "combi-stopper". O frasco, a seringa de 5 ml, uma agulha azul e uma rosa e um filtro de seringa foram embalados numa bolsa 2 e selados. As bolsas 1 e 2 foram reunidas numa bolsa maior e selada por aquecimento. Os Kits foram armazenados a menos de -15°C a -25°C e despachados em gelo seco. No dia da experiência, o Kit foi removido do armazenamento e colocado em temperatura ambiente até se descongelar totalmente. Na ocasião de uso, o Kit foi aberto no campo estéril. A solução de tetronic-tetra-acrilato foi transferida para o frasco contendo o pó de PEG-SH-5. O pó foi reconstituído agitando gentilmente o frasco durante 1-2 min. A mistura foi retirada novamente para a seringa, que foi conec- 60 tada a um filtro estéril e a uma agulha azul, sendo a solução transferida para o compartimento maior da seringa dupla. O dispensador foi fixado à seringa dupla e o ar que permaneceu foi expelido da seringa dupla. O bico spray foi colocado na seringa dupla e o aplicador ficou assim pronto para o uso. A composição foi pulverizada sobre a lesão durai e o biomaterial solidificou em menos de 5 segundos. A lesão durai foi cuidadosamente verificada quanto ao reaparecimento de fuga de CSF. O selante foi capaz de interromper intraoperativamente a fuga de fluido. 0 material estava ainda presente após 1 semana e foi completamente reabsorvido após 12 semanas.

Exemplo 9: Teste das propriedades de termogelificação de Tetronic-acrilato em altas concentrações

As propriedades de gelificação da composição 11 (como descrita no exemplo lk) e composição da 12 (como descrita no exemplo 11) foram ambas comparadas em conjunto com PEG-SH linear 3,4 kDa. Foi esperado que a formação de gel ocorresse através de reticulação química na composição 11 e através de meios físicos (termogelificação) seguidos por reticulação química na composição 12. A composição 11 geli-ficou em 1,5 minutos após uma mistura seringa a seringa de 30 segundos e teve um tempo de cura de 2-3,5 minutos após aplicação da solução num prato de pesagem através de uma agulha. No caso da composição 12, formou-se um gel quando a composição foi aplicada a um prato de pesagem aquecido por um banho de água circundante a 37°C e o escorrimento do material foi evitado. Entretanto, o tempo de cura foi aumentado para 4-55 minutos e assim a gelificação foi mais longa do que para a composição 11.

Exemplo 10: Influência do pH na cinética de reação 61 0 tempo de gelificação da composição 10 (como preparada no exemplo lj) versus o pH da solução tampão é representado na Figura 3. Esta mostra que o tempo de gelificação decresce com o aumento de pH. Um comportamento similar é observado para a composição 13 (preparada como descrito no exemplo lm) .

Lisbos, 17 de Abril de 2012

Claims (25)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição compreendendo pelo menos uma primeira e uma segunda molécula precursora, em que: i) a primeira molécula precursora é um polímero com base em poli(etileno glicol) tendo x grupos nu-cleofílicos selecionados a partir do grupo que consiste em grupos tiol ou amino, em que x é igual a 2 ou maior que 2, preferivelmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8; ii) a segunda molécula precursora é da fórmula geral: A- [ (C3H60) n- (C2H4O) m-B] i em que m e n são inteiros de 1 a 200 i é maior que 2, preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 A é um ponto ou porção de ramificação, B é um grupo conjugado insaturado.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que x é igual a 4.

3. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2 em que a primeira molécula precursora é pentae-ritritol poli(etileno glicol)éter tetrassulfidrilaa.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que pen-taeritritol poli(etileno glicol)éter tetrassulfidrilaa tem um peso molecular na faixa de cerca de 2 a 20 kD.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que pen- 2 taeritritol poli(etileno glicol)éter tetrassulfidrilaa tem um peso molecular na faixa de cerca de 3 a 11 kD.

6. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que B da segunda molécula precursora é um grupo acrilato.

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o ponto ou porção de ramificação A da segunda molécula precursora é selecionado no grupo que consiste em carbono, glicerol, pentaeritritol, dipentaeritri-tol e etileno diamina.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, em que a segunda molécula precursora tem um peso molecular na faixa de cerca de 10 a 25 kD.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, contendo adicionalmente uma base.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, em que a base é carbonato de sódio.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, em que a composição contém adicionalmente um corante .

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que o corante é selecionado no grupo que consiste em azul de me-tileno, verde de lissamina e verde rápido.

13. Método para fabricação de um biomaterial compreendendo as etapas de: 3 i) prover uma primeira molécula precursora que é um polímero com base em poli(etileno glicol) tendo x grupos nucleofílicos selecionados no grupo que consiste em grupos tiol ou amino em que x é igual a 2 ou maior que 2, preferivelmente 3, 4, 5 ou 6; ii) prover uma segunda molécula precursora da fórmula geral: A- [ (C3H60) n- (C2H40) m—B] i em que m e n são números inteiros de 1 a 200; i é maior do que 2, preferencialmente 3, 4, 5 ou 6; A é um ponto ou porção de ramificação; B é um grupo insaturado conjugado; iii) reagir as moléculas precursoras das etapas i) e ii) na presença de uma solução básica para formar uma rede tridimensional reticulada.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a primeira molécula precursora e a segunda molécula precursora são dissolvidas antes da etapa iii) em solução aquosa tam-ponada tendo pH ácido.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 e 14, em que o biomaterial é formado em menos de dois minutos .

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 e 15, em que o biomaterial é formado em menos de dez segundos . 4

17. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a composição da etapa iii) tem um pH num intervalo de 9 a 13.

18. Biomaterial sintético formado a partir da composição como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para uso como um selante tecidual.

20. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para revestimento da superfície de um tecido.

21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para reduzir, inibir ou conter perda de um fluido biológico ou gás.

22. Uso da composição como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para o fabrico de um medicamento para efetuar a fixação não cirúrgica de uma primeira superfície com uma segunda superfície.

23. Kit para formar um biomaterial contendo: i) um primeiro recipiente contendo uma primeira molécula precursora que é um polímero com base em poli (etileno glicol) tendo x grupos nucleofílicos selecionados no grupo que consiste em grupos tiol ou amino, em que x é igual a 2 ou maior que 2, preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8; ii) um segundo recipiente contendo uma segunda molécula precursora da fórmula geral: 5 A- [ (C3H60) n- (C2H4O) m—B] i em que m e n são números inteiros de 1 a 200 i é maior que 2, preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 A é um ponto ou porção de ramificação B é um grupo conjugado insaturado.

24. Kit de acordo com a reivindicação 23, incluindo adicionalmente um terceiro recipiente que compreende a solução básica.

25. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 24, contendo adicionalmente uma seringa de compartimento duplo. Lisboa, 17 de Abril de 2012