KR20130055847A - 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민 및 말단에 티올기가 결합된 폴락소머를 포함하는 하이드로젤 및 이의 제조방법 및 이를 이용한 지혈제 - Google Patents

카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민 및 말단에 티올기가 결합된 폴락소머를 포함하는 하이드로젤 및 이의 제조방법 및 이를 이용한 지혈제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카테콜기가 결합된 키토산 및 말단에 티올기가 결합된 플루로닉을 포함하는 접착성 하이드로젤 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체 내외에서의 안전성을 갖고, 온도 감응적이며, 지혈효과가 우수 하여 생체 접착제로서 이용 가능한 접착제 조성물 및 이를 포함하는 의료용 접착제, 유착 방지제 및 표면 흡착 방지제에 관한 것이다.

Description

카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민 및 말단에 티올기가 결합된 폴락소머를 포함하는 하이드로젤 및 이의 제조방법 및 이를 이용한 지혈제 {Methods to prepare hemostatic adhesive hydrogels for medical use by catechol-containing chitosan or related polyamines and thiol-conjugated polaxomers}
본 발명은 카테콜기가 결합된 키토산 및 말단에 티올기가 결합된 플루로닉을 포함하는 접착성 하이드로젤 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체 내외에서의 안전성을 갖고, 온도 감응적이며, 지혈효과가 우수하여 생체 접착제로서 이용 가능한 접착제 조성물 및 이를 포함하는 의료용 접착제, 유착 방지제 및 표면 흡착 방지제에 관한 것이다.
접착제란 물체와 다른 물체의 표면을 부착시키는데 사용하는 물질로 국제표준화기구(ISO)에서는 '접착(adhesion)은 두 면이 화학적 또는 물리적인 힘, 또는 그 양자에 의해서 일체화되는 상태이고, 접착제(adhesive)는 접착제에 의해 2개 이상의 물체를 일체화하는 것이 가능하게 하는 물질'로 정의하고 있다. 접착제는 편리함으로 인해 일상생활, 산업활동의 여러 분야에서 폭넓게 사용되고 있으며, 주성분에 따라 무기접착제 및 유기 접착제로 분류된다. 유기 접착제는 다시 합성 유기 접착제와 천연계 유기접착제로 분류되며, 합성 유기 접착제는 열경화성 수지 또는 열가소성 수지를 포함하는 수지계, 고무계 및 페놀, 에폭시를 포함하는 혼합계로 분류된다. 그러나 유기 합성 접착제의 경우, 최근 유해 물질이 방출 되는 등의 문제가 발생하고 있다. 이는 특히 유기 용제 중 휘발성 유기용제의 사용 및 미반응 모노머의 휘발에 의한 것이다. 특히, 건축시 내장재에 사용되는 접착제의 경우, 포름알데히드 등의 유해 물질을 방출하지 않도록 규제가 강화되고 있는 실정이며, 이에 대하여 아교, 대두 단백질계, 탄닌계 접착제에 대한 개발이 이루어지고 있다.
"점착제"는 접착제의 한 종류로 볼 수 있으며, 접착제에 한 부분으로 가하여주는 압력(지압)만으로도 피착재에 충분히 접착하며 접착제에 비하여 응집력이 낮고 응력 완화가 빠르며 외력에 대해서 쉽게 변형이 가능한 점탄성적인 거동을 나타내는 물질을 말한다. 점착제에 사용되는 원료는 천연 고무, 합성 고무, 아크릴 및 실리콘 등의 열가소성 수지로, 대부분 탄성을 가지는 것이 특징이다. 이와 같이, 점착제는 접착제와는 달리 여러 번 반복하여 사용하여도 접착력을 유지할 수 있는 특징을 가지며, 끈적끈적하게 달라붙는 성질을 가지고, 이를 점착성(stickiness)이라고 한다.
실란트(Sealant)와 지혈제(hemostats)를 포함하는 조직 접착제 분야의 연구개발은 빠르게 성장하고 있다. 1998년 미 FDA에서 피브린 실란트(Fibrin sealant)가 허가되면서, 매년 새로운 조직 접착제들이 끊임없이 개발되고 있다. 이러한 조직 접착제는 기존에 외과적 또는 내과적 수술에서 사용되고 있는 봉합술, 클립술, 뜸술과 같은 기술을 대체할 수 있는 소재로 각광을 받고 있다.
봉합술 등과 같은 기존의 외과적인 기술은 강한 신장력(strong tensile strength)를 가지지만, 환자의 고통 유발 및 시술 후 제거 등의 문제를 가지고 있다. 반면, 조직 접착제는 빠른 접착시간, 간편한 사용, 시술 후 제거 불필요 등 수 많은 장점을 가지고 있지만 낮은 접착성 및 신장력(low adhesiveness and tensile strength)와 수분 존재 하에서 접착성이 현저히 떨어지는 제한점을 가지고 있다. 이러한 조직 접착제의 한계점을 극복하기 위한 연구가 지속되고 있다.
조직 접착제는 조직에 직접 접촉하므로 생체적합성이 요구된다. 또한, 의료용 접착제의 경우에는 통상적으로 생체 내에서 사용되기 때문에 접착이 본질적으로 체액과 혈액 중으로 흘러 들어가면 생체가 직접 관여하므로, 보다 엄격한 조건으로 독성과 위해성이 없어야 하고, 보다 엄밀한 생체 적합성과 생분해성 소재가 요구된다.
일반적으로 조직 접착제는 피부, 혈관, 소화기, 뇌신경, 성형외과, 정형외과 등의 여러 영역에서 사용되기 때문에 각각 다른 특성이 필요하지만 주로 다음과 같은 특징이 요구된다. 즉, 1) 수분이 존재하는 경우에도 상온, 상압에서 빠르게 접착해야 하고, 2) 독성이 없어야 하고, 멸균이 가능해야 하고, 3) 창상면에 밀착하여 충분한 기계적 강도를 유지해야 하고, 4) 생분해성이고 지혈효과 가능해야 하며, 5) 생체 치유에 효과가 있어야 한다.
현재 상용화 또는 실용화되고 있는 조직 접착제는 크게 시아노아크릴레이트 순간 접착제, 피브린 글루, 젤라틴 글루 및 폴리우레탄계 등이 있다. 시아노아크릴레이트 순간 접착제는 최근 들어 고기능성 및 고성능을 갖는 순간 접착제의 연구에서 각광을 받고 있다. 특히, 생체적합성, 유연성 및 저독성의 생체 조직봉합용 의료용 순간접착제는 지혈, 항균 효과뿐만 아니라 봉합사의 대체도 가능하기 때문에 선진국을 중심으로 연구가 활발히 진행되고 있다.
이러한 시아노아크릴레이트 계열 조직 접착제는 현재 더마본드(Dermabond; Johnson&[0007] Johnson)와 인더밀(Indermil; US Surgical) 등의 제품으로 상용화되어 있다. 이러한 시아노아크릴레이트 계열 조직 접착제는 단일물질로 짧은 시간에 실온에서 개시제 없이 수분에 의해서 경화되고 외관이 투명하고 접착강도가 큰 장점이 있지만, 충격에 약하고 내열성이 떨어지는 단점을 가지고 있다. 또한, 독성이 심해서 현재는 거의 사용되지 않으며 미국을 제외한 다른 국가에서 임상에서 부분적으로 사용하고 있지만 일부 조직 독성과 취약성 때문에 사용이 제한되고 있다.
또, 피브린 글루 접착제는 최초 1998년 미국 FDA에 의하여 심장외과에 응용이 허가되었다. 그 이후, 피브린조직 접착제에 대한 연구 개발이 활발하게 이루어졌으며, 현재 Tisseel VH (Baxer)와 EvicelTM(Johnson&Johnson) 등과 같은 제품들이 상용화되어 있다.
피브린계 조직 접착제는 시아노아크릴레이트 계열과 함께 조직 접착제 시장의 거의 대부분을 차지하고 있다.
피브린 조직 접착제는 피브린의 가교 반응을 이용하여 피브리노겐, 트롬빈, 염화칼슘 및 선용 효소의 저해제를 조직 접착제로서 말초신경의 봉합, 미소 혈관의 봉합 등에 적용하여 봉합의 대용 또는 보강을 위한 임상응용이 실시되고 있다.
이러한 피브린 글루 접착제는 접착부위의 수분에 영향을 받지 않고 빠르게 접착하고 혈소판과 응고장해가 없고 생체적합성이 우수한 장점을 가지고 있다. 하지만, 접착력이 약하고 생분해속도가 빠르며 감염의 위험있는 제한점을 가지고 있다.
또, 젤라틴 글루는 생체 유래의 조직 접착제로 젤라틴-레조시놀-포르말린(GRF)으로 가교시킨 것이 개발되었다.
그 외에서 젤라틴-글루타알데하이드와 같은 조직접착제가 개발되었으나, 조직 접착성은 높지만, 가교제로 사용되는 포르말린이나 글루타알데하이드이 생체 내의 단백질과도 가교 반응을 일으켜 조직 독성을 일으키는 단점을 가지고 있다.
또, 폴리우레탄계 접착제는 경화 후 접합부의 유연성이 유지되는 탄성 접착제 형태로 개발되었다. 이 접착제는 생체 조직 표면의 물을 흡수하여 조직과의 밀착성을 높이고, 물과 반응하여 수분 이내에 경화하며, 경화물이 유연성을 가지는 것이 특징이며, 경화된 접착제가 적절히 생분해되는 장점을 가지고 있다. 하지만, 합성원료인 방향족 디아이소시아네이트가 생체 독성이 있다는 단점을 가지고 있다.
기존에 개발된 조직 접착제들은 고분자 또는 가교제의 독성과 약한 접착력 등의 문제점을 아직 가지고 있는 상황이다. 이러한 문제를 극복하고자 최근에는 홍합유래 단백질인 3,4-디하이드록시페닐-L-알라민(도파)을 이용한 조직 접착제 개발에 대한 연구가 진행되고 있다.
도파 물질은 홍합의 족사에 존재하는 족사 단백질(foot protein)에서 유래된 것으로, 족사 단백질에 존재하는 티로신(tyrosine)이 폴리페놀 산화제(polyphenol oxidase)에 의하여 수화되어 얻어지는 아미노산이다. 이 물질은 친수성 표면과 매우 강한 수소 결합을 형성할 수 있으며, 금속이나 반금속 등과도 강한 배위 결합을 할 수 있는 특징을 갖는다. 또한, 도파 잔기는 도파-퀴논 형태로 산화되면서 단백질 분자들의 가교를 도모하게 된다.
도파를 이용한 조직 접착제는 현재 Cell-TakTM(BDBioscienceClontech)과 MAPTM[0015] (SwedishBioScienceLab.) 제품으로 상업화되어 있다. 하지만 이러한 제품들은 1그램의 홍합의 족사 단백질을 얻기 위하여 10,000개의 홍합이 요구되게 된다. 이러한 문제로 인한 낮은 추출 수득률과 높은 생산가로 인하여 세포나 조직 배양 접착제로만 사용되는 제한점을 가지고 있다.
USPTO 데이터베이스에서 검색한 바에 따르면, 요약 및 청구의 범위에 키토산 및 접착제를 포함하는 특허는 단지 14개가 출원되었다. 이들 특허의 대부분은 제지 산업에 관한 것이다. 미국 특허 제5,773,033호는 피브리노겐/키토산 지혈제를 개시하나, 조직 접합에 사용하기 위한 것은 아니다. 발명의 명칭이 "생물학적 조직용 접착제(Adhesive for Biological Tissue)"인 미국특허 제6,329,337호는 재조합 사람 혈장 단백질 및 2(please delete) 양방작용성 또는 다작용성 알데하이드로부터 제조된 글루 제제를 개시한다. 키토산은 용액의 접도를 향상시키기 위한 제제에, 또는 양방작용성 또는 다작용성 알데하이드와의 가교결합제로서 사용되었다. 미국 특허 제5,496,872 호는 잠재적인 제제의 상당히 총망라한 열거 중에 키토산을 개시하였으나, 결합하는 티올, 카르복실산 및 라디칼에 의존적이다. 미국 특허 제6,200,595호는 잠재적인 의학 접착제로서 사용하기 위한, 키토산을 포함하는 다가양이온성 기질과 다가음이온성 기질의 조합을 개시하였다. 이 특허에서 접합력은 70 g-f/cm2을 넘지 않는 것으로 보고되었다. 또한, 이 발명은 두 성분을 사용 직전에 혼합할 필요가 있다. 미국 특허 제6,991,652호는 세포 성장을 위한 매트릭스로서 사용될 많은 잠재적인 물질의 열거 중 하나로 키토산을 개시하였다.
문헌을 조사하여, 정제 단계로서 및 공첨가제를 도입하는 수단으로서 키토산의 투석을 사용하였음이 밝혀졌다.
예를 들어, 미국 특허 제6,310,188호는 키토산의 투석을 이용하여 저분자량 화합물을 제거한다.
많은 시스템이 조직 접착제의 분야의 사용에 고려되었으나, 현재 유용한 시스템들은 독성, 불충분한 강도, 또는 사용의 어려움을 포함하는 결합을 겪는다. 따라서, 멸균 및 사용이 편리한 형태로 제공할 수 있는 안전하고 효과적인 조직 접착제인 추가적인 조성물이 해당 분야에 필요하다. 이러한 고도로 접착성인 조성물은 또한 약물송달에 상당한 이점을 제공한다. 미용 및 재건 외과 수술에 사용하기 위한 충전제, 벌킹 조성물, 또는 재건 조성물을 제공하는, 고도로 수화된 채로 남아있는 조성물이 또한 해당 분야에 필요하다.
(대한민국공개특허) 10-2008-0110274 (미국등록특허) 6,310,188 (미국등록특허) 6,991,652
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자는 인체에 무해한 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)에 카테콜기를 결합시킨 화합물과 폴락소머(polaxamer)의 양 말단에 타올기를 결합시킨 화합물을 포함하는 생체적합성 및 기계적 강도가 우수하고 온도 감응적인 우수한 조직 접착력을 갖는 접착성 하이드로젤을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)에 카테콜기를 결합시킨 화합물과 폴락소머(polaxamer)의 양 말단에 타올기를 결합시킨 화합물을 포함하는 접착성 하이드로젤을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)에 카테콜기를 결합시킨 화합물과 폴락소머(polaxamer)의 양 말단에 타올기를 결합시킨 화합물을 포함하는 접착성 하이드로젤을 의료용 접착제(bioadhesive), 유착방지제 및 표면 흡착 방지제용 소재로 응용하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)에 카테콜기를 결합시킨 화합물과 폴락소머(polaxamer)의 양 말단에 타올기를 결합시킨 화합물을 포함하는 접착성 하이드로젤의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (ⅰ) 카테콜기가 결합된 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)및 (ⅱ) 말단에 티올기가 결합된 폴락소머(polaxamer)를 포함하는 접착성 하이드로젤 조성물을 제공한다.
키토산은 새우, 랍스터, 및 게를 포함하는 갑각류의 외골격으로부터의 키틴을 부분적으로 탈아세틸화하여 유도된 양이온성 다당류이다. 키토산의 화학적 성질은 탈아크릴화된-(1,4)-N-아세틸-D-글루코사민 중합체로서 잘 설명된다. 키토산의 접착 성질은 일부 경우에 대해 알려져 있다. 그러나, 현재까지, 키토산에 기초한 접착제 제품은 전혀 생산된 적이 없다. 이는 키토산이 진한 산성 용액에서 녹는 성질로 인한 취급이 어려운 점과, 조직과 신속하게 접합하는 형태로 송달하기 어렵다는 데에 대부분 기인한다.
본 발명에서 기재하는 카테콜기는 하기 화학식 1로 표시되며;
[화학식 1]
Figure pat00001
카테콜기가 결합된 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)은 분자량이 10,000 Da 내지 1,000,000 Da 인 것을 특징으로 하고, 보다 바람직하게는 분자량이 50,000 Da 내지 200,000 Da인 것을 사용하는 것이 하이드로젤의 안정성 및 접착력 측면에 있어서 가장 바람직하다.
상기 카테콜기가 결합된 폴리아민(polyamine)은 구체적으로 에틸렌 다이아민(ethylene diamine), 1,3-다이아미노프로판(1,3-diaminopropane), 헥사메틸렌다이아민(hexamethylenediamine), 테트라에틸메틸렌다이아민(tetraethylmethylenediamine), 푸트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), 선형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, linear), 가지형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, branched), 폴리라이신(ε-poly-L-lysine) 및 폴리(알릴아민 수화염화물) (poly(allylamine hydrochloride))으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것이고, 보다 바람직하게는 선형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, linear), 가지형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, branched) 및 폴리라이신(ε-poly-L-lysine) 및 폴리(알릴아민 수화염화물) (poly(allylamine hydrochloride))으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것이지만, 이에 제한되지는 않는다.
폴락소머(polaxamer)는 온도감응성 고분자로써, 저온에서는 액체 상태이고, 체온에 이르러는 고체상태가 되는 온도 민감성 고분자로 주사형 물질로 적절히 사용되고 있다.
본 발명에서 기재하는 폴락소머(polaxamer)는 하기 화학식 2로 표시되는 플루로닉과 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 테트로닉인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조성물이다. 플루로닉은 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)의 구조를 갖는 블록코폴리머로, 구체적인 예로는 F로시작하는 F38, F68, F77, F77, F98, F108, F127 유도체와, L로 시작하는 L31, L42, L43, L44, L62, L72, L101 유도체와, P로 시작하는 P75, P103, P104 유도체가 포함되며, 테트로닉은 에틸렌다이아민(ethylene diamine) 말단에 폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)가 4방향으로 관능기화 되어 있는 블록코폴리머로, 구체적인 예로는 1107, 1307, 130r2, 150r1, 304, 701, 702, 704, 901, 904, 908, 90r4이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 2]
Figure pat00002
상기 화학식 2에서,
상기 a는 2 내지 200의 정수이고;
상기 b는 10 내지 100의 정수이며;
바람직하게는 상기 a는 2 내지 141의 정수이고;
상기 b는 16 내지 69의 정수이며;
a와 b는 1:9 내지 8:2의 비율로 존재한다.
[화학식 3]
Figure pat00003
상기 화학식 3에서,
상기 a는 2 내지 600의 정수이고;
상기 b는 10 내지 150의 정수이며;
바람직하게는 상기 a는 10 내지 455의 정수이고;
상기 b는 17 내지 116의 정수이며;
a와 b는 1:9 내지 9:1의 비율로 존재한다.
상기 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 또는 말단에 티올기가 결합된 테트로닉은 분자량이 500 Da 내지 500,000 Da인 것을 사용하는 것이 미셸 형성 후 밀접하게 패킹하는 측면과 카테콜기가 결합된 키토산과의 안정한 화학적 결합을 할 수 있다는 면에 있어서 가장 바람직하다.
본 발명은 키토산 또는 폴리아민에 카테콜기를 결합시키고, 폴락소머의 양 말단에 티올기를 결합시킴으로써 본 발명에 따른 접착성 하이드로젤은 기존의 생체접착용 하이드로젤에 비해 온도에 감응하는 특성과 최소 1 kPa 이상의 탄성계수, 생체 내외에서의 안정성 및 빠르고 강한 접착력 측면에 있어서 우수한 효능을 가지게 된다.
아울러, 본 발명의 접착제 조성물은 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 저급 알코올은 알코올 분자 중에 포함된 탄소 수에 따라 탄소수가 적은(탄소수 1 내지 6) 알코올을 의미하며, 저급 알코올은 물에 용해되나, 전리되지 않고, 이온이 발생하지 않는 중성 물질이며, 알코올의 OH기는 염기의 OH기와는 성질이 달라 알칼리성을 나타내지 않는다. 상기 저급 알코올에 속하는 것으로서, 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 에탄올, 노르말프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아밀알코올, 노르말아밀알코올, 이소아밀알코올, 노르말헥실알코올이 있으며, 본 발명의 접착제 조성물의 저급 알코올로서 바람직하게는 에탄올이 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 접착제 조성물에는 그 물성의 개선을 위한 첨가제 등을 사용할 수 있으며, 상기 첨가제는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
'접착'이란 통상적인 의미로서, 시간의 경과에 따라 초기 시간에 고화되어 탄성이 없는 상태가 되고, 다시 떨어질 경우 재 부착이 어려운 것이나, 본 발명에서의 "접착"은 "점착"을 포함하는 의미이며, "점착"이란 점탄성의 특성이 유지된 상태의 형태로 압력에 의해서 쉽게 붙을 수 있고, 떨어진 후에도 여러 번 재 접착이 가능한 것을 말한다. 본 발명의 접착제 조성물은 점착제로서의 특성을 가지고 있다.
본 발명의 접착제 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 전체 조성물 중 카테콜기가 결합된 키토산 0.1 내지 20 중량%, 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 3 내지 50 중량% 및 물, 저급알코올 또는 이들이 혼합물 35 내지 90 중량%로 포함한다. 보다 바람직하게는 카테콜기가 결합된 키토산 0.5 내지 10 중량%, 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 8 내지 20 중량% 및 물, 저급알코올 또는 이들이 혼합물 75 내지 90 중량%로 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는 카테콜기가 결합된 키토산 0.5 내지 4 중량%, 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 10 내지 18 중량% 및 물, 저급알코올 또는 이들이 혼합물 80 내지 85 중량% 로 포함하는 것이 접착제의 안정성 및 접착력, 그리고 사용의 측면에 있어 주입이 용이하다는 면에 있어서 가장 좋다.
본 발명에 있어서 하이드로젤 조성물은 치료용 약물을 더 포함할 수 있다.
하이드로젤 조성물에 더 포함될 수 있는 치료용 약물로는 난용성약물, 치료용 펩티드, 단백질 또는 항체를 포함하는 약물로써 인간성장호르몬, 에리트로포이에틴, 인터페론, 인슐린, 인터류킨, 칼시토닌, G-CSF, Angiopoietin, VEGF-Trap, 단일클론 항체, 항체단편을 포함할 수 있고, 지혈단백질, 항생제, 진통제가 하이드로젤 조성물에 더 포함될 수 있으며, 혀밑으로 응급투여가 필요한 협심증치료제, 천식 및 알러지비염 설하면역치료로 사용되는 allergen extract, 항히스타민, 항알러지제를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 접착제 조성물을 포함하는 의료용 접착제에 관한 것이다.
의료용 접착제(medical adhesive)는 넓은 의미에서는 의료 용구의 포장으로부터 외과용 점착, 접착 및 지혈에 이르기까지 광범위한 분야에 적용될 수 있는 것으로, 생체 적합성이 있어 피부에 직접 사용이 가능하고, 통상적으로는 생체 내에서 사용될 수 있도록 생체에 직접 관여시에도 독성과 위해성이 전혀 없는 접착제를 말한다. 의료용 접착제로 사용되기 위해서는 생체 적합성 외에도 생분해성, 수분 저항성, 멸균성, 비독성 및 지혈 효과를 가져야 하며 생체의 치유에 방해가 되지 않아야 한다. 본 발명의 접착제는 의료용 접착제로서의 용도를 가지며, 상기 용도에는 점착제로서의 용도를 포함한다. 보다 상세하게는 수술용 접착성 지혈제 및 대장 절개 후 봉합용 의료접착제로서 생체에 사용이 가능하다.
또한 본 발명은 상기 접착용 조성물을 포함하는 의료용 유착방지제에 관한 것이다.
유착방지제(Anti-adhesive agent)는 유착이 예상되는 부위에 일정기간 물리적인 장벽으로 남아 인접한 조직 사이에 유착이 형성되는 것을 막아주는 역할을 하는 물질을 말한다. 따라서 유착방지제는 일정기간 후에는 분해 혹은 생체 내에 흡수되어 이물질로 남지 않아야 한다. 본 발명의 접착용 조성물은 외과적 수술 후 유발될 수 있는 유착을 방지하는 유착방지제 제조 시 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 접착용 조성물을 포함하는 표면 흡착 방지제에 관한 것이다.
또한 본 발명은
(ⅰ) 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민을 제조하는 단계;
(ⅱ) 티올기가 결합된 폴락소머를 제조하는 단계;
(ⅲ) 완충용액에 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민을 녹여 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액을 제조하는 단계;
(ⅳ) 완충용액에 티올기가 결합된 폴락소머를 녹여 티올-폴락소머 용액을 제조하는 단계;
(ⅴ) 단계(ⅲ)의 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액과 단계(ⅳ)의 티올-폴락소머 용액을 혼합하여 접착성 하이드로젤 용액을 제조하는 단계; 및
(ⅵ) 단계(ⅴ)의 접착성 하이드로젤 용액을 젤화 시키는 단계;를 포함하는 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 단계별로 설명한다.
상기 단계(ⅰ)의 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민은
(a) 증류수 100 중량부에 대하여 키토산 또는 폴리아민 0.2 내지 5 중량부를 첨가하여 키토산 또는 폴리아민 용액을 제조하는 단계;
(b) 증류수 100 중량부에 대하여 하이드로카페익산 1 내지 5 중량부 및 1-에틸-3- (3-다이메틸아미노-프로필)-카르보이미드 하이드로클로라이드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimide hydrochloride; EDC) 2 내지 10 중량부를 첨가하여 하이드로카페익산 용액을 제조하는 단계;
(c) 단계(a)의 키토산 또는 폴리아민 용액과 단계(b)의 하이드로카페익산용액을 1:1 내지 3:1의 부피비로 혼합 및 교반하여 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민 혼합물을 제조하는 단계; 및
(d) 단계(c)의 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민 혼합물을 투석막을 이용하여 완충용액에서 6 내지 48시간 투석하고, 3차 증류수를 이용하여 4 내지 12시간 투석하여 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민을 정제하여 건조하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
상기 단계(d)에서 사용되는 완충용액은 pH 4.5 내지 5.5 인것을 특징으로 한다. pH가 4.5 미만으로 낮을 경우 최종 제품 면에 있어서 염산의 함량이 증가될 수 있고, pH가 5.5를 초과하여 높을 때에는 카테콜이 산화되어 발생하는 반응이 진행 될 수 있다.
상기 당계(d)에서 완충용액에서 투석하는 시간은 24 내지 36시간 수행하는 것이 더 바람직하다.
상기 카테콜기가 결합된 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)은 분자량이 10,000 Da 내지 1,000,000 Da 인 것을 특징으로 하고, 보다 바람직하게는 분자량이 50,000 내지 200,000 Da 인 것을 사용하는 것이 하이드로젤의 안정성 및 접착력 측면에 있어서 가장 바람직하다.
상기 카테콜기가 결합된 폴리아민(polyamine)은 구체적으로 에틸렌 다이아민(ethylene diamine), 1,3-다이아미노프로판(1,3-diaminopropane), 헥사메틸렌다이아민(hexamethylenediamine), 테트라에틸메틸렌다이아민(tetraethylmethylenediamine), 푸트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), 선형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, linear), 가지형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, branched), 폴리라이신(ε-poly-L-lysine) 및 폴리(알릴아민 수화염화물) (poly(allylamine hydrochloride))으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것이고, 보다 바람직하게는 선형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, linear), 가지형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, branched), 폴리라이신(ε-poly-L-lysine) 및 폴리(알릴아민 수화염화물) (poly(allylamine hydrochloride))으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것이지만, 이에 제한되지는 않는다.
상기 단계(ⅰ)의 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민의 제조는 pH5 내지 5.5의 조건 하에서 이루어지는 것을 특징으로 한다. 반응을 수행하는 데 있어서 pH가 너무 낮으면 키토산의 용해도가 높아져서 용이하게 되나 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노-프로필)-카르보이미드 하이드로클로라이드의 가수분해가 가속화되어 전환율이나 수율 측면에 있어서 불리하게 되고, pH가 너무 높으면 키토산의 용해도가 떨어져서 침전이 발생하고, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노-프로필)-카르보이미드 하이드로클로라이드의 가수분해가 가속화되어 전환율이나 수율 측면에 있어서 단점을 수반하게 된다.
상기 단계(ⅱ)의 티올기가 결합된 폴락소머는
(1) 비극성 유기용매 100중량부에 대하여 폴락소머 5 내지 15 중량부 및 비극성유기용매 100부피부에 대하여 트리에틸아민 0.1 내지 1 부피부를 첨가하여 폴락소머 용액을 제조하는 단계;
(2) 비극성 유기용매 100중량부에 대하여 니트로 페닐 클로로포메이트 5 내지 20 중량부를 첨가하여 니트로 페닐 클로로포메이트 용액을 제조하는 단계;
(3) 단계(1)의 폴락소머 용액과 단계(2)의 니트로 페닐 클로로포메이트 용액을 5:1 내지 10:1의 부피비로 혼합 및 교반하여 폴락소머 혼합 용액을 제조하는 단계;
(4) 단계(3)의 폴락소머 혼합 용액을 침전 및 건조하여 폴락소머 혼합물을 제조하는 단계;
(5) 비극성 유기용매와 극성용매의 혼합액 100중량부에 대하여 단계(4)의 폴락소머 5 내지 20 중량부 및 시스티아민 0.2 내지 5중량부 첨가 및 교반하여 티올기가 결합된 폴락소머 혼합액을 제조하는 단계;
(6) 단계(5)의 티올기가 결합된 폴락소머 혼합액을 침전 및 건조하여 티올기가 결합된 플루로닉 혼합물을 제조하는 단계; 및
(7) 단계(6)의 티올기가 결합된 폴락소머 혼합물을 투석막을 이용하여 증류수에서 12 내지 120 시간 투석하여 티올기가 결합된 플루로닉을 정제하여 건조하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
상기 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 또는 말단에 티올기가 결합된 테트로닉은 분자량이 0.5 kDa 내지 500 kDa인 것을 사용하는 것이 미셸 형성 후 밀접하게 패킹하는 측면과 카테콜기가 결합된 키토산과의 안정한 화학적 결합을 할 수 있다는 면에 있어서 가장 바람직하다.
상기 단계(ⅲ)의 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액은 완충용액 100중량%에 대하여 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민 0.1 내지 10 중량%를 첨가하고, 상기 단계(ⅳ)의 티올-폴락소머 용액은 완충용액 100중량%에 대하여 티올기가 결합된 폴락소머 3 내지 50 중량%를 첨가하여 제조된다.
상기 단계(ⅴ)의 접착성 하이드로젤 용액은 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액과 티올-폴락소머 용액을 1 : 3 내지 3 : 1의 부피비로 혼합하여 제조되는 것이 사용의 편리성과 반응의 안정성 측면에 있어서 가장 좋다. 티올-폴락소머 용액 대비 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액이 본 발명의 범주보다 소량 첨가되었을 때 높은 농도의 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액이 pH 조건 6.5 이상에서 자가조립되어 자극 없이 하이드로젤을 형성할 수 있다는 점과 온도감응성이 떨어지는 단점이 발생할 수 있고, 티올-폴락소머 용액 대비 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액이 너무 과량 첨가되었을 때에는 높은 농도의 티올-폴락소머 용액에 의해 부분적 용해가 발생할 수 있으며, 이로 인해 온도 감응성이 떨어지는 점에 있어서 단점이 발생할 수 있다.
상기 단계(ⅵ)의 접착성 하이드로젤 용액을 젤화는 4 내지 37℃ 의 온도에서 수행되는 것이 사용의 편리성과 생체의 특성을 이용한다는 측면에 있어서 가장 바람직하다. 4℃ 미만의 온도에서 젤화 현상이 발생하면, 냉장상태에서도 하이드로젤이 형성되므로 주입 불가능하고, 37℃를 초과하는 고온에서 젤화 현상이 발생하면, 생체 온도 37℃를 초과하게 되므로 주입시 생체 내에서 젤이 형성되지 않고 확산되는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 생체 내외에서의 안전성을 갖고, 온도 감응적이며, 지혈효과가 우수 하여 생체 접착제로서 의료용 접착제, 유착 방지제 및 표면 흡착 방지제에 응용이 용이하다.
도 1은 조직접착, 온도감응성, 그리고 용시젤화 특성을 가진 카테콜기가 결합된 키토산 및 말단에 티올기가 결합된 플루로닉을 포함하는 접착성 하이드로젤의 모식도이다.
도 2는 제조예 1에서 제조된 카테콜기가 결합된 키토산을 핵자기공명분광법으로 측정한 스펙트럼이다.
도 3은 제조예 2에서 제조된 양말단에 티올기가 결합된 플루로닉을 핵자기공명분광법으로 측정한 스펙트럼이다.
도 4는 비교시험예3 내지 9 및 시험예7를 통해 측정한 하이드로젤의 접착력에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 비교시험예 10, 11, 대조군 및 시험예8을 통하여 측정한 하이드로젤의 지혈효과에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 이는 발명의 구성 및 효과를 이해시키기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[제조예 1] 카테콜가 결합된 키토산의 제조
키토산(키토산 300) 0.5g을 0.1 M HCl용액 50 ml에 녹여 1 M NaOH를 이용하여 pH가 5를 유지할 수 있도록 조절한 키토산 용액을 만들었다. 하이드로카페익산(3,4-dihydroxy hydrocinnamic acid, Sigma-Aldrich) 591.0mg과 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, Sigma-Aldrich) 1244.9mg을 25ml의 3차 증류수에 녹이고, 키토산 용액에 천천히 넣어주었다. 반응이 진행되는 동안 pH가 5.5 이하가 되도록 pH를 모니터링하고 12시간 동안 상온에서 반응시켰다. 투석막(MWCO: 12,000-14,000, SpectraPor)을 이용하여 pH 5 조건에서 2일 동안 투석을 하고, 4시간 동안 3차 증류수에서 투석을 실시하였다. 투석이 완료된 물질은 동결건조 후 수분이 없는 데시케이터에 보관하였다. 핵자기 공명 분광법 및 자외선-가시광선 분광광도계를 이용하여 카테콜 결합율을 확인하였다. 카테콜기가 결합된 키토산을 핵자기 공명 분광법을 통하여 확인한 그래프를 하기 도 2에 나타내었으며, 키토산 한 분자당 카테콜의 결합율은 9.9% 임을 확인하였다.
[제조예 2] 말단에 티올기가 결합된 폴락소머(polaxamer)의 제조
플루로닉(Pluronic F-127) 10g을 메틸렌 클로라이드 70 ml에 녹이고, 221.2 μl의 트리에틸아민을 첨가하여 플루로닉 용액을 제조하였다. 제조된 플루로닉 용액을 니트로 페닐 클로로포메이트 (p-nitrophenyl chloroformate) 989.5 mg이 녹아있는 메틸렌 클로라이드 용액 10ml에 천천히 넣어주고 24시간 동안 상온에서 교반한 뒤 증발기를 이용하여 용매의 부피를 40 ml 만큼 되도록 줄여주었다. 생성물을 디메틸 이써를 이용하여 침전시킨 후 감압 건조하여 파우더 형태의 활성화된 플루로닉을 제조하였다. 활성화된 플루로닉 5 g을 메틸렌 클로라이드 20 ml에 녹이고, 시스티아민 423.4 mg을 메틸렌 클로라이드와 에탄올을 1:1의 부피비로 혼합한 용액 30ml에 녹이고, 두 용액을 섞어 주어 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 교반 후 생성물을 디메틸 이써를 이용하여 침전시킨 후 감압 건조하여 파우더 형태로 만들었고, 3차 증류수에 녹여 막(MWCO: 3,500, SpectraPor)을 이용한 투석을 96시간 동안 실시하고, 합성 및 정제된 물질은 동결건조 후 수분이 없는 데시케이터에 보관하였다. 핵자기 공명 분광법을 이용하여 플루로닉에 대한 티올기 결합율을 측정하였다.
티올기가 결합된 플루로닉을 핵자기 공명 분광법을 통하여 확인한 그래프를 하기 도 3에 나타내었으며, 플루로닉 한 분자당 티올기의 결합율은 78% 임을 확인하였다.
[실시예 1] 카테콜기가 결합된 키토산/말단에 티올기가 결합된 플루로닉 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 카테콜가 결합된 키토산 0.1g을 pH 7.4 PBS(Phosphate buffered saline) 완충용액 10g에 녹여서 키토산용액을 만들었고, 상기 제조예 2에서 제조된 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 2.4g을 pH 7.4 PBS(Phosphate buffered saline) 완충용액 10g에 녹여서 플루로닉용액을 만들었다. 상기 키토산용액 5g과 플루로닉용액 5g을 혼합하여 하이드로젤 용액을 제조하였다.
기존에 보고된 바이알 틸팅 (vial tilting) 기법을 활용하여 0℃부터 90℃까지 온도를 1℃씩 올려주어 젤화 현상을 확인하였다. 그 결과 4℃ 내지 37℃에서 5분 동안 육안으로 확인하여 움직임이 없는 상태의 젤 상태가 된 하이드로젤을 제조하였다.
[실시예 2] 카테콜기가 결합된 키토산/말단에 티올기가 결합된 플루로닉 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 카테콜가 결합된 키토산 0.1g을 pH 7.4 PBS(Phosphate buffered saline) 완충용액 10g에 녹여서 키토산용액을 만들고, 상기 제조예 2에서 제조된 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 3.2g을 pH 7.4 PBS(Phosphate buffered saline) 완충용액 10g에 녹여서 플루로닉용액을 만든 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
[실시예 3] 카테콜기가 결합된 키토산/말단에 티올기가 결합된 플루로닉 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 카테콜가 결합된 키토산 0.2g을 pH 7.4 PBS(Phosphate buffered saline) 완충용액 10g에 녹여서 키토산용액을 만들고, 상기 제조예 2에서 제조된 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 2.4g을 pH 7.4 PBS(Phosphate buffered saline) 완충용액 10g에 녹여서 플루로닉용액을 만든 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
[실시예 4] 카테콜기가 결합된 키토산/말단에 티올기가 결합된 플루로닉 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 카테콜가 결합된 키토산 0.2g을 pH 7.4 PBS(Phosphate buffered saline) 완충용액 10g에 녹여서 키토산용액을 만들고, 상기 제조예 2에서 제조된 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 3.6g을 pH 7.4 PBS(Phosphate buffered saline) 완충용액 10g에 녹여서 플루로닉용액을 만든 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
[비교예 1］키토산 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 카테콜기가 결합된 키토산 및 상기 제조예 2에서 제조된 말단에 티올기가 결합된 플루로닉을 사용하지 않고 키토산(키토산 300)을 사용하는 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
[비교예 2] 카테콜기가 결합된 키토산 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 말단에 티올기가 결합된 플루로닉을 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
[비교예 3］플루로닉 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 카테콜기가 결합된 키토산 및 상기 제조예 2에서 제조된 말단에 티올기가 결합된 플루로닉을 사용하지 않고 플루로닉(Pluronic F-127)을 사용하는 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
[비교예 4] 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 카테콜가 결합된 키토산을 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
[비교예 5] 키토산/플루로닉 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 카테콜기가 결합된 키토산 대신에 키토산(키토산 300)을 사용하고, 상기 제조예 2에서 제조된 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 대신에 플루로닉(Pluronic F-127)을 사용하는 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
[비교예 6] 키토산/말단에 티올기가 결합된 플루로닉 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 카테콜기가 결합된 키토산 대신에 키토산(키토산 300)을 사용하는 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
[비교예 7] 카테콜기가 결합된 키토산/플루로닉 조성의 하이드로젤의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 말단에 티올기가 결합된 플루로닉 대신에 플루로닉(Pluronic F-127)을 사용하는 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
[시험예 1] 하이드로젤의 생체 외 침식 측정
시간에 따른 하이드로젤의 침식 정도를 측정하기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 하이드로젤 1 ml를 2 ml 튜브에 담고,pH 7.4 PBS 1 ml를 넣어 준 뒤 남아있는 하이드로젤의 질량을 초기 하이드로젤의 질량과 비교하여 침식도를 측정하였다. 하이드로젤의 침식은 하이드로젤의 안정성을 의미하며, 침식이 빠르게 발생하면 단기간의 치료가 필요한 경우 용이할 수 있고, 하이드로젤의 침식이 느리다면 장기간의 치료가 필요한 경우 용이할 수 있다. 실시예 1에서 제조한 하이드로젤의 경우 12시간 이후 질량비로 100%가 남아있었으며, 1일 뒤 100%, 2일 뒤 94.43%, 7일 뒤 80.09%, 14일 뒤 72.02%, 31일 뒤에 66.83%가 남아 있었다.
[시험예 2] 하이드로젤의 생체 외 침식 측정
상기 실시예 2에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 1과 동일하게 수행하여 결과를 확인하였다. 12시간 이후 질량비로 100%가 남아있었으며, 1일 뒤 100%, 2일 뒤 100%, 7일 뒤 100%, 14일 뒤 100%, 31일 뒤에 100%가 남아 있었다.
[시험예 3] 하이드로젤의 생체 외 침식 측정
상기 실시예 3에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 1과 동일하게 수행하여 결과를 확인하였다. 12시간 이후 질량비로 100%가 남아있었으며, 1일 뒤 100%, 2일 뒤 100%, 7일 뒤 95.91%, 14일 뒤 64.76%, 31일 뒤에 27.30%가 남아 있었다.
[시험예 4] 하이드로젤의 생체 외 침식 측정
상기 실시예 3에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 1과 동일하게 수행하여 결과를 확인하였다. 12시간 이후 질량비로 100%가 남아있었으며, 1일 뒤 100%, 2일 뒤 100%, 7일 뒤 100%, 14일 뒤 80.26%, 31일 뒤에 42.33%가 남아 있었다. 상기 시험예 1 내지 4를 통하여 본 발명에 따른 하이드로젤은 카테콜기가 결합된 키토산 및 말단에 티올기가 결합된 플루로닉의 조성을 달리함으로써 침식도를 조절할 수 있음을 확인하였다.
[비교시험예 1] 하이드로젤의 생체 외 침식 측정
상기 비교예 3에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 1과 동일하게 수행하여 결과를 확인하였다. 12시간 이후 질량비로 60%가 남아있었으며, 1일 뒤 17%, 2일 뒤 4%, 7일 뒤 0%, 14일 뒤 0%, 31일 뒤에 0%가 남아 있었다.
[시험예 5] 하이드로젤의 생체 내 침식 측정
생체 내에서의 하이드로젤의 침식도를 측정하기 위해 쥐 피하 모델 (BALB/c, 21-23 g, 8w, M)을 도입하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 하이드로젤 500 μl을 쥐 피하에 주입한 후 시간에 따라 남아있는 하이드로젤의 질량을 초기 하이드로젤의 질량과 비교하여 침식도를 측정하였다. 생체 외에서의 침식 결과를 토대로 생체 내에서 하이드로젤의 안정성을 측정해 본 결과 실시예 1에서 제조한 하이드로젤의 경우 1일 뒤 질량비로 100%가 남아있었으며, 7일 뒤 100%, 14일 뒤 81.28%, 25일 뒤 75.04%가 남아 있었다.
[시험예 6] 하이드로젤의 생체 내 침식 측정
상기 실시예 2에서 제조된 하이드로젤을 사용한것을 제외하고는 상기 시험예 5와 동일하게 수행하여 결과를 확인하였다. 1일 뒤 질량비로 100%가 남아있었으며, 7일 뒤 100%, 14일 뒤 98.67%, 25일 뒤 97.45%가 남아 있었다.
시험예 5 및 6을 통하여 본 발명에 따른 하이드로젤은 카테콜기가 결합된 키토산 및 말단에 티올기가 결합된 플루로닉의 조성을 달리함으로써 침식도를 조절할 수 있으며, 생체 내에서도 우수한 안정성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
[비교시험예 2] 하이드로젤의 생체 내 침식 측정
상기 비교예 3에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 5와 동일하게 수행하여 결과를 확인하였다. 1일 뒤 질량비로 30%가 남아있었으며, 7일 뒤 0%, 14일 뒤 0%, 25일 뒤 0%가 남아 있었다.
[시험예 7] 조직 접착 특성 분석
조직 접착 특성을 분석하기 위하여 하이드로젤 홀더와 함께 150 N 로드 셀 (load cell)이 장착된 만능재료시험기 (UTM, universal testing machine)를 이용하였다. 먼저 쥐의 피하 조직을 6 mm 펀치를 이용하여 침샘검하였으며 이는 원통형 검출기에 시중에 판매되고 있는 순간접착제 (cyanoacrylate glue)를 이용하여 부착하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 하이드로젤 0.1g을 만능재료 시험기 판 위의 홀더에 위치시켰고, 피하 조직이 부착된 원통형 검출기를 0.1 mN의 힘으로 5분 동안 눌러 주었다. 홀더 부분의 온도는 37 ℃로 고정하였으며, 이를 당기면서 인장강도를 측정하였고, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
[비교시험예 3] 조직 접착 특성 분석
상기 비교예 1에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험에 7과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
[비교시험예 4] 조직 접착 특성 분석
상기 비교예 2에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험에 7과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
[비교시험예 5] 조직 접착 특성 분석
상기 비교예 3에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험에 7과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
[비교시험예 6] 조직 접착 특성 분석
상기 비교예 4에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험에 7과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
[비교시험예 7] 조직 접착 특성 분석
상기 비교예 5에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험에 7과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
[비교시험예 8] 조직 접착 특성 분석
상기 비교예 6에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험에 7과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
[비교시험예 9] 조직 접착 특성 분석
상기 비교예 7에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험에 7과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
[시험예 8] 지혈효과 분석
생체내에서의 지혈효과를 분석하기 위하여 쥐 (Normal SD rat, 185-200 g, 5w, M)의 복강을 절개하여 출혈상태에 있는 간 모델을 구축하였다. 먼저 수술대 위에 케타민 (Ketamine)을 이용하여 마취시킨 후, 개복하여 무게가 측정된 거름 종이를 파라필름 위에 올려놓고, 간 아래 쪽에 위치시킨다. 대조군으로는 18 G 주사기를 이용하여 간에 상처를 내어 흘리는 피의 양을 측정하고, 실험군으로는 18 G 주사기로 상처를 낸후, 즉시 상기 실시예 1에서 제조된 하이드로젤을 주입하여 흘린 피의 양을 측정하였고, 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.
[비교시험예 10] 지혈효과 분석
상기 비교예 2에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 8과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.
[비교시험예 11] 지혈효과 분석
상기 비교예 4에서 제조된 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 8과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.

Claims (19)

  1. (ⅰ) 카테콜기가 결합된 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)및 (ⅱ) 말단에 티올기가 결합된 폴락소머(polaxamer)를 포함하는 하이드로젤 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 카테콜기가 결합된 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)은 분자량이 10,000 Da 내지 1,000,000 Da 인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 카테콜기가 결합된 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)은 분자량이 50,000 내지 200,000인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 폴락소머(polaxamer)는 하기 화학식 2로 표시되는 플루로닉 또는 플루로닉과 구조적으로 유사한 양친성 트리블록코폴리머 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 테트로닉인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조성물:
    [화학식 2]
    Figure pat00004

    상기 화학식 2에서,
    상기 a는 2 내지 200의 정수이고;
    상기 b는 10 내지 100의 정수이며;
    바람직하게는 상기 a는 2 내지 141의 정수이고;
    상기 b는 16 내지 69의 정수이며;
    a와 b는 1:9 내지 8:2의 비율로 존재한다.
    [화학식 3]
    Figure pat00005

    상기 화학식 3에서,
    상기 a는 2 내지 600의 정수이고;
    상기 b는 10 내지 150의 정수이며;
    바람직하게는 상기 a는 10 내지 455의 정수이고;
    상기 b는 17 내지 116의 정수이며;
    a와 b는 1:9 내지 9:1의 비율로 존재한다.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 카테콜기가 결합된 폴리아민(polyamine)은 에틸렌 다이아민(ethylene diamine), 1,3-다이아미노프로판(1,3-diaminopropane), 헥사메틸렌다이아민(hexamethylenediamine), 테트라에틸메틸렌다이아민(tetraethylmethylenediamine), 푸트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), 선형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, linear), 가지형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, branched) 및 폴리라이신(ε-poly-L-lysine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 카테콜기가 결합된 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)은 카테콜 또는 폴리아민에 대하여 카테콜기의 결합율이 1 ~ 20몰%인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 말단에 티올기가 결합된 폴락소머(polaxamer)는 폴락소머에 대하여 티올기의 결합율이 50 ~ 100몰%인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조성물.
  8. 제 1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하이드로젤 조성물은 치료용 약물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 치료용 약물은 인간성장호르몬, 에리트로포이에틴, 인터페론, 인슐린, 인터류킨, 칼시토닌, G-CSF, Angiopoietin, VEGF-Trap, 단일클론 항체, 항체단편, 지혈단백질, 항생제, 진통제, 협심증치료제, allergen extract, 항히스타민 및 항알러지제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조성물.
  10. 제1항의 조성물을 포함하는 지혈제.
  11. (ⅰ) 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민을 제조하는 단계;
    (ⅱ) 티올기가 결합된 폴락소머를 제조하는 단계;
    (ⅲ) 완충용액에 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민을 녹여 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액을 제조하는 단계;
    (ⅳ) 완충용액에 티올기가 결합된 폴락소머를 녹여 티올-폴락소머 용액을 제조하는 단계;
    (ⅴ) 단계(ⅲ)의 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액과 단계(ⅳ)의 티올-폴락소머 용액을 혼합하여 접착성 하이드로젤 용액을 제조하는 단계; 및
    (ⅵ) 단계(ⅴ)의 접착성 하이드로젤 용액을 젤화 시키는 단계;를 포함하는 하이드로젤의 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 단계(ⅰ)의 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민은
    (a) 증류수 100 중량부에 대하여 키토산 또는 폴리아민 0.2 내지 5 중량부를 첨가하여 키토산 또는 폴리아민 용액을 제조하는 단계;
    (b) 증류수 100 중량부에 대하여 하이드로카페익산 1 내지 5 중량부 및 1-에틸-3- (3-다이메틸아미노-프로필)-카르보이미드 하이드로클로라이드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimide hydrochloride; EDC) 2 내지 10 중량부를 첨가하여 하이드로카페익산 용액을 제조하는 단계;
    (c) 단계(a)의 키토산 또는 폴리아민 용액과 단계(b)의 하이드로카페익산용액을 1:1 내지 3:1의 부피비로 혼합 및 교반하여 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민 혼합물을 제조하는 단계; 및
    (d) 단계(c)의 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민 혼합물을 투석막을 이용하여 완충용액에서 6 내지 48시간 투석하여 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민을 정제하여 건조하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 하이드로젤의 제조방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 단계(ⅱ)의 티올기가 결합된 폴락소머는
    (1) 비극성 유기용매 100중량부에 대하여 폴락소머 5 내지 15 중량부 및 비극성유기용매 100부피부에 대하여 트리에틸아민 0.1 내지 1 부피부를 첨가하여 폴락소머 용액을 제조하는 단계;
    (2) 비극성 유기용매 100중량부에 대하여 니트로 페닐 클로로포메이트 5 내지 20 중량부를 첨가하여 니트로 페닐 클로로포메이트 용액을 제조하는 단계;
    (3) 단계(1)의 폴락소머 용액과 단계(2)의 니트로 페닐 클로로포메이트 용액을 5:1 내지 10:1의 부피비로 혼합 및 교반하여 폴락소머 혼합 용액을 제조하는 단계;
    (4) 단계(3)의 폴락소머 혼합 용액을 침전 및 건조하여 폴락소머 혼합물을 제조하는 단계;
    (5) 비극성 유기용매와 극성용매의 혼합액 100중량부에 대하여 단계(4)의 폴락소머 5 내지 20 중량부 및 시스티아민 0.2 내지 5중량부 첨가 및 교반하여 티올기가 결합된 폴락소머 혼합액을 제조하는 단계;
    (6) 단계(5)의 티올기가 결합된 폴락소머 혼합액을 침전 및 건조하여 티올기가 결합된 플루로닉 혼합물을 제조하는 단계; 및
    (7) 단계(6)의 티올기가 결합된 폴락소머 혼합물을 투석막을 이용하여 증류수에서 12 내지 120 시간 투석하여 티올기가 결합된 플루로닉을 정제하여 건조하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 하이드로젤의 제조방법.
  14. 제 11항에 있어서,
    상기 단계(ⅲ)의 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액은 완충용액 100중량%에 대하여 카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민 0.1 내지 10 중량%를 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 하이드로젤의 제조방법.
  15. 제 11항에 있어서,
    상기 단계(ⅳ)의 티올-폴락소머 용액은 완충용액 100중량%에 대하여 티올기가 결합된 폴락소머 3 내지 50 중량%를 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 하이드로젤의 제조방법.
  16. 제 11항에 있어서,
    상기 단계(ⅴ)의 접착성 하이드로젤 용액은 카테콜-키토산 또는 카테콜-폴리아민 용액과 티올-폴락소머 용액을 1 : 3 내지 3 : 1의 부피비로 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 하이드로젤의 제조방법.
  17. 제 11항에 있어서,
    상기 단계(ⅵ)의 접착성 하이드로젤 용액을 젤화는 4 내지 37℃ 의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 하이드로젤의 제조방법.
  18. 제 12항에 있어서,
    상기 단계(ⅰ)의 카테콜기는 하기 화학식 1로 표시되고;
    [화학식 1]
    Figure pat00006

    카테콜기가 결합된 키토산(chitosan) 또는 폴리아민(polyamine)은 분자량이 10 kDa 내지 1,000 kDa 이며;
    카테콜기가 결합된 키토산 또는 폴리아민은 에틸렌 다이아민(ethylene diamine), 1,3-다이아미노프로판(1,3-diaminopropane), 헥사메틸렌다이아민(hexamethylenediamine), 테트라에틸메틸렌다이아민(tetraethylmethylenediamine), 푸트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), 선형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, linear), 가지형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, branched), 폴리라이신(ε-poly-L-lysine) 및 폴리(알릴아민 수화염화물) (poly(allylamine hydrochloride))으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 하이드로젤의 제조방법.
  19. 제 13항에 있어서,
    상기 단계(ⅱ)의 상기 폴락소머(polaxamer)는 하기 화학식 2로 표시되는 플루로닉 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 테트로닉인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조성물:
    [화학식 2]
    Figure pat00007

    상기 화학식 2에서,
    상기 a는 2 내지 200의 정수이고;
    상기 b는 10 내지 100의 정수이며;
    바람직하게는 상기 a는 2 내지 141의 정수이고;
    상기 b는 16 내지 69의 정수이며;
    a와 b는 1:9 내지 8:2의 비율로 존재한다.
    [화학식 3]
    Figure pat00008

    상기 화학식 3에서,
    상기 a는 2 내지 600의 정수이고;
    상기 b는 10 내지 150의 정수이며;
    바람직하게는 상기 a는 10 내지 455의 정수이고;
    상기 b는 17 내지 116의 정수이며;
    a와 b는 1:9 내지 9:1의 비율로 존재한다.
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