CN101711168A - 聚合物组织封闭剂 - Google Patents

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Abstract

本文涉及用作组织封闭剂的生物材料的制备方法、装有用于形成生物材料的前体的药盒和所产生的生物材料。生物材料由包含至少第一前体分子和第二前体分子的组合物形成，其中：i)第一前体分子是基于聚乙二醇的聚合物，具有x个选自巯基或氨基的亲核基团，其中x等于2或大于2，优选为3、4、5、6、7或8；ii)第二前体分子具有以下通式：A-[(C3H6O)n-(C2H4O)m-B]i，其中m和n为1-200的整数，i大于2，优选为3、4、5、6、7或8，A为支化点，B为共轭不饱和基团。

Description

聚合物组织封闭剂
发明领域
本发明涉及生物材料(尤其是聚合物组织封闭剂)和能够形成生物材料(尤其是聚合物组织封闭剂)的前体分子，及其制备和使用方法。具体地讲，本发明涉及用于封闭或阻隔组织裂伤、割伤或擦伤的生物材料。
发明背景
在实施作为损伤的手术干预或治疗组成部分的医学手术时，医师常常必须处理溢出的体液，例如脑或脊柱手术期间的脑脊液、或因损伤、疾病或病症或者由外科手术产生的血液。不论损害是由损伤造成还是因外科手术产生，恢复组织和循环完整性对于治疗的正面结果十分重要。
最早的缝合受损组织的方法是使用机械紧固器，例如夹钳、纤维(staple)或缝线。机械组织紧固器遇到许多限制。机械紧固器需要相当的技术，使用起来耗费时间，并可能沿连接线渗漏，该连接线本身可对周围组织造成额外的损伤。另外，机械紧固器可能对许多高度血管化器官不起作用。这些缺点进一步延缓了外科手术和愈合时间。
克服这些缺点的努力已导致开发出各种胶粘剂、胶或封闭剂，这些能够单独或与机械紧固结合以使组织表面快速粘合在一起，从而促进或至少不抑制正常愈合，并减少或阻止体液流失。
一类普通的组织胶粘剂是基于血纤蛋白的材料，它含有血纤蛋白原和凝血酶的浓缩物。血纤蛋白胶粘剂通常是二组分胶粘剂，当与钙源混合在一起时起反应，刺激天然存在的血凝块形成级联的最后阶段。所产生的血块粘附到组织上，桥接组织、裂缝，并封闭组织直到开始出现愈合为止。然而，由于封闭材料强度低以及与使用人血衍生产品有关的转染风险，所以基于血纤蛋白的胶粘剂的成效有限。
基于明胶与醛交联的胶的成效同样有限。代表性的这类胶为明胶-间苯二酚与甲醛(GRF)或戊二醛(GRFG)交联。虽然已经对基于明胶的胶进行了广泛深入的研究，且结果表明一般是有效的，但是由于使用热明胶溶液、与醛有关的组织刺激以及为了在连接部位获得适当交联所需要的处理操作的危险程度，因此这些组合物的成效有限。
由于上述限制，相当多的开发努力直指寻找可能用作组织胶或封闭剂的合适的合成组合物。为此，除其它合成聚合物以外，对氰基丙烯酸酯类、聚氨基甲酸酯类、聚甲基丙烯酸甲酯类和聚乙二醇类作为组织胶或封闭剂进行了研究，结果显示成效有限。除了操作性能与各种手术环境一致以外，几乎没有有效的组织胶或封闭剂组合物符合足够机械强度和生物相容性的要求。
然而，这些组合物却具有关于操作和机械性能的缺点，例如生物材料的溶胀。因此，存在对可用作组织胶或封闭剂的生物材料的需要，这种材料不仅是生物相容的，而且还是明确疗法(well-defined cure)，并具有所需要的机械性能的组合。
因此，本发明的一个目的是提供适于形成用作组织封闭剂的合成生物材料的组合物、方法和药盒。本发明的又一个目的是提供用作组织封闭剂的合成生物材料，该材料由吸水所引起的体积增加不大。本发明的又一个目的是提供用作组织封闭剂的合成生物材料，该材料是随时间变化完全可再吸收的。本发明的又一个目的是提供用作组织封闭剂的合成生物材料，该材料具有良好的机械强度。本发明的又一个目的是提供合成生物材料，该材料可有效用作头颅手术期间缝合的硬膜修复的辅助材料，并减少或防止脑脊液渗漏至外部环境。
发明概述
本文披露了用于制备用作组织封闭剂的生物材料的组合物和方法、装有用于形成生物材料的前体分子的药盒及生物材料在手术环境中的用途。用于制备生物材料的组合物包含至少第一前体分子和第二前体分子。第一前体分子含有至少2个亲核基团，第二前体分子含有至少2个亲电子基团。第一前体分子和第二前体分子的亲核基团和亲电子基团能够在生理条件下彼此形成共价键。该交联优选在碱性条件下发生在水中。根据所需生物材料的性能选择前体分子。在一个实施方案中，第一前体分子是基于聚乙二醇的聚合物，具有x个选自巯基或氨基的亲核基团，其中x大于或等于2。X个亲核基团优选为巯基。优选第二前体分子是在其备臂上用共轭不饱和基团官能化的多臂聚(环氧乙烷-聚环氧丙烷)(poly(ethylene oxide-polypropylene oxide)，PEO-PPO)嵌段共聚物，第二前体分子为下列通式I的分子：
A-[(C3H6O)n-(C2H4O)m-B]i
(式I)
其中m和n为1-200的整数，
i大于2，优选为3、4、5、6、7或8，
A为支化点，
B为共轭不饱和基团，例如丙烯酸基(acrylate)。
这类聚合物由BASF以商品名称
Figure G2008800192803D00031
销售。
在一个优选的实施方案中，第一前体分子是其各臂被巯基官能化的四臂聚乙二醇(PEG)(四巯基季戊四醇聚乙二醇醚(pentaerythritolpoly(ethylene glycol)ether tetra-sulfhydryl)“四巯基PEG”)。在最优选的实施方案中，四巯基季戊四醇聚乙二醇醚分子量的范围约为2-20kD，更优选范围约为3-11kD，甚至最优选范围约为5-10kD。在另一个实施方案中，第二前体分子的共轭不饱和基团B是丙烯酸基。优选第二前体分子的支化点A选自碳、甘油、季戊四醇、二季戊四醇和乙二胺。更优选第二前体分子的支化点A为乙二胺。式I第二前体分子的分子量范围约为10-25kD，更优选范围约为12-20kD，甚至更优选范围约为14-18kD。优选第一前体分子或第二前体分子各臂具有相同的聚合度。这就意味着第一前体分子或第二前体分子各臂具有相同的分子量。
选择其中亲核基团和亲电子基团总数大于或等于5的前体分子导致形成三维网状物(three-dimensional network)。任选组合物含有一种或多种添加剂，例如着色剂、触变剂、造影剂、填充剂、稳定剂或生物活性剂(bioactive agent)。在一个优选的实施方案中，组合物含有选自亚甲蓝、丽丝胺绿或坚牢绿的着色剂。组合物还任选含有碱。在一个实施方案中，碱为碳酸钠。在一个优选的实施方案中，由组合物形成的生物材料被用来减少、抑制或控制体液流失，例如脑部和/或脊柱手术后的脑脊液流失。在一个优选的实施方案中，使用组合物作为医疗封闭剂。在另一个优选的实施方案中，使用组合物涂抹于组织表面。在另一个实施方案中，使用组合物制备实现第一表面和第二表面非手术连接的药物。
为了制备本发明的生物材料，一种制备生物材料的方法包括以下步骤：
i)提供第一前体分子，
ii)提供第二前体分子，
iii)在碱性溶液存在下，使两种前体分子反应以形成交联的三维网状物。
优选碱性溶液pH范围介于9-14之间，更优选范围介于10-13之间，甚至更优选范围介于10-12之间。步骤i)、步骤ii)或步骤iii)每一步所得溶液的pH范围优选介于9-13之间、更优选介于9.5-11.5之间、甚至更优选介于9.8-11之间以便快速胶凝化。优选碱性溶液为碳酸钠溶液。两种前体分子与碱性溶液接触之后，快速形成生物材料，优选生物材料在不到2分钟内形成，更优选在不到10秒钟内形成，甚至更优选在不到5秒钟内形成。
前体分子可分别作为干燥粉保存和/或在通常为酸性pH的缓冲溶液中保存。在一个优选的实施方案中，第一前体分子作为干燥粉保存在第一容器中，第二前体分子保存在第二容器内的含水缓冲溶液中，缓冲溶液具有酸性pH。任选碱可以保存在第三容器内的溶液中。临用前可使前体分子接触数分钟或数小时。在一个实施方案中，第一前体分子和第二前体分子分开保存，只在将所得混合物转移到双室注射器(dual compartment syringe)中之前混合。注射器的一个室装有前体分子的混合物，另一室装有碱性溶液。为了制备具有所需性质的生物材料，在交联前控制前体分子的浓度是一个重要的参数。为了保持这种控制，双室注射器可包括预先设定体积比的两个室。优选两室的体积比为1∶5，更优选为1∶10。较大的室装有前体分子的混合物，较小的室装有碱性溶液。双室注射器装备有可拆卸的喷头，两个室的内容物被一起喷出，在体内需要的部位原位形成具有三维网状结构的生物材料。
附图简述
图1表示当在37℃下保存在磷酸缓冲盐溶液中时，所公开的生物材料和市售生物材料代表性制剂的溶胀百分比对时间的曲线图的比较。
图2表示当在50℃下保存在磷酸缓冲盐溶液时，所公开的生物材料和市售生物材料代表性制剂的溶胀百分比与时间的曲线图的比较。
图3显示缓冲液对用pH 7.4、pH 8和pH 8.5TEA缓冲液制备的组合物10的胶凝时间的影响。
图4显示缓冲液对用pH 9.13、pH 9.32和pH 9.47硼酸盐缓冲液制备的组合物13的胶凝时间的影响。
发明详述
定义
本文通常使用的“生物相容性”或“生物相容的”是指材料在具体应用中伴随适当的宿主反应起效的能力。从最广义来说，这是指没有可能超出材料和/或治疗对患者的益处的对身体的不良反应。
本文通常使用的“生物材料”或“组合物”是指适于与生物系统界面连接以优选评价、治疗或封闭身体任何组织、器官或功能的材料。生物材料是指在达到并超过其胶凝点之时和之后的全部材料(前体分子，加上所有添加剂、碱或溶剂和生物活性剂(如有的话))。组合物是指在达到其胶凝点之前的全部材料。
本文所使用的“前体组分的浓度”是指质量百分比，定义为溶质的质量(克)乘以100后除以溶液的总质量(克)(即溶剂和溶质的总量)：质量％＝溶质质量(100)/溶液总质量。
“共轭不饱和键”可指碳-碳、碳-杂原子或杂原子-杂原子多键与单键两者的交替。被CH或CH2单元间隔的双键称为“匀共轭双键”。
本文通常使用的“交联”是指共价键的形成。
本文所使用的“交联点密度”是指各分子两个交联点之间的平均分子量(Mc)。
本文所使用的“亲电子基团”是指能够在极性键形成反应中从亲核体接受电子对的官能团。术语亲电体和亲电子基团作为同义词使用。
本文通常使用的“官能度”是指前体分子上反应活性部位的数目。
“反应活性部位”是指能够至少但并非唯一地在人或动物体内的条件下彼此反应的亲核基团和亲电子基团。
“凝胶”是指物质介于液态和固态之间的状态。因此，“凝胶”具有某些液体性质(即形状是有弹性并可变形的)及某些固体性质(即形状是足够不连续的以在二维表面上保持三维状态)。
本文所使用的“凝胶点”是指当粘性模量和弹性模量彼此交叉且粘度增加的点。因此，凝胶点是液体从此开始呈现凝胶半固体性质的阶段。
本文通常使用的“原位形成”是指在注射前和注射时基本未交联的前体分子的混合物在身体注射部位于生理温度下彼此形成共价键的能力。
本文所使用的“分子量”是指在任何给定样品中许多分子的重量平均分子量，正如本领域普遍使用的一样。因此，PEG 5,000的样品可含有重量范围为例如4,000-6,000道尔顿(D)、其中某一范围的一种分子略不同于下一种分子的聚合物分子的统计混合物。分子量范围的规定表明平均分子量可以是规定极限值之内的任何值，且可以包括这些极限值以外单独的分子。因此，约2,000D至约20,000D的分子量范围表明至少约2,000D直到约20kD的平均分子量。
本文通常使用的“多官能团”是指每前体分子一个以上的官能团。
本文通常使用的“亲核基团”是指能够在极性键形成反应中向亲电体提供电子对的官能团。优选亲核体在生理pH下的亲核性大于H2O。强亲核体的实例为巯基且指含有这些官能团的分子。术语亲核体和亲核基团作为同义词使用。
“低聚物和聚合物”以该术语的通常意义使用。低聚物为低分子量聚合物。低聚物通常含有介于2-10个之间的单体单元。本文所使用的聚合物通常含有10个以上的单体单元。
“基于聚乙二醇的聚合物”是指其中聚合链或聚合物链主要、优选完全由聚乙二醇构成的聚合物。
本文所使用的“生理”是指可存在于有生命的脊椎动物内的条件。具体地讲，生理条件是指人体的温度、pH等条件。生理温度特别是指介于35℃-42℃之间的温度范围，在大气压下优选大约为37℃。
本文所使用的“聚合网状物(Polymeric network)”是指其中基本所有用作前体分子的单体、低聚物或聚合物通过其有效官能团由分子间键(优选共价键)结合形成太分子的过程的产物。
本文所使用的“前体分子”是指形成生物材料聚合网状物的分子。除聚合网状物以外，生物材料可含有添加剂和生物活性剂。前体分子可以选自官能化单体、低聚物和聚合物。
本文所使用的“相应的对应物(Respective counterpart)”是指给定前体分子的反应配偶体。亲电子基团相应的对应物为亲核基团，反之亦然。
本文通常使用的“自选择反应(Self selective reaction)”是指组合物的第一前体分子与组合物的第二前体分子的反应(反之亦然)比与在组合物中和/或在反应部位存在的其它化合物的反应快得多。本文所使用的第一前体分子的亲核基团优先与第二前体分子的亲电子基团结合而不是与其它生物化合物结合，第二前体分子的亲电子基团优先与第一前体分子的亲核基团结合而不是与其它生物化合物结合。
本文所使用的“溶胀”是指本发明生物材料的吸水。这是一种通常在将生物材料放入过量的PBS缓冲液(10mM磷酸缓冲盐溶液，例如得自Sigma的P3813粉，得到0.01M磷酸盐、0.0027M氯化钾和0.138M氯化钠的缓冲液(pH 7.4))之后在平衡溶胀时生物材料质量增加的函数。平衡溶胀通常在2天内达到，被定义为当生物材料在生物材料降解前达到其最大质量的时间。通过将在平衡溶胀时生物材料质量除以交联反应后10分钟生物材料的最初质量，计算出溶胀。术语“吸水”和“溶胀”在本申请全文中作为同义词使用。
“粘结强度(Cohesive strength)”是指本发明的生物材料当遇到物理性应力或环境条件时保持完整，即不破裂、撕裂或开裂的能力。“粘结强度”和“爆破强度”在本申请全文中作为同义词使用。
“粘附强度(Adhesive strength)”是指本发明的生物材料当遇到物理性应力或环境条件时能够在给予部位保持附着在组织上的能力。
组合物
本发明提供用于制备可原位交联的生物材料的组合物，该生物材料可优选用于降低、防止或控制人体液体的流失。组合物含有至少第一多官能团前体分子和第二多官能团前体分子。可任选将添加剂、着色剂和/或生物活性剂加到前体分子中以形成组合物。组合物包含前体分子加任何添加剂和/或生物活性剂，且前体分子可在身体需要的部位原位聚合形成生物材料的聚合网状物。根据所需要的生物材料的类型来选择前体分子的结构。
A.前体
第一前体分子含有至少2个亲核基团，第二前体分子含有至少2个亲电子基团。选择第一前体分子和第二前体分子使得亲核基团和亲电子基团能够在生理条件或在碱性条件下彼此形成共价键。这可通过不同的反应机制实现。一种反应机制是亲核取代反应。在另一个实施方案中，前体分子通过第一前体分子上的亲核基团或部分与第二前体分子上的共轭不饱和基团或部分之间的迈克尔加成(Michael addition)反应形成共价键。迈克尔加成反应包括亲核体(例如巯基、胺或羟基)与共轭不饱和部分(例如含α，β-不饱和羰基部分)的反应。
前体分子的实例包括但不限于聚醚衍生物，例如聚氧化烯或其衍生物、肽和多肽、聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)和聚氨基酸。优选的聚氧化烯衍生物为聚乙二醇(“PEG”)、聚环氧丙烷(“PPO”)、聚环氧乙烷(“PEO”)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物(“PEO-PPO”)、环氧乙烷嵌段共聚物或无规共聚物、泊洛沙姆、meroxapols、poloxamines和聚乙烯醇(“PVA”)。嵌段共聚物或均共聚物(当A＝B时)可以是线性的(AB、ABA、ABABA或ABCBA型)、星形(AnB或BAnC，其中B至少为n价，n为3-6)或分支的(1个B悬挂多个A)。优选的前体分子选自PEG和PEO-PPO嵌段共聚物。最优选的PEG和PEO-PPO嵌段共聚物彼此组合使用。优选的第一前体分子是基于聚乙二醇的聚合物，具有x个选自巯基或氨基的亲核基团，其中x大于或等于2。优选第二前体分子为下列通式(I)的多臂聚(环氧乙烷-聚环氧丙烷)(PEO-PPO)嵌段共聚物：
A-[(C3H6O)n-(C2H4O)m-B]i
(式I)
其中m和n为1-200的整数，
i大于2，优选为3、4、5、6、7或8，
A为支化点，
B为共轭不饱和基团。
前体分子为多官能团单体、低聚物和/或聚合物。优选第一前体分子的分子量范围介于2-20kD之间，更优选介于3kD和11kD之间，最优选介于5kD和10kD之间。第二前体分子优选的分子量优选介于10kD和25kD之间，更优选介于12kD和20kD之间，最优选介于14kD和18kD之间。
优选第二前体分子的支化点A选自碳、甘油、季戊四醇、二季戊四醇和乙二胺。在一个实施方案中，生物材料由式I的多臂聚(环氧乙烷-聚环氧丙烷)(PEO-PPO)嵌段共聚物形成，其中A为乙二胺分子(即i等于4)，B为丙烯酸基(-四丙烯酸酯)。具有乙二胺核心分子的四臂聚(环氧乙烷-聚环氧丙烷)(PEO-PPO)嵌段共聚物由BASF以商品名称
Figure G2008800192803D00102
销售。在又一个实施方案中，组合物包含分子量约为15kD的
Figure G2008800192803D00103
四丙烯酸酯(
Figure G2008800192803D00104
1107)和分子量约为10kD的四巯基PEG。在另一个实施方案中，生物材料由分子量约为15kD的四丙烯酸酯和分子量约为5kD的四巯基PEG形成。在另一个优选的实施方案中，生物材料由分子量约为15kD的
Figure G2008800192803D00106
四丙烯酸酯和分子量约为3.4kD的线性端官能化二巯基PEG形成。在又一个实施方案中，
Figure G2008800192803D00107
四丙烯酸酯与二硫苏糖醇(DTT)交联。生物材料的机械性能(即粘结强度和粘附强度、溶胀和胶凝时间)受前体分子臂的数目和这些臂的长度影响。各前体分子上臂的数量大将导致具有较高粘结强度的较密集的交联网状物。然而，所得生物材料的再吸收将较长。第一前体分子的链长对所得生物材料的溶胀有影响。较长的聚乙二醇链可提供较可溶胀的生物材料。
优选前体分子是对称的，这意味着分支具有相同的分子量和结构。
第一前体分子和第二前体分子官能度的总数大于或等于5。在一个实施方案中，第一前体分子具有4个官能度，第二前体分子具有3个官能度。在另一个实施方案中，第一前体分子具有2个官能度，第二前体分子具有4个官能度。在又一个实施方案中，前体分子之一具有8个官能度，另一个具有4个。在又一个实施方案中，两种前体分子都具有4个以上的官能度。比起伸展的前体分子，小而紧凑的前体分子将形成强度较大的聚合网状物，尽管官能度和反应配偶体对于两种分子可能是相同的。
按一般准则，选择第一前体组分与第二前体组分的比率使得两个组分的多数官能团与相应的对应物反应。第一前体分子与第二前体分子官能团的比率(即亲电子基团与亲核基团的比率)的范围介于0.7和1.2之间，更优选介于0.8和1.1之间，最优选为1(即化学计量比)。
a.亲核基团
第一前体组分的亲核基团能够以多种反应机制与亲电子基团(例如共轭不饱和基团)反应，优选人体中通过亲核取代或迈克尔型加成反应的自选择反应。有用的亲核体是在人或动物体条件下通过加成反应、特别是自选择迈克尔加成反应，优选对共轭不饱和基团起反应的亲核体。亲核体的反应性取决于特定的不饱和基团。特定的不饱和基团首先由于其在生理pH下与水反应而受到限制。因此，有益的亲核体的亲核性一般在生理pH下比水大。合适的亲核体包括但不限于-SH、-NH2、-OH、-PH2和-CO-NH-NH2。
具体亲核体的实用性取决于所预期的情况和所需要的自选择的量。在一个优选的实施方案中，亲核体为巯基。然而，胺和/或羟基也可为有效的亲核体。
要给予pH特别的关注，因为脱质子化胺或巯基是比质子化胺或巯基强得多的亲核体。因此，如果给予用作强亲核体的胺或巯基的pK特别关注，则可以获得实质上的自选择。其中溶液pH接近前体分子胺或巯基的pK的反应条件有利于共轭不饱和基团与提供的胺或巯基反应而不是与系统中存在的其它亲核体反应。
亲核基团可包含在整体结构具有相当挠性的分子中。例如，双官能亲核体可以Nuc-P-Nuc的形式存在，其中P表示单体、低聚物或聚合物，Nuc是指亲核体。同样，支化聚合物P，可用多个亲核体衍生化以产生P-(Nuc)i.，其中i大于1。亲核体可以是重复结构的组成部分，例如(P-Nuc)i.。显然，这类结构中并非所有的P或亲核体都必须相同。
可按照文献所述方法，例如POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY：BIOTECHNICAL AND BIOMEDICALAPPLICATIONS，第22章，J.Milton Harris，编著，Plenum Press，NY(1992)，对聚乙二醇类及其衍生物进行化学修饰以含有多个伯氨基或巯基。在最优选的实施方案中，通过巯基(SH)取代末端羟基，将第一前体分子末端存在的巯基引入基于PEG的聚合物上。由此获得的前体分子与第二前体分子的反应比其中巯基是通过巯基丙酸基引入的前体分子快。
不同形式的多氨基PEG购自Nektar Therapeutics，Inc.，San Carlos，Calif(通过其收购的Shearwater Polymers of Huntsville，Ala.)及以“Jeffamine”的名称购自Texaco Chemical Company of Houston，Tex.。用于本发明的多氨基PEG包括Texaco′s Jeffamine二胺(“D”系列)和三胺(“T”系列)，它们分别含有每分子2个和3个伯氨基。多胺例如乙二胺(H2N-CH2CH2-NH2)、四亚甲基二胺(H2N-(CH2)4-NH2)、五亚甲基二胺(尸胺)(H2N-(CH2)5-NH2)、六亚甲基二胺(H2N-(CH2)6-NH2)、双(2-羟乙基)胺(HN-(CH2CH2OH)2)、双(2-氨基乙基)胺(HN-(CH2CH2NH2)2)和三(2-氨基乙基)胺(N-(CH2CH2NH2)3)也可用作含多个亲核基团的合成聚合物。
二硫苏糖醇(HS-CH2-CHOH-CHOH-CH2-SH)也可用作含多个亲核基团的合成聚合物。
优选的第一前体分子
在一个优选的实施方案中，第一前体分子为下式II的四巯基PEG：
Figure G2008800192803D00131
(式II)
其中n的范围介于25和60之间。
b.亲电子基团
第二前体分子的亲电子基团优选为共轭不饱和基团。P和共轭不饱和基团的结构可与上述有关亲核体描述的类似。唯一必需的是一个亲电子前体含有的这类亲电子基团大于或等于2个。在一个实施方案中，亲电子基团为共轭不饱和基团。
有可能在多种共轭不饱和化合物上进行亲核加成反应，特别是迈克尔加成反应。在下列所示结构中，单体结构、低聚物结构或聚合物结构用P表示。具体P的各种优选的可能性如本文所述。P可与活性共轭不饱和基团偶联，活性共轭不饱和基团包括但不限于表1中编号为1-20的结构。
Figure G2008800192803D00141
Figure G2008800192803D00151
Figure G2008800192803D00161
反应性双键可与线性酮、酯或酰胺结构(1a、1b、2)中的一个或多个羰基共轭或环系中的两个羰基共轭，如马来酸或对醌型衍生物(3、4、5、6、7、8、9、10)中的一样。在后一种情况下，环可以稠合得到萘醌(6、7、10)或4，7-苯并咪唑二酮(8)，且羰基可转化为肟(9、10)。双键可与杂原子-杂原子双键共轭，例如砜(11)、亚砜(12)、磺酸酯或磺酰胺(13)、或膦酸酯或膦酰胺(14)。最后，双键可与缺电子芳族系统共轭，例如4-乙烯基吡啶鎓离子(15)。三键可用于与羰基或杂原子型多键共轭(16、17、18、19、20)。
1a、1b和2等结构以碳-碳双键与一个或两个吸电子基团的共轭为基础。它们中的一个总为羰基，增加了从酰胺传给酯然后传给苯基酮结构的反应性。在降低位阻或增加α位上的吸电子能力时，亲核加成更加容易。例如，存在下列关系，CH3＜H＜COOW＜CN，其中CH3具有最小的吸电子能力，CN具有最大的吸电子能力。
使用最后两个结构获得的较高反应性可通过改变发生亲核攻击的β位取代基的大小来调节；在P＜W＜Ph＜H顺序中，反应性降低。因此，可利用P的位置来调整对亲核体的反应性。该化合物家族包括对其毒理和在医学中的用途了解甚多的某些化合物。例如，在其末端具有丙烯酸基和甲基丙烯酸基的水溶性聚合物在体内聚合(通过自由基机制)。因此，含有丙烯酸基和甲基丙烯酸基的聚合物已用于体内的临床产品，但却具有显著不同的化学反应流程。
由于双键的顺式构型且存在两个吸电子基团，结构3-10对亲核体的反应性非常高。由于这些羰基的电负性较强，所以不饱和酮的反应比酰胺或酰亚胺的快。因此，环戊烯二酮衍生物的反应比马来酰亚胺酮(maleimidic ones)(3)的快，对醌比马来酰肼(4)和环己酮更快起反应，这是由于更扩大的共轭体系所致。萘醌(7)显出最高的反应性。可将P置于不会降低不饱和基团反应性的位置上，也就是环的相对部分(3、5)、另一个环上(7，8)或通过对醌单肟与O连接(9、10)。为了降低亲核加成反应的速率，还可将P连接到反应性双键上(6、8)。
可以通过使用基于杂原子的吸电子基团获得双键对亲核加成的活性。实际上，含杂原子的酮(11、12)、酯和酰胺(13、14)的类似物提供类似的吸电子作用。对亲核加成的反应性随基团的电负性增加。因此，各结构具有下列关系11＞12＞13＞14，其中11为最高电负性，14为最低电负性。对亲核加成的反应性还通过与芳环连接而提高。还可使用基于芳环的吸电子基团，获得有强活性的双键。含有吡啶鎓样阳离子的任何芳族结构(例如喹啉、咪唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪和类似的含sp2-氮化合物的衍生物)均使双键强极化，使快速迈克尔型加成成为可能。
与碳型或杂原子型吸电子基团共轭的碳-碳三键，可容易地与硫亲核体反应得到单加成和双加成的产物。取代基以上述含双键类似化合物类似的方式影响反应性。在一个优选的实施方案中，亲电子基团为丙烯酸基。
优选的第二前体分子
在一个优选的实施方案中，第二前体分子为含有丙烯酸基的单体、低聚物或聚合物。具体地讲，第二前体为下式Ia的化合物，为式I的具体实施方案：
Figure G2008800192803D00181
(式Ia)
其中n和m为1-200的整数。
优选n介于18-22之间的范围，m介于58-62之间范围。
Figure G2008800192803D00182
是基于聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的四官能嵌段共聚物，可获自BASF。可在碱的存在下，通过使聚合物上的游离羟基与过量丙烯酰氯反应，从而用共轭不饱和基团(例如丙烯酸基)使
Figure G2008800192803D00183
嵌段共聚物官能化。可按类似方式添加其它亲电子基团。
c.添加剂
组合物还可含有有机和/或无机添加剂，例如触变剂；造影剂和/或荧光剂，以跟踪实际应用的情况或即时检测不易观察到的可能的渗漏；稳定剂，用于稳定前体分子以避免过早聚合；和/或填充剂，它可使生物材料的机械性能(例如最终的压缩强度和杨氏模量E (Young′smodulus E))比聚合网状物的机械性能提高。稳定剂的实例包括自由基清除剂，例如丁基化羟基甲苯或二硫苏糖醇。根据应用，组合物(及由此产生的生物材料)可含有着色剂，优选有机颜料，例如染料。在一个实施方案中，加入亚甲蓝作为着色剂。亚甲蓝不仅起着色剂的作用，而且还可通过用作还原剂起含丙烯酸基前体分子的稳定剂的作用。它还可起二硫化物形成指示剂的作用(因为它在还原时变为无色)。在另一个实施方案中，加入坚牢绿作为着色剂。另一种优选的着色剂是丽丝胺绿。丽丝胺绿和坚牢绿着色剂具有因溶液pH而引起颜色改变的能力。它们在酸性条件下为绿色，在碱性条件下为蓝色。因此，这两种着色剂具有表示前体分子溶液与碱性溶液充分混合的额外优势。
d.碱
第一前体分子和第二前体分子的原位交联发生在碱性条件下。多种碱符合在生理条件下催化反应并对患者身体无害的要求，因此在生物材料形成时起活化剂的作用。合适的碱包括但不限于叔烷基胺，例如三丁胺、三乙胺、乙基二异丙胺或N，N-二甲基丁胺。对于给定组合物(并主要根据前体分子的类型)，胶凝时间取决于碱的类型和溶液的pH。因此，可通过改变碱性溶液的pH，在所需要的应用中控制和调整组合物的胶凝时间。增加碱性溶液的pH可缩短胶凝时间，但也将延长生物材料的降解时间。因此，应对胶凝和降解时间进行折衷处理。在一个优选的实施方案中，作为共价交联反应活化剂的碱选自含水缓冲溶液，其pH值和pK值在同一范围内。pK范围优选介于9和13之间。如果碱在碱性范围内有两个pK值，则第一个优选介于8.5和10之间，第二个介于10和13之间。合适的缓冲剂包括但不限于碳酸钠、硼酸钠和甘氨酸。在一个实施方案中，优选的碱为碳酸钠。优选碱性溶液pH范围介于9-14之间，更优选介于10-13之间的范围，甚至更优选介于10-12之间的范围。
e.生物活性剂
生物材料还可含有生物活性因子，比如小分子或肽、蛋白质，其可慢慢由生物材料中扩散出来，因此帮助组织再生和愈合。在这些情况下，生物材料作为具有额外组织再生性质的组织封闭剂并作为递药基质起作用。生物活性因子和/或小分子可仅仅混合入生物材料中，或者可通过将游离巯基掺入分子而与生物材料共价结合并通过水解或酶促降解释放出来。生物活性因子可以是生长因子，优选TGFβ超家族和PDGF的生长因子。
II.生物材料
正如上述，生物材料的要求以及进而前体分子的选择取决于体内应用的目的和部位。在一个优选的实施方案中，生物材料形成阻止、减少或控制液体流失的覆盖层、屏障或封闭层。液体流失包括但不限于任何生物液体或气体的流失，例如血液流失、脑髓液流失或肺部气体流失。生物材料可应用于身体内部或外部。为此，生物材料应具有良好的粘附强度和粘结强度、可适应快速的胶凝时间、由吸水所致的体积增加较小，以及随时间变化被身体完全再吸收。而生物材料的机械稳定性基本取决于聚合网状物的交联点密度，生物材料的吸水受交联点密度和聚合网状物疏水性相互作用的影响。生物材料的交联点密度和疏水性质在很大程度上由前体组分的结构和比率决定。因此，生物材料的吸水和机械性能可受适当选择的前体组分的控制和影响。
生物材料的性质
在一个实施方案中，在硬脑/脊膜切开或受伤之后，使用生物材料将其封闭以防止或减少脑脊液在手术干预之后渗漏到外部环境。如果硬膜损伤不大，则可作为缝合辅助手段进行封闭。生物材料可用作唯一的闭合手段以实现第一表面和第二表面的非手术连接。在最优选的应用中，在头颅手术后，使用组合物作为缝合硬膜修复的缝合辅助手段。影响形成生物材料的反应时间的一个因素是交联时组合物的pH，该生物材料用作硬膜封闭剂(简称“封闭剂”)。将前体分子溶于pH介于2和7.5之间、更优选介于4和5之间的含水缓冲溶液中。在一个优选的实施方案中，使用pK为4.76的乙酸钠、pK1为2.15、pK2为7.2的磷酸钠或盐酸(HCl)制备缓冲溶液或者调整前体分子溶液的pH。在前体分子(及任何添加剂和/或生物活性剂)混合之后或混合之时，碱作为活化剂催化反应。优选使用至少一个pK值范围介于9和13之间的碱性溶液作为活化剂。最优选是pK2为10.33的碳酸钠或pK1为9.23、pK2为12.74的硼酸钠。另外，硼酸钠具有抗菌性能，出于此原因也有利地用于伤口敷料。在另一个实施方案中，甘氨酸可以用作活化剂，其pK2为9.78。优选交联时组合物pH范围介于9-13之间、更优选范围介于9.5-11.5之间、甚至更优选范围介于9.8-11之间、甚至更优选范围介于10.3-10.6之间。
用作硬膜封闭剂的组合物必须具有非常快的交联时间，以便停留在原位并及时防止渗漏。优选组合物在2分钟以内、甚至更优选在1分钟以内、最优选介于5-20秒钟之间、甚至更优选介于1秒钟和5秒钟之间交联。
生物材料的溶胀应有限，因为溶胀可对组织造成压力，导致神经受压或局部缺血。如本文上文中的定义，封闭剂的溶胀不应超过1.5，优选小于1，更优选小于0.5。最优选溶胀值的范围介于0.1-1.5之间，更优选范围介于0.1-1之间，甚至更优选为0.1-0.8。在一个优选的实施方案中，至少前体分子之一具有疏水性比聚乙二醇高的分子作为主链。例如，在一个实施方案中，第一前体分子具有PEG主链，且PEO/PPO嵌段共聚物作为第二前体分子的主链。优选两种前体分子都具有三个以上的多个末端官能化臂。最优选两种前体分子都含有四个末端官能化臂。优选第一前体分子为分子量介于4kD和11kD之间、更优选介于5kD和10kD之间的四巯基PEG(式II)。第二前体组分优选为分子量介于10kD和20kD之间、更优选约为15kD的
Figure G2008800192803D00211
四丙烯酸酯(式I)。特别地，可通过将5kD或10kD四巯基PEG与四丙烯酸酯混合获得具有优良性能的封闭剂材料。形成生物材料的第二前体分子(亲电子前体)的浓度范围介于8％-18％(重量/重量)之间，更优选介于10％-16％(重量/重量)之间，最优选介于12％和14％(重量/重量)之间。计算出第一前体分子(亲核前体分子)的浓度，并根据所需的第一前体分子和第二前体分子间官能团的比率进行调整。前体分子的浓度范围同样对生物材料的溶胀、胶凝和再吸收时间有重大影响，出于此原因，最佳范围对于作为封闭剂的最终性能十分重要。由低浓度前体分子开始可延长胶凝时间，不过却可产生溶胀至较低程度的生物材料。在又一个实施方案中，生物材料在12周以内在体内降解。
III.形成生物材料的方法
A.贮存
第一前体分子和第二前体分子优选保存在排除氧气、低温(例如约+4℃)条件下的溶液中，以避免官能团用前分解。前体分子可作为干燥粉或作为缓冲液中的溶液保存。在一个实施方案中，两种前体分子作为酸性乙酸钠缓冲液中的溶液保存。在另一个实施方案中，第一前体分子作为干燥粉保存，第二前体分子保存在酸性pH溶液中。
B.用于组织封闭剂的组合物的制备
形成生物材料、特别是组织封闭剂的组合物可通过以下通用方法制备：
a)提供至少一种第一多官能团前体分子，该前体分子包含至少2个亲核基团，优选4个亲核基团，任选包含添加剂和/或生物活性剂；
b)提供至少一种第二多官能团前体分子，该前体分子包含在生理条件下能够与步骤a)的亲核基团形成共价键的至少2个亲电子基团，优选4个亲电子基团，任选包含添加剂和/或生物活性剂；
c)将步骤a)和步骤b)的前体分子溶于缓冲溶液中，缓冲溶液优选具有酸性pH；
d)将在步骤c)获得的前体分子溶液混合；和
e)在步骤d)期间或之后加入碱性溶液，优选pH值介于9和13之间的含水缓冲溶液，以开始进行第一前体分子溶液和第二前体分子溶液间的交联反应。
在一个优选的实施方案中，生物材料的制备方法包括以下步骤：
i)提供第一前体分子，该前体分子是基于聚乙二醇的聚合物，具有x个末端巯基，其中x等于2或大于2，优选为3、4、5、6、7或8；
ii)提供下列通式的第二前体分子：
A-[(C3H6O)n-(C2H4O)m-B]i
其中m和n为1-200的整数；
i大于2，优选为3、4、5、6、7或8；
A选自碳、甘油、季戊四醇、二季戊四醇和乙二胺；
B为共轭不饱和基团；
iii)在碱的存在下，使步骤i)和步骤ii)的前体分子反应形成交联的三维网状物。
在使第一前体分子和第二前体分子混合时，如果溶液的pH为酸性，则交联以慢速发生(10分钟至数小时)。为了避免混合物在给予前达到胶凝点并且按快速的预定时间形成生物材料，需要将前体分子保存在具有酸性pH的溶液中。优选溶液的pH范围介于2-6之间，更优选范围介于2.5-5.5之间。优选的酸性溶液用乙酸盐缓冲液或盐酸溶液获得。
在一个优选的实施方案中，将第一前体分子和第二前体分子溶于具有酸性pH的缓冲溶液中。在另一个优选的实施方案中，第一前体分子为干燥粉，第二前体分子溶于具有酸性pH的缓冲溶液中，在与碱接触前将两种前体分子混合。任选可在混合前，对第一前体分子和第二前体分子以及任何添加剂和/或生物活性剂(如果存在)进行灭菌。这优选通过对前体组分和任何可溶解的其它组分进行无菌过滤来实现，水不溶性组分则通过γ照射实现。在步骤a)、步骤b)中获得的前体分子和/或在步骤d)中获得的混合物可长期保存，优选在低温下保存。应用前，将前体分子(及其它组分，如果存在)彼此混合，其次与作为活化剂的碱性溶液混合。在引入碱性溶液时，组合物快速胶凝。优选组合物(包括碱性溶液)pH范围介于9-13之间、更优选范围介于9.5-11.5之间、甚至更优选范围介于9.8-11之间、甚至更优选范围介于10.3-10.6之间，可供在2分钟以内、优选10秒钟以内、更优选5秒钟以内产生胶凝作用。存在不同的混合方式。在一个实施方案中，3支注射器可使用三通连接器装置互相连接，其中1支装有亲核前体，另1支装有亲电子前体，第3支装有碱性溶液。在三通连接器装置出口处，通过静态混合，挤出注射器的内容物，从而使其混合。将静态混合器与注射针连接，将组合物直接注射到身体内需要治疗的部位。在第二个实施方案中，将一种前体分子溶液与碱性溶液混合。这优选将装有碱性溶液的注射器与优选装有亲电子前体(还任选装有添加剂和/或生物活性剂)的注射器通过连接器装置连接来进行，所述连接器装置可供注射器间相应内容物的混合之用。静态混合器可以是连接器装置的组成部分。当达到均匀混合时混合便完成。混合之后，1支注射器装有碱/前体分子的混合物，另1支注射器是空的。然后，从连接器装置上拆下空注射器，替换上装有另一前体分子、任选还装有添加剂和/或生物活性剂的注射器。注射器间的混合再次为单向的，以达到两种内容物均匀混合。随后将装有混合物的注射器与注射针连接，将组合物注射到体内需要的部位。
或者，将装有碱/前体混合物的注射器与装有另一前体的注射器通过在其出口包括静态混合器的两通连接器装置互相连接。两通连接器装置可以是双室注射器。通过静态混合器挤出注射器的内容物使内容物混合。静态混合器与注射针直接连接，或在又一个注射器中挤出混合物，然后该注射器与注射针连接。
在一个优选的实施方案中，使第一前体分子溶液和第二前体分子溶液混合，优选使溶于乙酸钠缓冲液的第一前体分子和第二前体分子混合(需要时，与任何添加剂或生物活性剂一起)，然后与活化剂即碱性溶液一起喷到组织上。
IV.形成原位可交联组合物的药盒
本发明的药盒是用于形成本发明生物材料的组成部分的套装。药盒装有至少第一前体组分和第二前体组分。药盒还可装有一个或多个装置，例如用于给予第一前体分子和第二前体分子加上任何添加剂和/或生物活性剂的注射器或双室注射器。药盒还可装有保存前体分子和碱性溶液的容器。药盒还装有无针装置，以将容器中的内容物彼此转移，或将容器中的内容物转移到双室注射器。任选药盒还装有碱性溶液。优选碱保存在第三容器中。第一前体分子和/或第二前体分子任选含有一种或多种添加剂和/或生物活性剂。可以在给予患者之前，将前体分子放置在一个或多个装置中。药盒还可包括可加到生物材料中以促使生物材料显现的染料，例如亚甲蓝、丽丝胺绿或坚牢绿。在一个优选的实施方案中，特别适用于施用生物材料，把前体分子溶液保存在双室装置的一个室内，把碱性溶液保存在同一装置的第二室内。装置的出口装有喷嘴，该喷嘴任选可与静态混合器联合以使碱性溶液与前体分子溶液混合最优化。前体分子溶液(必要时加上任何添加剂或生物活性剂)可装在预混合室内，或前体分子在室内可被膜分隔开，当所述膜被除去或破坏时可使分子混合。
在另一个实施方案中，药盒包括第一容器(真空)，该容器可为玻璃小瓶，装有作为干燥粉的第一前体分子；第二容器可为玻璃小瓶，装有溶于具有酸性pH的含水缓冲溶液的第二前体分子。第一容器或第二容器可任选装有一种或多种选自触变剂和造影剂或着色剂的添加剂。将第二容器的内容物通过无针转移装置(
Figure G2008800192803D00251
20/20，West)转移到第一容器中。之后，将第一前体分子和第二前体分子混合并溶于具有酸性pH的含水缓冲溶液中。可以是玻璃小瓶的第三容器装有碱性溶液。优选地，双室注射器配备有双灌注转移接头(double filingadaptor)。双注射器的两室可有不同的体积。接受前体分子的混合物的隔室的体积优选为接受碱性溶液隔室的体积的10倍。将装有前体分子的容器和装有碱的容器与连接装置连接，通过拉动注射器活塞将容器内容物同时转移到注射器的两个室内。从注射器上拆除连接装置和两个容器，给注射器装上可拆卸的喷嘴。前体分子溶液和碱性溶液在喷嘴中发生混合，把所得均匀混合物喷射到所需要的部位。
V.组合物的用途
选择并设计多官能团前体组分以产生具有所需性能的生物材料。前体分子能够在生理温度下原位交联以满足具体的封闭剂要求。在一个优选的实施方案中，使用本发明的组合物和生物材料以防止、减少、抑制或控制生物液体的流失。在另一个实施方案中，使用本发明的组合物和生物材料用于覆盖组织表面。
A.组织封闭剂
在一个实施方案中，本发明的组合物和生物材料用作组织封闭剂。在一个优选的实施方案中，原位交联组合物形成生物材料，该生物材料形成覆盖层、屏障或封闭剂以减少、抑制或控制液体流失。具体地讲，在医学手术后可以使用生物材料阻制、减少或控制液体流失。优选的医学手术包括但不限于脑手术或神经外科手术。
B.组织封闭剂以外的医学适应症
所公开的生物材料不限于用于外科手术。生物材料可用于任何身体部位伤口的伤口敷料。在一个实施方案中，生物材料可用作野外敷料(field dressing)以防止或减少由外伤引起的血液流失。在另一个实施方案中，生物材料可用来减少或防止手术后防粘连(post-surgicalanti-adhesion)。
实施例
材料
按照Biomaterials 25(2004)5115-5124中所述方法，将乙二胺四(聚(环氧乙烷-环氧丙烷)嵌段共聚物)(
Figure G2008800192803D00261
1107，分子量15kD，BASF)用丙烯酸基进行末端官能化以产生乙二胺四((聚(环氧乙烷-环氧丙烷)嵌段共聚物)-丙烯酸酯)(tetronic-四丙烯酸酯，分子量15kD)。
缓冲液制备
将1.11g三乙醇胺溶于25ml milli-Q水中后，加入5M盐酸调节pH，来制备0.3M三乙醇胺(TEA)。
将8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris碱溶于1L MilliQ水中来制备TBS。用5M NaOH调节pH。
甘氨酸缓冲液：将7.5g甘氨酸和5.85g NaCl溶于1L MilliQ水中。用5M NaOH调节pH。
乙酸盐缓冲液：用MilliQ水制备10mM乙酸(acidic acid)缓冲液和10mM乙酸钠缓冲液。将两种缓冲液按比率混合得到所需pH。
硼酸盐缓冲液：制备100mM硼酸缓冲液和50mM四硼酸钠十水合物缓冲液。将两种缓冲液按比率混合得到所需pH。
碳酸盐缓冲液：在MilliQ水中制备100mM碳酸钠缓冲液和100mM碳酸氢钠缓冲液。将两种溶液按比率混合得到所需pH。
胶凝试验
为了评价胶凝时间，50-100μl规定量的第一前体分子溶液和第二前体分子溶液(表2)用移液管移到Eppendorf管中。对于快速胶凝材料，将几滴(等体积)各第一前体分子溶液加到内壁上以防止还未与第二前体溶液接触便提前胶凝。在将Eppendorf管置于涡旋的同时开启定时器，然后使溶液混合正好5秒钟。紧接混合之后，用针探测混合的溶液，当针从溶液中抽出时，有细线开始保持粘附在针上时的“凝胶点”(当抽出后细线保持粘附在针上)记录时间记作“凝胶点”。对于快速胶凝配方，记录在5秒钟探测后的状态(例如细线、粗线和/或硬凝胶)。或者，混合通过注射器间混合进行。为此，将第一前体分子溶液和第二前体分子溶液吸入注射器，将注射器与连接器连接，来回推动溶液10次。将混合物转移到称量皿中，通过上述“针探测法”测定凝胶点。在最初胶凝之后，水凝胶通常保持粘性直到获得较大程度的交联。材料所需要充分交联(粘性特征丧失)的时间记作“凝固时间(set time)”，反映了在此时间后可以接触材料而无损害。
实施例1：组织封闭剂组合物
1a：组合物1：Tetronic-四丙烯酸酯和PEG-SH-10
第一前体分子溶液
将235mg四巯基聚乙二醇(“PEG-SH-10”)(分子量10kD)和0.1mg丽丝胺绿溶于1mL 10mM乙酸盐缓冲液(pH 5)中。
第二前体分子溶液
将315mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于1mL 10mM乙酸盐缓冲液(pH 5)中。
碱性溶液
0.22mL 50mM硼酸盐缓冲液(pH 9.8)。
1b：组合物2：Tetronic-四丙烯酸酯和PEG-SH-5
第一前体分子溶液
将112mg四巯基聚乙二醇(“PEG-SH-5”)(分子量5kD)和0.1mg丽丝胺绿溶于1mL 10mM乙酸盐缓冲液(pH 5)中。
第二前体分子溶液
将315mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于1mL 10mM乙酸盐缓冲液(pH 5)中。
碱性溶液
0.22mL 50mM硼酸盐缓冲液(pH 10.4)。
1c：组合物3：Tetronic-四丙烯酸酯和PEG-SH-5
第一前体分子溶液
将168mg四巯基聚乙二醇(“PEG-SH-5”)(分子量5kD)溶于1mL10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.9)中。
第二前体分子溶液
472mg的tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于2mL 20mM乙酸盐缓冲液(pH 4.9)中。
碱性溶液
0.3mL 250mM碳酸盐缓冲液(pH 11.0)。
1d：组合物4：Tetronic-四丙烯酸酯和PEG-SH-5
第一前体分子溶液
将192mg四巯基聚乙二醇(“PEG-SH-5”)(分子量5kD)溶于1mL5mM乙酸盐缓冲液(pH 4.9)中。
第二前体分子溶液
将427mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于1mL 15mM乙酸盐缓冲液(pH 4.9)中。
碱性溶液
0.3mL 250mM碳酸盐缓冲液(pH 11.0)。
1e：组合物5：Tetronic-四丙烯酸酯和DTT
第一前体分子溶液
将2.5mg二硫苏糖醇(DTT，分子量154g/mol)溶于500μL0.3M三乙醇胺缓冲液(pH 8.5)中。
第二前体分子溶液
将120mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于500μL 0.3M三乙醇胺缓冲液(pH 8.5)中。
或者
第一前体分子溶液
将3.15mg二硫苏糖醇溶于500μL0.3M三乙醇胺缓冲液(pH 8.5)中。
第二前体分子溶液
将150mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于500μL0.3M三乙醇胺缓冲液(pH 8.5)中。
1f：组合物6：Tetronic-四丙烯酸酯和2臂PEG-SH-3.4
第一前体分子溶液
将156mg二巯基聚乙二醇(“PEG-SH-3.4”)(分子量3.4kD)溶于1mL 10mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中。
第二前体分子溶液
将315mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于1mL 10mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中。
碱性溶液
0.3mL 250mM碳酸盐缓冲液(pH 10.0)。
1g：组合物7：Tetronic-四丙烯酸酯和8臂PEG-SH-10
第一前体分子溶液
161mg 8臂八巯基聚乙二醇(“8臂PEG-SH-10”)(分子量5kD)溶于1mL 10mM乙酸盐(pH 4.9)中。
第二前体分子
将472mg的tetronic-四丙烯酸酯(15kD)溶于2ml 20mM乙酸盐(pH 4.9)。
碱性溶液
0.3mL 0.25M碳酸钠缓冲液(pH 11.0)。
1h：组合物8：Tetronic-四丙烯酸酯和4臂PEG-SH-5
472mg tetronic-四丙烯酸酯，15kD
192mg四巯基PEG，5kD
0.55mg盐酸
9.5mg碳酸钠
0.15mg亚甲蓝水合物
3.3g注射用水
药盒的制备
将5mL 100mM HCl溶液在95ml milli-Q水中稀释来制备5mMHCl储备液。将20mg亚甲蓝溶于20ml HCl储备液中，来制备1mg/ml/5mM HCl亚甲蓝储备液。由5mM HCl与0.05mg/ml亚甲蓝制备用于重配tetronic-四丙烯酸酯的缓冲液。按1∶20的比率用HCl储备液稀释，调节pH至2.3-2.6的范围内。调节碱性溶液(碳酸盐缓冲液)的pH至11.35-11.45的范围内。将472mg tetronic-四丙烯酸酯溶于3ml冷的tetronic四丙烯酸酯缓冲液中，在冰上保持5分钟以易于增溶。将溶液以3000rpm离心1分钟以除去气泡后，用移液管移至装有192mg四巯基PEG的小瓶中，通过轻轻摇动使之溶解。在聚合物重配之后，将混合物3ml转移至1∶10双注射器较大的室内。较小的室充入0.4ml 300mM碳酸钠。插入塞子，小心地从注射器中排除空气，连上喷嘴。
1i：的制备
Figure G2008800192803D00312
(Confluent Surgical Inc.)按照使用说明书制备。
1j：组合物10Tetronic-四丙烯酸酯和2臂PEG-SH-3.4
将133mg二巯基聚乙二醇(“PEG-SH-3.4”)(分子量3.4kD)溶于500μL0.3M三乙醇胺缓冲液(pH 8.5)中。
第二前体分子溶液
将220mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于500μL0.3M三乙醇胺缓冲液(pH 8.5)中。
1k：组合物11：Tetronic-四丙烯酸酯和2臂PEG-SH-3.4
将107mg二巯基聚乙二醇(“PEG-SH-3.4”)(分子量3.4kD)溶于1.5mL 0.3M三乙醇胺缓冲液(pH 8.5)中。
第二前体分子溶液
将220mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于500μL0.3M三乙醇胺缓冲液(pH 8.5)中。
1l：组合物12：Tetronic-四丙烯酸酯和2臂PEG-SH-3.4
将354mg二巯基聚乙二醇(“PEG-SH-3.4”)(分子量3.4kD)溶于1.5mL 0.3M三乙醇胺缓冲液(pH 8.5)中。
第二前体分子溶液
将240mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于500μL0.3M三乙醇胺缓冲液(pH 8.5)中。
1m：组合物13：Tetronic-四丙烯酸酯和2臂PEG-SH-3.4
将140.7mg二巯基聚乙二醇(“PEG-SH-3.4”)(分子量3.4kD)溶于50μL100mM的pH为10.1、9.8和9.6的硼酸盐缓冲液中。
第二前体分子溶液
将286mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于50μL100mM硼酸盐缓冲液(pH 8.5)中。
实施例2a：第一前体分子和第二前体分子的混合物的稳定性
第一前体分子溶液
将194mg四巯基聚乙二醇(“PEG-SH-5”)(分子量5kD)溶于1mL10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.9)中。通过将100mM乙酸缓冲液和100mM乙酸钠缓冲液混合以达到pH 4.90来制备缓冲液，并用水按1∶10(体积/体积)稀释缓冲液。
第二前体分子溶液
将545mg tetronic-四丙烯酸酯(分子量15kD)溶于2mL 20mM乙酸盐缓冲液(pH 4.9)中。通过将100mM乙酸和100mM乙酸钠缓冲液混合以达到pH 4.90来制备缓冲液，并用水以1∶5(体积/体积)稀释缓冲液。
碱性溶液
0.3mL 250mM碳酸盐缓冲液(pH 11.0)。
当仅第一前体分子和第二前体分子通过涡旋30秒钟混合时，在30分钟内发生胶凝。胶凝时间通过将针浸入溶液并从溶液取出来测量，测定直到细线形成的时间，这表明了材料交联的高级程度。在较低浓度的前体分子的情况下，即对于按实施例1c和实施例1d(组合物3和组合物4)中所述制备的前体分子溶液，在1小时后才发生胶凝。当将碱性溶液用于前体分子的混合物中时，两种组合物在数秒钟内(10秒钟内)胶凝。
实施例2b：存在于相应聚合物中的丙烯酸基和巯基官能团数目之比的作用
以不同的体积比(0.25∶1、0.375∶1、0.5∶1、0.675∶1和0.75∶1)将实施例1c中所述的第一前体分子溶液和第二前体分子溶液混合。这些比率与1∶0.5、1∶0.75、1∶1、1∶1.25和1∶1.5的摩尔巯基与摩尔丙烯酸基的比率相对应。通过涡旋使第一前体分子溶液与第二前体分子溶液混合30秒钟。然后，按相当于前体分子溶液总体积十分之一的体积加入0.2mL 50mM硼酸盐缓冲液(pH 9.3)。通过涡旋使混合物混合正好5秒钟。通过将针浸入溶液并从溶液中取出，测定直到细线形成的时间，这表明了材料交联的高级程度。对于丙烯酸基与巯基摩尔比率为1∶1和1∶0.75的样品，所得最小胶凝时间为10-11秒钟。其它比率的胶凝时间增至13-15秒钟。
实施例3：生物材料的制备
3a：得自组合物1、2、3、4和6的生物材料的制备
在所需部位应用药物组合物之前，将第一前体分子溶液和第二前体分子溶液充入两个分开的用连接器连接的注射器中。将装在一支注射器中的材料转移到另一支注射器中，使第一前体分子溶液与第二前体分子溶液混合(通常将溶液来回推动10次)。虽然，混合物在其制备后保持稳定10-20分钟，理想的是，药物组合物应在其制备之后5分钟内使用。通过使用配备涂布器头或喷雾器头的两组分装置，将包含第一前体分子和第二前体分子以及活化剂的混合物递送到缺损部位，在所需部位原位形成生物材料。在递送两组分装置中的内容物后1分钟以内形成生物材料。
3b.得自组合物5、10、11、12和13的生物材料的制备
将第一前体分子溶液和第二前体分子溶液充入两个分开的用连接器连接的注射器中。将装在一支注射器的材料转移到另一支注射器中，使第一前体分子与第二前体分子溶液混合。在注射器中达到胶凝点，将生物材料从注射器中挤出，并递送到模子中。
3c.得自组合物7的生物材料的制备
通过注射器间混合使两种前体分子相混合。不加入碱性溶液，前体分子在30分钟内胶凝。这就意味着前体分子的混合物可在用前保存30分钟。当加入300μl 0.25M碳酸钠缓冲液(pH 11.0)时，在数秒(5秒钟以内)内发生胶凝。
实施例4：生物材料的溶胀/降解
为了评价生物材料的溶胀和降解，按实施例1a和实施例1b中所述由组合物制备生物材料。
在所需部位应用组合物之前，将第一前体分子溶液和第二前体分子溶液充入用连接器连接的两个分开的注射器中。将装在一支注射器的材料转移到另一支注射器中，使第一前体分子溶液与第二前体分子溶液相混合(通常将溶液来回推动10次)。虽然，混合物在其制备后10-20分钟保持稳定(意味着混合物在10-20分钟之前不会达到胶凝点)，理想的是，组合物应在其制备后5分钟内使用。通过使用配备有涂布器头或喷雾器头的两室装置，将包含第一前体分子和第二前体分子以及碱性溶液的混合物递送到所需部位，在所需部位原位形成生物材料。在递送两室装置的内容物后5秒钟内形成生物材料。将组合物涂布在称量皿上，使之形成1mm的生物材料层。然后装有反应溶液的称量皿置于37℃、湿润气氛下，并熟化10分钟。在每块薄膜上切下直径为1.2cm的3个圆盘。将样本放入装有磷酸盐缓冲溶液(PBS)的管中，并放置于37℃培养箱中。在不同的时间点上，借助刮刀从管中取出生物材料。使用绵纸小心地使生物材料干燥以除去任何过量的水份，然后称重。之后将生物材料放回它们相应的管中，并放回培养箱内。在PBS中于37℃下2天后，对于由实施例1a组合物形成的生物材料，溶胀值达到0.87±0.11，对于由实施例1b组合物形成的生物材料，溶胀值达到0.32±0.06％。两种生物材料在28-35天内全部溶解(图1和图2)。
实施例5：抗压试验
通过将100μl组合物1和组合物2充入到刻度1ml的注射器中，以制备实施例1a中所述的由组合物1形成的8个生物材料样本和实施例1b中所述的由组合物2形成的8个生物材料样本。使生物材料熟化5-10分钟后，从模子中取出。得到直径为5mm，高度为11.5mm的圆柱体。将4份生物材料放入10mM PBS(pH 7.4)中，并将4份生物材料放到干燥管中。将该管在37℃下保温24小时。由于用pH分别为9.8和10.4的碱性溶液时的胶凝时间太快而无法形成均匀的样本，因此降低碱性溶液的pH至pH 9.6。用“Zwick Materialprüfung 1456”仪器对样品进行了测定。杨氏模量(弹性模量)用50N测力传感器测量，极限强度用20kN测力传感器测量。预压速度由0.05mm/秒提高到0.1mm/秒，等待时间减少到3秒。在3％加压但在0.08mm/秒速度下测量杨氏模量。以20kN测力传感器采用同一速度，用于压力记录直到材料破裂。各生物材料样本在干燥状态，在PBS中保温24小时后加压。当加压高达99％时，生物材料无一在其干燥状态受到破坏(保存在空气、37℃下达24小时)。在湿润状态下，对于由组合物1形成的生物材料，遭破坏时的压力为3.8±2.5N/mm2，对于由组合物2形成的生物材料为1.51±0.17N/mm2。对于由组合物1形成的生物材料，遭破坏时的加压％为91±3％，对于由组合物2形成的生物材料为88±2％。在湿润状态下，对于由组合物1形成的生物材料，杨氏模量为0.125±0.005N/mm2，对于由组合物2形成的生物材料为0.10±0.00N/mm2。在干燥状态下，由组合物2形成的生物材料的杨氏模量值为0.561±0.152N/mm2，高于由组合物1形成的生物材料，该材料的杨氏模量为0.152±0.024N/mm2。
实施例6：生物材料的粘合强度和粘结强度
在爆破试验中研究了生物材料的粘合强度和粘结强度。按照ASTM F-2329-04(手术封闭剂爆破强度标准试验)，进行了爆破试验测量。采用测量范围为0-2巴(最大超压4巴)，分辨率为0.1毫巴的相对压力传感器(DeltaOhm TP704-2BGI)。采用恒流注射泵为液压泵(Alaris，Asena GH)。对于爆破压力测试，将按实施例1h和li制备的组合物8和
Figure G2008800192803D00361
应用到湿胶原膜上。为了保证相同的样品形状，将胶原膜置于掩膜片(mask)下，通过掩膜片施以封闭剂。然后，使样品熟化后，小心地从掩膜片取下。测量样品厚度和重量后，将样品夹在测试装置上，分别进行测试。连续测定通过胶原上的预制孔直接对封闭剂起作用的递增压力。在封闭剂爆裂后，可将泵关闭，并对所采集的数据进行评价。为了比较不同样品的具体爆破强度，在测试前测量其厚度并归一化至1mm。两种合成手术封闭剂的爆破压力测试表明了它们在抗破坏中的明显差异。
Figure G2008800192803D00362
在74mmHg的平均压力下爆裂，而由组合物8形成的生物材料在240mmHg的平均压力下爆裂。两种封闭剂内聚破坏的比率为90％，它表明与用于试验中的胶原膜良好粘合。
实施例7：绵羊硬膜的手术封闭
绵羊被处死3小时后，剖出硬膜。用解剖刀去皮，用骨刀将头骨割出一长方形。提起头骨，因为硬膜仍部分连在头骨上，所以要小心地将硬膜从头骨上切离并放回到脑部。将组合物1和组合物2(实施例1a和实施例1b中所述)在硬膜上涂成薄膜，使之熟化1分钟。观察无液体渗出。用扁圆形刮刀从硬膜尝试揭开/剥离熟化材料。按1-5的等级对凝胶外观、胶凝时间和粘连性进行定量评价。对于凝胶外观，1级相当于凝胶不均匀。2级相当于凝胶大多是粗糙的，3级相当于凝胶有部分粗糙，5级相当于凝胶均匀光滑。对于胶凝时间，1级相当于约50-100％的组合物流掉。2级相当于约25-50％的组合物流掉，3级相当于约5-10％的组合物流掉，5级相当于约0-5％的组合物流掉。对于粘连性，1级表示不用力可剥离凝胶，2级表示用少许力可剥离凝胶，3级表示需要施以中等力可剥离凝胶，4级表示剥离出非常少的凝胶，5级表示无法剥离任何凝胶。对于组合物2，增加pH至10.4以降低胶凝时间。为了比较，还将组合物应用到湿胶原膜以及直接应用到脑部。发现由组合物形成的两种生物材料非常好地粘附在硬膜上(组合物1形成的生物材料-4级，组合物2形成的生物材料-3级)。发现生物材料对硬膜的粘连性比对胶原膜的粘连性好得多。相比之下，当将生物材料应用到绵羊脑(被软脑膜和蛛网膜层覆盖)时较易剥离。组合物1快速胶凝(4级)，因此在施用过程结束时，由于半胶凝材料与涂布器接触产生一些粗糙部分(凝胶外观为4级)。另一方面，组合物2胶凝相当慢(2级)，甚至当碱性溶液pH增加到10.4时，并非所有产物都保持在使用的位置上，而是流到侧边，尤其如果硬膜不是水平放置时更是如此。尽管如此，使用材料的位置仍保留薄的材料层。在30秒钟内，材料形成粗糙且无粘性的水凝胶(凝胶外观为5级)。
实施例8：绵羊硬膜切开术(Durotomy)模型
使经麻醉绵羊的硬膜暴露出来，在硬膜和蛛网膜上切开2cm的切口，使得脑脊液渗漏出来。缺损处使用4/0聚丙烯缝线进行松修复，只留下1mm缝隙。按照下列方法使用实施例1h中所述的组合物8。
组分灭菌
所有施用器组件、小袋、玻璃小瓶和罩子(closures)用γ幅射按21.8kGy的量进行灭菌。之后无菌材料的任何操作都在无菌通风橱中进行。将缓冲液和tetronic-四丙烯酸酯溶液经过0.22μm PES注射器过滤器无菌过滤。药盒中提供的PEG-SH-5未经灭菌，在药盒制备期间，在与tetronic-四丙烯酸酯重配后经过0.22μm PES注射器过滤器进行过滤。
缓冲液的制备
将1.59g碳酸钠溶于50ml注射用水(aqua ad injectable)来制备碱性溶液。记录的pH为11.38。
将471mg tetronic-四丙烯酸酯溶于含有0.05mg/ml亚甲蓝的3ml5mM HCl中来制备Tetronic-丙烯酸酯溶液。通过涡旋10-20秒钟，得到重配液，将溶液保存在4℃下10分钟后以2500rpm离心5分钟。100mM HCl溶液用注射用水稀释制备5mM HCl溶液。亚甲蓝被制备成10mg/ml亚甲蓝的5mM HCl溶液后，用5mM HCl稀释。
药盒的无菌灌装和包装
在灭菌前将双注射器装上活塞。将400μl碳酸钠灌装到注射器较小的室内，与4个喷头和1个柱塞包装在一起装入1号袋。称取192mg聚合物装入玻璃小瓶中来制备PEG-SH-5-组分。玻璃小瓶用乙醇摇荡(whip)，在不触碰外部的情况下，将粉末倒入无菌玻璃小瓶中。小瓶用卷边(crimp)盖封盖。将tetronic-四丙烯酸酯溶液装入20ml注射器中，通过注射器间连接器将3.3ml转移到5ml注射器中。注射器用combi塞(combi-stopper)封盖。将小瓶、5ml注射器、蓝色针和粉红色针及注射器过滤器包装在2号袋中后热封。将1号袋和2号袋合在一起放到较大的袋中后热封。将药盒保存在-15℃以下至-25℃，用干冰运送。在实验当天，从仓库取出药盒，置于室温下直到完全融化为止。用时，在无菌区打开药盒。将tetronic-四丙烯酸酯溶液转移到装有PEG-SH-5粉的小瓶中。粉末通过在1-2分钟内轻轻摇动小瓶进行重配。再次将混合物加到注射器中，将注射器与无菌过滤器和蓝针连接后，转移到双注射器较大的室内。将分配器与双注射器连接，从双注射器中排除残留空气。把喷嘴安装在双注射器上，此时备好施用器待使用。将组合物喷洒在硬膜缺损上，生物材料在5秒钟内固化。仔细检查硬膜缺损再次出现的CSF渗漏。手术期中，封闭剂能够阻止液体渗漏。一周后材料仍然存在，12周之后被完全再吸收。
实施例9：高浓度Tetronic-丙烯酸酯的热凝胶性能测试
结合线性PEG-SH 3.4kDa，对组合物11(如实施例1k中所述)和组合物12(如实施例11中所述)的胶凝性能进行了比较。预期凝胶形成在组合物11中通过化学交联产生，在组合物12中通过物理手段(热胶凝)之后通过化学交联产生。组合物11在注射器间混合30秒钟后于1.5分钟内胶化，将溶液用于称量皿后(通过针)得到的凝固时间为2-3.5分钟。在组合物12的情况下，当将组合物用于周围用37℃水浴加热的称量皿时形成凝胶，防止了材料逸散开来(run-down)。然而，凝固时间增至4-55分钟，因此胶凝时间比组合物11的长。
实施例10：pH对反应动力学的影响
组合物10(如实施例1j中制备)的胶凝时间与缓冲溶液pH的关系见图3。该图显示胶凝时间随pH增加而减少。在组合物13(按实施例1m中所述制备)中观察到类似作用。

Claims (25)

1.一种包含至少第一前体分子和第二前体分子的组合物，其中：
i)第一前体分子是基于聚乙二醇的聚合物，具有x个选自巯基或氨基的亲核基团，其中x等于2或大于2，优选为3、4、5、6、7或8；
ii)第二前体分子为下列通式的分子：
A-[(C3H6O)n-(C2H4O)m-B]i
其中m和n为1-200的整数，
i大于2，优选为3、4、5、6、7或8，
A为支化点或部分，
B为共轭不饱和基团。
2.权利要求1的组合物，其中x等于4。
3.权利要求1-2中任一项的组合物，其中第一前体分子是四巯基季戊四醇聚乙二醇醚。
4.权 利要求3的组合物，其中四巯基季戊四醇聚乙二醇醚的分子量范围约为2-20kD。
5.权利要求4的组合物，其中四巯基季戊四醇聚乙二醇醚的分子量范围约为3-11kD。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中第二前体分子的B是丙烯酸基。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中第二前体分子的支化点或部分A选自碳、甘油、季戊四醇、二季戊四醇和乙二胺。
8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中第二前体分子的分子量范围约为10-25kD。
9.权利要求1-7中任一项的组合物，所述组合物还包含碱。
10.权利要求9的组合物，其中所述碱是碳酸钠。
11.权利要求1-10中任一项的组合物，其中所述组合物还包含着色剂。
12.权利要求11的组合物，其中所述着色剂选自亚甲蓝、丽丝胺绿和坚牢绿。
13.一种制备生物材料的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供第一前体分子，所述前体分子是基于聚乙二醇的聚合物，具有x个选自巯基或氨基的亲核基团，其中x等于2或大于2，优选为3、4、5或6；
ii)提供具有以下通式的第二前体分子：
A-[(C3H6O)n-(C2H4O)m-B]i
其中m和n为1-200的整数，
i大于2，优选为3、4、5或6，
A为支化点或部分，
B为共轭不饱和基团，
iii)在碱性溶液存在下，使步骤i)和步骤ii)的前体分子反应形成交联的三维网状物。
14.权利要求13的方法，其中将所述第一前体分子和第二前体分子在步骤iii)之前溶于具有酸性pH的含水缓冲溶液中。
15.权利要求13和权利要求14中任一项的方法，其中所述生物材料在2分钟以内形成。
16.权利要求13和权利要求15中任一项的方法，其中所述生物材料在10秒钟以内形成。
17.权利要求13的方法，其中步骤iii)的组合物的pH范围介于9-13之间。
18.一种由权利要求1-12中任一项的组合物形成的合成生物材料。
19.用作组织封闭剂的权利要求1-12中任一项的组合物。
20.用于覆盖组织表面的权利要求1-12中任一项的组合物。
21.用于减少、抑制或控制生物液体或气体流失的权利要求1-12中任一项的组合物。
22.权利要求1-12中任一项的组合物在制备用于实施非手术连接第一表面和第二表面的药物中的用途。
23.一种形成生物材料的药盒，所述药盒包括：
i)装有第一前体分子的第一容器，所述前体分子是基于聚乙二醇的聚合物，具有x个选自巯基或氨基的亲核基团，其中x等于2或大于2，优选为3、4、5、6、7或8；
ii)装有以下通式的第二前体分子的第二容器：
A-[(C3H6O)n-(C2H4O)m-B]i
其中m和n为1-200的整数，
i大于2，优选为3、4、5、6、7或8，
A为支化点或部分，
B为共轭不饱和基团。
24.权利要求23的药盒，所述药盒还包括装有碱性溶液的第三容器。
25.权利要求23-24中任一项的药盒，所述药盒还包括双室注射器。
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